Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Aus der Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie des 

Zentrums für Lebensmittelwissenschaften 

der Tierärztlichen Hochschule Hannover 

___________________________________________________________________________ 

Spezies- und gewebespezifischer Nachweis 

von bovinem ZNS – Gewebe in Fleischerzeugnissen 

mittels RT-PCR 

INAUGURAL-DISSERTATION 

zur Erlangung des Grades einer 

Doktorin der Veterinärmedizin 

(Dr. med. vet.) 

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover 

Vorgelegt von 

Alexandra Küfen 

aus Köln 

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: 

Priv.-Doz. Dr. B. Nowak 

Univ.-Prof. Dr. S. Wenzel 

Dr. C. Seyboldt 

1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. B. Nowak 

2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. H. Groschup 

Tag der mündlichen Prüfung: 2. Dezember 2003

Meinen Eltern und meinem Mann

Inhaltsverzeichnis 


1 Einleitung .................................................................................................................. 1 

2 Wissenschaftliches Schrifttum ................................................................................ 2 

2.1 Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE)................................................ 2 

2.1.1 Ätiologie der TSE....................................................................................................... 2 

2.1.2 Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier.......................................... 4 

2.1.2.1 Scrapie (Traberkrankheit, Wetzkrankheit, Gnubberkrankheit).................................. 4 

2.1.2.2 Übertragbare Enzephalopathie der Nerze (transmissible mink encephalopathy- 

TME) .......................................................................................................................... 5 

2.1.2.3 Chronic Wasting Disease (CWD) .............................................................................. 5 

2.1.2.4 Feline spongiforme Enzephalopathie (FSE) .............................................................. 6 

2.1.2.5 Bovine Spongiforme Enzephalopathie....................................................................... 6 

2.1.3 Transmissible spongiforme Enzephalopathien des Menschen................................... 8 

2.1.3.1 Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD).......................................................................... 8 

2.1.3.2 Kuru............................................................................................................................ 9 

2.1.3.3 Fatale Familiäre Insomnie (FFI)................................................................................. 9 

2.1.3.4 Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) ................................................... 10 

2.1.3.5 Neue Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD) ....................................... 10 

2.2 Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE.................................................................... 12 

2.3 Mögliche Exposition des Menschen mit BSE-Erreger-haltigem Gewebe und 

Maßnahmen zum vorbeugenden Verbraucherschutz ............................................... 17 

2.3.1 Kontamination von Schlachtprodukten mit ZNS-Gewebe....................................... 17 

2.3.2 Verwendung von ZNS-Gewebe und ZNS-Gewebe haltigem Rohmaterial bei der 

Herstellung von Fleischerzeugnissen ....................................................................... 19 

2.4 Methoden zur Detektion von ZNS in Fleisch- und Fleischerzeugnissen ................. 21 

2.4.1 Nachweis ZNS-spezifischer Fettsäuren und Cholesterin ......................................... 21 

2.4.1.1 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode (GC-MS) ..................... 21 

2.4.1.2 Nachweis von Cholesterin........................................................................................ 22 

2.4.2 Immunchemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe...................................... 23 

2.4.2.1 Nachweis der neuronenspezifischen Enolase (NSE)................................................ 23 

2.4.2.2 Nachweis des sauren Gliafaserproteins (GFAP)...................................................... 24 

2.4.2.3 Nachweis weiterer Marker für ZNS-Gewebe........................................................... 24 

2.4.3 Immunhistochemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe .............................. 25 

I


2.4.4 Direkter Nachweis von PrP SC ................................................................................... 26 

2.4.5 Molekularbiologische Methoden zum Nachweis von mRNA ................................. 27 

2.5 Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)................................ 29 

2.6 Polymerase-Kettenreaktion-Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (PCR- 

RFLP) ....................................................................................................................... 30 

2.7 Stabilität der mRNA................................................................................................. 32 

2.8 Saures Gliafaserprotein (GFAP) .............................................................................. 34 

3 Material und Methoden ......................................................................................... 36 

3.1 Material .................................................................................................................... 36 

3.1.1 Organe und Gewebe ................................................................................................. 36 

3.1.1.1 Zentrales Nervengewebe .......................................................................................... 36 

3.1.1.2 Peripheres Nervengewebe ........................................................................................ 38 

3.1.1.3 Organe und Gewebe vom Schwein .......................................................................... 38 

3.1.1.4 Organe und Gewebe vom Schaf............................................................................... 38 

3.1.2 Rohstoffe für die Fleischerzeugnisse ....................................................................... 39 

3.1.2.1 Fleisch ...................................................................................................................... 39 

3.1.2.2 Fett............................................................................................................................ 39 

3.1.2.3 Leber......................................................................................................................... 39 

3.1.3 Zutaten und Zusatzstoffe für die Herstellung von Fleischerzeugnissen................... 40 

3.1.4 Chemikalien und Enzyme ........................................................................................ 40 

3.1.5 Puffer und Lösungen ................................................................................................ 42 

3.1.6 Laborgeräte, Laborhilfsmittel und Verbrachsmaterialien ........................................ 42 

3.1.7 Geräte für die Herstellung von Fleischerzeugnissen................................................ 43 

3.2 Methoden.................................................................................................................. 44 

3.2.1 Herstellung der Brühwurstgrundmasse .................................................................... 44 

3.2.1.1 Brühwurstgrundmasse mit Rindermuskulatur.......................................................... 44 

3.2.1.1.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse........................................................... 44 

3.2.1.1.2 Brät für stark erhitze Brühwursterzeugnisse ............................................................ 45 

3.2.1.2 Brühwurstgrundmasse mit Schweinemuskulatur ..................................................... 45 

3.2.1.2.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse........................................................... 45 

3.2.2 Leberwurst................................................................................................................ 46 

3.2.3 Molekularbiologische Methoden.............................................................................. 47 

3.2.3.1 RNA-Extraktion ....................................................................................................... 47 

3.2.3.2 Reverse Transkription .............................................................................................. 48 

II


3.2.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR) .......................................................................... 49 

3.2.3.3.1 PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev ..................................................... 49 

3.2.3.3.2 PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 .................................................... 50 

3.2.3.3.3 PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 ............................................... 52 

3.2.3.4 Reinigung von DNA für die nachfolgende Sequenzierung...................................... 53 

3.2.3.5 Gelelektrophorese..................................................................................................... 53 

3.2.3.6 Untersuchungen zur Tierartspezifität des GFAP-mRNA-Nachweises .................... 54 

3.2.4 Untersuchungen zur Gewebespezifität des Gliafaserprotein-mRNA-Nachweises .. 55 

3.2.4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schweinegeweben ................................. 55 

3.2.4.1.1 Untersuchung nativer Gewebe ................................................................................. 55 

3.2.4.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)............................................... 55 


3.2.4.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)................ 56 

3.2.4.2 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schafgeweben........................................ 57 

3.2.4.2.1 Untersuchung nativer Gewebe ................................................................................. 57 



3.2.4.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)................ 58 

3.2.4.3 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystems auf den Nachweis porciner und 

oviner GFAP-mRNA................................................................................................ 58 

3.2.5 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis 

boviner GFAP-mRNA.............................................................................................. 59 

3.2.5.1 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in unterschiedlich erhitzten 

Brühwursterzeugnissen ............................................................................................ 59 

3.2.5.1.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 75°C 

Wasserbadtemperatur ............................................................................................... 59 





3.2.5.2 Herstellung von Vollkonserven................................................................................ 61 

3.2.5.3 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in einen Leberwursterzeugnis...................... 62 

3.2.5.4 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystem (PNS) auf den Nachweis 

boviner GFAP-mRNA in einem Brühwursterzeugnis ............................................. 63 

III


3.2.6 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den Nachweis 

porciner GFAP-mRNA ............................................................................................ 64 

3.2.6.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 80°C 


4 Ergebnisse ............................................................................................................... 66 

4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität von GFAP-mRNA...................................... 66 

4.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schweinegewebe................................................ 66 

4.1.1.1 Untersuchung nativer Gewebe ................................................................................. 66 

4.1.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten)............................................... 67 


4.1.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten)................ 70 

4.1.1.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 h) und nachfolgend erhitzter Gewebe (80°C, 

30 min) ..................................................................................................................... 71 

4.1.1.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 min) 

.................................................................................................................................. 72 

4.1.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schafgewebe ...................................................... 73 

4.1.2.1 Untersuchung nativer Gewebe ................................................................................. 73 



4.1.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten, 95°C, 60 Minuten)................ 76 

4.1.2.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 Stunden) und nachfolgend erhitzter Gewebe 

(80°C, 20 Minuten) .................................................................................................. 76 

4.1.2.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 

Minuten) ................................................................................................................... 77 

4.2 Fleischerzeugnisse, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an Gehirngewebe 

dotiert wurden .......................................................................................................... 78 

4.2.1 Fleischerzeugnisse dotiert mit Rindergehirngewebe................................................ 78 

4.2.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten 

(Gartemperatur 75°C)............................................................................................... 78 


(Gartemperatur 95°C)............................................................................................... 80 


(Gartemperatur 100°C)............................................................................................. 81 

4.2.1.4 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Leberwürsten .......... 83 

IV


4.2.1.5 Untersuchung von Vollkonserven............................................................................ 84 

4.2.1.5.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Brühwürsten 

(Vollkonserve I) ....................................................................................................... 84 


(Vollkonserve II) ...................................................................................................... 86 

4.2.1.6 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit peripherem Nervensystem (PNS) dotierten 

Brühwürsten ............................................................................................................. 87 

4.2.2 Fleischerzeugnisse dotiert mit porcinem Gehirngewebe.......................................... 89 

4.2.2.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten aus 

Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern GFAPforw 

und GFAPrev............................................................................................................ 90 

4.2.2.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten aus 

Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern GFAPpork1 

und GFAPpork2 ....................................................................................................... 90 

4.3 Sequenzierung der 399 bp GFAP-mRNA-Amplifikate verschiedener Tierarten .... 92 

4.4 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)........................................... 97 

5 Diskussion ............................................................................................................. 101 

5.1 Saures Gliafaserprotein (GFAP) als Marker für ZNS-Gewebe in 

Fleischerzeugnissen................................................................................................ 101 

5.1.1 GFAP-mRNA als Marker für ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen..................... 101 

5.1.2 RT-PCR Systeme zum Nachweis von GFAP-mRNA............................................ 103 

5.2 Gewebespezifität und Stabilität der GFAP-mRNA von Rind, Schwein und Schaf104 

5.3 GFAP-mRNA Nachweis zur Detektion von bovinem ZNS-Gewebe in 

Fleischerzeugnissen................................................................................................ 107 

5.3.1 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem ZNS-Gewebe ...................... 107 

5.3.2 Leberwurst mit bovinem ZNS-Gewebe ................................................................. 108 

5.3.3 Vollkonserven ........................................................................................................ 109 

5.3.4 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem PNS-Gewebe ...................... 110 

5.3.4.1 G1 a .......................................................................................................................... 112 

5.4 RFLP des 168 bp GFAP-mRNA Fragmentes zur Identifizierung boviner GFAPmRNA 

.................................................................................................................... 113 

6 Zusammenfassung................................................................................................ 115 

7 Summary ............................................................................................................... 117 

8 Literatur................................................................................................................ 119 

V


9 Tabellenverzeichnis.............................................................................................. 161 

10 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 164 

VI

Abkürzungsverzeichnis 


EEG Elektroenzephalogramm 

EG Europäische Gemeinschaft 

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbant 

Assay 

et al. et alii 

EU Europäische Union 

fCJD familiäre CJD 

FAME Fettsäuremethylestern 

F-ELISA Fluoreszent- Enzyme-Linked 

Immunosorbant Assay 

FFI fatalen familiären Insomnie 

FSE feline spongiforme 

Enzephalopathie 

Abb. Abbildung 

Abl. Amtsblatt 

Abk. Abkürzung 

ARE Arginin rich elements (Arginin 

reiche Elemente) 

BgVV Bundesinstitut für 

gesundheitlichen 

Verbraucherschutz und 

Veterinärmedizin 

bp Basenpaar 

BSE bovine spongiforme 


bzw. beziehungsweise 

ca. circa 

CCN Zerebrocorticalnekrose 

cCJD klassische Creutzfeld-Jakob 

Erkrankung 

cDNA copy-DNA 

CJD Creutzfeld-Jakob Erkrankung 

vCJD neue Variante der Creutzfeld- 

Jakob Erkrankung 

cm Zentimeter 

CWD chronic wasting disease of elk 

DEPC Diethylpyrocarbonat 

d.h. das heißt 

DNA Deoxyribonucleic acid 

(Desoxyribonukleinsäure) 

DNase Desoxyribonuklease 

dATP Desoxyadenosintriphosphat 

dCTP Desoxycytosintriphosphat 

dGTP Desoxyguanintriphosphat 

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat 

DTT 1,4-Dithio-D,L-threitol 

dTTP Desoxythymintriphosphat 

GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker- 

Syndrom 

°C Grad Celsius 

g Gramm 

g Fallbeschleunigung 

GC-MS Gaschromatographie- 

Massenspektrometrie 

GFAP glialfibrillary acidic protein 

(saures Gliafaserprotein) 

HCl Salzsäure 

HWZ Halbwertzeit 

iCJD iatrogene CJD 

IF Intermediärfilamentproteinen 

INV intrgriertes Nachweisverfahren 

IRMM Institut für Referenzmaterialien 

und –messungen 

ISTMEM Infektiöse septikämische, 

thrombosierende Meningo- 

Enzephalo-Myelitis 

kb kilobase 

VII


KCl Kaliumchlorid 

kg Kilogramm 

l Liter 

LMBG Lebensmittel- und 

Bedarfsgegenständegesetz 

MBP basisches Myelinprotein 

M Molar 

max. maximal 

µl Mikroliter 

µm Mikrometer 

Met Methionin 

mg Milligramm 

MgCl 2 Magnesiumchlorid 

min Minute 

ml Milliliter 

mm Millimeter 

mM Millimolar 

mRNA messenger Ribonukleinsäure 

mtDNA mitochondralen DNA 

RNA ribonucleic acid 

(Ribonukleinsäure) 

RNase Ribonuklease 

mRNP Ribonukleoprotein 

NaOCl Natriumhypochlorit 

NaOH Natronlauge 

(NH 4 ) 2 SO 4 Ammoniumsulfat 

neg. negativ 

no. Number (Nummer) 

NF Neurofilament 

ng Nanogramm 

nm Nanometer 

NSE Neuronen spezifische Enolase 

OIE Office International des 

Epizooties 

VIII 

PCR Polymerase chain reaction 

(Polymerase-Kettenreaktion) 

pH pondus hydrogenii 

pos. positiv 

PNS peripheres Nervensystem 

Prion proteinaceous infectious particle 

PRNP Prionproteingen 

PrP Prionprotein 

PrP C zelluläres Prion-Protein 

PrP RES 

PrP SC 

RFLP 

RNA 

RBP 

RT 

Proteinase K-resistentes Prion- 

Protein 

pathologischen Form des Prion- 

Proteins 

Restriktionsfragment 

Längenpolymorphismus 

Ribonucleic acid 

(Ribonukleinsäure) 

RNA-Bindungs-Proteine 

reverse Transkriptase 

S. Seite 

s. siehe 

SAF Scrapie assoziierte Fibrillen 

sCJD sporadischen CJD 

SDS Dodecylhydrogensulfat 

Natriumsalz 

s.o. siehe oben 

SRM spezifiziertes Risikomaterial 

SSC Scientific Steering Committee 

Tab. Tabelle 

TME transmissible mink 

encephalopathie 

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 

TSE transmissible spongiforme 


U Unit (Einheit) 

u. und


u.a. 

UK 

UpM 

USA 

UTR 

UV 

Val 

z.B. 

unter anderem 

United Kingdom (Vereinigtes 

Königreich) 

Umdrehungen pro Minute 

United States of Amerika 

untranslated region (nicht 

kodierender Bereich) 

Ultraviolett 

Valin 

zum Beispiel 

ZNS zentrales Nervensystem 

≅ entspricht 

® geschütztes Warenzeichen 

TM 

trade mark 

< kleiner als 

> größer als 

§ Paragraph 

IX

Einleitung 

1 Einleitung 

Das Auftreten einer neuen Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD), die 1995 

erstmals in Großbritannien diagnostiziert wurde (BATEMAN et al. 1995; BRITTON et al. 

1995; WILL et al. 1996), wird auf den Eintrag von hochinfektiösen, TSE-Erreger-haltigen 

Rohstoffen, wie dem zentralnervösen Gewebe (ZNS-Gewebe) von Wiederkäuern (SSC 1999, 

2001, 2002) in den Lebensmittelkreislauf zurückgeführt (WILL et al. 1996; BONS et al. 1997, 

1999; COULTHART u. CASHMAN 2001). Aus tierseuchenrechtlichen sowie aus Gründen 

des Verbraucherschutzes wurden bestimmte Wiederkäuergewebe als spezifiziertes 

Risikomaterial (SRM) ausgewiesen, das unschädlich beseitigt werden muss (EU 2001c, 

2000). Hinsichtlich des vorbeugenden Verbraucherschutzes sowie zur Verhinderung der 

weiteren Ausbreitung von TSE ist es wichtig, Testmethoden zur Detektion von SRM- 

Materialien zu entwickeln (EU 2001b; LÜCKER et al. 1999, 2001; WEYANDT 2001). 

Zur Zeit stehen bereits verschiedene Nachweisverfahren zur Detektion von ZNS-Gewebe zur 

Verfügung. Dies sind zum einen immunologische Methoden, die ZNS-spezifische Proteine 

wie z.B. das sauere Gliafaserprotein (GFAP) oder neuronenspezifische Enolase (NSE) als 

Marker nutzen. Zwei Testverfahren, ein GFAP-ELISA (SCHMIDT et al. 1999) sowie ein 

NSE-Westernblot (LÜCKER et al. 1999) sind kommerziell verfügbar. Mit diesen ist ein 

semiquantitativer Nachweis von ZNS-Gewebe möglich. Mit allen bisher entwickelten 

Verfahren, die auf dem Nachweis bestimmter Proteine beruhen, sind jedoch Aussagen über 

die Tierart des nachgewiesenen ZNS-Gewebes nicht eindeutig. Zum anderen ist der Nachweis 

dieser Gewebe über die stabilen Fettsäuren der Sphingomyeline, (NIEDERER u. 

BOLLHALDER 2001) erreichbar. Mit diesem Verfahren scheinen auch tierart- und 

altersbezogene Aussagen zum nachgewiesenen ZNS-Gewebe möglich. 

Mit einem RT-PCR Verfahren zum Nachweis boviner GFAP-mRNA (SEYBOLDT et al. 

2003) gelang es erstmals, gewebsspezifisch auftretende mRNA als Marker für bovines ZNS- 

Gewebe in Fleischerzeugnissen zu nutzen. Das Ziel des vorliegenden Dissertationsvorhabens 

ist, den Einfluss verschiedener fleischtechnologischer Parameter bei unterschiedlichen 

Fleischerzeugnissen auf den Nachweis der GFAP-mRNA des Rindes zu untersuchen. 

Weiterhin wird die Anwendung dieser Methode zur Detektion von ZNS-Gewebe der Tierarten 

Schwein und Schaf überprüft. Mit Hilfe dieser Arbeiten sollen Aussagen zur 

Anwendungsbreite und zu Sensitivität und Spezifität dieses Testverfahrens erarbeitet werden. 

1

Wissenschaftliches Schrifttum 

2 Wissenschaftliches Schrifttum 

2.1 Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) 

Bei den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) handelt es sich um eine 

Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen mit infektiösem Charakter, die bei Menschen 

und Tieren vorkommen können. Allen TSE ist gemeinsam, dass sie eine lange Inkubationszeit 

haben, die von einem Jahr bis zu mehreren Jahrzehnten andauernden kann und von der 

Eintrittspforte der Erreger sowie dem Genotyp des Wirtes abhängig ist (DIRINGER et al. 

1994; AGUZZI 2002; DORMONT 2002). Die TSE verlaufen chronisch progressiv und enden 

tödlich (SCHICKER 1998). Um einzelne Nervenzellen legt sich eine Amyloidschicht, die 

über die Einschränkung des Zellstoffwechsels zum langsamen Absterben der Nervenzelle 

führt. Es findet keine Immunreaktion statt, da das Amyloid als körpereigene Substanz 

angesehen wird (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002). Histopathologisch zeigt sich 

dieser Prozess als Spongiose, Amyloidose, Hyperastrozytose, Astrogliose und 

Neuronenverlust. Klinisch treten bei den TSE zunehmende Störungen im Verhalten, der 

Sensibilität und der Motorik auf (VANDEVELDE et al. 1992; SCHICKER 1998; 

DORMONT 2002; STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002). 

2.1.1 Ätiologie der TSE 

Es gibt viele Theorien über die eigentliche Natur des TSE-Erregers, da die physikochemische 

Natur des Erregers noch nicht eindeutig geklärt ist (GAREIS 1995; DORMONT 2002; 

SMITH 2002). Am häufigsten wird die „Protein-only“-Hypothese von Stanley Prusiner 

postuliert (PRUSINER 1982), der den Namen „Prion“ für „small, proteinous infectious 

particle“ prägte (RAIDEN et al. 2001; SMITH 2002). Das gesunde Prion-Protein (PrP C ) wird 

beim Menschen von dem PrP-Gen (PRNP) kodiert und besitzt eine dreidimensionale Struktur 

aus drei α-Helices, zwei schmalen antiparallelen β-Faltblatt-Strukturen und einem langen 

flexiblen Schwanz. Es ist mit einem Glykosyl-Phophatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker) an die 

Zellmembran von Neuronen, Gliazellen und Zellen des lymphoretikulären Systems gebunden 

(RIEK et al. 1996, 1997). Die genaue Funktion von PrP C ist nicht bekannt (PRUSINER et al. 

1990; PRUSINER 1993). Da transgene Mäuse, denen das PRNP fehlt, für das TSE-Agens 

oder eine Prion Infektion nicht empfänglich sind, wird vermutet, dass das Prion-Protein eine 

Schlüsselrolle bei der TSE-Erkrankung spielt (BÜELER et al. 1993). Von dem PrP C lässt sich 

2


die pathologische Form des Prion-Proteins (PrP SC ) unterscheiden. Die beiden Proteine haben 

die gleiche Aminosäuresequenz, aber eine unterschiedliche Konformation und chemische 

Eigenschaften. Im Gegensatz zu PrP C hat PrP SC einen höheren Anteil an β-Faltblatt- 

Strukturen (RIEK et al. 1998), ist wasserunlöslich und wird von Proteinase K nicht 

vollständig abgebaut. Es bleibt ein Rest von 27 – 30 kDa, den man auch Proteinase K- 

resistentes Prion-Protein (PrP RES ) nennt (PRUSINER 1992; COLLINGE et al. 1996; HILL et 

al. 1997). Bei der Krankheitsentstehung lagert sich PrP SC an der Zelloberfläche an PrP C an 

und verursacht eine Konformationsänderung der Sekundärstruktur der Proteine. Somit wird 

aus PrP C ein PrP SC , das wiederum andere PrP C umwandeln kann (HORIUCHI u. CAUGHEY 

1999; JACKSON et al. 1999; CAUGHEY u. BARON 2002). Auch in-vitro ist es gelungen 

PrP C unter Zugabe von PrP SC zu PrP SC zu konvertieren (RAYMOND et al. 1997). PrP SC 

assoziiert in den Endolysosomen zu Fibrillen, die auch Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) 

genannt werden (MERZ et al. 1981; PRUSINER 1983). Diese Amyloid-Plaque lagert sich in 

den Endolysosomen der Nervenzellen ab (COHEN et al. 1994) und führt über die 

Einschränkung des Zellstoffwechsels zum Zelltod. Histologisch sind konfluierende 

schwammartige Veränderungen im umgebenden Neuropil nachweisbar (PRUSINER 1995; 

CHAZOT et al. 1996; WILL et al. 1996). Dieser Prozess verläuft umso schneller, je ähnlicher 

PrP SC dem wirtseigenen PrP C ist (SCOTT et al. 1989, 1999; PRUSINER et al. 1990). Durch 

Glykolysierung entstehen drei Glykoformen von PrP. Mit den relativen Proportionen der drei 

Glykoformen zueinander und der Größe des unglykolysierten PrP RES Fragments im 

Westernblot, kann man die verschiedenen TSE-Agens-Stämme unterscheiden (COLLINGE et 

al. 1996; PARCHI et al. 1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997; ASANTE et al. 2002). 

Die TSE-Erreger sind resistent gegenüber Prozessen, die Nukleinsäuren inaktivieren 

(PRUSINER et al. 1980; PRUSINER 1982). Prozesse, die Proteine inaktivieren, reduzieren 

bei PrP SC die Infektiosität, wie z.B. Behandlung mit hohen Proteinase K-Konzentrationen 

(PRUSINER 1983), SDS, Diethylpyrocarbonat, Guanidin-Thiocyanat und Harnstoff 

(KIMBERLIN u. WALKER 1978; PRUSINER et al. 1980, 1981; BROWN et al. 1986). Eine 

komplette Dekontamination erfolgt bei: 

(a) Autoklavieren bei 132°C für 1,5 Stunden; (b) Behandlung mit 1 M Natriumhydroxid für 1 

Stunde bei 20°C; (c) Behandlung mit Natriumhypochlorit (NaOCl, 2% Chlorit) für 1 Stunde 

bei 20°C (ERNST u. RACE 1993; TAYLOR et al. 1994; DORMONT 2002a). Die in der 

Entscheidung 96/449/EG (EU 1996) festgeschriebene Methode zur Dekontamination ist die 

Erhitzung auf 133°C bei einem Druck von drei bar für 20 Minuten (TAYLOR et al. 1995). 

3


Diese Methode erreicht eine Reduktion der Infektiosität um den Faktor 10 2,2 (SCHREUDER 

et al. 1998). 

Neben der Prion-Protein Hypothese gibt es auch noch alternative Hypothesen über die 

Erregerherkunft, wie beispielsweise die „Virino-Hypothese“ (DIRINGER et al. 1994; 

AGUZZI 2002; SMITH 2002), die Hypothese des unkonventionellen Virus (SMITH 2002) 

sowie die Hypothese des molekularen Mimikry durch das Bakterium Actinobacter 

(EBRINGER et al. 1997; SMITH 2002). 

2.1.2 Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier 

Transmissible spongiforme Enzephalopathien beim Tier sind Erkrankungen des ZNS, die 

durch Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins (PrP SC , PRUSINER 1982; 

OESCH et al. 1985) in Form von Amyloid Plaques verursacht werden, die zum Zelltod der 

Nervenzellen führen (GIESE et al. 1995). Die Erkrankungen sind horizontal, transplazentar 

und oral über das Futter übertragbar (SCHICKER 1998). Bisher sind die nachfolgend 

beschriebenen TSE bei Tieren bekannt. 

2.1.2.1 Scrapie (Traberkrankheit, Wetzkrankheit, Gnubberkrankheit) 

Die bei Schafen und Ziegen vorkommende Erkrankung ist seit über 200 Jahren bekannt. Sie 

wurde erstmals 1922 von MCGOWAN beschrieben (MCGOWAN 1922). Die Erkrankung ist 

in Großbritannien enzootisch und betrifft jährlich 0,5 % – 1 % aller Schafe (AGUZZI u. 

WEISSMANN 1997). Am häufigsten erkranken Tiere im Alter von 2 – 4 Jahren (SCHICKER 

1998). Die Ansteckungswege verlaufen vertikal von dem Muttertier über die Plazenta auf das 

Lamm (BORCHERS et al. 2002) sowie horizontal durch das Muttertier während der Geburt 

und in der ersten Zeit nach der Geburt (FOOTE et al. 1993). Übertragungswege sind 

infektiöse innere Gewebe, wie z.B. die Milz, und kontaminierte Weiden (WISNIEWSKI. et 

al. 1996). Die Erkrankung verläuft protrahiert und führt nach chronischer Abmagerung sowie 

Festliegen zum Tod (BORCHERS 2002). Histologisch zeigen sich im Cerebellum 

spongiforme Degenerationen der Substancia grisea sowie damit einhergehende Astrogliose 

und amyloide Plaques, die aus assoziierten unlöslichen Fibrillen bestehen, und Scrapieassoziierte 

Fibrillen (SAF) genannt werden (BORCHERS 2002). Zur Zeit sind 20 

verschiedene Scrapie-Erreger-Stämme bekannt, die sich hinsichtlich der Dauer der 

4


Inkubationszeit und der Ausbildung der neuropathologischen Veränderungen unterscheiden 

(GOLDMANN et al. 1994; SIMON 1996). Es ist bisher noch nicht eindeutig erwiesen, ob 

Scrapie die Ursache für BSE ist. Es gibt sowohl Studien, bei denen die Untersuchung der 

PrP RES – Glykoform Unterschiede zwischen Schaf-Scrapie und Schaf-BSE aufzeigen (HILL 

et al. 1998) und Studien, bei denen dieser Unterschied nicht nachweisbar ist (BARON et al. 

1999). 

2.1.2.2 Übertragbare Enzephalopathie der Nerze (transmissible mink 

encephalopathy-TME) 

TME wurde erstmals von HARTSOUGH u. BURGER beschrieben und brach 1947 zum 

ersten Mal in einer Nerzzuchtfarm in den USA aus (HARTSOUGH u. BURGER 1965). TME 

ist weltweit sehr selten und betrifft hauptsächlich die Zuchtfähen. Obwohl die genaue Ursache 

nicht bekannt ist, nimmt man an, dass die Verfütterung TME-Erreger-haltiger Rinder- und 

Schafkadaver für den Ausbruch verantwortlich sind, da bisher nur Zuchtfähen, die mit Fleisch 

gefüttert wurden, erkrankt sind (BORCHERS 2002). Klinisch zeigt sich die TME als 

progressive neurologische Dysfunktion mit histopathologisch nachweisbaren degenerativen 

Veränderungen im ZNS-Gerwebe (BORCHERS 2002). 

2.1.2.3 Chronic Wasting Disease (CWD) 

Die seit 1974 bekannte CWD ist eine weitere progressive neurologische Erkrankung mit 

degenerativen Veränderungen im ZNS-Gewebe und wurde erstmals von WILLIAMS u. 

YOUNG beschrieben (WILLIAMS u. YOUNG 1980, 1982). CWD kommt hauptsächlich in 

den USA und Kanada vor und betrifft wildlebende, gezähmte Rocky Mountain Elche, Wapitiund 

Maultierhirsche sowie Rehe und Elche der USA. Die auffälligsten Symptome sind 

Unfruchtbarkeit, chronische Auszehrung und Orientierungslosigkeit (WILLIAMS u. YOUNG 

1980, 1982; BORCHERS 2002). Als Ursache für die CWD wird kontaminiertes Tiermehl aus 

Europa angenommen (BORCHERS 2002). Untersuchungen der PrP RES – Proteine haben 

ergeben, dass sich die PrP RES – Glykoformen von Scrapie-infizierten Rindern, Scrapieinfizierten 

Schafen und CWD-infizierten Cerviden nicht unterscheiden, aber von der PrP RES – 

Glykoform von BSE-infizierten Rindern gut unterscheidbar sind (RACE et al. 2002). Deshalb 

wird angenommen, dass CWD von Schaf-Scrapie stammt (RAYMOND et al. 2000; RACE et 

5


al. 2002). Eine Übertragung von CWD auf den Menschen wird bisher nicht angenommen und 

gilt als unwahrscheinlich (BELAY et al. 2001). 

2.1.2.4 Feline spongiforme Enzephalopathie (FSE) 

Diese Erkrankung trat 1990 das erste Mal bei Katzen im Vereinigten Königreich auf 

(LEGGET et al. 1990). Auch hier wird vermutet, dass der Verzehr von PrP SC – 

kontaminiertem Futter die Ursache für die Erkrankung ist. Bei der Übertragung von FSE auf 

Mäuse, zeigen sich bei diesen BSE-ähnliche Symptome. 

2.1.2.5 Bovine Spongiforme Enzephalopathie 

Die bovine spongiforme Enzephalopathie ist eine Einzeltiererkrankung, die 1985 erstmals im 

Vereinigten Königreich aufgetreten ist (WELLS et al. 1987). In Deutschland wurde der erste 

BSE-Fall am 26. 11. 2000 festgestellt (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002). 

Mittlerweile gibt es im Vereinigten Königreich über 183000 (OIE 2003a) und in der 

restlichen Welt bis insgesamt etwa 4110 (Stand: Juli 2003) amtlich gemeldete BSE-Fälle 

(OIE 2003b). Für die besonders starke Ausbreitung der BSE im Vereinigten Königreich sind 

unter anderem technische Änderungen der Tierkörper-Aufbereitung in der 

Tierkörperbeseitigungsanstalt eine Ursache, die im Verlauf der 70er und 80er Jahre 

stattgefunden haben (FRIES 2002). Mittlerweile sind die Zahlen der pro Jahr neu 

hinzukommenden BSE-Fälle rückläufig, was auf die Wirkung der eingeleiteten Schutz- und 

Kontrollmaßnahmen zurückzuführen ist (FRIES 2002). Die Inkubationszeit liegt bei 2,5 – 11 

Jahren (WILESMITH u. RYAN 1992; WELLS et al. 1995; WELLS u. WILESMITH 1995). 

Rinder zwischen vier und fünf Jahren erkranken am häufigsten (BRAUN 1998; SCHICKER 

2001). Der Hauptinfektionsweg von BSE erfolgt oral über mit TSE-Erregern kontaminiertes 

Futter (SCHICKER 1998). In verschiedenen Studien ist es gelungen, durch orale Exposition 

von mit BSE-Agens kontaminierten Futter eine spongiforme Enzephalopathie bei Primaten 

(BONS et al. 1999) und Mäusen, nicht aber bei Hamstern, (RAYMOND et al. 1997) 

hervorzurufen. Aufgrund der Hinweise auf die orale Übertragbarkeit, wurde in der 

Europäischen Union die Verfütterung von Proteinen, die von Säugetieren stammen, an 

Wiederkäuer verboten (EU, 1994; OIE 1996, 2000). Die Infektionsroute von TSE verläuft von 

den peripheren Geweben zum Gehirngewebe (WILL u. IRONSIDE 1999). Die Erkrankung 

verläuft chronisch-progressiv. Klinisch zeigen sich Abmagerung und Milchleistungsrückgang 

6


(AUSTIN u. SIMMONS 1993) sowie eine zunehmende Änderung des Verhaltens, der 

Sensibilität und des Bewegungsablaufes. Nach 2 – 6 Monaten endet die Erkrankung mit dem 

Tod (WILESMITH u. RYAN 1992; BRAUN et al. 1998, 1999; STAUFENBIEL u. 

HÄMÄLÄINEN 2002). Bei natürlich erworbener BSE sind PrP SC in den dorsalen 

Wurzelganglien und im Knochenmark nachweisbar, während bei experimentell erworbener 

BSE auch im distalen Ileum PrP SC nachweisbar sind (COLLEE u. BRADLEY 1997; WILL u. 

IRONSIDE 1999). Labordiagnostisch (d.h. in Vollblut, Blutserum, Harn, Pansen, Liquor 

cerebrospinalis) lassen sich keine diagnostisch relevanten Veränderungen feststellen 

(BRAUN et al. 1998a, 2001; SCHICKER 2001). Differentialdiagnostisch sind folgende 

Krankheiten abzuklären (STAUFENBIEL u. HÄMÄLÄINEN 2002): Tetanie, nervöse Form 

der Ketose, Gebärparese, Cerebrocorticalnekrose (CCN), hepatogene Enzephalopathie, 

Leberkoma, Urämie, Bleivergiftung, Tollwut, Tetanus, Botulismus, Listeriose, Aujeszkysche 

Krankheit, infektiöse septikämische thrombosierende Meningo-Enzephalo-Myelitis 

(ISTMEM) und sporadische ZNS-Erkrankungen mit einer Enzephalitis. Zur Diagnose der 

BSE am lebenden Tier wird von BRAUN et al. (1997, 1998a, 1998b) ein Untersuchungsgang 

beschrieben, dessen Schwerpunkte auf der Untersuchung der Körperhaltung, dem 

Bewegungsablauf und dem Verhalten der Tiere gegenüber akustischen, optischen und taktilen 

Reizen liegen. Jedoch ist bei der Anwendung dieses Testes bei Tieren mit schwacher oder 

untypischer Symptomatik ein erhebliches Maß an Erfahrung notwendig (GROSCHUP u. 

STOLZE 2002). Momentan noch nicht verfügbare Testverfahren am lebenden Tier stützen 

sich auf (a) den Nachweis von PrP SC im Blut, z.B. durch die Flouressenz-Korrelations- 

Spektroskopie oder die „Protein-Misfolding-Cyclic-Amplification“-Reaktion, (b) den 

Nachweis von Surrogatmarkern, (c) den Nachweis von Protein 14-3-3 im Liquor 

cerebrospinalis oder (d) den Nachweis von PrP SC im Urin (GROSCHUP u. STOLZE 2002). 

Beim toten Tier stützt sich die Diagnose auf den Nachweis der pathologischen Form des 

Prion-Proteins (PrP SC ) und die Histopathologie (GROSCHUP u. STOLZE 2002). Bei der 

Diagnose einer TSE mittels PrP SC nutzt man bestimmte Eigenschaften des PrP SC 

(z.B.: Proteinase K-Resistenz, die glykolysierte Form, molekulares Gewicht der 

unglykolysierten Form), um die einzelnen TSE voneinander zu unterscheiden (JEFFREY et 

al. 2001a). 

BSE kann auch bei Schafen vorkommen. Untersuchungen mit experimentell infizierten 

Schafen (FOSTER et al. 1993, 1996, 2001a, 2001b) haben gezeigt, dass bei Schaf-BSE der 

für Scrapie typische Hautjuckreiz fehlt (FOSTER et al. 2001a, 2001b). Bei BSE ist die PrP SC - 

7


Akkumulation im zentralen und peripheren Nervengewebe nachweisbar. Bei Scrapie kommt 

die PrP SC -Akkumulation zusätzlich in fast allen lymphoiden Geweben, wie z.B. der Milz, vor 

(FOSTER et al. 2001b). Experimentell ist es gelungen, bei Schafen BSE auf oralem Wege 

über kontaminiertes Futter hervorzurufen (FOSTER et al. 2001c; JEFFREY et al. 2001). Ob 

BSE auch natürlich bei Schafen vorkommt, ist zur Zeit nicht bekannt, kann aber auch nicht 

ausgeschlossen werden (FERGUSON et al. 2002). 

2.1.3 Transmissible spongiforme Enzephalopathien des Menschen 

Bei den humanen TSE unterscheidet man zwischen der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD), 

der neuen Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD), Kuru, der fatalen familiären 

Insomnie (FFI) sowie dem Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS). 

2.1.3.1 Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD) 

Die Creutzfeld-Jakob Erkrankung (CJD) ist die häufigste humane TSE und wurde schon von 

den Neurologen H. G. CREUTZFELDT (1920) und A. JAKOB (1921) erstmals beschrieben 

(CREUTZFELDT 1920; JAKOB 1921). Mittlerweile wird zwischen vier Typen von CJD 

unterschieden. Typ 1-3 werden zu den klassischen Formen der CJD (cCJD) gezählt (PARCHI 

et al. 1996) und man unterscheidet hier zwischen der sporadischen (90 % der Fälle), der 

iatrogenen (< 1 % der Fälle) und der familiären Form (5 – 10 % der Fälle) (ALPEROVITH et 

al. 1994). Die Inzidenz liegt weltweit bei 0,6 – 1,5 Fälle pro eine Million Einwohner und Jahr. 

Das Durchschnittsalter der Erkrankten liegt bei der sporadischen CJD bei 65 Jahren, bei der 

familiären CJD bei 50 – 55 Jahren und bei der sehr seltenen iatrogenen Form bei etwa 30 

Jahren (BROWN et al. 1984, 1992). Symptomatisch zeigt sich bei der sporadischen CJD 

(sCJD) eine rasch fortschreitende Demenz begleitet von Sprachstörungen, Myklonien, 

Hypokinese, Akinese, starker Rigidität oder Spastiken. Der Tod erfolgt bei 90 % der Patienten 

innerhalb eines Jahres nach Krankheitsbeginn (AGUZZI 2002). Die nicht erbliche iatrogene 

CJD (iCJD) und die erbliche familiäre CJD (fCJD) zeigen eine ähnliche Symptomatik. 

Patienten mit einer Homozygotie für Valin oder Methionin an Codon 129 des humanen PrP- 

Genes (PRNP) erkranken schneller an cCJD, als Patienten mit einer Heterozygotie an diesem 

Genort, die mit jahrelanger Verzögerung erkranken (BAKER et al. 1991; COLLINGE et al. 

1991; PALMER et al. 1991; AGUZZI 2002). Die Ursachen der iCJD sind Transplantationen 

8


von Cornea (DUFFY et al. 1974) oder Dura mater (NISBET 1989), ungenügend sterilisierte 

Instrumente in der Neurochirurgie (WILL u. MATTHEWS 1982) und das Verabreichen von 

Wachstumshormonen aus humanen Hypophysen (BROWN 1988). Die Diagnose der cCJD 

am lebenden Menschen basiert auf dem klinischen Erscheinungsbild sowie dem Nachweis 

(a) charakteristischer Veränderungen im EEG (FEIDEN 1998; SCHICKER 1998), (b) der 

unspezifischen Hirnatrophie durch bildgebende Verfahren und (c) der Erhöhung bestimmter 

Proteingehalte im Liquor der Patienten, wie z. B. die Neuronen spezifische Enolase (NSE) 

und das 14.3.3-Protein (ZERR et al. 1995). Die endgültige Diagnose findet erst am toten 

Patienten histopathologisch anhand der Spongiose und Astrogliose in den tiefen kortikalen 

Schichten der Großhirnrinde sowie den plaqueartigen Ablagerungen der pathologischen Form 

des Prion-Proteins, die synaptisch oder perivakuolär auftreten, statt (BUDKA u. 

HAINFELLNER 1996; AGUZZI 2002). 

2.1.3.2 Kuru 

Kuru ist eine exotische Form der CJD, die bei der „Fore“-Urbevölkerung der nördlichen 

Provinzen Neu Guineas vorkommt. Das klinische Erscheinungsbild zeigt Tremor, progressive 

zerebelläre Ataxie und Demenz. Der Tod tritt nach drei Monaten bis drei Jahren ein. Ursache 

ist ein ritueller Kannibalismus, der bis in die fünfziger und sechziger Jahre des vergangenen 

Jahrhunderts weit verbreitet war (GAJDUSEK u. ZIGAS 1957, 1959). Die Patienten 

infizieren sich auf dermalem, oralem und nasalem Wege (ALPERS u. GAJDUSEK 1965). 

2.1.3.3 Fatale Familiäre Insomnie (FFI) 

Die Fatale Familiäre Insomnie (FFI) ist eine sehr seltene Erkrankung, die 1986 erstmals bei 

einer norditalienischen Familie von LUGARESI beschrieben wurde (LUGARESI et al. 1986). 

Das Erkrankungsalter der Patienten liegt zwischen 40 und 60 Jahren. Symptomatisch kommt 

es zu Schlaflosigkeit, traumähnlichen Episoden und Gedächtnisschwund sowie zu autonomen 

und motorischen Störungen. Histopathologisch sind Ablagerungen der pathologischen Form 

des Prion-Proteins gering ausgeprägt oder fehlen ganz (AGUZZI 2002). Genetisch lässt sich 

bei allen Patienten an dem PrP-Gen an Position 178 eine Punktmutation nachweisen, bei der 

Aspartat zu Asparagin mutiert ist (PRUSINER 1998). 

9


2.1.3.4 Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) 

Das Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) wurde 1928 erstmals von 

GERSTMANN beschrieben (GERSTMANN 1928). Die Inzidenz liegt weltweit bei 1:10 8 

Erkrankungen pro Einwohner und Jahr. Das Erkrankungsalter wird mit durchschnittlich 

40 Jahren angegeben. Die Erkrankung dauert etwa fünf Jahre. Klinisch sind spinozerebelläre 

Ataxie mit Blickparesen, Pyramidenbahnzeichen und Demenz zu beobachten. 

Histopathologisch sind im Kleinhirn und im Großhirn multizentrische, plaqueartige 

Ablagerungen der pathologischen Form des Prion-Proteins nachweisbar (AGUZZI 2002). 

Genetische Ursache der Erkrankung ist eine Punktmutation im Codon 102 in einem der 

PRNP-Allele, bei der Prolin zu Leucin wird (HSIAO et al 1989). Später wurden noch andere 

Mutationen im PRNP-Leseraster gefunden, die GSS auslösen (HSIAO et al. 1992; AGUZZI 

2002). 

2.1.3.5 Neue Variante der Creutzfeld-Jakob Erkrankung (vCJD) 

Die neue Variante der CJD (vCJD) ist der vierte Typ der CJD (COLLINGE et al. 1996; HILL 

et al. 1999). Die Erstbeschreibungen dieser Erkrankung fanden 1995 durch BRITTON et al. 

und BATEMAN et al. sowie 1996 durch WILL et al. im Vereinigten Königreich (BATEMAN 

et al. 1995; BRITTON et al. 1995; WILL et al. 1996) und kurze Zeit später in Frankreich 

durch CHAZOT et al. statt (CHAZOT et al. 1996). vCJD kommt bisher nur in Ländern vor, in 

denen auch BSE auftritt und wurde zeitlich versetzt zur BSE am häufigsten in Großbritannien 

diagnostiziert (STOLTENBURG-DIDINGER 2002). Im Unterschied zur cCJD betrifft die 

vCJD junge Menschen. Bisher bekannt gewordene klinische Fälle traten im Alter zwischen 12 

und 52 Jahren auf (COUSENS et al. 1999). Im Gegensatz zur cCJD stehen bei der vCJD 

klinisch zunächst Persönlichkeitsstörungen oder Psychosen im Vordergrund. Im späteren 

Krankheitsstadium kommen Demenz, Dysästhesie und Ataxie hinzu (FEIDEN 1998; 

AGUZZI 2002). Bei der vCJD sind keine charakteristischen EEG-Veränderungen 

nachweisbar. Die Erkrankungsdauer scheint im Vergleich zu den cCJD verlängert zu sein, da 

der Tod der Patienten durchschnittlich nicht nach etwa 12 Monaten, sondern erst nach 14 

Monaten eintritt (KRETZSCHMAR et al. 1996). Histopathologisch zeigt sich bei den 

plaqueartigen Ablagerungen der PrP SC bei der vCJD eine Besonderheit: um die plaqueartigen 

Ablagerungen findet sich ein Ring aus spongiformen Veränderungen, die man aufgrund der 

blumenartigen Form „floride Plaques“ nennt (WILL u. ZEIDLER 1996; DORMONT 2002). 

10


Genetisch weisen alle Patienten mit vCJD eine Homozygotie für Methionin im Codon 129 des 

PrP-Genes auf. Versuche mit transgenen Mäusen, die humanes PrP exprimieren, dass an 

Codon 129 homozygot für Methionin ist, zeigen den neuropathologischen und molekularen 

Phänotyp von vCJD, unabhängig davon, ob die Mäuse mit BSE- oder vCJD-Prionen infiziert 

worden sind (ASANTE et al. 2002). 

Zur Zeit wird diskutiert, dass der Eintrag von erregerhaltigen Rohstoffen in den 

Lebensmittelkreislauf eine Ursache für vCJD sein kann (WILL et al. 1996; BONS et al. 1997, 

1999; COULTHART u. CASHMAN 2001; HILDEBRANDT et al. 2001). Hinweise darauf 

geben (a) das zeitlich versetzte Auftreten von BSE bei Rindern und vCJD beim Menschen in 

Ländern mit hoher BSE-Inzidenz (COUSENS et al. 2001), (b) die TSE-Infektiosität boviner 

Gewebe im Bioassay (FRASER u. FOSTER 1994; WELLS et al. 1998, 1999; 

HILDEBRANDT et al. 2001), (c) die biologische und biochemische Typisierung der 

einzelnen TSE-Stämme (COLLINGE et al. 1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997; 

SCOTT et al. 1999), (d) die Ähnlichkeit des Glykolysierungsprofils und des 

Molekulargewichts des unverdauten Restes der pathologischen Form des Prion-Proteins 

(PrP RES ) zwischen der BSE-Form und der vCJD-Form (BRUCE et al. 1993, 1994, 1997; 

COLLINGE et al. 1996; HILL et al. 1997; MCLEAN et al. 1998; IRONSIDE et al. 2000; 

BUDKA et al. 2002) sowie (e) die Ähnlichkeit der Pathologie von vCJD und sekundär 

passagierten BSE (LASMÉZAS et al. 1996, 2001; WILL et al. 1996, 2000; ZEIDLER et al. 

2000). 

11


2.2 Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE 

Die bisher ergriffenen Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE haben das Ziel die 

Kontamination der Tierkörper und damit den Eintrag von möglichem BSE-Risikomaterial in 

die humane Nahrungskette soweit wie möglich zu verhindern. Deswegen werden folgende 

Schutzmaßnahmen zur Prävention der weiteren Verbreitung von BSE und BSE-Erregerhaltigem 

Material durchgeführt: 

(a) Lückenlose Erfassung der Herkunft der Rinder (nach CONRATHS et al. 2002); 

(b) Anzeigepflicht der Erkrankung (EU 1990); 

(c) Verfütterungsverbot von proteinhaltigen Erzeugnissen und Fetten aus Gewebe 

warmblütiger Landtiere und von Fischen an alle landwirtschaftlichen Nutztiere, die 

der Lebensmittelgewinnung dienen. Dieses Verbot gilt nicht für Milch- und 

Milcherzeugnisse sowie für proteinhaltige Erzeugnisse und Fette aus Geweben von 

Fischen, die an Fische verfüttert werden sollen (ANONYM 2000a; EU 2000b, 2001, 

2002b); 

(d) Beschränkungen und Verbote des innergemeinschaftlichen Verbringens von lebenden 

Tieren und Erzeugnissen tierischen Ursprungs gemäß der Verordnung (EG) Nr. 

999/2001 (EU 2001b, 2002a); 

(e) Durchführung von BSE-Schnelltests bei über 24 Monate alten Rindern aus normaler 

Schlachtung (ANONYM 2000b, 2001a; EU 2000c) sowie bei über 24 Monate alten 

Rindern, die aus besonderen Anlass not- oder krankgeschlachtet werden, und 

stichprobenweise bei über 24 Monate alten Rindern, die verendet sind oder getötet 

wurden (EU 2001b); 

(f) Durchführung von stichprobenartigen BSE-Schnelltests bei über 18 Monate alten, zum 

menschlichen Verzehr und nicht zum menschlichen Verzehr geschlachteten Schafe 

und Ziegen (EU 2001b); 

(g) Epidemiologisches Überwachungsprogramm mit möglicher Tötung bei Erkrankungen 

mit Störungen des ZNS zu diagnostischen Zwecken (EU 1998, 2001d, 2002a); 

(h) Nach Feststellung von BSE die in der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 Maßnahmen 

hinsichtlich der amtlichen Schlachttier- und Fleischuntersuchung sowie der 

Untersuchung verendeter oder getöteter Rinder durchzuführen (EU 2001b); 

(i) Entfernung und Vernichtung von spezifizierten Risikomaterial (SRM) (ANONYM 

2000b, 2001b; EU 1990a, 1995, 1999, 2001c; 2002c); 

(j) Änderung tierkörperbeseitigungsrechtlicher Vorschriften (ANONYM 2000c) 

12


(k) Maßnahmen im Rahmen des Arbeitsschutzes, wie z.B.: Empfehlungen für den 

Umgang mit SRM bei der epidemiologischen Überwachung und Untersuchung der 

Verdachtsfälle sowie spezielle Schutzmaßnahmen für die Beschäftigten (ANONYM 

2001c, 2001d); 

(l) Tierkörper und Teile von Tierkörpern verendeter oder nicht zum Zwecke der 

Gewinnung von Lebensmitteln getöteter Tiere nicht zur Herstellung von Futtermitteln 

für Tiere, die zur Gewinnung von Lebensmitteln bestimmt sind, zu verwenden (EU 

2001a, 2001e, 2001f,; ANONYM 2001); 

(m) Regeln hinsichtlich des Handels und der Einfuhr mit lebenden Schafen und Ziegen 

(EU 2003a, 2003c) sowie der Züchtung von TSE-resistenten Schafen (EU 2003b) 

(n) Überprüfung der Fertigerzeugnisse hinsichtlich möglicherweise erhaltener 

Gewebeanteile des ZNS (LÜCKER et al.1999). 

Die zur Zeit bei dem BSE-Screening angewandten Tests (BSE-Schnelltests, EU 2000a) 

verwenden zum Nachweis des PrP SC den caudalen Obexbereich und die Medulla oblongata, 

die am abgetrennten Rinderkopf durch das Foramen magnum entnommen werden (OIE 

2000). Aus diesen Regionen ist bei den meisten an BSE erkrankten Rindern in einem frühen 

Stadium der Erkrankung die höchste Konzentration an akkumulierten PrP SC nachweisbar 

(WELLS et al. 1989; VAN KEULEN et al. 1995; GROSCHUP u. STOLZE 2002). Die 

nachfolgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die zur Zeit verfügbaren BSE-Schnelltests, 

die in den Testsystemen angewandte Methode und die Dauer der Durchführung bis zum 

Erhalt der Ergebnisse (nach MOYNAGH et al. 1999). 

13


Tabelle 1: BSE – Schnelltests 

Name Firma Vertrieb Methode 

Commisseriat á 

Sandwich-ELISA 

Capture ELISA 

lÉngerie 

Atomique (CEA) 

BioRad 

(München) 

mit monoklonalen 

Antikörper, 

(Frankreich) 

Dauer: 7-8 h 

Western Blot mit 

Prionics Check 

Prionics AG 

Roche Diagnostic 

monoklonalen 

Testkit 

(Schweiz) 

(Mannheim) 

Antikörper; 

Dauer: 7-8 h 

Chemiluminescent- 

ELISA Test 

Enfer Technology 

Ltd. (Irland) 

Abbott GmbH 

(Wiesbaden) 

ELISA mit 

polyklonalen 

Antikörper; 

Dauer: ca. 4 h 

So verwendet der Capture ELISA zum Nachweis von PrP RES einen Sandwich-ELISA mit 

monoklonalen Antikörpern. Die Durchführung des Tests bis zum Erhalt der Ergebnisse dauert 

7 – 8 Stunden (Tabelle 1). Die gleiche Zeit wird auch bei dem Prionics Check Testkit 

gebraucht, um PrP RES mittels eines Westernblot mit monoklonalen Antikörpern nachzuweisen 

(Tabelle 1). Bei dem ELISA Test wird ein Chemiluminescent-ELISA verwendet, um PrP RES 

nachzuweisen. Die Durchführung dieses Tests benötigt vier Stunden (Tabelle 1). 

An der Entwicklung von BSE-Schnelltests wird auch weiterhin geforscht. Das Institut für 

Referenzmaterialien und –messungen (IRMM) hat im März 2003 BSE-Schnelltests folgender 

Firmen dem Evaluierungsverfahren unterzogen: ID Lelystad (Niederlande), PerkinElmer Life 

Sciences (UK), Prionics A.G. (Schweiz), University of California in San Francisco (USA) 

und MRC Prion Unit, Imperial College (UK) (IRMM 2003). Das Scientific Steering 

Committee (SSC) hat im März 2003 zwei BSE-Tests der Firmen Prionics (Schweiz, „LIA 

Test“) und InPro („CDI Test“) zugelassen (SSC 2003). 

14


Die Diagnose der BSE-Schnelltests wird im positiven Fall mit folgenden zugelassenen 

Diagnostikmethoden des Internationalen Tierseuchenamts überprüft (nach GROSCHUP u. 

STOLZE 2002): 

(a) OIE-Western Blot: vor dem eigentlichen Western Blot werden die von PrP SC gebildeten 

Scrapie-assoziierten Fibrillen aufwendig präpariert (DIRINGER et al. 1997), so dass die 

Sensitivität dieses Testes höher ist, als die der BSE-Schnelltests; 

(b) immunhistochemische Untersuchung histologischer Präparate: Detektion des PrP SC mittels 

des PrP-spezifischen monoklonalen Antikörper (SCHALLER et al. 1999); 

(c) histopathologische Untersuchung: Nachweis der charakteristischen Gehirngewebeläsionen 

(WELLS et al. 1987; EHRENSPRINGER u. VANDEVELDE 1998), zu denen die 

spongiformen Veränderungen (WELLS et al. 1989, 1995; LIBERSKI et al. 1992a), die 

Vakuolenbildung in den neuronalen Perikarya (FRANKHAUSER et al. 1972; LIBERSKI et 

al. 1992a, 1992b) und die Gliose (Astrozytose) gehören (ZLOTNIK 1958; WELLS et al. 

1987, 1989); 

(d) elektronenmikroskopische Darstellung aufgereinigter SAF (MERZ et al. 1984; WELLS et 

al. 1987; SCOTT et al. 1990, 1991). 

Eine weitere Möglichkeit zur Abklärung von BSE ist der Mäuse-Inokulationstest, bei dem 

Mäusen möglicherweise infiziertes Gewebematerial, meist Gehirngewebe, intracerebral 

verabreicht wird und im Fall der Erkrankung der Mäuse BSE nachgewiesen wird. Diese Tests 

sind aufgrund der langen Inkubationszeiten von 250 bis 300 Tagen sehr aufwendig und 

werden deswegen überwiegend zu Forschungszwecken eingesetzt (GROSCHUP u. STOLZE 

2002). 

Mittels Mäuseinokulationstests und der Messung von Scrapietitern ließ das Scientific Steering 

Committee (SSC) die potentielle BSE-Infektiosität der Organe von Rind, Schaf und Ziege 

untersuchen (SSC 1999). Die nachfolgende Tabelle 2 gibt einen Überblick über die hoch-, 

mittel- und geringgradig infektiösen Gewebe bei Rind, Schaf und Ziege, von denen in Fall 

einer BSE-Erkrankung eine Infektiosität ausgehen kann (nach Hildebrandt et al. 2001): 

15


Tabelle 2: potentielle BSE-Infektiosität verschiedener Gewebe 

Infektiosität Schaf, Ziege Rind 

Hoch 

Mittel 

Gering 

Gehirn, Rückenmark, 

Gehirn, Rückenmark, 

Augen, 

Augen, 

Paravertebralganglien, 

Paravertebralganglien, 

Wirbelsäule, Dura mater, 

Wirbelsäule, Milz, Kopf 

Hypophyse, Kopf ohne 

ohne Zunge, Lunge 

Zunge, Lunge 

Darm von Duodenum bis Rektum, Mandeln, Placenta, 

Uterus, foetales Gewebe, Nebenniere, 

Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphknoten 

Leber, Pankreas, Thymus, 

Knochenmark, 

Röhrenknochen, 

Nasenschleimhaut, 

periphere Nerven 

„Auf der Grundlage der TSE-Pathogenese und des Seuchenstatus des Herkunfts- oder 

Haltungslandes“ werden „bestimmte Wiederkäuergewebe“, die ein Infektionsrisiko aus 

tierseuchenrechtlichen Gründen für andere Tiere und aus verbraucherschutzrechtlichen 

Gründen für den Menschen darstellen können, „als SRM ausgewiesen“ (EU, 2001c, L 147/2). 

Zu diesen sogenannten SRM (ANONYM 2000b, 2001b; EU 2001c; LÜCKER et al. 2001) 

zählen „Schädel, einschließlich Hirn und Augen, Tonsillen, Wirbelsäule ausschließlich der 

Schwanzwirbel, aber einschließlich der Spinalganglien und des Rückenmarks von über zwölf 

Monate alten Rindern sowie der Darm von Duodenum bis Rektum und das Mesenterium von 

Rindern jeden Alters“ und weiterhin „Schädel einschließlich Gehirn und Augen, Tonsillen 

und Rückenmark von Schafen und Ziegen, die über zwölf Monate alt sind oder bei denen ein 

bleibender Schneidezahn das Zahnfleisch durchbrochen hat und die Milz von Schafen und 

Ziegen aller Altersklassen“ (EU 2002, L45/12). 

16


2.3 Mögliche Exposition des Menschen mit BSE-Erreger-haltigem Gewebe 

und Maßnahmen zum vorbeugenden Verbraucherschutz 

Die Kontrolle der Lebensmittel und die Überwachung der Lebensmittelherstellung ist wichtig 

für den Verbraucherschutz und die Lebensmittelindustrie, die aus wirtschaftlichen Gründen 

auf das Vertrauen der Verbraucher in ihre Produkte angewiesen ist (ANKLAM u. 

BATTAGLIA 2001). Lebensmittelqualität und Lebensmittelsicherheit sind eng miteinander 

verbunden. Im Umgang mit Lebensmitteln ist eine zuverlässige Risikoeinschätzung wichtig 

für ein angemessenes Risikomanagement (ANKLAM u. BATTAGLIA 2001). Jedoch werden 

Lebensmittel aus Kostengründen bestimmte unerwünschte Zutaten zugesetzt oder verfälscht, 

die dann bei sehr fein zerkleinerten Produkten durch histologische Methoden nur sehr schwer 

detektierbar sind (LUMLEY 1996; MILLER 1991). Dies gilt im Besonderen auch für ZNS- 

Material, das zu den SRM gehören kann (WENISCH et al. 1999; LÜCKER et al. 2001). Im 

Hinblick auf den vorbeugenden Verbraucherschutz ist die mögliche Gefährdung der humanen 

Gesundheit durch Aufnahme von TSE-Erreger-haltigem Material zu beachten. Mögliche 

Gefahren gehen von kontaminierten Fleisch und Fleischerzeugnissen, Arzneimitteln (EU 

2002d) und der Arbeit mit erregerhaltigem Material (ANONYM 2001c, 2001d) aus. 

2.3.1 Kontamination von Schlachtprodukten mit ZNS-Gewebe 

Untersuchungen zur Kontamination der Gewebe des Rindes mit bovinem ZNS-Gewebe 

während des Schlachtprozesses haben ergeben, dass diese nicht ausgeschlossen werden kann 

(LÜCKER et al. 2002). Es ist durchaus möglich, dass Fleisch während der Schlachtung mit 

ZNS-Gewebe verunreinigt wird (KELLY et al. 2000, BROWN et al. 2001). Mehrere Studien 

haben gezeigt, dass mechanische Einwirkung, wie z.B. durch verschiedenste 

Bolzenschussgeräte (SCHMIDT et al. 1999), ZNS-Gewebe zerreißen kann und somit Emboli 

aus Gehirngewebe in die Blutbahn gelangen können (BAUER et al. 1996; GARLAND et al. 

1996; SCHMIDT et al. 1999; HORLACHER et al. 2002). In einer Studie mit Pseudomonas 

fluorescens als Marker-Organismus für die Verteilung der ZNS-Emboli im Schlachttier wurde 

ZNS-Gewebe im Blut, den Organen und in der Muskulatur nachgewiesen. Die Verteilung des 

Marker-Organismus im Schlachttier fand besonders nach dem Bolzenschuss, dem Entbluten 

und der Teilung des Schlachtkörpers statt (DALY 2002). Ein Kontaminationsrisiko besteht 

somit bei Blut, Lunge, Arteria pulmonaris sowie rechtem Atrium und Ventrikel des Herzens 

(SSC 2001, 2002). Dennoch ist die Menge der entstandenen Emboli sehr gering (ANIL et al. 

17


1999, 2002; LÜCKER et al. 2002). Die Menge an ZNS-Gewebe, die möglicherweise beim 

Endverbraucher in Fleisch und Fleischerzeugnissen vorkommt, wird durch die weiteren 

nachgelagerten technologischen Prozeduren in der Lebensmittelkette sowie von 

Konsumgewohnheiten der Endverbraucher sehr beeinflusst (LÜCKER et al. 2002). Die 

Gewebe, die im Falle einer TSE-Erkrankung potentiell eine hohe TSE-Erregerdichte 

aufweisen können, werden als SRM bezeichnet. Diese Gewebe von Rindern, Schafen und 

Ziegen müssen unschädlich entsorgt werden und dürfen nicht in die Lebensmittel- sowie 

Futtermittelkette gelangen (EU 2001b, 2002), da von diesen Geweben im Fall einer Infektion 

eine hohe Gefahr der TSE-Verbreitung ausgehen kann (EU 1997, 2000b, 2001b). Im 

Tierexperiment an Mäusen hat sich 0,5 g ZNS-Gewebe als minimale Infektionsdosis für eine 

intrazerebrale Infektion herausgestellt (MAIGNIEN et al. 1999). 

Nach der Spaltung der Tierkörper in Hälften mit einer Bandsäge konnten ZNS-Gewebeteile 

auf der Tierkörperoberfläche, dem Auffangschalenwasser und den Schürzen des 

Schlachtpersonals gefunden werden (HELPS et al. 2001). Bisher ist bereits die Anwendung 

von Rückenmarkszerstörern untersagt (EU 2000). Neue Methoden der Tierkörperteilung sind 

zur Zeit in der Erprobungsphase (TROEGER 2001). 

Weiterhin ist Fleisch, dass von Tieren einer Kohorte aus einem Bestand mit einem amtlichen 

BSE-Fall stammt, nach §17 (1) 1 des LMBG als ein nicht zum Verzehr geeignetes 

Lebensmittel zu erklären und zu beschlagnahmen (ANONYM 1994). Für die weitere 

Reduktion des Eintrages an SRM in die Nahrungsmittelkette während der Schlachtung wird 

folgendes für die Zukunft empfohlen (nach SCHÜTT-ABRAHAM 2002): 

(a) den gesamten Kopf, Blut, Lunge und Herz zu SRM zu erklären, wenn bei der 

Schlachtung ein penetrierendes Bolzenschussgerät verwendet wird (BgVV 2001a); 

(b) die Zunge nur dann als Lebensmittel zu verwenden, wenn sie hygienisch entnommen 

werden konnte und auf die Außen- und Innenwäsche des Kopfes verzichtet wurde 

(BgVV 2001b); 

(c) Verzicht auf die Längsspaltung der Tierkörper im Schlachtbetrieb (BgVV 2001c); 

(d) Darmkonvolut inklusive Darmgekröse bei Rindern jeden Alters als SRM zu 

betrachten (BgVV 2001d), da auch im Darm von oral infizierten Kälbern sechs 

Monate nach der Applikation BSE-Infektiosität nachgewiesen werden konnte 

(WELLS et al. 1994); 

18


(e) alle Geräte und Einrichtungen, die mit BSE-positiven Tieren in Berührung gekommen 

sind, als kontaminiert anzusehen. Dieses gilt besonders für die Geräte, die zur 

Betäubung (Bolzenschussgerät), zum Absetzen und zur Bearbeitung des Kopfes, zum 

Längsspalten der Wirbelsäule und zum Herauslösen des Rückenmarks verwendet 

werden (BgVV 2001b). 

2.3.2 Verwendung von ZNS-Gewebe und ZNS-Gewebe haltigem Rohmaterial bei der 

Herstellung von Fleischerzeugnissen 

ZNS-Gewebe kann durch den Einsatz von Hartseparatorenfleisch und die Verwendung von 

Gehirngewebe über die Verarbeitungstechnologie in Fleischerzeugnisse gelangen. 

Hartseparatorenfleisch ist mechanisch von Knochengewebe befreites Restfleisch. Dieser 

Rohstoff wurde anstelle von sehnenreichem Rindfleisch bei Brüh- und Kochwürsten sowie 

streichfähigen Rohwürsten eingesetzt (HILDEBRANDT et al. 2001). Da in der 

Vergangenheit Hartseparatorenfleisch aus Rinderwirbelknochen verwendet wurde, ist nun der 

Schädel, d.h. der Kopfknochen ohne Unterkiefer und Zunge einschließlich Gehirn und Augen, 

die Mandeln sowie das Rückenmark von über 12 Monate alten Rindern zu Konfiskat erklärt 

worden, dass in der Tierkörperbeseitigungsanstalt entsorgt werden muss (ANONYM 2003). 

Ebenso dürfen Rückenwirbel und Röhrenknochen nicht der maschinellen 

Restfleischgewinnung zugeführt werden (EU 2000). Zudem muss die Verwendung von 

Separatorenfleisch in der Zutatenliste der Fleischerzeugnisse kenntlich gemacht werden 

(z.B.:„mit Schweineseparatorenfleisch“) (EU 2001g, 2002d). 

Innereien, wie u.a. das Gehirn sind gute Emulgatoren und wurden bei der Herstellung von 

Leberwurst einfacher Qualität häufig verwendet (HILDEBRANDT et al. 2001). Laut den 

Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches war die 

Verwendung von Gehirngewebe in regionalen Wurstspezialitäten erlaubt, wie z.B. bei der 

Bregenwurst (ANONYM 1998). Allerdings wurde wegen der leichten Zugänglichkeit bei der 

Schlachtung hauptsächlich Schweinegehirn verwendet. Seit der Änderung der Leitsätze für 

Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches im Oktober 2001 ist die 

Verwendung Hirn, Rückenmark, Bries, Milz, mit Ausnahme von Schweinemilz, 

Schweinemicker und Speiseröhre zur Herstellung von Fleischerzeugnissen verboten 

(ANONYM 2001e). Durch den Verkauf von bovinem Fettgewebe an Fettschmelzen kann 

aber nicht ausgeschlossen werden, dass vor der Änderung der Leitsätze für Fleisch und 

19


Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches, Lebensmittel mit Fettfraktionen aus 

Rindergehirn hergestellt worden sind (HILDEBRANDT et al., 2001). 

Es bestehen viele Möglichkeiten, dass möglicherweise TSE-Erreger-haltiges Material 

beabsichtigt und unbeabsichtigt in die Lebensmittel- sowie Futtermittelkette gelangt. 

Aufgrund der Tatsache, dass vCJD sehr wahrscheinlich mit BSE assoziiert ist (ALMOND u. 

PATTISON 1997), erscheint es wichtig, insbesonders ZNS-Gewebe in Lebensmitteln 

detektieren zu können (LÜCKER et al. 1999, 2001; EU 2001b). Deswegen ist es hinsichtlich 

des vorbeugenden Verbraucherschutzes und zur Verhinderung der weiteren Ausbreitung von 

TSE von großer Bedeutung, derartige Tests zu entwickeln (WEYANDT 2001). 

Eine chronologische Übersicht über die Gemeinschaftsvorschriften bezüglich BSE ist bei der 

EU unter der Adresse http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/legislation_de.hmtl abrufbar 

(EU 2003). 

20


2.4 Methoden zur Detektion von ZNS in Fleisch- und Fleischerzeugnissen 

Als mögliche Markersubstanzen für das ZNS-Gewebe eignen sich Stoffwechselprodukte, 

Struktur- und Stoffwechselproteine sowie Produkte der gewebespezifischen Genexpression. 

Die Markersubstanzen sollten spezifisch für das ZNS-Gewebe, hitzestabil und für mögliche 

Detektions-Tests gut verfügbar sein. Zu den Stoffwechselprodukten, die als Marker für ZNS 

eingesetzt werden, gehören (a) die Nervonsäure, die zu den Glykosphingolipiden gehört und 

in der weißen Substanz des ZNS zu finden ist (ANONYM 1994a) sowie (b) das Cholesterin, 

einem einwertigen hydroaromatischen Kohlenwasserstoff, der Baustein von Membranen ist 

und im Nervensystem besonders reichlich vorkommt (LÜCKER u. BÜLTE 1997). Die 

neuronenspezifische Enolase, die an der aeroben Glykolyse beteiligt ist und als γγ-Enolase im 

ZNS und in neuroendokrinen Zellen zu finden ist (LÜCKER et al. 1998), ist als Enzym am 

Stoffwechsel des ZNS beteiligt. Zu den Strukturproteinen gehören (a) die Gruppe der 

Intermediärfilamente in den Axonen, zu denen das GFAP, Vimentin, sowie Neurofilamente 

gehören (FUCHS u. CLEVELAND 1998), (b) das basische Myelinprotein, das Bestandteil 

des Myelins ist (LÜCKER et al. 2002a), (c) das Tau-Protein (AUPPERLE et al. 2002), das an 

die Mikrotubuli bindet sowie (d) das S100- und S100L-Protein (AUPPERLE et al. 2002). Bei 

den Zwischenprodukten der spezifischen Genexpression wird zur Zeit die mRNA der ZNSspezifischen 

Proteine GFAP (LANGE et al. 2002; SEYBOLDT et al., 2003) und basischen 

Myelinproteins (LANGE et al. 2002) genutzt. 

2.4.1 Nachweis ZNS-spezifischer Fettsäuren und Cholesterin 

2.4.1.1 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Methode (GC-MS) 

Bei dieser Methode werden gehirnspezifische Fettsäureprofile mittels der 

Gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode (GC-MS) identifiziert 

(NIEDERER u. BOLLHALDER 2001). Nach Extraktion der Gesamtlipide und Aufreinigung 

durch Festphasenextraktion, findet eine säurekatalysierte Umesterung zu 

Fettsäuremethylestern (FAME) sowie Trennung, Identifizierung und Quantifizierung mittels 

GC-MS statt. Durch die charakteristischen Verhältnisse der cis- und trans-Isomeren der 

Nervonsäure können die Tierarten Rind, Schaf und Schwein voneinander unterschieden 

werden. In Referenzwürsten mit unbekanntem Nervengewebe ist die Tierartenunterscheidung 

bis zu einem ZNS-Gewebe-Anteil von 0,05 % möglich. Ohne Tierartenunterscheidung liegt 

21


die Nachweisgrenze von ZNS-Gewebe in Referenzwürsten bei < 0,01 % (NIEDERER u. 

BOLLHALDER 2001). 

BIEDERMANN et al. (2002) vereinfachten das oben genannte GC-MS-Verfahren von 

NIEDERER u. BOLLHALDER (2001), indem aus den Gesamtlipiden zunächst die Fraktion 

der Sphingolipide (SL) abgetrennt und dann aufgereinigt zu Methylestern derivatisiert wurden 

(BIEDERMANN et al. 2002). LÜCKER et al. (2002b) verbesserten das Verfahren von 

NIEDERER u. BOLLHALDER (2001) nochmals, indem für die Extraktion der Gesamtlipide 

ein Chloroform-Methanol-Gemisch von 2:1 statt eines Hexan-Aceton-Gemisches verwendet 

wurde. Zudem wurde zur massenspektrometrischen Detektion der FAME ein anderes 

Verfahren angewandt, um die Empfindlichkeit zu steigern (LÜCKER et al. 2002b). Die trans- 

Nervonsäure (C 24:1c/t) zeigte die größten Unterschiede zwischen den einzelnen Tierarten 

Rind, Kalb, Schaf, Schwein und Pute. Zur besseren Unterscheidung der Tierarten Kalb und 

Schaf sowie Schwein und Pute wurde der Nachweis der Lignocerinsäure in das Verfahren 

integriert. Da das Verhältnis der cis/trans-Nervonsäure (C 24:1c/t) mit dem Alter zunimmt 

und beim adulten Rind am höchsten ist, konnte zwischen Kalb und adulten Rind 

unterschieden werden. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass das Verhältnis der cis/trans- 

Nervonsäure (C 24:1c/t) durch herstellungstechnische Parameter beeinflusst wird. Für den 

Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen (Brühwurst) erwies sich die 

Cerebronsäure (C 24 OH) als geeignetster Marker, da die Nachweisgrenze für Rindergehirn in 

Fleischerzeugnissen bei 0,2 % Gehirngewebegehalt lag (LÜCKER et al. 2002b). 

2.4.1.2 Nachweis von Cholesterin 

Als eines der ersten Verfahren zur Detektion von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen gilt die 

enzymatisch-photometrische Bestimmung des Cholesteringehaltes (LÜCKER u. BÜLTE 

1997). Cholesterin weist jedoch keine absolute Spezifität für das ZNS auf, da z.B. der 

Cholesteringehalt von Eidotter dem Cholesteringehalt des ZNS sehr ähnlich ist. Zudem trägt 

die unterschiedliche Verteilung von Cholesterin im Rindergehirn (RUNQUIST et al. 1995) 

und in pflanzlichen Inhaltsstoffen zu der Variabilität der Testergebnisse bei (LÜCKER et al. 

1999). Dennoch können mit Cholesterin-Bestimmung im Rahmen eines schnellen Screening- 

Verfahrens Zusätze von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen ab 2 % detektiert werden 

(LÜCKER u. BÜLTE 1997). 

22


Neben dem bereits verfügbaren enzymatischen Nachweisverfahren für Cholesterin, wird zur 

Zeit an einem gaschromatographischen Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin geforscht 

(LÜCKER u. SCHLOTTERMÜLLER 2001a). Dieses Verfahren basiert auf der amtlichen 

Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG für Eier und Eiprodukte. 

2.4.2 Immunchemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe 

2.4.2.1 Nachweis der neuronenspezifischen Enolase (NSE) 

Bei diesem Verfahren von LÜCKER et al. (1998) handelt es sich um den Nachweis der 

neuronenspezifische Enolase (NSE) aus ZNS-Gewebe, die auch gehirnspezifisches 14-3-2- 

Protein oder γγ-Enolase genannt wird, mittels mono- und polyklonaler Antikörper nach Fettund 

Proteinextraktion sowie SDS-Gel-Elektrophorese im Westernblot. Die Nachweisgrenze 

dieser Methode liegt bei 0,25 % ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen (Brühwurst). 

Bei der Detektion von ZNS-Gewebe in fettreichen Fleischerzeugnissen (z.B. Leberwurst) 

verringerte sich die Sensitivität dieser Methode erheblich. Durch die Reduktion des 

Fettgehaltes während der Probenpräparation ist diese Unsicherheit teilweise gelöst worden 

(LÜCKER et al. 1999, 2000a). Bei stark erhitzten Fleischerzeugnissen (120°C für 20 

Minuten) reduzierte sich die Immunoreaktivität von NSE und die Nachweisgrenze fällt auf 

2 % ZNS-Gewebe (AGAZZI et al. 2002). Durch die Verwendung eines anderen 

Extraktionsverfahrens und der Aufkonzentrierung der Proteinextrakte konnte die 

Empfindlichkeit des NSE-Westernblots auf die Detektion von ca. 0,01 % ZNS-Gewebe in 

erhitzten Fleischerzeugnissen erhöht werden (LÜCKER et al. 2000, 2000a). Möglicherweise 

falsch positive Ergebnisse durch das Vorhandensein von PNS sind zu beachten (LÜCKER et 

al. 2000a). Kommerziell ist dieses Verfahren als Weternblot-Testkit (NSE-Kit) der Firma 

ScheBo-Biotech (Gießen) erhältlich. Dieses Verfahren wurde mit dem oben genannten 

Cholesterin-Nachweisverfahren (LÜCKER u. BÜLTE 1997) gekoppelt und als Referenz- 

Nachweisverfahren (INV-intrgriertes Nachweisverfahren) evaluiert (LÜCKER et al. 1998, 

1999, 2000a). In einer Studie von OVERHOFF et al. (2002) konnte mittels des NSE- 

Westernblot natives ZNS-Gewebe der Tierarten Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, Gans, 

Huhn und Pute nachgewiesen werden. 

23


2.4.2.2 Nachweis des sauren Gliafaserproteins (GFAP) 

Bei dem Westernblot mit GFAP handelt es sich um das gleiche Testprinzip, das schon beim 

NSE-Westernblot angewandt wurde, mit dem Unterschied, dass hierbei GFAP als Marker für 

ZNS-Gewebe verwendet wird (LÜCKER et al. 2000). Bei dem GFAP Westernblot war die 

Sensitivität durch das Vorkommen unterschiedlicher Bandenanzahl sowie durch das Auftreten 

von nicht ZNS-spezifischen Banden herabgesetzt (LÜCKER et al. 2000). Mit dem GFAP- 

Westernblot konnte natives ZNS-Gewebe der Tierarten Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, 

Gans, Huhn und Pute nachgewiesen werden (OVERHOFF et al. 2002). 

Weiterhin kann GFAP mittels eines Enzymimmunoassays (Immunosorbent-ELISA) für 

GFAP nachgewiesen werden (SCHMIDT et al. 1999a). Dieser Test weist ZNS-Gewebe im 

Blut, Muskelgewebe und in Fleischprodukten mit einer Nachweisgrenze von 0,2 – 1 µg/ml 

nach. Durch die Verwendung einer fluoreszierenden Substanz (GFAP-F-ELISA) konnte eine 

Steigerung der Sensitivität um das 10 bis 30-fache im Vergleich zu dem Immunosorbent- 

ELISA erreicht werden (SCHMIDT et al. 2001). Eine Erhitzung auf 80°C für 20 Minuten und 

Zutaten bei der Herstellung der Fleischerzeugnisse beeinträchtigten den Nachweis der GFAP 

nicht. Bei stark erhitzten Fleischerzeugnissen (120°C für 20 Minuten) lag die Nachweisgrenze 

bei 0,5 % ZNS-Gewebe (AGAZZI et al. 2002). Der GFAP-Enzymimmunoassay ist 

kommerziell als GFAP-Kit (RIDASCREEN ® Risk Material ELISA) der Firma r-biopharm 

(Darmstadt) erhältlich. Mit diesem Test war der Nachweis von Gehirn-Gewebe ab 0,2 % in 

erhitzten und ab 0,1 % in rohen Fleischerzeugnissen gelungen. Somit stellt dieser Test eine 

Alternative zu dem INV dar (HORLACHER et al. 2002a). 

2.4.2.3 Nachweis weiterer Marker für ZNS-Gewebe 

LOVE et al. (2000) untersuchten in ihrer Studie einen Capture ELISA für Syntaxin 1B, um 

ZNS-Gewebe in Blut zu detektieren. Die Nachweisgrenze lag bei diesem Test bei 50 – 100 µg 

ZNS-Gewebe pro Milliliter Blut. Bei einer vergleichenden Untersuchung des Syntaxin- 

Capture-ELISA mit dem GFAP-F-ELISA hinsichtlich der Detektion von ZNS-Gewebe in 

erhitzten Fleischprodukten, konnte nachgewiesen werden, dass der Syntaxin-Capture-ELISA 

sich nicht für die Detektion von ZNS-Gewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen (80°C für 60 

Minuten) eignet, da der Gehalt an Syntaxin 1B in diesen Produkten unterhalb der 

24


Nachweisgrenze lag (SCHMIDT et al. 2001). Somit war mit dem Syntaxin-Capture-ELISA 

eine Detektion geringer Mengen an ZNS-Gewebe nicht möglich (SCHMIDT et al. 2001). 

OVERHOFF et al. (2002) untersuchten die Antikörper anti-GFAP (saures Gliafaserprotein), 

anti-NSE (Neuronenspezifische Enolase), anti-MBP (basisches Myelinprotein), anti-TAU 

(Tau-Protein), anti-S100 (S100-Protein), anti-S100L (S100L-Protein), anti-NF 

(Neurofilament), anti-Syntaxin und anti-Peripherin im Westernblot bezüglich ihrer Eignung 

Tierarten zu differenzieren und geringe Mengen an ZNS-Gewebe in nativen Wurstbrät sowie 

erhitzten Fleischerzeugnissen zu detektieren. Mit den Antikörpern für Tau und Peripherin 

konnte kein ZNS-Gewebe nachgewiesen werden. Mittels anti-MBP konnte Gehirngewebe der 

Tierarten Rind, Schaf, Ziege und Pferd spezifisch erfasst werden. Der Nachweis von ZNS- 

Gewebe in nativem Wurstbrät gelang mit den Antikörpern anti-GFAP, anti-NSE, anti-MBP 

und anti-Syntaxin. Mit anti-MBP wurde der Nachweis von ZNS-Gewebe in unterschiedlich 

erhitzten Fleischerzeugnissen (bis 125°C für 20 Minuten) erbracht. Bei der Erhitzung der 

Fleischerzeugnisse über 125°C nahm die Immunoreaktivität von MBP ab (OVERHOFF et al. 

2002). In der Studie von AUPPERLE et al. (2002) hingegen ergab die Verwendung der 

Antikörper für Neurofilamente, basisches Myelinprotein und Peripherin zur Detektion von 

ZNS-Gewebe im Westernblot keine aussagekräftigen Resultate. 

2.4.3 Immunhistochemische Detektionsverfahren von ZNS-Gewebe 

LOVE et al. (2000) untersuchten in ihren immunhistochemischen Arbeiten den Nachweis von 

ZNS-Gewebe-Emboli im Blut mittels Antikörpern gegen NSE, Mikrotubuli-assoziiertes 

Protein 2, NF, Synaptophysin, S100ß-Protein und GFAP. Der Nachweis des S100ß-Protein 

war in dieser Studie mit einer Nachweisgrenze für die Detektion von ZNS-Gewebe bei ca. 2 – 

4 µg/ml am sensitivsten. Da das S100ß-Protein jedoch auch in anderen Geweben als dem 

ZNS vorkommt, können falsch positive Ergebnisse bei der Detektion von ZNS-Gewebe nicht 

ausgeschlossen werden (LOVE et al. 2000). 

TERSTEEG et al. (2002) untersuchten immunhistochemische Färbemethoden mit vier 

verschiedenen Antikörpern, dem Anti-NF (Neurofilament), Anti-MBP (Myelin Basic 

Protein), Anti-GFAP (saures Gliafaserprotein) und Anti-NSE (neuronenspezifische Enolase) 

auf ihre Fähigkeit, ZNS-Gewebe von Schwein und Rind in unterschiedlich behandelten 

(rohen und auf 80°C bzw. 115°C für 60 Minuten erhitzten) Fleischprodukten zu detektieren. 

Bei dieser Studie erwies sich Anti-MBP als der geeignetste Antikörper, um ZNS-Gewebe in 

25


erhitzten Fleischprodukten zu detektieren (TERSTEEG et al. 2002). Bei der Verwendung des 

Antikörpers Anti-MBP lag die Nachweisgrenze bei 1 % bovinem ZNS-Gewebe und 5 % 

porcinem ZNS-Gewebe in moderat und stark erhitzten Fleischerzeugnissen. Bei der 

Verwendung von Anti-NF bei moderat und stark erhitzten Fleischerzeugnissen lag die 

Nachweisgrenze bei über 5 % bei porcinem ZNS-Gewebe sowie über 20 % bei bovinem 

ZNS-Gewebe. Mit Anti-NSE konnte nur natives ZNS-Gewebe von Schwein und Rind 

nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von Anti-GFAP konnte bei nicht erhitzten 

Fleischprodukten eine geringe Reaktion festgestellt werden. Zudem war eine Hintergrund- 

Färbung nachweisbar (TERSTEEG et al. 2002). 

In der immunhistologischen Studie von AUPPERLE et al. (2002) wurden Anti-NSE-, Anti- 

GFAP-, Anti-NF-, Anti-MBP- und Anti-Peripherin-Antikörper verwendet, um Nervengewebe 

in unterschiedlich erhitzten Fleischerzeugnissen nachzuweisen. Im zentralen Nervengewebe 

(ZNS) ergab die Verwendung von Anti- MBP beim Rind ein deutliches Detektionssignal, 

während im peripheren Nervengewebe (PNS) und im porcinem zentralen Nervengewebe ein 

schwaches bzw. kein Signal nachweisbar war. Im peripheren Nervengewebe ergab der 

Nachweis von Peripherin starke Detektionssignale. Das GFAP, NSE und NF konnten sowohl 

im peripheren als auch im zentralen Nervengewebe nachgewiesen werden. Somit konnte bei 

der Detektion von Peripherin zwischen ZNS und PNS unterschieden werden. In erhitzten 

Fleischerzeugnissen war der Nachweis von Peripherin sowie von GFAP und MBP nicht 

geeignet, um Nervengewebe zu detektieren. Der Nachweis von NSE eignete sich in dieser 

Studie nicht als Marker für die Detektion von Nervengewebe, da starke Hintergrundsignale 

vorhanden waren. Der Nachweis von NF eignete sich am besten als Marker für 

Nervengewebe, da schon Beimengungen von 1 % nachweisbar waren. Parallel war jedoch 

eine morphologische Untersuchung nötig, da NF auch bei PNS positive Signale ergab 

(AUPERLE et al. 2002; LÜCKER et al. 2002a). 

2.4.4 Direkter Nachweis von PrP SC 

In einer Studie von SCHLOTTERMÜLLER et al. (2002) wurde der direkte Nachweis von 

PrP SC in Fleischereierzeugnissen mittels eines kommerziell erhältlichen und für natives, 

bovines Gehirngewebe validierten immunometrischen PrP SC -Assays (BSE-Schnelltest) 

getestet. BSE-positives ZNS konnte in erhitzten Wurstwarenstandards bis zu einem Gehalt 

von 0, 25 % nachgewiesen werden. Im Vergleich mit anderen ZNS-Gewebemarkern, wie 

26


NSE (LÜCKER et al. 1999, 2000, 2001) und GFAP (SCHMIDT et al. 1999a; LÜCKER et al. 

2000) zeigte der Nachweis von PRP C eine geringe Korrelation mit den ZNS-Gewebe- 

Gehalten auf. Somit war PRP C im Gegensatz zu PrP SC , das in Fleischprodukten das 

Vorhandensein von BSE-Agens anzeigte, als Marker für den Nachweis von ZNS-Gewebe in 

Fleischerzeugnissen nicht geeignet (SCHLOTTERMÜLLER et al. 2002). 

2.4.5 Molekularbiologische Methoden zum Nachweis von mRNA 

Es sind zur Zeit zwei molekularbiologische Methoden zur Detektion von ZNS-Gewebe 

mittels eines mRNA-Nachweises durch RT-PCR bekannt. 

Bei der von LANGE et al. (2002) verwendeten Methode wurde die mRNA der Zielproteine 

GFAP und MBP nach Extraktion der Gesamt-RNA mittels RT-PCR nachgewiesen und als 

Marker für das Vorhandensein von ZNS-Gewebe in verschiedenen bovinen Geweben sowie 

Fleischerzeugnissen verwendet. Die Reinheit und Konzentration der Gesamt-RNA wurde 

photometrisch bestimmt und mittels der RT-PCR und nachfolgender 

Agarosegelelektrophorese eine mögliche DNA-Kontamination kontrolliert. Die verwendeten 

Oligonukleotidprimer-Paare waren „GFAP 87 “ und „MBP 51 “. Mit GFAP 87 gelang der 

tierartenunabhängige Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen. Der Nachweis der 

mRNA mittels MBP 51 war nur positiv für die Tierarten Rind, Schaf und Ziege gewesen. 

Somit eignete sich MBP als Marker zur Detektion von ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen 

(LANGE et al. 2002). Bei der Methode von SEYBOLDT et al. (2003) wird die mRNA des 

Zielproteins GFAP nach Extraktion der Gesamt-RNA mittels RT-PCR nachgewiesen und als 

Marker für das Vorhandensein von ZNS-Gewebe in Fleisch und Fleischprodukten verwendet. 

Die verwendeten Oligonukleotidprimer „GFAPforw“ und „GFAPrev“ binden an 

Exonregionen, die das Intron 3 umgeben, und amplifizieren ein 168 bp großes Fragment der 

GFAP-mRNA. Somit kann das GFAP-mRNA Fragment von der genomischen DNA des 

GFAP beim Rind unterschieden werden, die etwa 957 bp groß ist. Im Anschluss an die RT- 

PCR wird mittels des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus mit den 

Restriktionsenzymen Alu I, Hae III, Mbo I, Msp I und Sst I eine Tierartendifferenzierung 

durchgeführt. Die Untersuchungen des nativen Gewebes des Rindes ergaben bei 

zerkleinertem Herz-, Muskel- und Rückenmarkgewebe über den Zeitraum von sieben Tagen 

positive 168 bp große GFAP-mRNA Signale. Nach Einwirkung von Hitze (70°C, 20 min.) 

waren die Signale von Herz- und Muskelgewebe nicht mehr detektierbar. Mittels der 

27


verwendeten Restriktionsenzyme war eine Unterscheidung der ZNS-Gewebe der Tierarten 

Schaf, Rind, Pferd und der Tiergruppen Schwein und Wildschwein sowie Damwild, Rehwild 

und Rotwild möglich. In einem pasteurisierten Fleischproduktes aus zerkleinertem 

Muskelgewebe, das mit bovinem ZNS-Gewebe dotiert war, konnte bovines ZNS-Gewebe 

nachgewiesen werden (SEYBOLDT et al. 2003). Diese Untersuchungen bilden die Grundlage 

für die Anfertigung dieser Dissertation. 

28


2.5 Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) 

Das zur RT-PCR benötigte Enzym reverse Transkriptase, auch Revertase oder 

Umkehrtranskriptase genannt, ist eine RNA-abhängige DNA-Poymerase und natürlicher 

Bestandteil von Retroviren. Die reverse Transkriptase wird zur Umschreibung von RNA in 

komplementäre oder copy-DNA (cDNA) benötigt (NIEMANN 2000). 

Die so gebildete cDNA dient als Martize für die nachfolgende Polymerase Kettenreaktion 

(PCR). Die PCR wurde von MULLIS et al. (1986) entwickelt. Mittels der PCR kann in-vitro 

eine bestimmte DNA- oder RNA-Sequenz amplifiziert werden. Als Startpunkte für die DNA- 

Polymerase dienen zwei synthetische Oligonukleotide, die auch Primer genannt werden, 

welche die Zielsequenz flankieren und eine möglichst ähnliche Schmelztemperatur haben 

sollten (EHRLICH 1996). Die PCR besteht aus einer Folge von mehreren Zyklen. Ein Zyklus 

besteht aus drei Schritten. Zunächst wird die Zielsequenz durch Erwärmung denaturiert. 

Danach binden die Oligonukleotidprimer an die so gebildeten Einzelstränge der DNA 

(Annealing). Zuletzt werden bei der Extension durch die Polymerase die zur DNA-Matrize 

komplementären Nukleotide an die freie 3´-Hydroxylgruppe der Oligonukleotidprimer 

angehängt. So werden die Oligonukleotidprimer komplementär zur DNA-Matrize verlängert. 

Der neu gebildete DNA-Strang kann im nächsten Zyklus als Vorlage dienen. Durch die 

ständige Wiederholung der Zyklen kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der 

Zielsequenz, solange die Einzelkomponenten frei verfügbar sind. Wenn die 

Einzelkomponenten verbraucht sind, flacht die Kurve der Vermehrung ab und es stellt sich 

ein Gleichgewicht zwischen DNA-Denaturierung sowie Neubildung der Zielsequenz ein 

(EHRLICH 1996). 

Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode, um mRNA zu detektieren (CHEN et al. 1999; 

SCHRAMM et al. 1999). Die Sensitivität der Methode wird zum einen durch die Auswahl der 

Primer bestimmt (SAIR et al. 2002) und zum anderen können Inhibitoren die Sensitivität der 

RT-PCR beeinflussen (SAIR et al. 2002). Bei dem Nachweis von Viren in Lebensmitteln 

mittels RT-PCR wurden bereits viele Methoden, die den Einfluss von Inhibitoren 

berücksichtigen, untersucht (DREBOT u. LEE 1997; AGGARWAL u. MCCAUSTLAND 

1998; SHIEH et al. 1999; KOK et al. 2000; SAIR et al. 2002). 

29


2.6 Polymerase-Kettenreaktion-Restriktionsfragment- 

Längenpolymorphismus (PCR-RFLP) 

Heutzutage findet häufig eine Verfälschung mancher Lebensmittel statt, die durch 

verschiedenste Ursachen hervorgerufen wird, wie z.B.: (a) Verwendung von 

kostengünstigeren Zutaten (RAM et al. 1996; SEBASTIO et al. 2001), (b) Verwendung bzw. 

Kontamination der Lebensmittel mit im Hinblick auf BSE unerwünschten SRM-Materialien 

(LÜCKER et al. 2000a) und (c) die im Hinblick auf BSE unerwünschte Kreuzkontamination 

von Futtermitteln für Wiederkäuer mit Säugetierfleischmehl (BELLAGAMBA et al. 2001). 

Deswegen sind auf der Detektion von Nucleinsäuren basierende Methoden zur 

Tierartendifferenzierung wichtig geworden, die sich schnell und kostengünstig durchführen 

lassen sowie eine hohe Sensitivität und Spezifität besitzen (MEYER et al. 1995; MEYER u. 

CANDRIAN 1996; RAM et al. 1996; BELLAGAMBA et al. 2001; SEBASTIO et al. 2001). 

Die auf der DNA-Detektion basierenden Methoden haben den Vorteil, dass DNA stabil und 

ubiquitär in den Zellen (z.B. in Muskel oder Blut) vorhanden ist (nach WOLF et al. 1999). 

Aufgrund der evolutionären Veränderung der mitochondralen DNA (mtDNA) wird diese 

(besonders die mtDNA des Cytochrom b Gens) häufig zur Tierartenidentifizierung und 

-differenzierung verwendet. Somit sind mittels der mtDNA auch nah verwandte Tierspezies 

unterscheidbar (KOCHER et al. 1989; RAM et al. 1996; WOLF et al. 1999; CESPEDES et al. 

1998; BELLAGAMBA et al. 2001; QUINTEIRO et al. 2001; SEBASTIO et al. 2001). Die 

Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist in Kombination mit einer anschließenden 

Sequenzierung der PCR-Produkte zur Tierartendifferenzierung (BARLETT u. DAVIDSON 

1992) eine einfache, aber aufgrund der Sequenzierung auch teure Methode, die ihre Grenzen 

bei Lebensmitteln hat, die aus Zutaten vieler verschiedener Tierspezies bestehen 

(QUINTEIRO et al. 2001). Bei Einsatz von PCR-Restriktionsfragment- 

Längenpolymorphismus (PCR-RFLP) reicht oft eine Kombination einiger weniger 

Restriktionsenzyme aus, um in einem Gemisch von Zutaten verschiedener Tierarten diese im 

Einzelnen zu identifizieren (QUINTEIRO et al. 2001). 

Bei der Konservenherstellung kommt es zu einem Abbau der DNA, die eine Reduzierung der 

Länge der DNA-Fragmente zur Folge hat (RAM et al. 1996; CESPEDES et al. 1998; 

QUINTEIRO et al. 2001). In verschiedenen Studien waren die aufgereinigten DNA- 

Fragmente der mtDNA des Cytochrom b Genes noch lang genug (zwischen 150 bis 200 bp 

lang), um eine Tierartendifferenzierung mittels RFLP durchzuführen (RAM et al. 1996; 

30


CESPEDES et al. 1998; QUINTEIRO et al. 2001). Die verschiedenen Methoden zur 

Konservierung, wie Salzung und Einlegen in Öl, hatten in der Studie von SEBASTIO et al. 

(2001) keinen Einfluss auf die Tierartendifferenzierung mittels PCR-RFLP. Somit ist die 

PCR-RFLP eine genügend sensitive und spezifische Methode zur Tierartendifferenzierung 

und –identifizierung (SOTELO et al. 1993; RAM et al. 1996; CESPEDES et al. 1998; WOLF 

et al. 1999; BELLAGAMBA et al. 2001; QUINTEIRO et al. 2001; SEBASTIO et al. 2001). 

31


2.7 Stabilität der mRNA 

Der Prozess des mRNA Zerfalls ist ein wichtiger Kontrollpunkt bei der Regulation der 

Genexpression (GUHANIYOGI u. BREWER 2001). mRNA, die für reichlich vorhandene 

hoch-konservierte Proteine kodieren (ROSS 1995) oder bei denen die Translation zeitlich 

verlegt ist, wie z.B. bei Oozyten (SPIRIN 1994), sind selbst relativ stabil, während mRNA, 

die für Wachstums-Regulationsproteine codieren, im allgemeinen eine kurze Halbwertszeit 

haben (ROSS 1995). Intravitam findet eine Regulation der mRNA auf der Ebene (a) der 

Zellentwicklung und –differenzierung, (b) der hormonellen Regulation, (c) des 

Tagesrhythmus und (d) der Stressentwicklung statt (GUHANIYOGI u. BREWER 2001). 

Nach der Translation wird an das 3´-Ende einiger mRNA ein poly(A)-Schwanz angehängt. 

Änderungen in der Länge des poly(A)-Schwanzes beeinflussen die Stabilität der mRNA 

(BERNSTEIN u. ROSS 1989; SACHS 1993; BEELMAN u. PARKER 1995; ROSS 1995). 

Die Stabilität der mRNA wird durch folgendes positiv beeinflusst: (a) Interaktion mit dem 

poly(A)-Bindungsprotein (GORLACH et al. 1994; KORNER et al. 1998; KEENE 2001), (b) 

Interaktion in der 3´-UTR mRNA (CHEN et al. 1995; PESOLE et al. 1997, 2000, 2001), (c) 

RNA-Bindungs-Proteine (RBP), die an den 5´- und 3´-UTR binden, und die Stabilität der 

mRNA je nach Protein auch negativ beeinflussen können (GORLACH et al. 1994; ROSS 

1995; DERRIGO et al. 2000; KINDLER u. MONSHAUSEN 2002), (d) Ribonukleoprotein 

(mRNP)-Komplexe, wie z.B. „ELAV/Hu“ (TENENBAUM et al. 2000; KEENE 2001), das 

den Zugang von Proteinen, die den Abbau der mRNA fördern, zu deren RNA reguliert 

(FORD et al. 1999) und (e) Verlängerung der Halbwertszeit von mRNA durch Deletion von 

an Adenin reichen Elementen (ARE) (SHAW u. KAMEN 1986; GAO 1998). Negativ 

beeinflusst der Einbau von ARE die Stabilität der mRNA, wie z.B. der Globin-mRNA, und 

verhindert dadurch die Akkumulation der mRNA in ruhenden Primärzellen (MALTER 2001). 

Der Abbau des poly-A-Schwanzes der mRNA an der 3´-UTR leitet die Degradation der 

mRNA ein (BEELMAN u. PARKER 1995). 

Im postmortalen Gewebe wird die Stabilität von mRNA durch viele Faktoren beeinflusst. So 

verringert die Absenkung des pH-Wertes im Gehirn infolge von Agonie unter pH 6 die 

Stabilität der mRNA (HARRISON et al. 1991, 1995; KINGSBURY et al. 1995). Der 

langsame Gefrierungsprozess beeinflusst die Integrität des poly-A-Schwanzes der mRNA, 

und somit ihre Stabilität (JOHNSTON et al. 1997). Deshalb hat VONSATTEL et al. (1995) 

ein Protokoll zur besseren Lagerung und Verarbeitung des postmortalen Gehirngewebes 

32


vorgeschlagen, bei dem das Gehirn vorsichtig seziert und die Gewebeblöcke in flüssigen 

Stickstoff schockgefroren werden. Im gefrorenen Zustand wird die mRNA nicht geschädigt. 

So konnte bei einer Lagerung von bis zu 15 Jahren bei – 70°C kein Verlust an mRNA 

nachgewiesen werden (BURKE et al. 1991; LEONARD et al. 1993; EASTWOOD et al. 

1995; YASOJIMA et al. 2001). Bei bereits gefrorenen Geweben ist mRNA noch 1 – 2 

Stunden nach dem Auftauen zuverlässig nachweisbar (YASOJIMA et al. 2001). Das 

postmortale Zeitintervall bis zur weiteren Verarbeitung des Gehirngewebes hat nur einen 

begrenzten Einfluss auf die mRNA- und Proteinintegrität (TAYLOR et al. 1986; HARRISON 

et al. 1995). In einer Studie von TROTTER et al. (2002) hatte die Lagerung von 

Gehirngewebe für vier Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Kühlung bei 4°C über 

Nacht, kaum Einfluss auf die Stabilität oder Qualität der mRNA. In weiteren Studien konnte 

mRNA bei Raumtemperatur bis zu 48 Stunden in humanen Geweben (ARAI et al. 1989; 

HARRISON et al. 1997; SCHRAMM et al. 1999; YASOJIMA et al. 2001) und bis zu 

96 Stunden in bovinen Geweben des Reproduktionsapparates (FITZPATRICK et al. 2001) 

nachgewiesen werden. Bei kühler Lagerung bei 4°C bis zu 96 Stunden ist in humanen 

Geweben noch mRNA nachweisbar (YASOJIMA et al. 2001). In zellarmen Geweben, wie 

z.B. Knorpel oder Sehnen, konnte mRNA noch bis zu 48 Stunden bei Lagerung unter 

Raumtemperatur und bis zu 96 Stunden bei kühler Lagerung (4°C) nachgewiesen werden 

(MARCHUK et al. 1998). LUKIW et al. (1990) zeigten in ihrer Studie, dass die mRNA von 

HNF-L, GFAP, die eine Klasse von reichlich vorhandenen Proteinen repräsentieren, gefolgt 

von α-Tubulin und β-Aktin, postmortem lange Halbwertszeiten (HWZ) haben. Eine andere 

Studie zeigte, dass die mRNA von β-Globin eine HWZ von über 50 Stunden hat (STOLLE u. 

BENZ 1988). Somit haben besonders gehirnspezifische und zytoskelettspezifische mRNA, 

deren Transkripte reichlich in der Zelle vorhanden sind, eine lange HWZ (JOHNSON et al. 

1986; LUKIW et al. 1990). mRNA ist somit noch zuverlässig in postmortalem Gehirngewebe 

mit langer Autolysezeit nachweisbar, unter der Voraussetzung, dass diese Gewebe noch nicht 

vollständig zersetzt sind. Der Nachweis der mRNA kann durch (a) einen spektrometrischen 

Assay, (b) in-situ-Hybridisation (WAKER u. MCNICOL 1992), (c) Visualisierung mittels 

Gel-Elektrophorese (BAHN et al. 2001), (d) Northernblot (FITZPATRICK et al. 2001; 

YASOJIMA et al. 2001) sowie (e) sehr genau durch die RT-PCR und cDNA-Synthese 

erfolgen (JOHNSTON et al. 1998; SCHRAMM et al. 1999; FITZPATRICK et al. 2001; 

YASOJIMA et al. 2001). Bei der Detektion der mRNA-Signale ist die RT-PCR eine sehr 

sensitive Methode, die mRNA noch nach langer Zeit detektieren kann. (FITZPATRICK et al. 

2001; YASOJIMA et al. 2001). 

33


2.8 Saures Gliafaserprotein (GFAP) 

Im ZNS sind die Neuronen von Astrogliazellen umgeben, welche die verschiedensten 

Aufgaben haben, wie z.B. neuronale Migration, Regulation des Wasser-, Ionen- und 

Neurotransmitter-Haushaltes, Instandhaltung der Blut-Hirnschranke sowie Versorgung der 

Neuronen mit Energie (NORENBERG 1994). Zusammen mit Aktinfilamenten und 

Mikrotubuli bilden die Intermediärfilamente (IF) Komponenten des Zytoskeletts (PEKNY et 

al. 1995). Die genaue Funktion der IF in den verschiedenen Zellen ist bisher noch nicht 

vollständig erforscht (DAMODARAN u. ABOU-DONIA 2000). Die IF des Nervensystems 

werden Neurofilamente genannt und modulieren die Dicke des Axons (DAMODARAN u. 

ABOU-DONIA 2000). Das saure Gliafaserprotien (GFAP) gehört zu den Typ III 

Intermediärfilamentproteinen (IF), die im Zentrum eine hoch konservierte α-Helix Struktur 

aufweisen, die von nicht helicalen Kopf- und Schwanz-Domänen flankiert werden 

(BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994; NIELSEN et al. 2002). Zusammen mit den IF 

Nestin und Vimentin ist GFAP in reifen Astrozyten zu finden (REEVES et al. 1989). GFAP 

ist in fünf Untergruppen gegliedert. GFAPα ist die stärkste Untergruppe und in den 

Astrozyten zu finden (BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994). Daneben existieren noch 

GFAPβ in den Schwannschen Zellen des PNS (BRENNER 1994; GALEA et al. 1995), 

GFAPγ, das außerhalb des Gehirns expremiert wird (BRENNER 1994; ZELENIKA et al. 

1995), GFAPδ, das im ZNS expremiert wird (BRENNER 1994; CONDORELLI et al. 1999) 

sowie GFAPε, welches in allen Zellen des ZNS zu finden ist und sich nur in der Sequenz der 

Schwanzdomäne von GFAPα unterscheidet (BRENNER 1994; NIELSEN 2002). Für das 

bovine GFAP kodiert nur ein Gen. Die bisher bekannten GFAP-Gene bestehen aus neuen 

Exons, die auf 10 kb DNA verteilt sind. Die daraus erhaltene mRNA ist ca. 3 kb groß (ENG et 

al. 2000). Steroide, Cytokine und Wachstumsfaktoren sind Modulatoren der GFAP- 

Expression (LAPING et al. 1994). Unter physiologischen sowie unter pathologischen 

Stoffwechselbedingungen wird die Expression von GFAP unterschiedlich reguliert. In der 

nachfolgenden Tabelle 3 sind beispielhaft die Cytokine und Wachstumsfaktoren aufgelistet, 

welche die GFAP-mRNA Expression beeinflussen (nach LAPING et al. 1994): 

34


Tabelle 3: Modulatoren der GFAP-Expression 

Faktor Änderung Gewebe Literatur 

B-Zellen GF mRNA↑ Prim. Astrozyten, Ratte BEVENISTE et al. 1989 

GMF-β 

mRNA, Protein 

↑ 

TGF β 1 mRNA↑ / 

Transkription ↑ 

Medullablastom KELES et al. 1992 

Hippocampus, Ratte 

Prim. Astrozyten, Ratte 

LAPING et al. 1994a 

TNF mRNA ↓ Prim. Astrozyten, Rind SELMAJ et al. 1991 

Abk.: GF: Growth Factor; GMF-β: glial maturation factor-β; TGF β 1 : transforming growth 

factor; TNF: Tumornekrosefaktor; 

Der GFAP-Gehalt erhöht sich bei einer Astrogliose (ENG u. DEARMOND 1983; ENG u. 

GHIRNIKAR 1994), wie sie z.B. bei Gehirntraumen (GOEBEL et al. 1987) oder bei 

spongiformen Enzephalopathien (PRUSINER 1993, 1993a) vorkommen kann und erniedrigt 

sich bei einer hepatischen Enzephalopathie (SOBEL et al. 1981). 

Aufgrund (a) der hohen Stabilität (LUKIW et al. 1990), (b) des hohen Gehaltes an GFAP in 

den Geweben des ZNS, (c) des relativ geringen Gehaltes in den Geweben des PNS und 

anderen Geweben (Schmidt et al. 1999a; 2001) sowie (d) durch die Ergebnisse der bereits 

existierenden immunhistochemischen und immunchemischen Testverfahren, bei denen sich 

die GFAP als Marker für ZNS-Gewebe in rohen und moderat erhitzten Fleischerzeugnissen 

bewährt hat (LÜCKER et al. 2000; AUPPERLE et al. 2002; TERSTEEG et al. 2002), scheint 

die GFAP-mRNA ein geeigneter Marker für die Detektion von ZNS-Gewebe mittels der RT- 

PCR in Fleischerzeugnissen zu sein. Die Gewebespezifität der GFAP-mRNA für das ZNS- 

Gewebe des Rindes sowie die Eignung des Markers für rohe und pasteurisierte 

Fleischerzeugnisse, wurde durch die Untersuchungen von SEYBOLDT et al. (2003) 

vorgestellt (SEYBOLDT et al. 2003). Die Untersuchungen zur Gewebespezifität der GFAPmRNA 

für ZNS-Gewebe vom Schwein und Schaf sowie die Eignung für fettund 

enzymreiche sowie für moderat und stark erhitzte Fleischerzeugnisse sind Bestandteil der hier 

vorgestellten Dissertation. 

35

Material und Methoden 

3 Material und Methoden 

3.1 Material 

3.1.1 Organe und Gewebe 

3.1.1.1 Zentrales Nervengewebe 

Rind 

Die zur Dotierung von Fleischerzeugnissen verwendeten Teile des zentralen 

Nervensystems stammen von tauglich beurteilten, unter 12 Monaten alten Rindern 

(Kälber) des Schlachthofes Hannover. Zunächst wurden die Köpfe von Kälbern über die 

Firma Bönisch, Hannover, erworben. Im Institut wurden die Köpfe der Kälber eröffnet, 

das Gehirngewebe entnommen und so gut wie möglich von anhaftenden Hirnhäuten, 

Blutgerinnseln und Knochenfragmenten gereinigt. Das Gehirngewebe wurde mit einer 

Moulinette homogenisiert und, sofern es nicht sofort verbraucht wurde, in Portionen von 

50 g bis 70 g in 200 ml Probengefäße gefüllt und bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C 

gelagert. Weitere Gehirngewebeproben wurden im Institut für Pathologie der 

Tierärztlichen Hochschule Hannover entnommen. Sie stammen von acht Kälbern, die 

keine Erkrankung aufwiesen, die im Zusammenhang mit dem zentralen oder peripheren 

Nervensystem steht. Als Anteil des zentralen Nervensystems wurde den Tieren je eine 

Scheibe von ca. 0,5 cm Dicke aus dem vorderen Teil des Rhinencephalons und des 

Rückenmarks im Bereich caudal der Medulla oblongata entnommen. Das Gewebe wurde 

gekühlt transportiert, und sofern es nicht sofort verbraucht wurde, bis zum weiteren 

Gebrauch bei – 20°C gelagert. 

Schwein 

Gehirn- und Rückenmarksgewebe wurden im Schlachthof Hannover von zehn frisch 

geschlachteten und tauglich beurteilten Schweinen entnommen und gekühlt zum Institut 

transportiert. Wenn das Gewebe nicht sofort verarbeitet wurde, wurde es separat in 200 ml 

Probengefäße gefüllt und bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C gelagert. Gehirngewebe 

für die Dotierung von Fleischerzeugnissen wurde ebenfalls gekühlt zum Institut 

transportiert, und dort zunächst mit der Moulinette zerkleinert. Anschließend wurde das 

36


Gehirnhomogenat portioniert, und umgehend in 200 ml Probengefäßen bei – 20°C 

tiefgekühlt. 

Schaf 

Rückenmarkgewebe von zehn geschlachteten und tauglich beurteilten Schafen, welche 

jünger als 12 Monate waren, wurde im Schlachthof Hannover aus den Tierkörpern 

entnommen. Zusätzlich wurden im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule 

Hannover Gehirngewebeproben von vier Schafen mit einem Alter unter 12 Monaten 

entnommen. Die beprobten Tiere wiesen keine Erkrankung auf, die im Zusammenhang 

mit dem zentralen oder peripheren Nervensystem steht. Als Anteil des zentralen 

Nervensystems wurde den Tieren je eine Scheibe von ca. 0,5 cm Dicke aus dem vorderen 

Teil des Rhinencephalons und des Rückenmarks im Bereich caudal der Medulla oblongata 

entnommen. Alle im Schlachthof und im Institut für Pathologie der Tierärztlichen 

Hochschule Hannover entnommenen Rückenmark- und Gehirngewebe wurden gekühlt 

transportiert und bei Ankunft im Institut sofort weiterverarbeitet oder bis zum weiteren 

Gebrauch bei – 20°C gelagert. 

Pferd 

Im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde Gehirngewebe 

von fünf Pferden entnommen. Als Anteil des zentralen Nervensystems wurde je eine 

Scheibe von ca. 0,5 cm Dicke aus dem vorderen Teil des Rhinencephalons und des 

Rückenmarks im Bereich caudal der Medulla oblongata entnommen. Das Gehirngewebe 

wurde gekühlt zum Institut transportiert und sofern es nicht sofort verarbeitet wurde, bis 

zum weiteren Gebrauch bei – 20°C gelagert. Zusätzlich wurde Gehirngewebe von drei 

Pferden aus dem Schlachthof Hannover bezogen. Das Gehirngewebe wurde entnommen, 

grob zerkleinert, umgehend in 200 ml Probengefäße verbracht und entweder sofort 

beprobt oder bis zur weiteren Verwendung bei – 20°C gelagert. 

Damwild, Rehwild, Rotwild und Wildschwein 

Die Gehirngewebe von je einem Damwild, Rehwild, Rotwild und Wildschwein stammen 

von einem Wildhändler. Im Institut wurden die Köpfe der Tiere eröffnet und das 

Gehirngewebe entnommen. Anschließend wurde das Gehirngewebe grob zerkleinert, 

umgehend in 200 ml Probengefäße verbracht und bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C 

gelagert. Das Gehirngewebe eines weiteren Damwildes stammt von dem Institut für 

37


Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Gehirngewebe wurde im 

Bereich der Medulla oblongata entnommen und bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C 

gelagert. 

Huhn und Pute 

Gehirne von Huhn und Pute wurden von der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen 

Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Das Gehirngewebe wurde bei Ankunft im 

Institut bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C gelagert. 

3.1.1.2 Peripheres Nervengewebe 

Im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden bei jeweils drei 

Rindern, Schweinen und Schafen zur Untersuchung des peripheren Nervensystems und 

beim Rind zusätzlich zur Dotierung der Rinderfleischerzeugnisse, peripheres Nervensystem 

mit sauberem Besteck entnommen. Als Anteil des peripheren Nervensystems wurde jeweils 

der Nervus ischiadicus und von ihm abgehende Nervenstränge beider Körperhälften bei frisch 

getöteten Tieren entnommen. Die beprobten Tiere waren unter 12 Monate alt und hatten keine 

Erkrankung, die im Zusammenhang mit dem zentralen oder peripheren Nervensystem steht. 

Das Material wurde gekühlt transportiert und entweder sofort weiterverarbeitet, oder bis zur 

weiteren Verwendung bei – 20°C gelagert. 

3.1.1.3 Organe und Gewebe vom Schwein 

Am Schlachthof Hannover wurden von geschlachteten, tauglich beurteilten Schweinen 

folgende Gewebe mit sauberen Besteck entnommen: Leber, Niere, Lunge, Lymphknoten, 

Milz, Muskel und Herz. Die Gewebe wurden auf dem Transport gekühlt und bei Ankunft im 

Institut unverzüglich weiterverarbeitet. 

3.1.1.4 Organe und Gewebe vom Schaf 

Bei geschlachteten, tauglich beurteilten Schafen wurden am Schlachthof Hannover mit 

sauberen Besteck folgende Gewebe entnommen: Leber, Niere, Lunge, Lymphknoten, Muskel 

38


und Herz. Die beprobten Tiere waren unter 12 Monate alt. Auf dem Transport wurden die 

Gewebe gekühlt und nach Ankunft im Institut unverzüglich weiterverarbeitet. 

3.1.2 Rohstoffe für die Fleischerzeugnisse 

3.1.2.1 Fleisch 

Rind- und Schweinefleisch von tauglich beurteilten Tieren wurde am Schlachthof Hannover 

über die Firma Bönisch, Hannover, bezogen. Das Rindfleisch stammt von Tieren, die jünger 

als 24 Monate waren und nicht der Testpflicht auf BSE unterlagen. Das Rind- und 

Schweinefleisch wurde im Institut bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C im Kühlhaus 

gelagert. Anschließend wurde das Verarbeitungsfleisch mit einem Fleischwolf (Lochscheibe 

3 mm) zerkleinert, sofort weiterverarbeitet oder in Portionen zu 1 kg abgepackt und bei – 

20°C gelagert. 

3.1.2.2 Fett 

Das zur Herstellung von den Fleischerzeugnissen verwendete Fett stammt von tauglich 

beurteilten Schweinen des Schlachthofes Hannover und wurde von der Rückenpartie 

entnommen (Rückenspeck). Das Fett wurde über die Firma Bönisch, Hannover, bezogen. 

Nach Ankunft im Institut wurde das Fett, falls es nicht sofort gebraucht wurde, grob 

zerkleinert und bis zum weiteren Gebrauch bei – 20°C gelagert. 

3.1.2.3 Leber 

Die zur Herstellung der Leberwurst verwendete Leber stammt von tauglich beurteilten 

Schweinen des Schlachthofes Hannover und wurde auch über die Firma Bönisch, Hannover, 

bezogen. Die Leber wurde nach Ankunft im Institut sofort weiterverarbeitet. 

39


3.1.3 Zutaten und Zusatzstoffe für die Herstellung von Fleischerzeugnissen 

Brühwurst „Sonderklasse“ Gewürzmischung: Schmidt WWE Gewürze, Köln 

Eis: aus Trinkwasser 

Leberwurstgewürz „Delikatess-Leberwurst fein“: Schmidt WWE Gewürze, Köln 

Milchpulver: bezogen über Gewürzmühle Hannover 

Natriumdiphosphat: Plastal ® , Van Hees V&G Gewürzmühlen, Walluf/Rheingau 

Nitritpöckelsalz: Ako GmbH, Ronnenberg 

Salz (NaCl): bezogen über Hannoversche Gewürzmühle GmbH, Hannover 

Super Pök ® (Laktose mit Natriumascorbat): Van Hees V&G Gewürzmühlen, 

Walluf/Rheingau 

Kutterhilfsmittel Bindus®: Moguntia-Werk, Mainz 

Zucker: bezogen über Hannoversche Gewürzmühle GmbH, Hannover 

Walsroder Kunstdarm: bezogen über Hannoversche Gewürzmühle GmbH, Hannover 

3.1.4 Chemikalien und Enzyme 

Chemikalien und Enzyme für die RNA-Extraktion 

Trichlormethan/Chloroform, 3313.1 

Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe 

Ethanol, 9065.1 


peqGOLD RNAPure TM , 30 – 1020 peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen 

2-Propanol, 6752.1 


Wasser für Molekularbiologie, DEPC-behandelt Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe 

Chemikalien und Enzyme für die Reverse Transkription 

Dithiothreitol (DTT; 0,1 M) 

Invitrogen TM life technologies, Karlsruhe 

Magnesiumchlorid (MgCl 2 , 25 mM) Invitrogen TM life technologies, Karlsruhe 

Random Hexamere (50 ng/µl) 


Roti ® -Mix PCR 3 (dNTP Mix, jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 


RNaseOUT TM Recombinant ribonuclease Inhibitor (40 U/µl) 


40


SuperScript TM II Rnase H - Reverse Transcriptase (200 U/µl) 


Wasser für Molekularbiologie, DEPC-behandelt Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe 

10X RT buffer 


200 mM Tris – HCl (pH 8,4) 

500 mM Kaliumchlorid (KCl) 

Chemikalien und Enzyme für die PCR 

HotStarTaq Polymerase (1000) 

Qiagen GmbH, Hilden 

Magnesiumchlorid (MgCl 2 , 25 mM) 


dNTP Mix (Roti ® -Mix PCR 3, jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 


Wasser für Molekularbiologie, DEPC-behandelt, Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe 

10X PCR Buffer 


Tris.Cl (pH 8,7) 

KCl 

(NH 4 ) 2 SO 4 

15 mM MgCl 2 

Oligonukleotidprimer 


Restriktionsenzyme 

Alu I (10.000 U/ml) 

Hae III (10.000 U/ml) 

Mbo I (5000 U/ml) 

Msc I (3000 U/ml) 

Msp I (20.000 U/ml) 

Sst I (10.000 U/ml) 

New England BioLabs Inc., Frankfurt am Main 






Chemikalien für die Gelelektrophorese 

Agarose NEEO, 2267.4 

Borsäure, 64943.1 

Bromphenolblau, A512.1 

EDTA, 8043.1 

Glycerin, 3783.1 






41


TRIS-Base, 4855.2 

puC 19 Msp I, T149.1 



Chemikalien für die Aufreinigung der DNA 

QIAquick ® PCR – Purifikation Kit 

Ethanol, 9065.1 



3.1.5 Puffer und Lösungen 

75 % Ethanol 

12,5 ml Wasser für die Molekularbiologie 

37,5 ml Ethanol 

10 X TBE 

107,8 g TRIS-Base 

55,0 g Borsäure 

9,3 g EDTA pH 8,3 

Aqua dest. ad 1000 ml 

Blaumarker 

400,0 µl Glycerin 

50,0 µl 60% Glycerin gesättigt mit Bromphenolblau 

550,0 µl 1 x TBE 

3.1.6 Laborgeräte, Laborhilfsmittel und Verbrachsmaterialien 

Brutschrank: 

BIORAD ® Power Pac: 

Digitalwaage 466 – 41: 

Digitalwaage BP 221 S: 

Elektrophorese Apparat Horizon ® 20.25: 

Eppendorf Zentrifuge 5417 R: 

GelCam: 

Homogenisator Antrieb Miccra D8: 

Dispersionswerkzeug DS8/P: 

Horizon ® Gelgießstation H20-25: 

Memmert, Schwabach 

Bio-Rad Laboratories GmbH, München 

Kern + Sohn, Albstadt 

Sartorius, Göttingen 

GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein 

Eppendorf-Netheier-Hinz GmbH, Hamburg 

Polaroid GmbH, Offenbach 

Art Labortechnik München 

Art Labortechnik München 

GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein 

42


Kämme 20, 30 und 42 Zähne für Gelgießstation: GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein 

Kolbenhubpipetten: 

Eppendorf GmbH, Hamburg 

Konservengläser 230 ml: 

Hannoversche Gewürzmühle GmbH, Hannover 

Magnet-Heizrührer: H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim Variomag ® Monotherm 

Magnetrührer: 

Gerhardt, Germany 

Pipettenspitzen: 

Sorenson TM BioScience, Inc., Salt Lake City, USA 

Polaroid Filme: 


Probengefäße, 200 ml, steril: 

Technolab, Labortechnik, Herne 

Zentrifugenröhrchen, 15 ml: 


Zentrifugenröhrchen, 50 ml: 


Reaktionsgefäße 8-Strips, 0,2 ml: neoLab ® Migte Laborbedarf Vertriebs GmbH, Heidelberg 

Reaktionsgefäße 2,0 ml, Safe-Lock-Tubes: 

Eppendorf GmbH, Hamburg 

Reaktionsgefäße 1,5 ml: 


Reaktionsgefäße 0,2 ml, Mµlti-Ultra Tubes, H561.1: Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe 

Techne DRI-BLOCK ® DB.3D: Labtech International, Burkhardtsdorf, Techne Duxford; 

Cambridge, U.K. 

Thermocycler, GeneAmp ® PCR System 9700: PE Applied Biosystems, Norwalk, USA 

Transilluminator BIOMETRA ® , TI 2: 

Whatman Biometra ® , Göppingen 

UNIPREP Schüttelgerät: 

Uni Equip GmbH, Martinsried 

3.1.7 Geräte für die Herstellung von Fleischerzeugnissen 

Fleischwolf: 

Kolloidmühle „PUC-Vikosator“: 

Korimat KA 240 E: 

Bizerba – Werke, Wilhelm Kraut AG, Balingen 

Kolloidtechnik, PUC Probst & Class GmbH, 

Rastatt 

Metallwarenfabrik GmbH, Haiger 

43


3.2 Methoden 

3.2.1 Herstellung der Brühwurstgrundmasse 

Die Herstellung der Brühwursterzeugnisse erfolgte nach den Leitsätzen des Deutschen 

Lebensmittelbuches Kapitel 2.221.12. für Brühwurstgrundbrät und nach den Angaben von 

KOCH (1992), Rezept 2601. 

3.2.1.1 Brühwurstgrundmasse mit Rindermuskulatur 

3.2.1.1.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse 

Rezeptur: 

• 1 kg Rindfleisch 

• 250 g Fettgewebe (Rückenspeck) 

• 200 g Eis 

• 25 g Nitritpökelsalz 

• 3,75 g Plastal ® (Natriumdiphosphat) 

• 7,25 g „Brühwurst Extra“ Gewürzmischung 

Zunächst wurden das Rindfleisch und der Rückenspeck mit einem Fleischwolf auf die 

Korngröße von 3 mm zerkleinert. Durch anschließende Vermengung von 1 kg zerkleinertem 

Fleisch mit 250 g Fett entstand eine Fleisch-Fett-Masse von 1250 g. Nun folgte die Zugabe 

von 200 g Eis, 20g/kg Nitritpökelsalz (≅ 25 g), 3 g/kg Plastal ® (≅ 3,75 g) zur Fleisch-Fett- 

Masse und 5 g/kg (≅ 7,25 g) Gewürzmischung zur Gesamtmenge. Um eine homogene 

Brätmasse zu erhalten, erfolgte die Feinstzerkleinerung in zwei Durchgängen in der 

Kolloidmühle. Die so gewonnene, 1450 g schwere Brätmasse wurde vor der weiteren 

Bearbeitung auf eine Ausgangstemperatur von ca. 5°C gekühlt. 

44


3.2.1.1.2 Brät für stark erhitze Brühwursterzeugnisse 

Rezeptur: 

• 4 kg Rindfleisch 


• 600 g Eis 


• 200 g Milchpulver 

• 25 g „Brühwurst Extra“ Gewürzmischung 

Rindfleisch und Rückenspeck wurden mit einem Fleischwolf (3 mm Lochscheibe) zerkleinert 

und miteinander vermengt. Zur entstandenen Fleisch-Fett-Masse von 5 kg wurden 600 g Eis, 

20g/kg Nitritpökelsalz (≅ 100 g), 40g/kg Milchpulver (≅ 200 g) zugesetzt und daraufhin 

5 g/kg Gewürzmischung (≅ 25 g) bezogen auf die Gesamtmasse hinzugegeben. Um eine 

homogene Brätmasse zu erhalten, erfolgte die Feinstzerkleinerung mit zwei Durchgängen in 

der Kolloidmühle. Die so gewonnenen 5600 g Brätmasse wurden vor der weiteren 

Bearbeitung auf eine Ausgangstemperatur von ca. 5°C gekühlt. 

3.2.1.2 Brühwurstgrundmasse mit Schweinemuskulatur 

3.2.1.2.1 Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse 

Rezeptur: 

• 3 kg Schweinefleisch 


• 600 g Eis 


• 11,25 g Plastal ® (Natriumdiphosphat) 

• 21,75 g Brühwurst Extra Gewürzmischung 

Zunächst wurden Schweinefleisch und Rückenspeck mit dem Fleischwolf auf eine 3 mm 

Körnung zerkleinert. Zu der entstandenen Fleisch-Fett-Masse von 3750 g wurden 600 g Eis, 

20g/kg Nitritpökelsalz (≅ 75 g), 3 g/kg Plastal ® (≅ 11,25 g) zugesetzt und daraufhin 5g/kg 

Gewürzmischung (≅ 21,75 g) bezogen auf die Gesamtmasse hinzugegeben. Es folgte die 

Feinstzerkleinerung und Homogenisierung der eingesetzten Gewebe mit der Kolloidmühle in 

zwei Durchgängen. Die so gewonnene Brätmasse wurde auf eine Ausgangstemperatur von ca. 

45


5°C gekühlt und sofort weiterverarbeitet oder in Portionen von 1 kg bis zur weiteren 

Verwendung bei – 20°C gelagert. 

3.2.2 Leberwurst 

Die Grundmasse für die Leberwurst wurde nach den Angaben von KOCH et al. (1992) 

hergestellt (Rezept 2801, ohne Honig). 

Rezeptur: 

• 6 kg Verarbeitungsfleisch Klasse 3 (50 % mageres Fleisch, 50 % Fett), 3 mm 

gewolft, vom Schwein 

• 2,5 kg Schweineleber, 3 mm gewolft 

• 2 Gemüsezwiebeln 


• 42 g Leberwurstgewürz „Delikatess-Leberwurst fein“ 

• 18 g Zucker 

• 4 g Super Pök ® (Laktose mit Natriumascorbat) 

6 kg Verarbeitungsfleisch Klasse 3 wurden zwei Tage in 10 %ige Nitritpökelsalzlake 

eingelegt. 2,5 kg Leber wurden von den großen Gallengängen befreit, und mit Nitritpökelsalz 

ebenfalls vorgepökelt. Das Verarbeitungsfleisch wurde anschließend 1,5 Stunden bei 100°C 

gegart. In der letzten halben Stunde des Garvorganges wurden zwei Gemüsezwiebeln 

zugeben. Die Leber wurde anschließend mit dem Kochsud kurz blanchiert. 

Verarbeitungsfleisch, Zwiebeln sowie Leber wurden separat mit dem Fleischwolf auf eine 

Körnung von 3 mm zerkleinert und miteinander vermengt. Anschließend wurden die Gewürze 

dazugegeben, die gesamte Masse mit der Kolloidmühle feinstzerkleinert und emulgiert. 

46


3.2.3 Molekularbiologische Methoden 

3.2.3.1 RNA-Extraktion 

Um RNA zu gewinnen wurde eine Methode nach CHOMCZYNSKI und SACCHI (1987) 

angewandt, bei der das Gewebe in Guanidinisothiocyanat-Phenol-Lösung homogenisiert wird 

(CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; MACDONALD et al., 1987). Nach Zugabe von 

Chloroform und der anschließenden Zentrifugation wurde RNA in dem wässrigen Überstand 

gelöst und von DNA und anderen Zellbestandteilen isoliert, die sich in der organischen Phase 

befanden. 

Für die RNA-Extraktion wurde peqGOLD RNAPure TM (peqlab Biotechnologie GmbH, 

Erlangen) verwendet. Die Probenaufbereitung erfolgte nach Herstellerangaben. Zunächst 

wurde 1 ml peqGOLD RNAPure-Lösung in 2 ml Reaktionsgefäße vorgelegt. Von den zu 

beprobenden Geweben und Fleischerzeugnissen wurden jeweils 100 mg in die peqGOLD 

RNAPure-Lösung eingewogen, und mit einem Rotor-Stator-Homogenisator 20 Sekunden bei 

ca. 38.000 Umdrehungen pro Minute (UpM) homogenisiert. Bei jeder neuen, an ZNS höher 

konzentrierten Probe, wurde der Homogenisator je 20 Sekunden bei ca. 38 UpM in 

Seifenlauge und in destilliertem Wasser gründlich gereinigt. Bei jedem neuen Versuchsansatz, 

neuer Tierart oder Proben, die nicht in aufsteigender Konzentration folgten (z.B. zwei 

verschiedene Gehirngewebeproben), wurde der Homogenisator gründlich mit Seifenwasser 

und Flaschenbürste gereinigt und nachfolgend für mindestens 15 Minuten in 2 M Natronlauge 

(NaOH-Lösung) verbracht. Bei der Untersuchung der Leberwurstproben wurde zur Reduktion 

des Fettgehaltes nach Herstellerangaben das Gemisch nun bei 12000 x g für 10 Minuten 

zentrifugiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde das Gemisch 15 Sekunden mit 

Hilfe eines Vortexers vermengt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine 

Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Es folgte eine Zentrifugation für 5 

Minuten bei 12000 x g. Dabei trennte sich die Probe in drei Phasen auf, von denen der 

Überstand die RNA enthielt. Zur RNA-Präzipitation wurde der klare Überstand in neue 2 ml 

Reaktionsgefäße pipettiert und mit 500 µl Isopropanol mit Hilfe eines Vortexers vermengt. 

Nachfolgend wurde das Gemisch für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 

10 Minuten bei 4°C und 12000 x g zentrifugiert, und der Isopropanolüberstand abpipettiert. 

Das verbleibende RNA-Pellet wurde nun zweimal gewaschen. Dafür wurde es mit 1 ml 75% 

Ethanol überschüttet, 10 Minuten bei 4°C und 12000 x g zentrifugiert und nach Entfernung 

47


des Ethanols erneut gewaschen. Das so erhaltene RNA-Pellet wurde bei 60°C im Heizblock 

für ca. 30 Sekunden getrocknet, in 100 µl DEPC-behandelten Wasser gelöst, in 1,5 ml 

Reaktionsgefäße überführt und anschließend bei – 20°C gelagert. 

3.2.3.2 Reverse Transkription 

Die c-DNA-Synthese wurde mit der Superscript II RT (Invitrogen TM life technologies, 

Karlsruhe) in zwei Schritten nach Herstellerangaben durchgeführt. 

Für den Primermix wurden pro Reaktion 

• 2 µl Random-Hexamere (≅ 200 ng), 

• 2 µl DNase und Rnase-freies Wasser (DEPC-behandelt), 

• 1 µl dNTP-Mix, 

in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgemischt und anschließend mit 5 µl der aus der RNA- 

Extraktion gewonnenen Probe in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß (Mµlti ® -Ultra Tubes) 

vermischt. Dann wurden die Proben in einen Thermocycler verbracht und für 5 Minuten bei 

65°C erwärmt. Dabei wurden die Sekundärstrukturen der RNA zerstört. Anschließend wurden 

die Proben bis zur Entnahme aus dem Thermocycler für mindestens eine Minute auf 4°C 

heruntergekühlt. 

Nachfolgend wurde in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß der Reaktionsmix angesetzt, der pro 

Reaktion folgendes enthielt: 

• 4 µl 25 mM MgCl 2 

• 2 µl 10 x RT-Puffer 

• 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT) 

• 1 µl RNase OUT TM . 

9 µl des Reaktionsmixes wurden zu dem Primermix in die 0,2 ml Reaktionsgefäße 

hinzupipettiert und das Gemisch anschließend im Thermocycler für 2 Minuten bei 25°C 

inkubiert. Nachfolgend wurde 1 µl Superscript II RT TM mit der Konzentration von 50 U/µl 

hinzupipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden dann im Thermocycler folgendem Temperatur- 

Zeit-Profil unterzogen: 

10 min bei 25°C, 50 min bei 42°C, 15 min bei 70°C und 4°C bis zur Entnahme der Probe aus 

dem Thermocycler (mindestens 1 Minute). Als Negativkontrolle wurde eine Reaktion, 

bestehend aus Primermix und Reaktionsmix, mitgeführt. Als Positivkontrolle bei den 

48


Versuchen mit Vollkonserven (s. Kapitel 3.2.5.1.4) wurde eine positiv getestete 

Rindergehirnprobe mitgeführt. Die nicht zur PCR benötigten Probemengen wurden bis zur 

weiteren Verwendung bei – 20°C gelagert. 

3.2.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR) 

Durch Polymerase Chain Reaktion (PCR) erfolgte die Amplifikation der c-DNA aus der 

reversen Transkription. 

3.2.3.3.1 PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev 

Die in der PCR eingesetzten Primer GFAPforw und GFAPrev wurden von Seyboldt et al. 

(2002) aus Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. 

Y08255) entwickelt und binden an Sequenzen der Exons, die das Intron 3 (accession no. 

L19867) flankieren. Die Sequenzen der Primer lauten: 

• GFAPforw: 5`-GAGGAAGATTGAGTCTCTGGAGGA- 3` 

• GFAPrev: 5`-TCATACTGTGTGCGGATCTCTCTC- 3`. 

Der Mastermix für die PCR mit GFAPforw und GFAPrev Primern enthielt pro Reaktion 

folgende Komponenten (Tabelle 4): 

Tabelle 4: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev 

Reagenzien Konzentration Volumen (µl) 

10 x PCR-Puffer 5 

dNTPs je 10 mM/µl 1 

GFAPforw 100 pmol/µl 1 

GFAPrev 100 pmol/µl 1 

Taq-Polymerase 5 U/µl 0,2 

DEPC-Wasser 39,8 

Die Reagenzien wurden vorgemischt und je 48 µl dieses Gemisches entweder in 0,2 ml 

Achterstrips oder 0,2 ml Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert. 

49


Anschließend wurden 2 µl der jeweiligen c-DNA-Proben, einschließlich der mitgeführten RT- 

Negativkontrolle, hinzupipettiert. Zudem wurden eine PCR-Negativkontrolle, sowie eine 

PCR-Positivkontrolle, bestehend aus Rinder-DNA, mitgeführt. Bei der Untersuchung der 

Vollkonserve (s. Kapitel 3.2.5.1.4) besteht die Positivkontrolle aus der RT-Positivkontrolle. 

Dann wurden die Reaktionsgefäße gut verschlossen in den Thermocycler überführt und 

folgendem Temperatur-Zeit-Programm unterzogen (Tabelle 5): 

Tabelle 5: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern GFAPforw und 

GFAPrev 

Programmschritt Temperatur Dauer (min:sec) Zyklenzahl 

Initiale Denaturierung 95°C 15 1 

Denaturierung 94°C 0:45 

Anlagerung (Annealing) 65°C 1 

50/45 

Verlängerung 72°C 1:30 

Finale Verlängerung 72°C 10 1 

Warten bis Probenentnahme 4°C ∞ 1 

3.2.3.3.2 PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 

Die bei dieser PCR eingesetzten Primer bGFAPw1 und bGFAPw2 wurden anhand der 

Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. Y08255) 

entwickelt und amplifizieren einen Sequenzabschnitt der GFAP-mRNA von 399 bp Größe. 

Damit wird ein Bereich amplifiziert, der das Amplifikat der PCR mit den Primern GFAPforw 

und GFAPrev mit benachbarten Sequenzabschnitten einfasst. Die Primer haben folgende 

Sequenz: 

• bGFAPw1: 5`-GGCACCTTGAGGCAGAAGCTCCAG- 3` 

• bGFAPw2: 5`-CTCATGCTTGGCCTGGCGGA- 3´ 

Der Mastermix für die PCR mit bGFAPw1 und bGFAPw2 Primern enthielt pro Reaktion 


50


Tabelle 6: Mastermix für PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 




bGFAPw1 100 pmol/µl 1 

bGFAPw2 100 pmol/µl 1 



Je 48 µl der vorgemischten Reagenzien wurden entweder in 0,2 ml Achterstrips oder in 0,2 ml 

Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert und mit 2 µl der jeweiligen c-DNA- 

Proben vermischt. Zusätzlich zur RT-Negativkontrolle wurde eine PCR-Negativkontrolle 

mitgeführt. Die Reaktionsgefäße wurden gut verschlossen in den Thermocycler überführt und 

folgendem Temperatur-Zeit-Programm unterzogen (Tabelle 7): 

Tabelle 7: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern bGFAPw1 und 

bGFAPw2 

Programmschritt Temperatur Dauer (min:sec) Zyklenzahl 

Initiale Denaturierung 95°C 15 1 

Denaturierung 94°C 0:45 

Anlagerung (Annealing) 72°C 1 

45 

Verlängerung 72°C 1:30 

Finale Verlängerung 72°C 10 1 

Warten bis Probenentnahme 4°C ∞ 1 

Die hier erhaltenen PCR-Produkte wurden, sofern sie nicht sofort zur Aufreinigung und 

nachfolgenden Sequenzanalyse verwendet wurden (siehe Kapitel 3.2.3.4) bei – 20°C gelagert. 

51


3.2.3.3.3 PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 

Die hierbei verwendeten Primer wurden mittels der Sequenzinformationen des 399 bp großen 

Fragmentes der porcinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. AJ551395) entwickelt. Die 

Primer amplifizieren ein 168 bp großes Fragment der porcinen GFAPmRNA. 

Die Sequenz der Primer lautet wie folgt: 

• GFAPpork1: 5` -GAGGAAGATCGAGTCTTTGGAGGA- 3` 

• GFAPpork2: 5` -TCATATTGCGTGCGAATCTCTCTC- 3` 

Für die PCR mit GFAPpork1 und GFAPpork2 Primern enthielt der Mastermix pro Reaktion 


Tabelle 8: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 




GFAPpork1 50 pmol/µl 1 

GFAPpork2 50 pmol/µl 1 



Von den vorgemischten Reagenzien wurden je 48 µl entweder in 0,2 ml Achterstrips oder in 

0,2 ml Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert und mit 2 µl der jeweiligen c- 

DNA-Proben, einschließlich der mitgeführten RT-Negativkontrolle, vermischt. Es wurde eine 

PCR-Negativkontrolle, sowie eine PCR-Positivkontrolle, bestehend aus Schweine-DNA, 

mitgeführt. Dann wurden die Reaktionsgefäße gut verschlossen in den Thermocycler 

überführt und dem Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern GFAPforw und 

GFAPrev unterzogen (Tabelle 5). 

52


3.2.3.4 Reinigung von DNA für die nachfolgende Sequenzierung 

Die in Kapitel 3.2.3.3.2 gewonnenen 399 bp großen Amplifikationsprodukte der GFAP 

mRNA wurden in einem nächsten Schritt aufgereinigt, um sie anschließend bei der 

Sequenzanalyse verwenden zu können. Verwendet wurde das QIAquick ® PCR-Purification 

Kit (Qiagen GmbH, Hilden). Das Arbeitsprotokoll wurde nach Herstellerangaben 

durchgeführt. Hierzu wurde zunächst der PE-Puffer mit 96 %igen Ethanol versetzt. Dann 

wurden 5 Teile des PB-Puffers mit 1 Teil des PCR-Produktes vermischt. Als nächstes wurde 

die so erhaltene Lösung auf die QIAquick ® Mini-Säule gegeben und 1 Minute bei 10000 x g 

zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Säule anschließend mit 750 µl PE-Puffer 

beschickt und wiederum 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Dabei wurden Primer bis 40 bp 

und Salze entfernt, die im Durchfluss, der wieder verworfen wurde, enthalten waren. Danach 

wurde die Säule nochmals für 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Nachfolgend wurde die 

Säule auf ein neues 1,5 ml RNase und DNase freies Reaktionsgefäß gesetzt, 50 µl EB-Puffer 

auf die Säulenmembran gegeben und nochmals 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Das 

hierbei entstandene Eluat enthielt die gereinigte DNA. Von dieser DNA-Lösung wurde ein 

Aliquot zur Sequenzanalyse in das Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der 

Tierärztlichen Hochschule Hannover gegeben. Dort wurde eine Sequenzanalyse nach dem 

Didesoxynukleotidverfahren von SANGER et al. (1977) durchgeführt. 

3.2.3.5 Gelelektrophorese 

Für die Herstellung der Agarosegele wurden 7,5 g (für ein 2,5-%iges Gel) bzw. 11,25 g (für 

ein 3,75-%iges Gel) Agarose abgewogen und zusammen mit 300 ml 1 x TBE-Puffer in einem 

600 ml Becherglas 30 Minuten bei 200°C auf einem Magnet-Heizrührer erwärmt, so dass sich 

die Agarose in dem TBE-Puffer löste. Anschließend wurde die Lösung bei 300°C auf dem 

Magnet-Heizrührer kurz aufgekocht und nachfolgend auf einem weiteren Magnetrührer für 

ca. 30 Minuten auf eine Temperatur von ca. 50 – 60°C abgekühlt. Danach wurden 3 – 4 µl 

Ethidiumbromid je 100 ml Agarosegel zugegeben und die Flüssigkeit in eine vorbreitete 

Gelgießeinrichtung verbracht. Nach einer Abkühlungsphase von ca. 30 Minuten war das 

Agarosegel erstarrt und die Kämme wurden entfernt. 

53


Bei Gebrauch wurde das Agarosegel in eine Elektrophoresekammer mit 1 x TBE-Puffer als 

Laufpuffer verbracht. 8 µl Probe wurden mit 2 µl Blaumarker vermengt und auf das 

Agarosegel in die Geltaschen aufgetragen. Als Längenstandard diente puC 19/Msp I, der in 

die jeweils erste und letzte Geltasche aufgetragen wurde. Es folgte der Lauf der DNA im Gel 

bei 200 Volt über 30 Minuten und damit die Auftrennung der DNA anhand ihrer Größe. Auf 

einem Transilluminator mit 254 nm UV-Licht erfolgte die Auswertung des Gels. Die 

Dokumentation der Ergebnisse fand durch Fotografieren mit einer Polaroid-Kamera statt. 

Eine Probe wurde dann als positiv für das Vorhandensein von GFAP-mRNA bewertet, wenn 

die Bande ein Fragment mit der Größe von 168 bp bzw. 399 bp aufwies. Eine Bande mit 

einem Fragment der Größe von 957 bp zeigt das Amplifikationsprodukt der genomischen 

DNA. 

3.2.3.6 Untersuchungen zur Tierartspezifität des GFAP-mRNA-Nachweises 

Bei dem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) wurde die zu untersuchende 

DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, und mittels Gelelektrophorese 

aufgetrennt. Dazu wurden die PCR-Produkte aus den Versuchen mit Gehirngewebe der 

Tierarten Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Wildschwein, Dammwild, Rehwild, Rotwild, Huhn 

und Pute verwendet. Zunächst wurden 10 µl der unverdauten PCR-Probe mittels 

Gelelektrophorese (Kapitel 3.2.3.5) auf das Vorhandensein des 168 bp großen GFAP-mRNA 

Fragments untersucht und darauf geachtet, dass diese Proben frei von dem 957 bp großen 

DNA-Fragment waren. Als nächstes wurden die Restriktionsenzyme (Tabelle 9) in ein 1,5 ml 

Reaktionsgefäß vorgegeben und mit 10 µl des jeweiligen PCR-Produktes durch vorsichtiges 

auf- und abpipettieren gründlich vermengt. Danach wurden die so vorbereiteten 

Reaktionsgefäße für 60 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert und die Proben 

nachfolgend mittels Gelelektrophorese auf das Vorhandensein des jeweiligen 

Spaltungsmusters untersucht. 

Die verwendeten Restriktionsenzyme und ihre eingesetzte Konzentration sind der 

nachfolgenden Tabelle zu entnehmen (Tabelle 9): 

54


Tabelle 9: Restriktionsenzyme 

Restriktionsenzym Konzentration (U/ml) Eingesetztes Volumen 

Alu I 10000 0,5 µl 

Hae III 10000 0.5 µl 

MbO I 5000 0,5 µl 

Msc I 3000 1 µl 

Msp I 20000 0,5 µl 

Sst I 0,5 µl 

3.2.4 Untersuchungen zur Gewebespezifität des Gliafaserprotein-mRNA-Nachweises 

3.2.4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schweinegeweben 

3.2.4.1.1 Untersuchung nativer Gewebe 

Von den Geweben und Organen vom Schwein (Kapitel 3.1.1.3) wurden etwa vier Stunden 

postmortem jeweils ca. 1 g von jeder Probe mit einem sauberen Messer entnommen und 

100 mg davon für die RNA-Extraktion abgewogen. Die verbleibende Probenmenge wurde bei 

4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde die RNA-Extraktion mit dem bei 4°C gelagerten 

Gewebe wiederholt. Als Positivkontrolle wurde porcines Rückenmark- und Gehirngewebe 

mitgeführt. 

3.2.4.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten) 

Von den verbliebenen 9 g der Proben aus der vorangegangenen Untersuchung des nativen 

Gewebes wurden jeweils 1 g mit einem sauberen Messer abgeschnitten und in ein 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Proben wurden bei 10.000 U/min 1 Minute zentrifugiert 

und anschließend für 20 Minuten bei 75°C im Wasserbad erhitzt. Nachfolgend wurde von den 

so behandelten Proben je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die jeweils 

verbliebenen 8 g der Proben wurden bei 4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde dieser 

Versuchsschritt mit dem bei 4°C gelagerten Probenmaterial wiederholt. Als Positivkontrolle 

wurde auch bei diesem Versuch porcines Rückenmark- und Gehirngewebe mitgeführt. Dieser 

Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

55



Bei diesem Versuch wurden die frischen Proben von jeweils 10 g zunächst separat in der 

Moulinette zerkleinert. Die Moulinette wurde vor der Bearbeitung jeder neuen Probe 

gründlich mit heißem Wasser und Seifenlauge gereinigt. Beim Schwein wurden alle im 

Kapitel 3.1.1.3 aufgeführten Gewebe einschließlich Rückenmark- und Gehirngewebe (Kapitel 

3.1.1.1) untersucht. 

Die zerkleinerten Proben wurde wie folgt aufgeteilt: 

• 100 mg natives Gewebe von jeder Probe wurden für die RNA-Extraktion 

abgewogen, 

• je 1 g von jeder Probe wurden abgewogen und jeweils in ein separates 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert und im 

Wasserbad bei 80°C Wassertemperatur für 30 Minuten erhitzt; von den erhitzten 

Proben wurde je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. 

Die verbliebenen nativen Proben wurden bei 4°C gelagert. Nach 24 Stunden wurde dieser hier 

beschriebene Versuch mit dem Probenmaterial, das bei 4°C gelagert wurde, wiederholt. 

Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

3.2.4.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten) 

In einem dritten Versuch wurde von frischen Muskel-, Herz-, Rückenmark- und Gehirn- 

Gewebeproben (Kapitel 3.1.1.1 b und 3.1.1.3) je ca. 10 g entnommen, jeweils separat in der 

gründlich gesäuberten Moulinette zerkleinert und wie folgt aufgeteilt: 

• 100 mg natives Gewebe von jeder Probe wurden für die RNA-Extraktion 

abgewogen, 

• zweimal wurde je 1 g von jeder Probe abgewogen und jeweils in ein separates 

15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Je ein Satz der so vorbereiteten Proben 

wurde dann für 30 Minuten bzw. 60 Minuten im Wasserbad mit 95°C 

Wassertemperatur erhitzt. Anschließend wurden wiederum je 100 mg für die 

RNA-Extraktion abgewogen. 

Dieser Versuch wurde ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt. 

56


3.2.4.2 Untersuchungen zur Gewebespezifität an Schafgeweben 

3.2.4.2.1 Untersuchung nativer Gewebe 

Von Geweben und Organen des Schafes (Kapitel 3.1.1.4) wurde je eine Probe von ca. 1 g mit 

einem sauberen Messer entnommen und 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die 

verbleibende Probenmenge wurde bei 4°C gelagert. Dieser Versuch wurde nach 24 Stunden 

mit den bei 4°C gelagerten Geweben wiederholt. Als Positivkontrolle diente ovines 

Rückenmarkgewebe. 


Jeweils 1 g von den verbliebenen 9 g der Proben aus der vorangegangenen Untersuchung der 

nativen Gewebe wurden mit einem sauberen Messer abgeschnitten, in ein 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben, bei 10.000 U/min 1 Minute zentrifugiert und anschließend für 

20 Minuten bei 75°C im Wasserbad erhitzt. Von diesen Proben wurden dann je 100 mg für 

die RNA-Extraktion abgewogen. Die verbliebenen 8 g der Proben wurden bei 4°C gelagert. 

Dieser Versuchsschritt wurde nach 24 Stunden mit dem im Kühlschank gelagerten 

Probenmaterial wiederholt. Bei dieser Untersuchung diente ovines Rückenmarkgewebe als 

Positivkontrolle. Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 


Bei diesem Versuch wurden die frisch entnommenen Proben von jeweils 10 g zunächst 

separat in einer Moulinette zerkleinert. Die Moulinette wurde vor jeder neuen Probe gründlich 

mit heißem Wasser und Seifenlauge gereinigt. In diesem Versuchsansatz wurden ovines 

Nieren-, Muskel-, Herz- sowie Rückenmarkgewebe (Kapitel 3.1.1.4) untersucht. 

Die mit der Moulinette zerkleinerten Proben wurden wie folgt weiterverarbeitet: 

• für die RNA-Extraktion wurden je 100 mg natives Gewebe abgewogen, 

• je 1 g von jeder Probe wurde abgewogen und in ein separates 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert, für 

57


30 Minuten bei 80°C Wasserbadtemperatur erhitzt. Daraufhin wurden wiederum 

von jeder Probe je 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. 

Das verbliebene native Gewebe wurde bei 4°C gelagert. Dieser Versuch wurde mit dem bei 

4°C eingelagerten Probenmaterial nach 24 Stunden wiederholt, und ebenfalls insgesamt 

dreimal durchgeführt. 

3.2.4.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten) 

In einem dritten Versuch wurde von frischem Muskel-, Herz-, Rückenmarkgewebe je 10 g 

entnommen, in einer gründlich gesäuberten Moulinette jeweils separat zerkleinert und wie 

folgt aufgeteilt: 

• für die RNA-Extraktion wurden 100 mg natives Gewebe von jeder Probe 

abgewogen, 

• zweimal je 1 g von jeder Probe abgewogen, in ein separates 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben und im Wasserbad mit 95°C Wassertemperatur 

erhitzt. Die Erhitzungsdauer betrug für den einen Satz der Proben 30 Minuten und 

den anderen Satz Proben 60 Minuten. Daraufhin wurden für die RNA-Extraktion 

wiederum je 100 mg abgewogen. 

Dieser Versuch wurde ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt. 

3.2.4.3 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystems auf den Nachweis 

porciner und oviner GFAP-mRNA 

Anteile des peripheren Nervengewebes von Schaf und Schwein (Kapitel 3.1.1.2) wurden 

zunächst mit einem sauberen Messer fein zerkleinert und dann wie folgt aufgeteilt: 

• 100 mg natives Gewebe wurden für die RNA-Extraktion abgewogen, 

• das restliche Gewebe wurde in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, 1 Minute bei 

10000 x g zentrifugiert und anschließend im Wasserbad für 60 Minuten bei 80°C 

Wassertemperatur erhitzt. Daraufhin wurden von jeder Probe je 100 mg für die RNA- 

Extraktion abgewogen. 

Dieser Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

58


3.2.5 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den 

Nachweis boviner GFAP-mRNA 

3.2.5.1 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in unterschiedlich erhitzten 

Brühwursterzeugnissen 


Wasserbadtemperatur 

Für die Herstellung einer Brühwurst mit verschiedenen Konzentrationsstufen an 

Rindergehirnhomogenat wurde Brät für pasteurisierte Fleischerzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) 

und Gehirnhomogenat (Kapitel 3.1.1.1) wie folgt miteinander vermengt (Tabelle 10): 

Tabelle 10: Dotierung des Brätes mit bovinem Gehirngewebe 

Konzentration 

im Fleischerzeugnis 

Einwaage an Brät 

Einwaage an 

Rindergehirnhomogenat 

0 % 100 g 0 g 

0, 25 % 199,5 g 0,5 g 

0,5 % 199 g 1 g 

1 % 99 g 1 g 

5 % 95 g 5 g 

100 % 0 g 10 g 

Anschließend wurden die einzelnen Brät-Rindergehirn-Gemische nochmals in der Moulinette 

vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der 

Brühwurstmasse zu gewährleisten. Dann wurde von den so vermengten Gemischen je 100 g 

abgewogen und jeweils separat in 200 ml Probengefäße unter Vermeidung größerer 

Luftblasen eingefüllt. Die 10 g natives Gehirngewebe wurden in ein 15 ml 

Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten in 

ein Wasserbad mit 75°C Wassertemperatur verbracht. Von den so gewonnenen Produkten 

wurden nach Abkühlung jeweils 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen und 

weiterverarbeitet. Die weitere Probenentnahme fand im wöchentlichen Abstand über einen 

Zeitraum von 35 Tagen statt. Der hier beschriebene Versuch wurde insgesamt viermal 

durchgeführt. Die Dotierung einer Probe mit 0,25 % Rindergehirngewebe erfolgte nur in einer 

der vier durchgeführten Versuchsreihen. Bei einem dieser Versuche wurde zusätzlich ein 

59


Probengefäß mit 100 g Brät mitgeführt, bei dem die Kerntemperatur in der Probe erfasst 

wurde. 



Das Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) wurde wie in 3.2.5.1.1 

beschrieben mit verschiedenen Konzentrationen an bovinem Gehirngewebe dotiert. Die 

einzelnen Brät-Rindergehirn-Gemische wurden anschließend nochmals in der Moulinette 

vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der Brätmasse zu 

gewährleisten. Von diesen Gemischen wurden je 100 g abgewogen und jeweils separat in 

200 ml Probengefäße unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. 10 g natives 

Gehirngewebe vom Kalb, die in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingefüllt wurden, dienten als 

Positivkontrolle. Zusätzlich wurden 100 g eines nicht mit Gehirngewebe dotierten Brätes in 

einem 200 ml Probengefäß mitgeführt, in das ein Temperaturmessfühler in Form eines 

Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der Kerntemperatur zu verfolgen. Die 

Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten im Wasserbad mit einer Temperatur 

von 95°C gebrüht. Dann wurde von den abgekühlten Brühwurstprodukten jeweils eine Probe 

von 100 mg zur RNA-Extraktion entnommen. Die weitere Beprobung fand im wöchentlichen 

Abstand für den Zeitraum von 35 Tagen statt. Diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal 

durchgeführt. 



Brät für sterilisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.2) wurde mit Gehirngewebe vom 

Kalb wie folgt mit der Moulinette gemischt und je 100 g in 200 ml Probengefäße eingefüllt 

(Tabelle 11): 

60



Konzentration 

im Fleischerzeugnis 


Einwaage an 


0 % 100 g 0 g 

0, 25 % 199,5 g 0,5 g 

0,5 % 199 g 1 g 

1 % 99 g 1 g 

5 % 95 g 5 g 

100 % 0 g 10 g 

In dieser Versuchsreihe wurde ebenfalls zusätzlich ein 200 ml Probengefäß mit 100 g Brät 

ohne Gehirngewebe mitgeführt, in das ein Temperaturmessfühler in Form eines 

Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der Kerntemperatur zu verfolgen. 

Anschließend wurden die Probengefäße in ein auf 100°C geheiztes Wasserbad gegeben und 

für 65 Minuten gebrüht. Von den abgekühlten Brühwursterzeugnissen wurde anschließend je 

100 mg Probe für die RNA-Extraktion abgewogen. Die weitere Beprobung fand auch hier im 

wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 28 Tagen statt. Auch diese Versuchsreihe 

wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

3.2.5.2 Herstellung von Vollkonserven 

Auch in diesem Versuch wurde Brät für sterilisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.2) 

mit Gehirngewebe vom Kalb wie folgt mit der Moulinette gemischt und je 200 g in 230 ml 

Konservengläser eingefüllt (Tabelle 12): 


Konzentration 

im 

Einwaage an Brät Einwaage an Gehirngewebe 

Fleischerzeugnis 

0 % 200 g 0 g 

0, 25 % 199,5 g 0,5 g 

0,5 % 199 g 1 g 

1 % 198 g 2 g 

5 % 190 g 10 g 

61


Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt: 

A) Produktion eines einfachen Satzes an Vollkonserven mit anschließender 

Beprobung im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum von 28 Tagen. Die 

geöffneten Konserven wurden bei 4°C gelagert 

B) Produktion eines dreifachen Satzes an Vollkonserven mit anschließender 

Beprobung im vier-wöchentlichen Abstand. Die Beprobung fand an Tag 0, Tag 28 

und an Tag 56 statt. Die nicht angebrochenen Konserven wurden bei 

Raumtemperatur gelagert 

Für die Beprobung wurden jeweils 100 mg einer Probe für die RNA-Extraktion abgewogen. 

Zudem wurde bei beiden Versuchsansätzen jeweils eine Konserve mit 0 % bovinem 

Gehirngewebe mit einer Messelektrode versehen, um den Verlauf der Kerntemperatur 

verfolgen zu können. Die dabei ermittelten F-Werte werden folgendermaßen definiert: 

10 C 

F ° °C 

121 

[min] = F S -Werte 

Bei der unter B) genannten Versuchsreihe wurden aufgrund des niedrigen 

Fassungsvermögens der Moulinette pro Konzentrationsstufe drei Aliquots aus der gleichen 

Brät-Gehirngewebe-Masse hergestellt, die anschließend gründlich miteinander vermengt 

wurden. Somit entstand pro Konzentrationsstufe 600 g Brät, das in drei gleiche Portionen zu 

200 g geteilt und dann separat in 230 ml Konservengläser abgefüllt wurde. Nachfolgend 

wurden die befüllten Konservengläser in einen Korimaten verbracht und gekocht. 

In das Steuerprogramm des Korimaten wurden zuvor folgende Parameter eingegeben: 

1. Kerntemperatur: max. 110°C 

2. Kesseltemperatur: max. 115°C 

3. F-Wert (F S ): 4 

3.2.5.3 Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in einen Leberwursterzeugnis 

Leberwurstbrät (Kapitel 3.2.2) wurde mit bovinem Gehirngewebe wie folgt in der Moulinette 

homogen vermengt (Tabelle 13): 

62


Tabelle 13: Dotierung der Leberwurstmasse mit Rindergehirngewebe 

Konzentration 

im 


Einwaage an 

Leberwurstmasse 

Einwaage an 


0 % 300 g 0 g 

0, 25 % 299,25 g 0,75 g 

0,5 % 298,5 g 1,5 g 

1 % 297 g 3 g 

5 % 285 g 15 g 

Die Moulinette wurde nach der Herstellung jeder Konzentrationsstufe gründlich mit Wasser 

und Seifenlauge gereinigt. Die Leberwurstmasse jeweils in Walsroder Kunstdarm gefüllt und 

die einzelnen Konzentrationsstufen mit verschiedenfarbigen Wurstbändern gekennzeichnet. 

Die Würste wurden anschließend in feste Plastikbeutel vakuum-eingeschweißt, um eine 

mögliche Kontamination des Kochkessels mit bovinen Gehirngewebe durch austretende 

Wurstmasse zu verhindern. Danach wurden die Würste im Kochkessel mit 80°C 

Wassertemperatur für 85 Minuten gegart. Dabei fand in den ersten 15 Minuten die 

Temperaturangleichung der Würste an das Wasserbad statt, während der eigentliche 

Garvorgang 70 Minuten dauerte. Daraufhin wurden die Würste in ein mit kaltem Wasser 

gefülltes Wasserbecken verbracht und während des Auskühlungsvorganges durchgeknetet, 

um möglichen Fettabsatz zu vermeiden. Nachdem die Würste abgekühlt waren, wurden sie 

über Nacht in ein Kühlhaus verbracht. Am nächsten Tag wurden die Würste für die RNA- 

Extraktion beprobt. Die weitere Beprobung fand im wöchentlichen Abstand für den Zeitraum 

von 28 Tagen statt. Auch diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

3.2.5.4 Einfluss von Gewebe des peripheren Nervensystem (PNS) auf den Nachweis 

boviner GFAP-mRNA in einem Brühwursterzeugnis 

Bei diesem Versuch wurde Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.1.1) 

wie folgt mit bovinem peripheren Nervengewebe (Kapitel 3.1.1.2) vermengt (Tabelle 14): 

63


Tabelle 14: Dotierung des Brätes mit bovinem peripheren Nervengewebe 

Konzentration 

im 



Einwaage an peripheren 

Nervengewebe (PNS) 

0 % 100 g 0 g 

0, 25 % 199,5 g 0,5 g 

0,5 % 199 g 1 g 

1 % 99 g 1 g 

5 % 95 g 5 g 

Die jeweiligen Brät-PNS-Gemische wurden anschließend nochmals in der Moulinette 

vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des peripheren Nervengewebes in der 

Brühwurstmasse zu gewährleisten. Dann wurden je 100 g abgewogen und separat in 200 ml 

Probengefäße unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. Zusätzlich wurden bei 

dieser Versuchsreihe 10 g natives, bovines peripheres Nervengewebe und 10 g natives 

Gehirngewebe vom Kalb als Kontrollen jeweils separat in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen 

gefüllt. Nachfolgend wurden die Probengefäße für 65 Minuten in ein Wasserbad mit 75°C 

Wassertemperatur verbracht und von den abgekühlten Brühwurstprodukten, dem erhitzten 

peripheren Nervengewebe sowie dem bovinen Gehirngewebe jeweils eine Probe von 100 mg 

für die RNA-Extraktion entnommen. Parallel wurde als Positivkontrolle eine Probe von 

100 mg des nativen, bovinen peripheren Nervengewebes für die RNA-Extraktion gezogen. 

Diese Versuchsreihe wurde insgesamt dreimal durchgeführt. 

3.2.6 Untersuchungen zum Einfluss fleischtechnologischer Parameter auf den 

Nachweis porciner GFAP-mRNA 

3.2.6.1 Herstellung einer mit Gehirngewebe dotierten Brühwurst bei 80°C 


Brät für pasteurisierte Brühwursterzeugnisse (Kapitel 3.2.1.2.1) wurde mit porcinem, 

homogenisierten Gehirngewebe (Kapitel 3.1.1.1) wie folgt für die verschiedenen 

Konzentrationsstufen vermengt (Tabelle 15): 

64


Tabelle 15: Dotierung des Brätes aus Schweinefleisch mit porcinem Gehirngewebe 

Konzentration 

im 



Einwaage an 

Schweinegehirnhomogenat 

0 % 100 g 0 g 

0, 25 % 199,5 g 0,5 g 

0,5 % 199 g 1 g 

1 % 99 g 1 g 

5 % 95 g 5 g 

100 % 0 g 10 g 

Die einzelnen Brät-Schweinegehirn-Gemische wurden anschließend in der Moulinette 

vermengt, um eine möglichst homogene Verteilung des Gehirngewebes in der 

Brühwurstmasse zu erreichen. Von den so vermengten Gemischen wurde 100 g abgewogen 

und jeweils separat in 200 ml Probengefäße sowie 10 g natives Gehirngewebe in ein 15 ml 

Zentrifugenröhrchen unter Vermeidung von größeren Luftblasen eingefüllt. Zusätzlich wurde 

ein Probengefäß mit 100 g Brät ohne Gehirngewebe mitgeführt, in das ein 

Temperaturmessfühler in Form eines Thermometers gegeben wurde, um den Verlauf der 

Kerntemperatur zu verfolgen. Die Reaktionsgefäße wurden nachfolgend für 65 Minuten in ein 

Wasserbad mit 75°C Wassertemperatur verbracht. Nach Abkühlung wurde von den 

Brühwurstprodukten jeweils 100 mg für die RNA-Extraktion abgewogen. Die weitere 

Beprobung fand im wöchentlichen Abstand über einen Zeitraum von 28 Tagen statt. Die hier 

beschriebene Versuchsreihe wurde insgesamt viermal durchgeführt. 

65

Ergebnisse 

4 Ergebnisse 

4.1 Untersuchungen zur Gewebespezifität von GFAP-mRNA 

Bei den Untersuchungen zur Gewebespezifität von GFAP-mRNA wurden bei Schwein und 

Schaf neben der Untersuchung nativer Gewebe jeweils vier verschiedene Versuchsreihen 

hinsichtlich der Erhitzung der Gewebe durchgeführt: 

1. Erhitzung der Gewebe für 20 Minuten bei 75°C im Wasserbad 




Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt hauptsächlich tabellarisch. Dabei steht ein „+“ für den 

Nachweis von GFAP-mRNA durch RT-PCR, während ein „−“ für ein negatives Ergebnis der 

RT-PCR steht. 

Zwischen der Schlachtung der Tiere am Tag 0 und dem Untersuchungszeitpunkt lagen etwa 

vier Stunden. Bei dem Untersuchungszeitpunkt an Tag 1 lag der Schlachtungszeitpunkt etwa 

24 Stunden zurück. 

4.1.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schweinegewebe 

Bei der Untersuchung der porcinen Gewebe wurde die PCR mit den Primern GFAPpork1 und 

GFAPpork2 verwendet (s. Kapitel 3.2.6.3). 

4.1.1.1 Untersuchung nativer Gewebe 

Zunächst wurden verschiedene Gewebe des Schweins (s. Tabelle 16) im nativen Zustand, d.h. 

bei 4°C gekühlt, etwa vier Stunden post mortem (T 0) und 24 Stunden post mortem (T 1) auf 

das Vorhandensein der GFAP-mRNA überprüft. Dieser Versuch wurde zweimal 


66

Ergebnisse 

Tabelle 16: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen Schweinegeweben 

Gewebe 

Versuch 1 Versuch 2 

T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b 

Lunge - - - + 

Leber + - + + 

Niere + - + + 

Milz + - + + 

Lymphknoten - + - - 

Muskulatur + + + + 

Herz + + + + 

Rückenmark + + + + 

Gehirn + + + + 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Aus diesen Ergebnissen wurde ersichtlich, dass neben den Geweben Rückenmark und Gehirn 

auch die anderen untersuchten Gewebe an Tag 0, sowie an Tag 1, ein positives GFAPmRNA-Signal 

ergeben können (Tabelle 16). Basierend auf den Untersuchungen zur 

Gewebespezifität der GFAP-mRNA beim Rind (SEYBOLD et al 2003) wurde das Gewebe 

beim Schwein dem nachfolgend beschriebenen Erhitzungsversuch unterzogen. 

4.1.1.2 Untersuchung erhitzter Gewebe (75°C, 20 Minuten) 

Bei diesen Versuchen wurde neben den erhitzten Geweben jeweils eine Kontrolle mit nativem 

Gewebe mitgeführt, um eine Aussage darüber treffen zu können, ob das untersuchte Gewebe 

im nativen Zustand ein positives GFAP-mRNA-Signal hatte, und dieses Signal durch den 

angewandten Erhitzungsschritt inaktiviert werden konnte. 

Dieser Versuchsaufbau wurde zur besseren statistischen Absicherung dreimal wiederholt. Die 

bei diesen Untersuchungen erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 

zusammengefasst. 

67

Ergebnisse 

Tabelle 17: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (75°C, 20 min) 

Gewebe 

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 

nativ erhitzt nativ erhitzt nativ Erhitzt 

T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b 

Lunge + + - - - - - - + - - - 

Leber + + - - - - - - - - - - 

Niere + + - - + + - - + + - - 

Milz + + + - + - + - + - + - 

Lymphknoten + - - - - - - - - - - - 

Muskulatur + + + - + + + + + + + + 

Herz + + + + + + + + + + + + 

Rückenmark + + + + + + + + + + + + 

Gehirn + + + + + + + + + + + + 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Wie aus Tabelle 17 ersichtlich, konnten mit der Erhitzung der Gewebe auf 75°C im 

Wasserbad für 20 Minuten nur die Signale der GFAP-mRNA von Lunge, Leber, Niere und 

Lymphknoten sicher inaktiviert werden. Der Nachweis der GFAP-mRNA aus Milz-, 

Muskulatur-, Herz-, Rückenmark- und Gehirngewebe ließ sich durch die Erhitzung nicht 

beeinflussen (Tabelle 17). In Abbildung 1 ist beispielhaft der Nachweis porciner GFAPmRNA 

aus Versuch 1 Tag 0 in einer Agarosegelelektrophorese mit einem 2,5 prozentigen 

Agarosegel dargestellt. Die Abbildung zeigt zum einen die 168 bp großen Banden der GFAPmRNA 

Amplifikate, die bei allen untersuchten nativen Gewebe und in dem erhitzten Gewebe 

bei Milz, Muskulatur, Herz, Rückenmark und Gehirn vorhanden sind. Die etwa 950 bp 

großen Banden zeigen das Amplifikationsprodukt der genomischen DNA der bovinen GFAPmRNA. 

68

Ergebnisse 

natives Gewebe 

erhitztes Gewebe (75°C, 20 min). 

Marker 

Leber 

Milz 

Lunge 

Niere 

Lymphknoten 

Muskulatur 

Herz 

Rückenmark 

Gehirn 

Leber 

Milz 

Lunge 

Niere 

Lymphknoten 

Muskulatur 

Herz 

Rückenmark 

Gehirn 

ca. 957 bp 

168 bp 

Abb. 1: Nachweis porciner GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten (75°C, 20 min) 

Geweben durch RT-PCR 

Beispiel einer Agarosegelelektrophorese (2,5 %iges Agarosegel) (4.1.1.2, Versuch 1 

Tag 0) 

Marker puC 19/Msp I (Bandengrößen von oben nach unten: 489/501 bp, 404 bp, 

331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp, 110/111 bp) 


Basierend auf den vorangegangenen Versuchen sollte hier untersucht werden, inwieweit eine 

höhere und längere Temperatureinwirkung auf das Gewebe, die Signale der GFAP-mRNA 

inaktivieren kann. Im Vergleich zu dem vorangegangenen Versuch wurde bei dieser 

Untersuchung das Gewebe vor der weiteren Verarbeitung in einer Moulinette zerkleinert, um 

die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Anhäufung von peripheren Nervenfasern in dem 

beprobten Gewebestück zu minimieren. Es wurde eine Kontrolle mit nativem Gewebe 

mitgeführt. Die Darstellung der Ergebnisse dieser Untersuchungen ist in der nachfolgenden 

Tabelle 18 wiedergegeben. 

69

Ergebnisse 

Tabelle 18: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (80°C, 30 min) 

Gewebe 


nativ erhitzt nativ erhitzt nativ Erhitzt 


Lunge - - - - + + - - - - - - 

Leber - - - - + + - - - + - - 

Niere + + - - + + - - + - - - 

Milz + + - - + + - - + - - - 

Lymphknoten - - - - + + - - - - - - 

Muskulatur + + - - + + + + + + - - 

Herz + + + + + + + + + + - + 

Rückenmark + + + + + + + + + + + + 

Gehirn + + + + + + + + + + + + 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die Signale der GFAP-mRNA des 

Milzgewebes durch die höhere Temperatureinwirkung inaktiviert werden konnten. Bei 

Muskelgewebe konnten die Signale der GFAP-mRNA nicht sicher inaktiviert werden. Bei 

Versuch 2 war sowohl an Tag 0 als auch an Tag 1 noch ein positives Signal nach der 

Erhitzung des Muskelgewebes zu finden. Die Detektion der GFAP-mRNA-Signale des 

Herzgewebes wurden durch den Erhitzungsvorgang kaum beeinflusst. Nur bei Versuch 3 war 

an Tag 0 das Signal der GFAP-mRNA durch die Erhitzung inaktiviert worden. Auch bei 

diesem Versuchsansatz hatte sich gezeigt, dass die Signale der GFAP-mRNA des 

Rückenmark- und Gehirngewebes gegenüber dieser Temperatureinwirkung beständig waren. 

4.1.1.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten; 95°C, 60 Minuten) 

Diese Versuche basierten auf den Ergebnissen aus den Versuchen 4.1.1.3, bei denen sich 

gezeigt hatte, dass die GFAP-mRNA-Signale von Muskulatur- und Herzgewebe nach einer 

Erhitzung auf 80°C in Wasserbad für 30 Minuten und der Zerkleinerung durch die Moulinette 

nicht inaktiviert werden konnten. Deshalb wurden diese Gewebe einer besonders hohen 

Erhitzung ausgesetzt, um zu untersuchen, ob die Signale der GFAP-mRNA überhaupt durch 

den Faktor Temperatur zu inaktivieren waren. Der Zerkleinerungsschritt mit der Moulinette 

wurde beibehalten. Parallel zu der Erhitzungsdauer von 30 Minuten wurde ein Versuchsansatz 

70

Ergebnisse 

mit einer Erhitzungsdauer von 60 Minuten mitgeführt, um zu prüfen, ob neben der 

Temperaturerhöhung die Verlängerung der Erhitzungsdauer die Signale der GFAP-mRNA 

inaktivieren kann. 

Tabelle 19: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben (95°C, 30 min; 

95°C, 60 min) 

Versuche 1 – 3 

Gewebe 

nativ 

95°C für 30 95°C für 60 

Minuten 

Minuten 

T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b 

Muskulatur +/+/+ +/+/- +/+/- +/-/- +/-/- -/-/- 

Herz +/+/+ +/+/- -/+/- -/-/- -/-/- -/-/- 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

Gehirn +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass die GFAP-mRNA-Signale von Muskulatur- und 

Herzgewebe erst an Tag 1 bei einer Temperatureinwirkung von 95°C für 60 Minuten sicher 

zu inaktivieren waren (Tabelle 19). An Tag 0 war bei einem der drei Versuche noch ein 

positives Signal der GFAP-mRNA aus Muskelgewebe aufgetreten (Tabelle 19). Bei 

Rückenmark- und Gehirngewebe waren die Signale der GFAP-mRNA gegenüber dieser 

hohen Temperatureinwirkung beständig (Tabelle 19). 

4.1.1.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 h) und nachfolgend erhitzter Gewebe 

(80°C, 30 min) 

Da sich die Signale der GFAP-mRNA von Muskulatur- und Herzgewebe erst durch massive 

Temperatureinwirkung inaktivieren ließen (s. Kapitel 4.1.1.4, Tabelle 19), sollte in einem 

weiteren Versuchsansatz, im Hinblick auf eine mögliche Inaktivierung der GFAP-mRNA- 

Signale, zum einen die Wirkung von Kälte und zum anderen die Kombination von Kälte- und 

Wärmeeinwirkung auf den Nachweis der GFAP-mRNA in Muskulatur- und Herzgewebe 

untersucht werden. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle 20 

dargestellt. 

71

Ergebnisse 

Tabelle 20: Nachweis von GFAP-mRNA aus tiefgekühlten (-20°C, 24 h) und nachfolgend 

erhitzten Geweben (80°C, 30 min) 


Gewebe 

nativ gefroren gefroren + erhitzt 

T 0 a /T 1 b T 1 b T 1 b 

Muskulatur +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

Herz +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Es zeigte sich, dass der alleinige Gefrierprozess, sowie ein Gefrierprozess mit nachfolgender 

Erhitzung beim Schwein unter den gegebenen Bedingungen keinen inaktivierenden Einfluss 

auf den Nachweis der GFAP-mRNA des Muskulatur-, Herz- und des Rückenmarkgewebes 

hatten. 

Somit konnte das Signal der GFAP-mRNA in Muskulatur- und Herz-, Rückenmark- und 

Gehirngewebe nicht durch starke Erhitzung (s. Kapitel 4.1.1.4) inaktiviert werden. In 

Muskulatur-, Herz- und Rückenmarkgewebe konnten die GFAP-mRNA-Signale weder durch 

alleinige Kältewirkung, noch durch eine Kombination von Kälte- und Wärmewirkung (s. 

Kapitel 4.1.1.5) inaktiviert werden. Somit könnten beim Schwein die GFAP-mRNA-Signale 

des Muskel- und Herzgewebes bei der Nutzung der GFAP-mRNA als Marker für ZNS- 

Gewebe als mögliche Störsignale in einem Fleischprodukt auftreten. 

4.1.1.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 

60 min) 

In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob aus peripherem Nervengewebe ein GFAPmRNA 

Nachweis möglich war und ob sich das Signal durch Erhitzung inaktivieren ließ. Als 

Kontrolle diente eine mitgeführte porcine Rückenmarkgewebeprobe. In der nachfolgenden 

Tabelle 21 sind die Ergebnisse zusammengefasst. 

72

Ergebnisse 

Tabelle 21: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativem und erhitztem peripheren 

porcinen Nervengewebe (PNS) 

Gewebe 

nativ 


erhitzt 

PNS +/+/+ +/+/+ 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ 

Die Untersuchungen haben gezeigt, dass die Signale der GFAP-mRNA aus Geweben des 

peripheren Nervensystems nachweisbar waren, und sich durch die Erhitzung nicht 

inaktivieren ließen, so dass mit durch PNS-Gewebe verursachten falsch positiven GFAPmRNA-Signalen 

bei der Untersuchung eines Fleischerzeugnisses gerechnet werden muss. 

4.1.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus Schafgewebe 

Bei der Untersuchung der Gewebe des Schafes wurde die PCR mit den Primern GFAPforw 

und GFAPrev verwendet (s. Kapitel 3.2.6.1). 

4.1.2.1 Untersuchung nativer Gewebe 

Im Gegensatz zu den Versuchen mit porcinen Gewebe, wurde beim Schaf das native Gewebe 

parallel mit den Erhitzungsversuchen untersucht. Die Ergebnisse aus diesen Arbeiten sind 

daher bei den Erhitzungsversuchen aufgeführt. 

Bei der Untersuchung des nativen Gewebes vom Schaf hatte sich gezeigt, dass vor allem bei 

Nieren- und Muskelgewebe positive Signale der GFAP-mRNA auftraten (s. Tabelle 22, 23, 

und 24). Dagegen waren bei Leber- und Herzgewebe nur vereinzelt positive Signale der 

GFAP-mRNA nachweisbar (s. Tabelle 22, 23, und 24). 

73

Ergebnisse 


Wie in dem vorangegangenen Kapitel bereits erwähnt, wurde bei den Untersuchungen des 

Schafgewebes neben dem erhitzten Gewebe jeweils das native Gewebe mitgeführt, um eine 

Aussage darüber treffen zu können, ob durch den Erhitzungsschritt die möglicherweise 

vorhandenen GFAP-mRNA-Signale inaktiviert werden konnten. Nachfolgend werden die 

Ergebnisse tabellarisch dargestellt (Tabelle 22). 

Tabelle 22: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten Schafgeweben 

(75°C, 20 min) 

Gewebe 


nativ erhitzt nativ erhitzt nativ erhitzt 


Lunge - - - - - - - - - - - - 

Leber + - - - - - - - - - - - 

Niere + + + - + + - + + + + - 

Lymphknoten - - - - - - - - - - - - 

Muskulatur + + + + + + - - + + + + 

Herz + - - - - - - - + - + - 

Rückenmark + + + + + + + + + + + + 

Gehirn + + + + + + + + + + + + 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Bei der Untersuchung des Schafgewebes hatte sich herausgestellt, dass durch die 

Temperatureinwirkung die Signale der GFAP-mRNA von Lebergewebe inaktiviert werden 

konnten (Tabelle 22). Bei Muskel-, Herz- und Nierengewebe reichte diese 

Temperatureinwirkung jedoch nicht aus, um die Signale der GFAP-mRNA zu inaktivieren 

(Tabelle 22). Die Signale der GFAP-mRNA von Rückenmark- und Gehirngewebe waren 

gegenüber dieser Temperatureinwirkung resistent (Tabelle 22). 

74

Ergebnisse 


Basierend auf den vorangegangenen Versuchen beim Schwein sollte auch hier untersucht 

werden, inwieweit eine höhere und längere Hitzeeinwirkung auf das Gewebe die Signale der 

GFAP-mRNA inaktivieren konnte. Im Gegensatz zu den Gewebe-Versuchen beim Schwein, 

wurden hier nur Nieren-, Muskulatur- und Herzgewebe untersucht, da die Signale der GFAPmRNA 

der anderen Gewebe bereits durch die im vorangegangenem Versuch angewandte 

Temperatureinwirkung inaktiviert wurden. Die jeweiligen nativen Gewebe wurden auch 

hierbei mitgeführt. Als Kontrolle diente hier das Rückenmarkgewebe, da sich das GFAPmRNA-Signal 

dieses Gewebes, ebenso wie der des Gehirngewebes, bereits bei den 

Versuchen mit Rinder- und Schweinegewebe als beständig gegenüber den verschiedenen 

Versuchsbedingungen erwiesen hatte. 

Tabelle 23: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten Schafgeweben 

(80°C, 30 min) 


Gewebe nativ erhitzt nativ erhitzt nativ erhitzt 


Niere + - - - - - - - - + - - 

Muskulatur + + - + + + + + + + - + 

Herz + - - - - - - + - + - - 

Rückenmark + + + + + + + + + + + + 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Die Signale der GFAP-mRNA aus nativem Nierengewebe wurden durch den 

Erhitzungsschritt inaktiviert (Tabelle 23). Die GFAP-mRNA-Signale des Herzgewebes waren 

nach dem Erhitzungsprozess meist inaktiviert (Tabelle 23). Da jedoch bei Versuch 2 ein 

positives Signal nach Erhitzung auftrat, scheint die Inaktivierung nicht ausreichend sicher zu 

sein (Tabelle 23). Die Signale der GFAP-mRNA aus Muskelgewebe konnten im Vergleich zu 

Herzgewebe kaum inaktiviert werden (Tabelle 23). Die GFAP-mRNA des Rückenmarks 

erwies sich als stabil. 

75

Ergebnisse 

4.1.2.4 Untersuchung erhitzter Gewebe (95°C, 30 Minuten, 95°C, 60 Minuten) 

Beim Schaf haben die Ergebnisse aus Versuch 4.1.2.3 gezeigt, dass die GFAP-mRNA- 

Signale von Muskulatur- und Herzgewebe nach einer Erhitzung auf 80°C im Wasserbad für 

30 Minuten nicht ausreichend inaktiviert wurden. Deshalb wurde auch an Schafgeweben 

weitere Versuche mit höherer und längerer Temperatureinwirkung durchgeführt, um zu 

untersuchen, ob die Signale der GFAP-mRNA dadurch zu inaktivieren waren. 

Tabelle 24: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten Schafgeweben (95°C, 

30 min, 95°C, 60 min) 


Gewebe 

nativ 

95°C für 30 95°C für 60 

Minuten 

Minuten 

T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b T 0 a T 1 b 

Muskulatur +/+/+ +/+/- +/+/+ -/-/+ -/+/+ +/+/+ 

Herz +/+/+ +/-/- +/-/- -/-/- +/-/- -/-/- 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

a T 0: 4 h p.m.; b T 1: 24h p.m. 

Bei den Untersuchungen des Schafgewebes hatte sich herausgestellt, dass die Signale der 

GFAP-mRNA aus Herz- und Muskelgewebe durch die hier angewandte Hitzeeinwirkung 

nicht sicher zu inaktivieren waren (Tabelle 24). Trotz der höheren Temperatur und der 

längeren Hitzeeinwirkung ergaben sich im Vergleich zu Versuch 4.1.2.3 keine Änderungen in 

der Aktivität der GFAP-mRNA-Signale (Tabelle 23 und 24). Bei Herzgewebe war nur an 

Tag 1 ein negativer GFAP-mRNA Nachweis feststellbar (Tabelle 24). 

4.1.2.5 Untersuchung tiefgekühlter (-20°C, 24 Stunden) und nachfolgend erhitzter 

Gewebe (80°C, 20 Minuten) 

Basierend auf Untersuchungen mit porcinen Geweben, wurde bei Muskulatur- und 

Herzgewebe des Schafes die Einwirkung von Kälte auf die Nachweisbarkeit der GFAPmRNA 

Signale untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden 

Tabelle 25 zusammengefasst. 

76

Ergebnisse 

Tabelle 25: Nachweis von GFAP-mRNA aus tiefgekühltem (-20°C, 24 h) und nachfolgend 

erhitztem Schafgewebe (80°C, 20 min) 

Gewebe 


nativ gefroren gefroren + erhitzt 

Muskulatur -/-/+ -/-/+ -/-/+ 

Herz -/+/- -/+/- -/-/- 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ +/+/+ 

Bei Muskulatur- und Herzgewebe war durch den Gefrierprozess keine Inaktivierung der 

GFAP-mRNA-Signale feststellbar (Tabelle 25). Die Untersuchung der gefrorenen und 

nachfolgend erhitzten Gewebe zeigte keine Abweichung von den Versuchen mit alleinig 

erhitzten Geweben (Kapitel 4.1.2.3 und 4.1.2.4 ): während das Signal der GFAP-mRNA bei 

Herzgewebe inaktiviert wurde, blieb das Signal bei Muskelgewebe erhalten. Somit ist auch 

beim Schaf keine sichere Inaktivierung des GFAP-mRNA-Nachweises aus Herz- und 

Muskelgewebe möglich. 

4.1.2.6 Untersuchung von nativem und erhitztem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 

Minuten) 

Ebenso wie bei der Untersuchung des peripheren Nervengewebes vom Schwein, sollte auch 

für das ovine periphere Nervengewebe untersucht werden, ob dieses ein 168 bp großes 

GFAP-mRNA-Signal ergab, und ob sich das Signal durch Erhitzung inaktivieren ließ. Die 

Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 26 zusammengefasst. 

Tabelle 26: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativem und erhitztem ovinem peripheren 

Nervengewebe (80°C, 60 min) 

Gewebe 

nativ 


erhitzt 

PNS +/+/+ +/+/+ 

Rückenmark +/+/+ +/+/+ 

Bei der Untersuchung ovinen peripheren Nervengewebe waren ebenfalls GFAP-mRNA- 

Signale vorhanden, die sich durch die Erhitzung nicht inaktivieren ließen (Tabelle 26). Somit 

77

Ergebnisse 

muss auch beim Schaf mit durch PNS-Gewebe verursachten falsch positiven GFAP-mRNA- 

Signalen bei der Untersuchung von Fleischerzeugnissen gerechnet werden. 

4.2 Fleischerzeugnisse, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an 

Gehirngewebe dotiert wurden 

4.2.1 Fleischerzeugnisse dotiert mit Rindergehirngewebe 

Die selbst hergestellten Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 3.2.1.1) wurden mit Rindergehirn 

(s. Kapitel 3.1.1.1) in folgenden Konzentrationen dotiert: 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 %. 

Das Fleischerzeugnis ohne Gehirn diente als Negativkontrolle, bei den Versuchen 

mitgeführtes reines Gehirngewebe als Positivkontrolle. Bei den Versuchen mit Brühwurst 

(75°C Gartemperatur), Leberwurst und den Vollkonserven diente das Fleischerzeugnis mit 

5 % Gehirngewebe-Beimengung als Positivkontrolle. Bei Vollkonserven wurde eine RNA- 

Probe aus reinem Gehirngewebe als Positivkontrolle für die RT-PCR eingesetzt. Bei allen 

Fleischerzeugnissen, die mit Rindergehirn dotiert wurden, wurde die PCR mit den Primern 

GFAPforw und GFAPrev eingesetzt (s.a. Kapitel 3.2.6.1). 


(Gartemperatur 75°C) 

Die Brühwursterzeugnisse wurden bei 75°C im Wasserbad für 65 Minuten erhitzt (s. Kapitel 

3.2.5.1.1). Die mit dem Temperaturmessfühler ermittelte Kurve der Kerntemperatur hatte 

ergeben, dass im Kern des Brätes eine Höchsttemperatur von 68°C für den Zeitraum von 

mindestens 15 Minuten erreicht werden konnte. 

Die mittels der RT-PCR und nachfolgender Agarosegelelektrophorese detektierten Banden 

des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats sind in der nachfolgenden Tabelle 27 

dargestellt. Hierbei steht ein „+“ für den Nachweis des 168 bp großen GFAP-mRNA- 

Amplifikats durch RT-PCR, und ein „−“ für ein negatives Ergebnis der RT-PCR. 

78

Ergebnisse 

Tabelle 27: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierter Brühwurst 

vom Rind (Brühtemperatur 75°C) über einen Zeitraum von 42 Tagen (T) 

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 

T 

% 

0 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 0 0,5 1 5 0 0,5 1 5 

0 - + + + - + + + + - + + + - + + + 

7 - + + + - + + + + - + + + - + + + 

14 - + + + - + + + + - + + + - + + + 

21 - + + + - + + + + - + + + - + + + 

28 - + + + - + - * + + - + + + - + + + 

35 - + + + - + + + + - + + + - + + + 

42 - + + + Proben aufgrund hgr. Verderb verworfen 

* Probe aus verschimmelten Bereich entnommen 

Diese Versuchsreihe hatte gezeigt, dass bei nicht mit Rindergehirngewebe dotierten 

Brühwurstprodukten keine GFAP-mRNA-Signale nachweisbar waren (Tabelle 27). Bei den 

mit Rindergehirn dotierten Brühwurstprodukten war das Signal der GFAP-mRNA in allen 

gewählten Konzentrationsstufen für den Testzeitraum von 35 Tagen detektierbar (Tabelle 27). 

Das falsch negative Ergebnis bei Versuch 2 an Tag 28 bei der Konzentrationsstufe 0,5 % 

beruht möglicherweise darauf, dass die Probe aus einem verschimmelten Bereich der 

Brühwurst entnommen wurde. Somit war in 80 von insgesamt 81 getesteten, mit Rindergehirn 

dotierten, Brühwürsten ab einer Gehirngewebe-Konzentration von 0,25 % ein richtig positives 

Ergebnis nachweisbar. 

In Abbildung 2 ist beispielhaft der Nachweis der GFAP-mRNA aus einer mit Rindergehirn 

dotierten Brühwurst (Versuch 2, Tag 14) mittels Agarosegelelektrophorese mit einem 2,5 

prozentigen Agarosegel dargestellt. Bei den verschiedenen Konzentrationsstufen ist die Bande 

des 168 bp großen Amplifikats der GFAP-mRNA zu sehen. Die etwa 957 bp große Bande 

zeigt die Positivkontrolle mit Rinder-DNA. 

79

Ergebnisse 

957 bp 

Marker 

0 % 

0,5 % 

0,25 % 

1 % 

5 % 

Negativkontrolle RT-PCR 

Negativkontrolle PCR 

Positivkontrolle Rinder DNA 

Marker 

168 bp 

Abb.2: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit Rindergehirn dotierten Brühwurst 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR (aus Kapitel 4.2.1.1, Versuch 2, Tag 14) 

mittels Agarosegelelektrophorese (2,5 %iges Agarosegel). 


331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 

Negativkontrollen von RT-PCR und PCR (s. Kapitel 3.2.3.2 und 3.2.3.3) 

Positivkontrolle der PCR bestehend aus Rinder-DNA (s. Kapitel 3.2.3.3.1) 



Bei dieser Versuchsreihe wurden die Brühwursterzeugnisse bei 95°C für 65 Minuten im 

Wasserbad hergestellt (s. Kapitel 3.2.5.1.2), um die Hitzeempfindlichkeit des GFAP-mRNA- 

Nachweis zu testen. Zur Herstellung der mit bovinem Gehirngewebe (s. Kapitel 3.2.1.1) 

dotierten Brühwürste, wurde die Brätmasse für pasteurisierte Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 

3.2.1.1.1) verwendet. Die mittels der RT-PCR und nachfolgender Agarosegelelektrophorese 

ermittelten Signale des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats sind in der Tabelle 28 

80

Ergebnisse 

zusammengefasst. Hierbei steht ein „+“ für den Nachweis des 168 bp großen GFAP-mRNA- 

Amplifikats durch RT-PCR, und ein „−“ für ein negatives Ergebnis der RT-PCR. 

Die Aufzeichnungen der Kerntemperatur, die mit einem Temperaturmessfühler in Form eines 

Thermometers ermittelt wurden, ergaben, dass bei diesem Versuchsansatz eine 

Kerntemperatur von 89 °C erreicht wurde, die für den Zeitraum von mindestens 20 Minuten 

gehalten werden konnte. 




T 

% 

0 0,25 0,5 1 5 100 0 0,25 0,5 1 5 100 0 0,25 0,5 1 5 100 

0 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

7 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

14 - - - + + + - - + - - + - + + + + + 

21 - + - + + + - + + + + + - + + + + + 

28 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

Auch bei dieser Versuchsreihe wurde deutlich, dass zum einen keine falsch positiven 

Nachweise von GFAP-mRNA auftraten. Zum anderen war das Signal der GFAP-mRNA bei 

den mit Rindergehirngewebe dotierten Brühwursterzeugnissen trotz der höheren 

Hitzeeinwirkung ab einer Gehirngewebe-Konzentration von 0,25 % für den Probenzeitraum 

von 28 Tagen nachweisbar. Falsch negative Ergebnisse wurden in sechs von 60 dotierten 

Brühwürsten erhalten. Dabei war keine Abhängigkeit von der Konzentration des Hirngewebes 

sowie von der Lagerdauer und den nachgewiesenen falsch negativen Ergebnissen erkennbar. 



Bei diesen Versuchen wurden die Brühwursterzeugnisse bei 100°C für 65 Minuten im 

Wasserbad hergestellt (s. Kapitel 3.2.5.1.3), um den Einfluss von hoher 

Temperatureinwirkung auf den Nachweis von GFAP-mRNA zu testen. Zur Herstellung der 

mit bovinem Gehirngewebe (s. Kapitel 3.2.1.1) dotierten Brühwürste wurde die Brätmasse für 

81

Ergebnisse 

sterilisierte Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 3.2.1.1.2) verwendet. Die mittels der RT-PCR und 

nachfolgender Agarosegelelektrophorese nachgewiesenen Signale des 168 bp großen GFAPmRNA-Amplifikats 

wurden in Tabelle 29 zusammengefasst. Ein „+“steht für den Nachweis 

des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats durch RT-PCR und ein „−“ für ein negatives 

Ergebnis der RT-PCR. 

Bei diesem Versuchsansatz hatten die Messungen der Kerntemperatur, die mit einem 

Temperaturmessfühler in Form eines Thermometers ermittelt wurden, ergeben, dass eine 

Kerntemperatur von 91 °C erreicht wurde, die für den Zeitraum von 20 Minuten gehalten 

werden konnte. 




T 

% 

0 0,25 0,5 1 5 100 0 0,25 0,5 1 5 100 0 0,25 0,5 1 5 100 

0 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

7 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

14 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

21 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

28 - + + + + + - + + + + + - + + + + + 

In dieser Versuchsreihe konnten keine falsch positiven GFAP-mRNA Signale bei den nicht 

mit Rindergehirngewebe dotierten Brühwursterzeugnissen beobachtet werden (Tabelle 29). 

Das Signal der GFAP-mRNA war, im Gegensatz zu der vorangegangenen Versuchsreihe mit 

95°C Wasserbadtemperatur, bei den mit Rindergehirngewebe dotierten 

Brühwursterzeugnissen trotz der höheren Hitzeeinwirkung für den Probenzeitraum von 28 

Tagen bei allen Konzentrationsstufen konstant nachweisbar (Tabelle 29). Es traten keine 

falsch negativen Ergebnisse auf. 

82

Ergebnisse 

4.2.1.4 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn dotierten Leberwürsten 

Bei der Herstellung der Leberwürste konnte aufgrund der Brühbedingungen (in einem großen 

Kochkessel) keine Temperaturkurve ermittelt werden (s. Kapitel 3.2.5.2). Deswegen ist die 

Kerntemperatur der bei 80°C für 75 Minuten gebrühten Leberwürste bei diesem 

Versuchsaufbau nicht bekannt. Bei der RNA-Extraktion wurde bei der Untersuchung der 

Leberwürste ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt eingefügt, da in einem ersten Versuch bei 

Verwendung der herkömmlichen RNA-Extraktion (s. Kapitel 3.2.3.1) bei der Detektion des 

GFAP-mRNA-Signals mittels Agarosegelelektrophorese optisch schwache Banden 

nachweisbar waren. 

Die Signale des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats sind in der nachfolgenden 

Tabelle 30 mit einem „+“ für den Nachweis des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats 

durch RT-PCR und mit einem „−“ für ein negatives Ergebnis der RT-PCR zusammenfassend 

für die drei durchgeführten Versuche dargestellt. 

Tabelle 30: Nachweis von GFAPmRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten Leberwürsten 

über einen Zeitraum von 35 Tagen (T) 


T 

% 

0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 

0 - + + + + - + + + + - + + + + 

7 - - + + + - + + + + - - + + + 

14 - + + + + - + + + + - + + + + 

21 - + + + + - + + + + - + + + + 

28 - + + + + - + + + + - + + + + 

35 - + + + + Proben wegen hgr. Verderb verworfen 

Bei dieser Versuchsreihe wurde erneut deutlich, dass bei den nicht mit Rindergehirngewebe 

dotierten Leberwurstprodukten keine falsch positiven Signale der GFAP-mRNA auftraten 

(Tabelle 30). In den mit Rindergehirn dotierten Leberwürsten waren von insgesamt 64 

83

Ergebnisse 

beprobten Leberwürsten zwei falsch negative Signale der GFAP-mRNA in Proben mit der 

Konzentration von 0,25 % an Tag 7 nachweisbar. Die GFAP-mRNA-Signale waren, 

ansonsten in allen Konzentrationsstufen über den Versuchszeitraum von 28 Tagen stabil 

nachzuweisen (Tabelle 30). Somit scheint der relativ hohe Gehalt an Fettgewebe und die 

Verwendung enzymreichen Lebergewebes (s. Kapitel 3.3.3) den Nachweis der GFAP-mRNA 

in einem Leberwursterzeugnis nicht zu beeinflussen (Tabelle 30). Die zwei Ausnahmen 

bildeten die falsch negativen Proben bei der Konzentrationsstufe 0,25 % (Tabelle 30). 

4.2.1.5 Untersuchung von Vollkonserven 

In einer ersten Versuchsreihe „Vollkonserve I“ wurde ein mit bovinem Gehirngewebe 

dotiertes Konservenprodukt aus Brätmasse für sterilisierte Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 

3.2.1.1.2) hergestellt und unmittelbar nach der Herstellung, sowie im wöchentlichen Abstand, 

für einen Zeitraum von 21 Tagen untersucht (s. Kapitel 3.2.5.1.4). In der Zeit zwischen den 

Versuchen wurden die geöffneten Vollkonserven bei 4°C gelagert. 

In einer zweiten Versuchsreihe „Vollkonserve II“ wurde der dreifache Satz an Konserven aus 

Brätmasse für sterilisierte Fleischerzeugnisse produziert (s. Kapitel 3.2.1.1.2) und der erste 

Satz Konserven an Tag 1, der zweite Satz Konserven an Tag 28 sowie der dritte 

Konservensatz an Tag 56 untersucht (s. Kapitel 3.2.5.1.4). Als Positivkontrolle für eine 

erfolgreiche RT-PCR diente eine bei der c-DNA-Synthese und der PCR mitgeführte und 

bereits als positiv für das GFAP-mRNA-Signal getestete, Rindergehirngewebeprobe. Die 

Ergebnisse der mittels der RT-PCR und nachfolgender Agarosegelelektrophorese ermittelten 

Signale des 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats sind tabellarisch zusammengefasst, 

wobei ein „+“ für den Nachweis der GFAP-mRNA durch RT-PCR und ein „−“ für ein 

negatives Ergebnis der RT-PCR steht. 


(Vollkonserve I) 

Bei diesem Versuchsansatz hatten die Verlaufsmessungen der Temperatur ergeben, dass eine 


gehalten werden konnte. Der bei den einzelnen Versuchsreihen erreichte F-Wert (F S , s. 

Kapitel 3.2.5.2) lag bei über 5 (Versuch1:F S = 5,67; Versuch 2: F S = 5,31; Versuch 3: 

84

Ergebnisse 

F S = 5,29). Die Kesseltemperatur betrug 115°C. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden 

Tabelle zusammengefasst (Tabelle 31). 

Tabelle 31: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten Brühwürsten 

(Vollkonserve I) über einen Zeitraum von 21 Tagen (T) 


T 

% 

0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 

0 - + + + + - - + - + - - - - - 

7 - - - - - - - - - - - - - - + 

14 - - - - + - - - - + - - - - - 

21 - - - - + - - - - - - + - + - 

Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass von 48 getesteten, mit bovinem Gehirngewebe 

dotierten, Vollkonserven insgesamt 36 falsch negative Ergebnisse aufgetreten waren. Falsch 

positive Ergebnisse waren nicht nachweisbar (Tabelle 31). Dabei waren an Tag 0 bei den 

Versuchen 1 und 2 die wenigsten falsch negativen Ergebnisse nachweisbar, während bei 

Versuch 3 an Tag 21 die wenigsten falsch negativen Ergebnisse detektiert wurden 

(Tabelle 31). Bei der Konzentrationsstufe 5 % waren mit sechs richtig positiven Ergebnissen, 

von insgesamt 12 getesteten Proben, die wenigsten falsch negativen Ergebnisse aufgetreten 

(Tabelle 31). Augrund der inkonstanten Ergebnisse wurde der Beprobungszeitraum von 

ursprünglich 28 Tagen auf 21 Tage verkürzt. 

Abbildung 3 zeigt beispielhaft den Nachweis der GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn 

dotierten Konserven (Versuch 1,Tag 0). Bei den verschiedenen Konzentrationsstufen ist die 

Bande des 168 bp großen Amplifikats der GFAP-mRNA zu sehen. Die 957 bp große Banden 

bei den Konzentrationsstufen 0 %, 0,5 % und 5 % zeigen das Amplifikationsprodukt der 

genomischen DNA der bovinen GFAP-mRNA. 

85

Ergebnisse 

Marker 

0 % 

0,25 % 

0,5 % 

1 % 

5 % 

Positivkontrolle (bovines ZNS) 



Marker 

957 bp 

168 bp 

Abb. 3: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit Rindergehirn dotierten Vollkonserve 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR (aus Kapitel 4.2.1.4.1, Versuch 1, Tag 0) 



331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 


Positivkontrolle von RT-PCR bestehend aus bereits positiv getestetem bovinem 

Gehirngewebe (s. Kapitel 3.2.3.2 und 3.2.3.3.1) 


(Vollkonserve II) 

Die Messungen der Kerntemperatur hatten bei diesem Versuchsansatz ergeben, dass eine 


gehalten werden konnte. Der bei den einzelnen Versuchsreihen erreichte F S -Wert lag bei 

über 5 (Versuch1: F S = 5,7; Versuch 2: F S = 5,3; Versuch 3: F S = 5,4). Die Kesseltemperatur 

betrug 115°C. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse der ermittelten GFAPmRNA-Signale 

zusammengefasst (Tabelle 32). 

86

Ergebnisse 

Tabelle 32: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten Brühwürsten 

(Vollkonserve II) über einen Zeitraum von 56 Tagen (T) 


T 

% 

0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 0 0,25 0,5 1 5 

0 - + + + + - + + + + - + + + + 

28 - - - - + - - - + - - - - - - 

56 - + - + + - - - + - - - - - - 

Unmittelbar nach der Herstellung der mit bovinem Gehirngewebe dotierten 

Brühwurstkonserve gelang in dieser Versuchsreihe der richtig positive GFAP-mRNA 

Nachweis in allen Konzentrationsstufen (Tabelle 32). Nach längerer Lagerdauer wurden an 

Tag 28 und Tag 56 hauptsächlich falsch negative Ergebnisse erzielt (Tabelle 32). Somit waren 

bei der Beprobung von insgesamt 36 mit Gehirngewebe dotierten Konserven 18 falsch 

negative Ergebnisse nachweisbar. Es wurden keine falsch positiven Ergebnisse beobachtet 

(Tabelle 32). 

4.2.1.6 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit peripherem Nervensystem (PNS) dotierten 

Brühwürsten 

In diesem Versuchsansatz sollte untersucht werden, ob bei Verwendung von PNS-Gewebe in 

einem Brühwursterzeugnis GFAP-mRNA-Signale nachweisbar sind. Untersucht wurde 

hierbei natives und erhitztes PNS-Gewebe, sowie die mit PNS-Gewebe dotierten 

Brühwursterzeugnisse (75°C, 65 min). Als Positivkontrolle diente hierbei ZNS-Gewebe vom 

Rind (s. Kapitel 3.2.5.3). 

Bei diesem Versuchsansatz hatten die Messungen der Temperatur ergeben, dass eine 


gehalten werden konnte. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengefasst 

dargestellt. Dabei steht PN für das native PNS-Gewebe, PE für das zusammen mit den 

87

Ergebnisse 

Brühwursterzeugnissen erhitzte PNS-Gewebe, und ZE für das erhitzte ZNS-Gewebe 

(Tabelle 33). 

Tabelle 33: Nachweis von GFAPmRNA aus mit peripheren Nervengewebe dotierten 

Brühwursterzeugnissen 

Konzentration 

Versuch 

0 % 0,5 % 1 % 5 % PN PE ZE 

1 - - - - + - + 

2 - - - - + - + 

3 - - - - + - + 

Es hatte sich gezeigt, dass aus nativem PNS-Gewebe GFAP-mRNA nachweisbar war, 

während das erhitzte reine PNS-Gewebe kein GFAP-mRNA-Signal ergab. Bei den mit PNS- 

Gewebe dotierten Brühwursterzeugnissen konnte ebenfalls keine GFAP-mRNA 

nachgewiesen werden. Das heißt, dass bei Brühwursterzeugnissen aus Rindfleisch nicht mit 

durch PNS-Gewebe verursachten, falsch positiven Signalen gerechnet werden muss. 

In Abbildung 4 ist beispielhaft der Nachweis der GFAP-mRNA bei einem mit bovinem 

peripheren Nervengewebe dotierten Brühwursterzeugnis (Versuch 1) dargestellt. Bei dem 

nativen PNS- und ZNS-Gewebe ist die Bande des 168 bp großen Amplifikats der GFAPmRNA 

zu sehen. 

88

Ergebnisse 

Marker 

0 % 

0,5 % 

1 % 

5 % 

PNS nativ 

PNS erhitzt 

ZNS erhitzt 


Marker 

168 bp 

Abb. 4: GFAP-mRNA Nachweis aus einer Brühwurst dotiert mit bovinem PNS-Gewebe 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR mittels Agarosegelelektrophorese 

(2,5 %iges Agarosegel) (Kapitel 4.2.1.6, Versuch 1) 

Negativkontrollen von RT-PCR (s. Kapitel 3.2.3.2) 


331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 

4.2.2 Fleischerzeugnisse dotiert mit porcinem Gehirngewebe 

Die selbst hergestellten Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 3.2.6.1) wurden mit porcinem 

Gehirngewebe (s. Kapitel 3.1.1.1) in folgenden Konzentrationen dotiert: 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 

1 % und 5 %. Das Fleischerzeugnis ohne Gehirn diente als Negativkontrolle und bei den 

Versuchen mitgeführtes reines Gehirngewebe als Positivkontrolle. Bei dieser Versuchsreihe 

wurde in einem ersten Versuch die PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev, und in 

den nachfolgenden Versuchen die PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 

verwendet (s.a. Kapitel 3.2.6.3). 

89

Ergebnisse 

4.2.2.1 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten 

aus Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern 

GFAPforw und GFAPrev 

Bei Verwendung der PCR mit den Primen GFAPforw und GFAPrev konnte aus mit 

Schweinegehirn dotierten Brühwursten mit den Konzentrationsabstufungen 0 %, 0,25 %, 

0,5 %, 1 % und 5 % über den Zeitraum von 14 Tagen keine porcine GFAP-mRNA 

nachgewiesen werden. 

4.2.2.2 Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Schweinegehirn dotierten Brühwürsten 

aus Schweinefleisch (Brühtemperatur 80°C, 65 Minuten) mit den Primern 

GFAPpork1 und GFAPpork2 

Bei diesem Versuchsansatz hatten die Verlaufsmessungen der Kerntemperatur ergeben, dass 

eine Kerntemperatur von 68 °C erreicht wurde und für den Zeitraum von 15 Minuten gehalten 

werden konnte. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse der ermittelten GFAP-mRNA 

Nachweise zusammen (Tabelle 34). 

Tabelle 34: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit porcinem Gehirngewebe (%) dotierten 

Brühwürsten (Brühtemperatur 80°C, 65 min) über einen Zeitraum von 

35 Tagen (T) 


T 

% 

0 0,5 

0,2 

5 

1 5 0 0,5 0,2 

5 

1 5 0 0,5 

0,2 

5 

1 5 

0 + + + + + - + + + + - + + + + 

7 - + + + + - + + + + - + + + + 

14 - + + + + + + + + + - + + + + 

21 + + + + + - + + + + - + + + + 

28 - + + + + - + + + + - + + + + 

35 + + + + + - + + + + - + + + + 

90

Ergebnisse 

Im Gegensatz zu den Untersuchungen bei Rinderfleischerzeugnissen waren bei den 

Versuchsreihen 1 und 2 auch bei den nicht mit Schweinegehirngewebe dotierten Proben ein 

168 bp großes GFAP-mRNA-Signal detektierbar (Tabelle 34). Somit traten bei vier von 18 

nicht mit Gehirngewebe dotierten Proben falsch positive GFAP-mRNA Nachweise auf. 

Falsch negative Resultate wurden nicht nachgewiesen. 

In Abbildung 5 ist beispielhaft Nachweis der GFAP-mRNA aus einer mit porcinem 

Gehirngewebe dotierten Brühwurst (Versuch 2, Tag 14) dargestellt. Die 168 bp großen 

Banden bei den einzelnen Konzentrationsstufen zeigen hierbei das Amplifikationsprodukt der 

porcinen GFAP-mRNA. Die etwa 950 bp großen Banden bei den Konzentrationsstufen 0 %, 

0,25 % und 0,5 % zeigen das Amplifikationsprodukt der genomischen DNA des porcinen 

GFAP-Gens. 

Marker 

0 % 

0,25 % 

0,5 % 

1 % 

5 % 

100 % 

DNA-Positivkontrolle 



Marker 

168 bp 

Abb. 5: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit porcinem Gehirngewebe dotierten 

Brühwurst 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR (aus Kapitel 4.2.2.1, Versuch 2, Tag 14) 



331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 


Positivkontrolle von PCR bestehend aus porciner DNA (s. Kapitel 3.2.3.3.3) 

91

Ergebnisse 

4.3 Sequenzierung der 399 bp GFAP-mRNA-Amplifikate verschiedener 

Tierarten 

Bei der RT-PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev wurde ein 168 bp großer 

Sequenzausschnitt der GFAP-mRNA amplifiziert, während das Amplifikationsprodukt der 

genomischen DNA des Rindes 957 bp groß war. Diese PCR mit den oben genannten Primern 

war bei folgenden Tierarten einsetzbar: Rind, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild, Rotwild. Bei 

Huhn und Pute ergaben sich bei Verwendung dieser Primer keine Banden. Nachdem anhand 

der Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. Y08255) die 

Primer bGFAPw1 und bGFAPw2 entwickelt wurden, konnten Sequenzabschnitte der GFAPmRNA 

von 399 bp Größe bei allen gewählten Tierarten, außer aus Gehirngewebe von Huhn 

und Pute, amplifiziert werden (s. Kapitel 3.2.3.3.2). Abbildung 6 zeigt den Nachweis der 399 

bp großen GFAP-mRNA-Amplifikate der RT-PCR mittels Agarosegelelektrophorese mit 

einem 2,5 prozentigen Agarosegel. Rechts und links außen ist der verwendete Marker puC 

19/Msp I mit den Bandengrößen (von unten nach oben) 110/111 bp, 147 bp, 190 bp, 242 bp, 

331 bp, 404 bp und 489/501 bp dargestellt. 

Marker 

Schwein 

Wildschwein 

Rind 

Schaf 

Pferd 

Dammwild 

Rehwild 

Rotwild 

Huhn 

Pute 


Marker 

399 bp 

Abb. 6: Nachweis der 399 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikate 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR (aus Kapitel 4.3) mittels 

Agarosegelelektrophorese (2,5 %iges Agarosegel) 


331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 

Negativkontrolle von PCR (s. Kapitel 3.2.3.3.2) 

92

Ergebnisse 

In Abbildung 7 wird die Vorgehensweise zur Erlangung der 399 bp großen GFAP-mRNA 

Amplifikate sowie die Detektion des porcinen, 168 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikats 

mittels RT-PCR schematisch dargestellt. 

Seq1 

R1 

mRNA Rind 

Seq1 

R2 

Seq2 

mRNA Schwein 

399 bp 

S1 

Seq2 

mRNA Schwein 

168 bp 

S2 

S1 

Exon 

Intron 

S1 

Exon Exon 

Exon 

S2 

Genomische DNA 

mRNA 

ca.950 bp 

168 bp 

S2 

Abb. 7: Vorgehensweise bei der Sequenzierung und Detektion der porcinen GFAP-mRNA 

R 1 und R 2: entsprechen den Primern GFAPforw und GFAPrev, die ein 168 bp 

großes Fragment der bovinen GFAP-mRNA amplifizieren 

Seq 1 und Seq 2: entsprechen den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2, die ein 399 bp 

großes Fragment der bovinen und (nach erfolgter Sequenzierung) porcinen GFAPmRNA 

amplifizieren 

S 1 und S 2: entsprechen den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2, die anhand der 

erhaltenen Sequenzinformation entwickelt wurden, und ein 168 bp großes Fragment 

der porcinen GFAP-mRNA bzw. die ca. 950 bp große, porcine GFAP-DNA 

amplifizieren 

93

Ergebnisse 

Nach der Aufreinigung der Amplifikationsprodukte (s. Kapitel 3.2.3.4), wurden diese der 

Sequenzanalyse zugeführt. Die Sequenzierung wurde durch das Institut für Tierzucht und 

Vererbungslehre der Tierärztlichen Hochschule Hannover mittels des 

Didesoxynukleotidverfahren nach SANGER et al. (1977) durchgeführt. Die verwendeten 

PCR-Produkte stammten aus der RT-PCR mit Gehirngewebe der Tierarten Rind, Schaf, 

Pferd, Damwild, Rehwild, Rotwild, Schwein, Wildschwein, Huhn und Pute (s. Kapitel 

3.1.1.1). Anhand der durch die Sequenzierung erlangten Informationen der porcinen GFAPmRNA 

(GenBank accession no. AJ551395) konnte für die Tierart Schwein / Wildschwein die 

PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 entwickelt werden (Abbildung 7). 

Die Sequenzen der einzelnen Tierarten wurden bei der EMBL Nucleotide Sequence Database 

hinterlegt: 

Schwein/Wildschwein (Sus scrofa): Accession No. AJ551395 

Schaf (Ovis aries): Accession No. AJ551397 

Pferd (Equus caballus): Accession No. AJ551396 

Damwild (Dama Dama): Accession No. AJ551398 

Rehwild (Capreolus capreolus): Accession No. AJ551399 

Rotwild (Cervus elaphus): Accession No. AJ551400. 

Da die Primer nicht Bestandteil der Sequenz der jeweiligen Tierart sind, haben die bei der 

EMBL Nucleotide Sequence Database hinterlegten Sequenzen eine Größe von 355 bp. 

In Abbildung 8 sind die 168 bp großen Ausschnitte der einzelnen 399 bp großen Sequenzen 

der oben genannten Tierarten vergleichend dargestellt. 

94

Ergebnisse 

* 20 * 40 * 

168BOVIN.T : .................................................. : 50 

168SCHAF.T : .................................................. : 50 

168DAMWI.T : .................................................. : 50 

168REHWI.T : .................................................. : 50 

168ROTWI.T : .................................................. : 50 

168PFERD.T : ...........................G...................... : 50 

168PORCI.T : .........C......T..............A.................. : 50 

168WILDS.T : .........C......T..............A.................. : 50 

GAGGAAGATtGAGTCTcTGGAGGAGGAaATCcGGTTCTTGAGGAAGATCC 

60 * 80 * 100 

168BOVIN.T : .................................................. : 100 

168SCHAF.T : ......................A........................... : 100 

168DAMWI.T : .................................................. : 100 

168REHWI.T : .................................................. : 100 

168ROTWI.T : .................................................. : 100 

168PFERD.T : .C................................................ : 100 

168PORCI.T : ....C..............A.................A............ : 100 

168WILDS.T : ....C..............A.................A............ : 100 

AtGAgGAGGAGGTGCGGGAgCTcCAGGAGCAGCTGGCcCAGCAGCAGGTC 

* 120 * 140 * 

168BOVIN.T : .................A................................ : 150 

168SCHAF.T : .............................T...........T........ : 150 

168DAMWI.T : ......................................A........... : 150 

168REHWI.T : ..............C........A.......................... : 150 

168ROTWI.T : .................................................. : 150 

168PFERD.T : ..T..A...C.C..............G.....G..G.............. : 150 

168PORCI.T : ........A.....C...A.......C....................... : 150 

168WILDS.T : ........A.....C...A.......C....................... : 150 

CAcGTgGAgaTgGA GTggCCAAgCC GAcCTcACaGCgGCcCTGAGAGA 

160 

168BOVIN.T : .................. : 168 

168SCHAF.T : .................. : 168 

168DAMWI.T : .................. : 168 

168REHWI.T : .................. : 168 

168ROTWI.T : .................. : 168 

168PFERD.T : .........G........ : 168 

168PORCI.T : ...T.....G..A..... : 168 

168WILDS.T : ...T.....G..A..... : 168 

GATcCGCAC CAgTATGA 

Abb. 8: vergleichende Darstellung der 168 bp großen GFAP-mRNA-Sequenzen bei den 

verschiedenen Tierarten 

Bovin.: GFAP-mRNA-Fragment des Rindes; Schaf.: GFAP-mRNA-Fragment des 

Schafes; Damwi.: GFAP-mRNA-Fragment des Damwildes; Rehwi.: GFAPmRNA-Fragment 

des Rehwilds; Rotwi.: GFAP-mRNA-Fragment des Rotwildes; 

Pferd.: GFAP-mRNA-Fragment des Pferdes; Porci.: GFAP-mRNA-Fragment des 

Schweines; Wilds.: GFAP-mRNA-Fragment des Wildschweines 

G/g: Guanin, C/c: Cytosin, A/a: Adenin; T/t: Thymin; die Sequenz in der jeweils 

letzten Reihe ist die Konsensussequenz 

95

Ergebnisse 

Aus der Abbildung 8 wird deutlich, dass die Basensequenzen der GFAP-mRNA von Schwein 

und Wildschwein sich in diesem Abschnitt nicht unterscheiden. Im Vergleich zur 

Konsensussequenz in der letzten Zeile weisen die Sequenzen von Schwein und Wildschwein 

insgesamt an 13 Positionen Unterschiede in der Basenfolge auf. Zwischen den Sequenzen 

Damwild, Rehwild und Rotwild gibt es in dem 168 bp großen Ausschnitt der GFAP-mRNA 

nur wenige Unterschiede in der Basenfolge. Wenn man die Basensequenz des Rotwildes, die 

sich in keiner Position von der Basenfolge der Konsensussequenz unterscheidet, als Basis 

nimmt, unterscheidet sich die Basensequenz des Dammwildes an der Position 138 durch den 

Austausch der Base Guanin durch die Base Adenin von den Basensequenzen von Rehwild 

und Rotwild. Die Basensequenz des Rehwildes unterscheidet sich an Position 115 (Austausch 

einer nicht festgelegten Base durch Cytosin) und Position 124 (Austausch von Guanin durch 

Adenin) von den Basensequenzen von Dammwild und Rotwild. Die Basensequenz des 

Pferdes weist insgesamt an 10 Positionen, die des Rindes an einer Position, und die des 

Schafes insgesamt an drei Positionen Unterschiede zur in der letzten Zeile stehenden 

Konsensussequenz auf. 

Durch die gewonnenen Sequenzdaten konnten die Restriktionsfragmentgrößen, der durch die 

Spaltung mit Restriktionsenzymen erhaltenen Fragmente, theoretisch bestimmt werden. 

Zudem war eine Auswahl geeigneter Restriktionsenzyme möglich. 

96

Ergebnisse 

4.4 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) 

Durch den restriktionsenzymatischen Spaltungsvorgang sollten die GFAP-mRNA- 

Amplifikate der verschiedenen Tierarten unterschieden werden. Verwendet wurden die in der 

nachfolgenden Tabelle (Tabelle 35) zusammengefassten Restriktionsenzyme. 

Tabelle 35: Darstellung der Bandenmuster der GFAP-mRNA-Fragmente bei Aufspaltung 

mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen 

Enzym Hae III Alu I Mbo I Msc I Msp I Sst I 

Schnittstelle 

GG ▼ CC AG ▼ CT 

▼ GATC TGG ▼ CCA C ▼ CGG GAGCT ▼ C 

5´.....3´ 

CC ▲ GG TC ▲ GA ▲CTAG ACC ▲ GGT G ▲ GCC CTCGA ▲ G 

3´....5´ 

Tierart 

(Fragmentlänge in bp) 

Schwein 

Wildschwein 

Rind 

Schaf 

Pferd 

Damwild 

Rehwild 

Rotwild 

140 

28 

140 

28 

86 

45 

28 

86 

49 

33 

86 

33 

28 

21 

86 

49 

33 

86 

33 

28 

21 

86 

33 

28 

21 

86 

82 

86 

82 

86 

70 

12 

86 

70 

12 

70 

59 

27 

12 

86 

70 

12 

86 

70 

12 

86 

70 

12 

123* 

39 

6 

123* 

39 

6 

105 

45 

18 

82 

45 

23 

18 

105 

27 

18 

18 

105 

45 

18 

*bei Verwendung der Primer GFAPforw und GFAPrev entsteht das Fragmentmuster 105, 45, 

18 

97 

105 

45 

18 

105 

45 

18 

168 168 168 

168 168 168 

168 

117 

51 

117 

51 

117 

51 

117 

51 

117 

51 

137 

31 

137 

31 

94 

43 

31 

137 

31 

137 

31 

137 

31 

96 

72 

168 

72 

57 

39 

96 

72 

96 

72 

96 

72

Ergebnisse 

Dabei wurden bei den Tierarten Schwein und Wildschwein die enzymatischen Spaltung des 

Amplifikats aus der RT-PCR mit den Primern GFAPpork 1 und GFAPpork2 sowie bei den 

anderen Tierarten die enzymatischen Spaltung des Amplifikats mit den Primern GFAPforw 

und GFAPrev dargestellt. 

Mit den verwendeten Restriktionsenzymen ließen sich Schwein und Wildschwein sowie 

Rehwild und Rotwild nicht voneinander unterscheiden, da diese Tierarten stets gleiche 

Bandenmuster aufwiesen. 

Mit dem Restriktionsenzym Hae III ließen sich die Tierarten Schwein und Wildschwein durch 

ihr zweibandiges Fragmentmuster von den Tierarten Rind, Schaf und Damwild, die ein 

dreibandiges Fragmentmuster besaßen, voneinander unterscheiden (Tabelle 35, Abbildung 9). 

Die Tierarten Rehwild, Rotwild und Pferd wiesen bei der Spaltung mit dem 

Restriktionsenzym Hae III ein vierbandiges Fragmentmuster auf (Tabelle 35, Abbildung 9). 

Das Bandenmuster 86, 45, 28 tritt ausschließlich beim Rind auf. 

Die Tierarten Schwein und Wildschwein waren durch das zweibandige Fragmentmuster mit 

dem Restriktionsenzym Alu I von den Tierarten Rind, Schaf, Damwild, Rehwild und Rotwild, 

die ein dreibandiges Fragmentmuster aufwiesen, sowie dem Pferd mit seinem vierbandigen 

Fragmentmuster voneinander unterscheidbar (Tabelle 35, Abbildung 9). 

Mit dem Restriktionsenzym Msp I ergaben sich die gleichen Unterscheidungsmöglichkeiten, 

da das 168 bp große GFAP-mRNA-Fragment bei Schwein und Wildschwein nicht durch das 

Restriktionsenzym Msp I gespalten wurde, die Tierarten Rind, Schaf, Damwild, Rehwild und 

Rotwild ein zweibandiges Fragmentmuster aufwiesen, und das Pferd ein dreibandiges 

Fragmentmuster aufwies (Tabelle 35, Abbildung 9). 

Bei der Verwendung des Restriktionsenzyms Mbo I sind die Tierarten Schwein und 

Wildschwein mit einem dreibandigen Fragmentmuster von der Gruppe Rind, Damwild, 

Rehwild und Rot wild unterscheiden, die ebenfalls ein dreibandiges Fragmentmuster besitzen 

(Tabelle 35). Bei Verwendung RT-PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev bei den 

Tierarten Schwein und Wildschwein entsteht bei der enzymatischen Spaltung mit dem 

Restriktionsenzym Mbo I das Fragmentmuster 105 bp, 45 bp, 18 bp. In diesem Fall ist anhand 

der Restriktionsfragmentgrößen keine Unterscheidung zwischen diesen beiden Tiergruppen 

98

Ergebnisse 

möglich (Abbildung 9). Das Pferd weist ebenfalls ein dreibandiges Fragmentmuster auf, das 

sich von den beiden oben genannten Fragmentmuster unterscheidet (Tabelle 35). Das Schaf 

weist bei der enzymatischen Spaltung mit Mbo I ein vierbandiges Fragmentmuster auf 

(Tabelle 35, Abbildung 9), und ist somit von dem Rind unterscheidbar. 

Mit dem Restriktionsenzym Msc I ließen sich die Tierarten Schwein, Wildschwein und Rind, 

deren 168 bp großes GFAP-mRNA-Fragment nicht gespalten wurde, von den restlichen 

Tierarten unterscheiden, die ein zweibandiges Fragmentmuster aufwiesen. Somit war mit 

diesem Restriktionsenzym eine Unterscheidung zwischen Rind und Schaf möglich 

(Tabelle 35, Abbildung 9). 

Auch mit dem Restriktionsenzym Sst I konnte zwischen Rind und Schaf unterschieden 

werden, da die Tierarten Schwein, Wildschwein und Schaf, deren 168 bp großes GFAPmRNA-Fragment 

nicht gespalten wurde, von den Tierarten Rind, Damwild, Rehwild und 

Rotwild, die ein zweibandiges Fragmentmuster aufwiesen, unterscheidbar waren. Das Pferd 

war durch sein dreibandiges Muster von den beiden oben genannten Tierarten ebenfalls 

unterscheidbar (Tabelle 35). Allerdings konnten bei der Tierart Pferd Bandenmuster 

beobachtet werden, die auf eine unvollständige enzymatische Spaltung durch das 

Restriktionsenzym Sst I zurückzuführen sind (Abbildung 9). 

Zusammenfassend waren mit den gewählten Restriktionsenzymen die Tierarten Rind, Schaf, 

Pferd, Damwild sowie die Tiergruppen Schwein – Wildschwein und Rehwild – Rotwild 

voneinander unterscheidbar. Durch die Spaltung mit den gewählten Restriktionsenzymen 

konnten die Sequenzdaten aus der Sequenzierung bestätigt werden (s. Kapitel 4.3, Tabelle 35, 

Abbildung 9). Insgesamt wurde Gehirngewebe von 10 Schweinen, 1 Wildschwein, 8 Rindern, 

14 Schafen, 8 Pferden, 2 Damwild, 1 Rehwild und 1 Rotwild mittels der RFLP hinsichtlich 

der innertieartlichen Varianz untersucht. Es konnte bei keiner dieser Tierarten eine Varianz 

der RFLP des 168 bp langen GFAP-mRNA-Amplifikats festgestellt werden. 

In Abbildung 9 ist die Auswertung der enzymatischen Spaltung des 168 bp großen 

Amplifikats der GFAP-mRNA der RT-PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev mit 

den verschiedenen Restriktionsenzyme mittels Agarosegelelektrophorese in einem 3,75 

prozentigen Gel bei den verschiedenen Tierarten dargestellt. 

99

Ergebnisse 

Marker 

Schwein 

Wildschwein 

Rind 

Schaf 

Pferd 

Damwild 

Rehwild 

Rotwild 

Huhn 

Pute 

Marker 

168 bp 

nativ 

168 bp 

Hae III 

168 bp 

Alu I 

168 bp 

Msc I 

168 bp 

Msp I 

168 bp 

Mbo I 

168 bp 

Sst I 

Abb. 9: RFLP des 168 bp großen Fragments der GFAP-mRNA 

Beispiel einer Auswertung der RT-PCR mit den Primen GFAPforw und GFAPrev 

mittels Agarosegelelektrophorese (3,75 %iges Agarosegel); 


331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp,110/111 bp) 

Restriktionsenzyme: Hae III, Alu I, Msc I, Msp I, MboI, Sst I 

100

Diskussion 

5 Diskussion 

5.1 Saures Gliafaserprotein (GFAP) als Marker für ZNS-Gewebe in 

Fleischerzeugnissen 

Das saure Gliafaserprotien (GFAP) gehört zu den Typ III Intermediärfilamentproteinen (IF), 

die im Zentrum eine hoch konservierte α-Helix Struktur aufweisen, die von nicht helicalen 

Kopf- und Schwanz-Domänen flankiert werden (BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994; 

NIELSEN et al. 2002). GFAP zählt zu den wichtigsten Strukturproteinen der reifen 

Astrogliazellen (FUCHS u. CLEVELAND 1998). Das GFAP kommt somit hauptsächlich in 

Geweben des zentralen (ZNS) und peripheren Nervensystems (PNS) vor (ENG et al. 2000). 

Im ZNS-Gewebe sind hohe Gehalte an GFAP enthalten. Das Rückenmarkgewebe enthält mit 

55000-220000 ng/mg, gemessen im colorimetrischen ELISA, die höchsten Konzentrationen 

an GFAP (Schmidt et al. 1999). Das Gehirngewebe enthält mit 9000-55000 ng/mg ein Drittel 

und die peripheren Nerven, wie der Nervus ischiadicus, mit 13,5-51 ng/mg weniger als 1 % 

des GFAP-Gehaltes des Rückenmarks (Schmidt et al. 2001). 

Aufgrund des hauptsächlich gewebespezifischen Auftretens des GFAP, kann es als Marker 

zum Nachweis von ZNS-Gewebe in Fleisch und Fleischerzeugnissen genutzt werden. Zur 

Zeit existieren folgende Nachweisverfahren zum Nachweis von GFAP in mit Gehirngewebe 

dotierten Fleischerzeugnissen: (a) immunchemische Nachweisverfahren, zu denen der GFAP- 

Westernblot (LÜCKER et al. 2000; OVERHOFF et al. 2002) und der Immunosorbent-F- 

ELISA (SCHMIDT et al. 1999a, 2001) gehören und (b) immunhistochemische 

Nachweisverfahren mit Antikörpern gegen GFAP (LOVE et al. 2000; TERSTEEG et al. 

2002; AUPERLE et al. 2002; LÜCKER et al. 2002a). 

5.1.1 GFAP-mRNA als Marker für ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen 

Die Regulation der Stabilität der mRNA in Säugetierzellen ist sehr komplex (ROSS 1995; 

GUHANIYOGI u. BREWER 2001) und die Halbwertszeiten reichen wenigen Minuten bis zu 

über 24 Stunden. Stabile mRNAs kodieren meist für reichlich vorhandene und hochkonservierte 

Proteine (ROSS 1995) oder stammen aus Geweben, bei denen die Translation 

101

Diskussion 

zeitlich verlegt ist, wie z.B. bei Oozyten (SPIRIN 1994). In einer Studie von LUKIW et al. 

(1990) hatte die mRNA von GFAP, neben der mRNA des humanen Neurofilament L, 

postmortal eine relativ lange Halbwertszeit (HWZ). In weiteren Studien zur postmortalen 

Stabilität von mRNA an humanem Gehirngewebe zeigte sich, dass ein langsamer 

Gefrierprozess die Stabilität der mRNA negativ beeinflussen kann (JOHNSTON et al. 1997). 

Tiefgekühlt wurde die mRNA in humanem Gehirngewebe dagegen kaum geschädigt 

(BURKE et al. 1991; LEONARD et al. 1993; EASTWOOD et al. 1995; YASOJIMA et al. 

2001) und konnte noch 1 – 2 Stunden nach dem Auftauen zuverlässig nachgewiesen werden 

(YASOJIMA et al. 2001). 

In der Literatur werden fünf Untergruppen von GFAP-mRNA unterschieden. GFAP-αmRNA 

repräsentiert die stärkste Untergruppe und ist hauptsächlich in Astrozyten zu finden 

(BRENNER 1994; FUCHS u. WEBER 1994). Daneben existieren noch GFAP-βmRNA in 

den Zellen des PNS, GFAP-γmRNA, die in Zellen außerhalb des Gehirns expremiert wird, 

sowie GFAP-δmRNA und GFAP-εmRNA, die im ZNS expremiert werden (BRENNER 

1994). 

Neben den Verfahren, die auf dem Nachweis des Proteins (GFAP) als Marker für ZNS- 

Gewebe beruhen, wurden auch molekularbiologische Verfahren entwickelt, die auf dem 

Nachweis gewebespezifisch expremierter GFAP-mRNA basieren (LANGE et al. 2002; 

SEYBOLDT et al. 2003). Hierbei kann, bei gegebener Gewebespezifität, die in der mRNA 

enthaltene Sequenzinformation zum tierartspezifischen Nachweis des detektierten ZNS- 

Gewebe genutzt werden (SEYBOLDT et al. 2003). Untersuchungen zur Gewebespezifität der 

GFAP-mRNA beim Rind ergaben, dass aus nativen zerkleinerten Herz-, Muskel- und ZNS- 

Gewebe über den Zeitraum von sieben Tagen ein positives GFAP-mRNA Signal detektiert 

werden konnte (SEYBOLDT et al. 2003). Nach Einwirkung von Hitze (70°C, 20 min.) waren 

die Signale von Herz- und Muskelgewebe jedoch nicht mehr nachweisbar und damit die 

Gewebespezifität dieser Nachweismethode gegeben (SEYBOLDT et al. 2003). 

102

Diskussion 

5.1.2 RT-PCR Systeme zum Nachweis von GFAP-mRNA 

In dieser Dissertation wurde die mRNA des GFAP nach Extraktion der Gesamt-RNA mittels 

RT-PCR nachgewiesen und als Marker für bovines ZNS-Gewebe verwendet (SEYBOLDT et 

al. 2003). Die RT-PCR gehört zu den indirekten Nachweismethoden für mRNA (JOHNSTON 

et al. 1997). Direkte Methoden zur Detektion von mRNA sind beispielsweise der Northern 

Blot oder die in-situ-Hybridisation. Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode, um mRNA 

in geringen Konzentrationen über einen längeren Zeitraum zu detektieren (FITZPATRICK et 

al. 2001; YASOJIMA et al. 2001). 

Es wurden drei verschiedene RT-PCR-Systeme angewandt. Das erste System verwendete die 

Oligonukleotidprimer „GFAPforw“ und „GFAPrev“, die an die Exonregionen 3 und 4, 

welche das Intron 3 umgeben, binden und ein 168 bp großes Fragment der GFAP-mRNA 

amplifizieren. Da die verwendeten Primer jeweils in einem anderen Exonbereich binden, ist 

das entstehende 168 bp große GFAP-mRNA Amplifikat spezifisch für die mRNA. Signale, 

die von der DNA des GFAP Gens stammen, weisen eine Größe von 957 bp auf (SEYBOLDT 

et al. 2003). Somit kann auf eine Kontrolle zur Überprüfung einer möglichen DNA- 

Kontamination verzichtet werden. Bei Verwendung dieser RT-PCR konnte ZNS-Gewebe 

vom Rind in zerkleinerten Fleisch und in einem pasteurisierten Fleischerzeugnis sicher 

detektiert werden (s. Kapitel 2.4.5). 

In den hier vorgestellten Untersuchungen zur Detektion von porcinem ZNS-Gewebe in einem 

Fleischerzeugnis zeigte sich, dass bei Verwendung der PCR mit den Primern GFAPforw und 

GFAPrev die Nachweisgrenze über 5 % Gehirngewebebeimengung lag (s. Kapitel 4.2.2.1). 

Hinweise auf eine geringere Nachweisbarkeit porciner GFAP-Sequenzen mit diesen Primern 

finden sich auch bei SEYBOLDT et al. (2003). Um an Sequenzinformationen der 168 bp 

großen Amplifikate der GFAP-mRNA für die RFLP zu gelangen und um für die Tierart 

Schwein sensitivere Primer auswählen zu können, wurde anhand der Sequenzinformationen 

der bovinen GFAP-mRNA eine weitere RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 

etabliert. Mit dieser RT-PCR wurde beim Rind ein Sequenzabschnitt der GFAP-mRNA von 

399 bp Größe amplifiziert, der weiter in den Bereich der das Intron 3 umschließenden Exons 

3 und 4 reichte (Kapitel 4.3, Abb. 7). Diese RT-PCR führte auch bei den Tierarten Schwein / 

Wildschwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild und Rotwild zu einem 399bp großen 

Amplifikat. 

103

Diskussion 

Durch die Sequenzierung dieser 399 bp großen GFAP-mRNA Amplifikate, konnte 

nachfolgend für die Tierart Schwein / Wildschwein eine dritte RT-PCR mit den Primern 

GFAPpork1 und GFAPpork2 entwickelt werden, die einen Sequenzabschnitt der porcinen 

GFAP-mRNA amplifiziert, der dem Sequenzabschnitt der bovinen GFAP-mRNA von 168 bp 

Größe entspricht. Die Primer GFAPpork1 und GFAPpork2 entsprechen den Primern 

GFAPforw und GFAPrev des ersten RT-PCR Systems und sind entsprechend der porcinen 

mRNA-Sequenz modifiziert. Mit dieser RT-PCR wurden beim Schwein die Untersuchungen 

zur Gewebespezifität und Detektion von porcinem Gehirngewebe in Fleischerzeugnissen 


Dagegen gelang es nicht mit den hier verwendeten RT-PCR Systemen Amplifikate der 

GFAP-mRNA von Huhn und Pute zu erhalten. Der wahrscheinlichste Grund hierfür sind 

phylogenetisch bedingte Unterschiede der GFAP-mRNA zwischen der Klasse der Vögel und 

der Säugetiere. 

5.2 Gewebespezifität und Stabilität der GFAP-mRNA von Rind, Schwein 

und Schaf 

Vorangegangene Untersuchungen zur Gewebespezifität des GFAP-mRNA Nachweises an 

bovinen Geweben haben ergeben, dass neben Gehirn und Rückenmark auch aus nativem 

Herzgewebe und Muskulatur ein GFAP-mRNA Nachweis möglich war (SEYBOLDT et al. 

2003). Im Gegensatz zu den Geweben des ZNS, konnten die GFAP-mRNA Signale aus 

Herzgewebe und Muskulatur durch einen Erhitzungsschritt (75°C, 20 min) vor der RNA- 

Extraktion inaktiviert werden. Bovines ZNS-Gewebe konnte jedoch auch in Konzentrationen 

von 0,5% in zerkleinertem Fleisch über einen längeren Zeitraum anhand der GFAP-mRNA 

sicher nachgewiesen werden (s. Kapitel 2.4.5). 

In der hier vorgestellten Dissertation wurden zur Untersuchung der Gewebespezifität der 

porcinen GFAP-mRNA die RT-PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 

verwendet. Die GFAP-mRNA konnte in allen untersuchten nativen Geweben des Schweins 

nachgewiesen werden (s. Kapitel 4.1.1.1). Daraufhin wurde untersucht, inwieweit 

Erhitzungsprozesse und auch Gefrierprozesse zum Erreichen der Gewebespezifität des 

Nachweises porciner GFAP-mRNA beitragen könnten. Bei moderater Erhitzung (75°C für 20 

104

Diskussion 

min bzw. 80°C für 30 min) wurden beim Schwein alle GFAP-mRNA Signale der beprobten 

Gewebe inaktiviert, außer von Muskel-, Herz- und ZNS-Gewebe, die auch noch bei moderater 

Erhitzung (80°C für 30 min) nach vorangegangenem 24 stündigen Gefrierprozess 

nachweisbar waren (s. Kapitel 4.1.1.2, 4.1.1.3, 4.1.1.5). Durch starke Hitzeeinwirkung (95°C 

für 60 min) konnten die GFAP-mRNA Signale aus Herz- und Muskelgewebe in Abhängigkeit 

von der vorhergehenden Lagerdauer bei 4°C deutlich reduziert werden (s. Kapitel 4.1.1.4). 

Bei der Untersuchung von Geweben des peripheren Nervensystems (PNS) des Schweins 

konnten, im Gegensatz zu den Untersuchungen beim Rind (s. Kapitel 4.2.1.6), aus moderat 

erhitztem (80°C, 60 Minuten) PNS-Gewebe noch GFAP-mRNA Signale detektiert werden (s. 

Kapitel 4.1.1.6). 

Bei der Untersuchung eines mit porcinem Gehirngewebe dotierten 

Schweinefleischerzeugnisses (80°C, 65 min) waren in vier von 18 durchgeführten Versuchen 

auch solche Proben positiv für GFAP-mRNA, die kein porcines Gehirngewebe enthielten (s. 

Kapitel 4.2.2.2). Somit wurde der Nachweis porciner GFAP-mRNA als nicht ausreichend 

spezifisch für ZNS-Gewebe befunden. Insbesondere kann nicht sicher ausgeschlossen 

werden, dass bei der Untersuchung von Fleischerzeugnissen die mit schlachtfrischer 

Muskulatur hergestellt wurden, falsch positive Ergebnisse auftreten. 

Für die Untersuchungen zur Gewebespezifität der ovinen GFAP-mRNA wurde die RT-PCR 

mit den Primern GFAPforw und GFAPrev verwendet, da die Sequenz der ovinen GFAPmRNA 

im Bereich der Primer nicht von der bovinen Sequenz abweicht (s. Kapitel 4.3.). In 

nativem Gewebe vom Schaf war die GFAP-mRNA in Nieren-, Leber-, Herz-, Muskel- und 

ZNS-Gewebe nachweisbar (s. Kapitel 4.1.2.1). Auch für die Tierart Schaf wurde daraufhin 

untersucht, inwieweit Erhitzungsprozesse und Gefrierprozesse zum Erreichen der 

Gewebespezifität des Nachweises der GFAP-mRNA beitragen. Mäßige Erhitzung (75°C für 

20 min bzw. 80°C für 30 min) reduzierte die Nachweisbarkeit GFAP-mRNA in Nieren- und 

Lebergewebe so sehr, dass kein GFAP-mRNA Signal detektiert wurde. In Muskel-, Herz- und 

ZNS-Gewebe war unter diesen Erhitzungsbedingungen der Nachweis der GFAP-mRNA 

jedoch weiterhin möglich (s. Kapitel 4.1.2.2, 4.1.2.3). Bei moderater Erhitzung (80°C für 30 

min.) nach vorangegangenem 24 stündigen Gefrierprozess wurde lediglich das GFAP-mRNA 

Signal des ovinen Herzgewebes so stark reduziert, dass kein GFAP-mRNA Signal mehr 

detektiert wurde (s. Kapitel 4.1.2.5). Auch bei starker Erhitzung (95°C, 60 min) war die 

105

Diskussion 

Reduktion des GFAP-mRNA Signals nicht ausreichend, um eine Gewebespezifität zu 

erzielen. So konnten die ovinen GFAP-mRNA Signale in Muskelgewebe noch in fünf von 

sechs Fällen, in Herzgewebe noch in zwei von sechs Fällen und in ZNS-Gewebe in allen 

untersuchten Proben, nachgewiesen werden (s. Kapitel 4.1.2.4). 

Bei der Untersuchung von Geweben des peripheren Nervensystems (PNS) vom Schaf konnte 

bei nativen sowie moderat erhitzten (80°C, 60 Minuten) PNS-Gewebe GFAP-mRNA Signale 

detektiert werden (s. Kapitel 4.1.2.6), während bei dem Rind nur das native PNS positive 

GFAP-mRNA Signale ergab (s. Kapitel 4.2.1.6). Somit war der Nachweis der GFAP-mRNA 

nicht gewebespezifisch für ovines ZNS-Gewebe. 

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass im Gegensatz zu den Untersuchungen mit boviner 

GFAP-mRNA (SEYBOLDT et al. 2003), durch unterschiedlich lange und starke 

Temperatureinwirkung die Signale porciner und oviner GFAP-mRNA in Herz- und 

Muskulaturgewebe zwar deutlich reduziert werden konnten, aber keine sichere 

Gewebespezifität erreicht wurde. Somit können die GFAP-mRNA Signale dieser Gewebe in 

Fleischerzeugnissen als Störsignale bei der Detektion von ZNS-Gewebe auftreten. 

Die große Stabilität der GFAP-mRNA von ZNS-Geweben der Tierarten Rind, Schwein und 

Schaf sowie von Herz- und Skelettmuskelgewebe der Tierarten Schwein und Schaf gegenüber 

den hohen Temperatureinwirkungen sind mit den derzeit durchgeführten Untersuchungen 

nicht zu erklären. Denkbare Ursachen für die hohe Stabilität der GFAP-mRNA sind das 

Vorhandensein (a) einer hohen Anzahl an Transkripten (ROSS 1995; LOCKHART u. 

WINZELER 2000), (b) von bestimmten RNA Bindungsproteinen, welche die GFAP-mRNA 

möglicherweise auch postmortal stabilisieren (GUHANIYOGI u. BREWER 2001; MALTER 

2001) oder (c) anderer molekularer Mechanismen, die auch noch postmortal einen 

stabilisierenden Einfluss auf die GFAP-mRNA haben (BERNSTEIN u. ROSS 1989; SACHS 

1993; BEELMAN u. PARKER 1995; ROSS 1995). 

106

Diskussion 

5.3 GFAP-mRNA Nachweis zur Detektion von bovinem ZNS-Gewebe in 

Fleischerzeugnissen 

Es wurden Brühwursterzeugnisse unter verschiedenen Temperaturbedingungen sowie eine 

Leberwurst hergestellt. Diese Fleischerzeugnisse wurden aufgrund der hohen 

Wahrscheinlichkeit der möglichen ZNS-Verarbeitung ausgewählt. So wurde 

Hartseparatorenfleisch vom Rind, das mit ZNS-Gewebe kontaminiert sein konnte, anstelle 

von sehnenreichem Rindfleisch bei Brüh-, und Kochwürsten sowie in streichfähigen 

Rohwürsten eingesetzt (HILDEBRANDT et al. 2001). Bei der Herstellung von Leberwurst 

einfacher Qualität und regionalen Wurstspezialitäten, wie z.B. bei der Bregenwurst (Leitsätze 

für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches von 1998), war die 

Verwendung von Gehirngewebe bis zur Änderung der Leitsätze für Fleisch und 

Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches im Oktober 2001 erlaubt (ANONYM 

2001e). 

5.3.1 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem ZNS-Gewebe 

Es wurden Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch produziert, die mit bovinem ZNS-Gewebe 

in den Konzentrationsstufen 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 % dotiert waren und jeweils bei 

75°C, 95°C und 100°C Wasserbadtemperatur erhitzt wurden. Bei der Herstellung der 

Brühwursterzeugnisse bei 75°C und bei 95°C wurde das Brät für pasteurisierte 

Fleischerzeugnisse verwendet (s. Kapitel 3.2.1.1.1), während das bei 100°C 

Wasserbadtemperatur behandelte Brühwursterzeugnis aus Brät für sterilisierte 

Fleischerzeugnisse hergestellt wurde (s. Kapitel 3.2.1.1.2). Das 168 bp große Amplifikat der 

bovinen GFAP-mRNA konnte in den hier durchgeführten Untersuchungen ab einer ZNS- 

Gewebe-Konzentration von 0,25 % über einen Zeitraum von 35 bzw. 28 Tagen nachgewiesen 

werden (s. Kapitel 4.2.1.). Bei den Brühwürsten, die bei 75°C im Wasserbad erhitzt wurden, 

war bei 24 durchgeführten Versuchen ein falsch negatives Ergebnis bei der 

Konzentrationsstufe 0,5 % an Tag 28 aufgetreten, das möglicherweise auf die Entnahme der 

Probe aus einem mikrobiell verunreinigten Bereich zurückzuführen ist (s. Kapitel 4.2.1.1). 

Bei den Brühwursterzeugnissen, die bei 95°C im Wasserbad erhitzt wurden und eine 

Kerntemperatur von 89 °C für den Zeitraum von mindestens 20 Minuten aufwiesen, waren bei 

insgesamt 60 durchgeführten Versuchen sechs falsch negative Ergebnisse nachweisbar (s. 

107

Diskussion 

Kapitel 4.2.1.2). Die Untersuchungen zur Hitzestabilität der bovinen GFAP-mRNA in einem 

Fleischerzeugnis, das bei 100°C Wasserbadtemperatur hergestellt und bei dem eine maximale 

Kerntemperatur von 91°C für mindestens 20 Minuten erreicht wurde, haben gezeigt, dass der 

Nachweis der GFAP-mRNA in allen 75 mit Rindergehirn dotierten Proben bei allen 

Konzentrationsstufen möglich war (s. Kapitel 4.2.1.3). 

Das Auftreten von falsch negativen Ergebnissen bei den stark erhitzten Brühwürsten mit 95°C 

Brühtemperatur ist im Gegensatz zu Brühwürsten, die bei 100°C gegart wurden, 

möglicherweise mit der unterschiedlichen Rezeptur der hergestellten Bräte erklären. 

Brühwürste bis 95°C Brühtemperatur wurden mit Phosphat hergestellt. Die bei 100°C 

gegarten Brühwürste wurden ohne Phosphat, aber unter Zusatz von Milchpulver hergestellt (s. 

Kapitel 3.2.5.1). Somit ist denkbar, dass die Verwendung von Milcheiweiß, welches bei 

hohen Temperaturen die Proteinkonfigurationen festigt, möglicherweise auch eine schützende 

Wirkung auf die Stabilität der GFAP-mRNA in den bei 100°C Wassertemperatur erhitzten 

Brühwürsten hatte. 

Die Ergebnisse zeigen, dass hier mRNA weit über den bisher in der Literatur angegebenen 

Zeitraum von bis zu 96 Stunden (HARRISON et al. 1995; MARCHUK et al. 1998; 

FITZPATRICK et al. 2001; YASOJIMA et al. 2001) mittels RT-PCR nachweisbar war. Die 

oben bereits diskutierten Ursachen für die Stabilität der GFAP-mRNA in verschiedenen 

Geweben von Schwein und Schaf gegenüber hoher Temperatureinwirkung können auch beim 

Nachweis der bovinen GFAP-mRNA in Fleischerzeugnissen eine Ursache für die hohe 

postmortale Stabilität sein. 

5.3.2 Leberwurst mit bovinem ZNS-Gewebe 

Um den Einfluss von Fett und Enzymen aus Geweben, wie z.B. der Leber, auf den Nachweis 

der GFAP-mRNA in Fleischerzeugnissen zu untersuchen, wurden Leberwürste hergestellt, 

die in den Konzentrationsstufen 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 % mit bovinem 

Gehirngewebe dotiert waren. Von insgesamt 64 beprobten mit bovinem Gehirngewebe 

dotierten Leberwürsten waren zwei falsch negative Ergebnisse in der Konzentrationsstufe 

0,25 % aufgetreten. Auch in dieser Versuchsreihe konnte die GFAP-mRNA über einen 

Zeitraum von 35 bzw. 28 Tagen nachgewiesen werden (s. Kapitel 4.2.1.4). 

108

Diskussion 

Die Leberwurst repräsentiert durch die Verwendung von Leber zum einen ein enzymreiches, 

und zum anderen, durch die Verwendung von Kategorie 3 Fleisch (50 % Fettgewebe, 50 % 

Muskelgewebe), ein sehr fetthaltiges Fleischerzeugnis. Die Leberenzyme, die möglicherweise 

zu einem beschleunigten Abbau der GFAP-mRNA beitragen, hatten keinen Einfluss auf den 

Nachweis der bovinen GFAP-mRNA. Ein möglicher Einfluss des Fettgehaltes auf den 

Nachweis der GFAP-mRNA (optische Reduktion der Bandenintensität bei der Detektion der 

Ergebnisse in der Agarosegelelektrophorese) konnte mit einem zusätzlichen 

Zentrifugationsschritt nach Herstellerangaben bei der RNA-Extraktion behoben werden (s. 

Kapitel 3.2.3.1). Ein direkter Einfluss des Fettgewebes auf den Nachweis der GFAP-mRNA 

wurde nicht festgestellt. 

5.3.3 Vollkonserven 

Aus Brühwurstbrät für sterilisierte Fleischerzeugnisse (s. Kapitel 3.2.1.1.2) wurden 

Vollkonserven hergestellt (Versuchsbedingungen: Kesseltemperatur. 115°C, Kerntemperatur: 

110°C, F-Wert > 5). Bei der Untersuchung der Vollkonserven (s. Kapitel 4.2.1.5.1) mit 

wöchentlicher Beprobung waren von 48 getesteten, mit bovinem ZNS dotierten Konserven 

insgesamt 36 falsch negative Ergebnisse aufgetreten, wobei an Tag 0 mit 6 von 12 die 

wenigsten falsch negativen Ergebnisse nachweisbar waren. 

Bei der Untersuchung der im vierwöchentlichen Abstand beprobten Vollkonserve (s. Kapitel 

4.2.1.5.2) waren von insgesamt 36 mit Gehirngewebe dotierten Konserven 18 falsch negative 

Ergebnisse identifizierbar. Davon kamen an Tag 0 keine falsch negativen Ergebnisse vor. 

Die Tatsache, dass bei beiden Versuchen mit Vollkonserven an Tag 0 die wenigsten falsch 

negativen Ergebnisse auftraten, und dass in dem nachfolgenden Untersuchungszeitraum 

verschiedene Ergebnisse ermittelt wurden, lassen den Schluss zu, dass die GFAP-mRNA bei 

sehr hohen Temperaturen, wie sie bei der Konservenherstellung auftreten, möglicherweise 

instabil wurde und somit nicht mehr über einen längeren Zeitraum nachweisbar war. Als 

Ursache für den Abbau der GFAP-mRNA während und nach der Konservenherstellung 

kommen mehrere Möglichkeiten in Frage. Zum einen können durch Additive bei der 

Konservenherstellung entstandene PCR-Inhibitoren und Inhibitoren der reversen 

Transkriptase (RAM et al. 1996) die Amplifikation des 168 bp großen GFAP-mRNA 

Fragmentes verhindern. Zum anderen kann das Zusammenwirken von Additiven und hohen 

109

Diskussion 

Temperaturen zur Produktion von Stoffen führen, die GFAP-mRNA abbauen. In diesem 

Zusammenhang können auch Enzyme, RNA-Bindungsproteine oder andere Moleküle 

entstehen oder zerfallen, die zur Stabilität bzw. Abbau der GFAP-mRNA beitragen. Eine 

weitere mögliche Ursache ist der Zerfall der GFAP-mRNA in kleinere Fragmente, die von der 

verwendeten RT-PCR nicht mehr erfasst werden können. RAM et al. (1996) berichten in ihrer 

Arbeit von dem Zerfall der DNA des Cytochrom b Gens in Fragmente kleiner als 123 bp, der 

durch den Erhitzungsprozess bei der Konservenherstellung verursacht wurde. Somit kann es 

durchaus möglich sein, dass auch mRNA durch den Erhitzungsprozess bei der 

Konservenherstellung fragmentiert wird. 

Somit ist ein sicherer Nachweis der GFAP-mRNA über einen längeren Zeitraum mit der hier 

angewandten Methode in Vollkonserven nicht möglich. 

5.3.4 Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch mit bovinem PNS-Gewebe 

Der Gehalt von GFAP in peripheren Nervengewebe (PNS) ist mit 13,5 – 51 ng/mg im 

Vergleich zu Muskelgewebe (2,8 ng/mg GFAP-Gehalt) recht hoch (SCHMIDT et al. 1999) 

und könnte möglicherweise als falsch positives Signal bei der Detektion von Gehirngewebe in 

Fleisch und Fleischerzeugnissen auftreten. In Bezug auf den Nachweis des GFAP sind 

Untersuchungen zum Einfluss von PNS auf die Identifizierung von ZNS-Gewebe noch nicht 

durchgeführt worden. In den bisher veröffentlichten Untersuchungen wird davon 

ausgegangen, dass das PNS-Gewebe im GFAP-ELISA (SCHMIDT et al. 2001) sowie im 

NSE-Westernblot (LÜCKER et al. 1998, 1999, 2000a,) erst bei sehr hoher Beimengung von 

25 % bis 50 % in Fleischerzeugnissen ein falsch positives Ergebnis verursachen könnte 

(LÜCKER u. SCHLOTTERMÜLLER 2001a). Bei einem immunhistologischen Nachweis 

von ZNS-Gewebe konnte mit einem Antikörper gegen das Neurofilament auch PNS-Gewebe 

detektiert werden (AUPPERLE et al. 2002; LÜCKER et al. 2002a). 

In den eigenen Untersuchungen sollte aufgezeigt werden, inwieweit der Nachweis boviner 

GFAP-mRNA durch Beimengung von PNS-Gewebe beeinflusst wird. Um festzustellen, ab 

welcher Konzentration die Beimengung von PNS in Fleisch und Fleischerzeugnissen beim 

Rind einen falsch positiven Nachweis des ZNS-Gewebes ergeben kann, wurde natives PNS- 

Gewebe, erhitztes PNS-Gewebe sowie Brühwursterzeugnisse aus Rindfleisch untersucht, die 

mit bovinen PNS-Gewebe in den Konzentrationsabstufungen 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 

% dotiert waren und bei 75°C im Wasserbad erhitzt wurden (s. Kapitel 4.2.1.6). Lediglich die 

110

Diskussion 

Proben mit nativem PNS-Gewebe ergaben ein positives GFAP-mRNA Signal (s. Kapitel 

4.2.1.6). Somit konnte mit diesem Versuch gezeigt werden, dass die bovine GFAP-mRNA im 

PNS-Gewebe bei moderater Erwärmung, unabhängig von der vorhandenen Konzentration, 

inaktiviert wurde 

In der Tabelle 36 sind die Ergebnisse des bovinen GFAP-mRNA Nachweises in den 

produzierten Fleischerzeugnissen hinsichtlich der auftretenden falsch positiven (FP) und 

falsch negativen (FN) GFAP-mRNA Signale in Relation zu den durchgeführten Versuchen 

(G) in nicht mit bovinem ZNS-Gewebe dotierten und mit bovinem ZNS-Gewebe dotierten 

Fleischerzeugnissen zusammenfassend dargestellt. 

Tabelle 36: Nachweis boviner GFAP-mRNA aus Fleischerzeugnissen - Zusammenfassende 

Darstellung der Ergebnisse in Hinblick auf Spezifität (falsch positive 

Ergebnisse) und Wiederfindung (falsch negative Ergebnisse) 


nicht mit ZNS-Gewebe mit ZNS-Gewebe 

dotiert 

dotiert 

FP 

FN 

G a FP b G a FN c 

(%) d (%) e 

Brühwurst, 75°C 24 0 0 78 1 1,3 

Brühwurst, 95°C 15 0 0 60 6 10 

Brühwurst, 100°C 15 0 0 60 0 0 

Leberwurst 16 0 0 64 2 3,1 

Vollkonserve I 12 0 0 48 36 75 

Vollkonserve II 9 0 0 36 18 50 

a G: Anzahl der untersuchten Proben; b FP: falsch positive Ergebnisse; c FN: falsch negative 

Ergebnisse; d FP (%): falsch positive Ergebnisse in %; e FN (%): falsch negative Ergebnisse in 

% 

Bei der Gasamtbetrachtung dieser Ergebnisse wird deutlich, dass in keinem Fall falsch 

positive Resultate bei nicht mit bovinem ZNS dotierten Fleischerzeugnissen aufgetreten 

waren (Tabelle 36). In den untersuchten Fleischerzeugnissen war die Wiederfindungsrate von 

boviner GFAP-mRNA in den untersuchten Vollkonserven mit 75 % und 50 % falsch 

negativen Ergebnissen am niedrigsten (Tabelle 36), während die unterschiedlich stark 

111

Diskussion 

erhitzten Brühwursterzeugnisse und die Leberwurst gute Wiederfindungsraten aufwiesen 

(Tabelle 36). Somit ist die in dieser Dissertation angewandte Methode zur Detektion von 

bovinem ZNS-Gewebe mittels boviner GFAP-mRNA in erhitzten Fleischerzeugnissen 

einsetzbar. 

Nachfolgend werden die Ergebnisse des bovinen GFAP-mRNA Nachweises 

produktübergreifend über einen Zeitraum von 28 Tagen (G1), exklusive der Untersuchungen 

mit Vollkonserven, summarisch dargestellt (Tabelle 37). 

Tabelle 37: Nachweis boviner GFAP-mRNA aus Fleischerzeugnissen - Zusammenfassende 

Darstellung der Ergebnisse unter Berücksichtigung der ZNS-Konzentration 

ZNS- 

Beimengung 

(%) 

0 0,25 0,5 1 5 

a 

G1 65 50 65 65 65 

FP (%) b 0 - - - - 

FN (%) c 

(A) d - 

8 

(4) 

4,6 

(3) 

1,5 

(1) 

1,5 

(1) 

a G: Anzahl der untersuchten Proben; b FP %: falsch positive Ergebnisse in %; c FN %: falsch 

negative Ergebnisse in %; d (A) Anzahl der falsch negativen Ergebnisse 

Wie aus Tabelle 37 ersichtlich wird, war kein falsch positiver GFAP-mRNA Nachweis 

feststellbar. Bei den mit Gehirngewebe dotierten Fleischerzeugnissen war bei der 

Konzentrationsstufe 0,25 % mit 8 % der höchste Wert an falsch negativen Ergebnissen 

aufgetreten. Die Sensitivität dieser Methode liegt bei den hier untersuchten 

Fleischerzeugnissen (unter Nichtbeachtung der getesteten Vollkonserven) gemessen über 

einen Zeitraum von 28 Tagen bei 97 % (Tabelle 37), und die Gewebespezifität für bovines 

ZNS-Gewebe bei 100 % (Tabelle 37). Somit ist die hier verwendete Methode geeignet, um 

bovines ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen, außer Vollkonserven, zu detektieren. Die hier 

eingesetzte Methode ist hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität für pasteurisierte 

Fleischerzeugnisse mit dem GFAP-ELISA (AGAZZI et al. 2002) vergleichbar. 

112

Diskussion 

5.4 RFLP des 168 bp GFAP-mRNA Fragmentes zur Identifizierung 

boviner GFAP-mRNA 

In den hier vorgestellten Untersuchungen wurde im Anschluss an die RT-PCR ein RFLP 

durchgeführt, um neben dem Nachweis der GFAP-mRNA eine Differenzierung der Tierarten 

zu erlangen. Nach dem derzeitigen Wissensstand ist die PCR-RFLP einer konservierten 

Region der DNA, wie z.B. des Cytochrom b Gens, eine gut erforschte Methode, um 

verschiedene Spezies in Fleischerzeugnissen zu detektieren (MEYER et al. 1995) sowie 

zwischen eng verwandten, verschiednen Rotwildspezies (WOLF et al. 1999) und Fischspezies 

(CÈSPEDES et al. 1998; BELLAGAMBA et al. 2001; QUINTEIRO et al. 2001) zu 

unterscheiden. 

In dieser Arbeit konnte mit den Primern GFAPforw und GFAPrev die GFAP-mRNA aus 

ZNS-Gewebe der Tierarten Schwein, Wildschwein, Rind, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild 

und Rotwild detektiert werden (s. Kapitel 4.3, 4.4). Aufgrund der durchgeführten Versuche 

zur Gewebespezifität ist bisher nur die bovine GFAP-mRNA ein sicherer Marker für ZNS- 

Gewebe. Deshalb muss, bei einem positiven Nachweis von GFAP-mRNA, durch die 

Amplifikation eines 168 bp großen Fragments der GFAP-mRNA Sequenz, die bovine 

Herkunft dieses Signals verifiziert werden. Nur wenn dies gelingt, ist bovines ZNS-Gewebe 

nachgewiesen. 

In vorangegangenen Untersuchungen zur Differenzierung boviner GFAP-mRNA 

(SEYBOLDT et al. 2003), wurden die Restriktionsenzyme Hae III und Sst I verwendet. 

Aufgrund fehlender Sequenzdaten der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild 

und Rotwild, war jedoch die Unterscheidung Damwild / Rind problematisch. Durch die 

Entwicklung der RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 und die anschließende 

Sequenzierung der erhaltenen Amplifikate konnten die notwendigen Sequenzinformation zum 

entsprechenden GFAP-mRNA Abschnitt der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild, 

Rehwild und Rotwild erarbeitet werden (s. Kapitel 4.3). 

Anhand der erhaltenen Sequenzdaten konnten nun die Fragmentgrößen nach 

Restriktionsenzymspaltung für die untersuchten Tierarten berechnet werden (s. Kapitel 4.3, 

Abb. 8) und zur Differenzierung von boviner GFAP-mRNA geeignete Restriktionsenzyme 

ausgewählt werden. Die bei der Restriktionsenzymanalyse entstehenden Fragmentmuster 

113

Diskussion 

(s. Kapitel 4.4, Tabelle 35) konnten an Individuen mehrerer Tierarten bestätigt werden (Rind, 

8; Schaf, 10; Schwein, 10; Pferd, 8; Damwild, 2; Rehwild, 1; Rotwild, 1). So konnte 

festgestellt werden, dass nach Hae III Spaltung der 168 bp Amplifikate das Fragmentmuster 

86 bp, 54 bp, 28 bp typisch für das Amplifikat der bovinen GFAP-mRNA ist (s. Kapitel 4.4, 

Tabelle 35, Abb. 9). Die 168 bp Amplifikate der GFAP-mRNA von Schaf und Damwild 

erzeugen jedoch nach Spaltung mit Hae III Fragmentmuster, die dem der bovinen GFAPmRNA 

ähneln (s. Kapitel 4.4, Tabelle 35, Abb. 9). Hier kann durch eine Msc I Spaltung der 

Amplifikate von Rind, Schaf und Damwild eine sichere Differenzierung boviner GFAPmRNA 

erreicht werden. Das Amplifikat boviner GFAP-mRNA kann nicht durch Msc I 

aufgetrennt werden, das GFAP-mRNA Amplifikat von Schaf und Damwild kann dagegen in 

Fragmente von 117 bp und 51 bp Größe gespalten werden (s. Kapitel 4.4, Tabelle 35, Abb. 9). 

Somit ist mit der Kombination der Restriktionsenzyme Hae III und Msc I die GFAP-mRNA 

der Tierart Rind sicher identifizierbar. Die Differenzierung weiterer Tierarten ist möglich, 

aufgrund der fehlenden bzw. noch nicht untersuchten Gewebespezifität jedoch nicht 

notwendig. 

In zukünftigen Untersuchungen sollte die Gewebespezifität des 168 bp großen GFAP-mRNA 

Fragments weiterer Tierarten ebenfalls überprüft werden. Möglicherweise ist der Nachweis 

von GFAP-mRNA bei weiteren Tierarten (z.B. Pferd, Damwild, Rehwild und Rotwild) 

geeignet, um ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen zu detektieren. Auch ist der Einsatz 

anderer gewebsspezifisch transkribierter mRNA als Marker für den Nachweis von ZNS und 

auch anderer Gewebetypen in Fleisch und Fleischerzeugnissen denkbar. 

114

Zusammenfassung 

6 Zusammenfassung 


Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS – Gewebe in 

Fleischerzeugnissen mittels RT-PCR 

Im Rahmen des vorbeugenden Verbraucherschutzes haben die bovine spongiforme 

Enzephalopathie (BSE), die möglichen Übertragungswege der BSE und die mit dieser 

assoziierten neuen Variante der Creutzfeldt-Jakob Erkrankung (vCJD) erheblich an 

Bedeutung gewonnen. In diesem Zusammenhang ist der mögliche Eintrag von spezifiziertem 

Risikomaterial, insbesondere von Gewebe des zentralen Nervensystems, in die humane 

Lebensmittelkette von besonderem Interesse, da ein möglicher Einsatz von Separatorenfleisch 

und Gehirngewebe als Emulgator in Brüh- und Kochwürsten nicht ausgeschlossen werden 

kann. 

Das in dieser Arbeit verwendete molekularbiologische Verfahren zur Detektion von ZNS- 

Gewebe in Fleischerzeugnissen basiert auf dem für die Tierart Rind gewebespezifischen 

Nachweis eines 168 bp großen Fragments der mRNA des sauren Gliafaserproteins (GFAP) 

mittels reverser Transcriptase- Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR). Im Anschluss an die 

RT-PCR wird die Bestimmung der Tierart Rind mittels eines Restriktionsfragment 

Längenpolymorphismus (RFLP) durchgeführt. 

Die Untersuchungen zur Gewebespezifität der GFAP-mRNA beim Schwein und Schaf 

zeigen, dass die hier verwendete Methode anscheinend nicht geeignet ist, um ZNS-Gewebe 

von Schaf und Schwein in Fleischerzeugnissen mit ausreichender Gewebespezifität 

nachzuweisen. Daher ist bisher nur die bovine GFAP-mRNA ein sicherer Marker für ZNS- 

Gewebe. Deshalb muss die bovine Herkunft dieses Signals verifiziert werden. Durch die 

Entwicklung der RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 und die anschließende 

Sequenzierung der erhaltenen Amplifikate konnten die notwendigen Sequenzinformation zum 

entsprechenden GFAP-mRNA Abschnitt der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild, 

Rehwild und Rotwild erarbeitet werden. Durch die Restriktionsenzyme Hae III und Msc I ist 

die GFAP-mRNA der Tierart Rind sicher identifizierbar. 

115

Zusammenfassung 

In den Brühwursterzeugnissen aus Rinderfleisch und Leberwürsten, die mit bovinen ZNS- 

Gewebe in den Konzentrationsstufen 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % und 5 % dotiert wurden, und 

verschiedenen Erhitzungsbedingungen bis 100°C unterzogen wurden, ist der Nachweis des 

168 bp großen Amplifikats der bovinen GFAP-mRNA ab einer Konzentration von 0,25 % 

ZNS-Gewebe über einen Zeitraum bis zu 35 Tagen möglich. Bei einem 

Untersuchungszeitraum von 28 Tagen lag die Sensitivität dieser Methode bei 97 % für 

Fleischerzeugnisse, die mit Temperaturen bis zu 100°C erhitzt wurden, die Gewebespezifität 

für bovines ZNS-Gewebe lag bei 100 %. Bei der Untersuchung der mit bovinen ZNS-Gewebe 

dotierten Vollkonserven mit einem F S -Wert von über 5 ist der Nachweis der GFAP-mRNA 

mit der hier verwendeten Methode nicht sicher möglich. 

In der hier vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die verwendete molekularbiologische 

Methode geeignet ist, bovines ZNS-Gewebe in Fleischerzeugnissen, die mit Temperaturen bis 

zu 100°C erhitzt wurden, nachzuweisen. 

116

Summary 

7 Summary 


Species- and Tissue-Specific Detection of Bovine CNS-Tissue in Meat Products Using RT- 

PCR 

The bovine spongiform encephalopathy (BSE), the possible routes of infection of BSE, and 

the new variant of the Creuzfeld-Jakob-disease (vCJD) which is closely connected with the 

first, have gained special attention with regard to preventive protection of consumers. The 

possible entry of specific risk material, particularly the entry of CNS tissue in the human food 

chain, is considered as a main root of infection. The illegal use of mechanically recovered 

meat in retail meat products and CNS-tissue as an emulgator in cooked sausages can not be 

excluded. Therefore appropriate control procedures for food and feeding are necessary in 

order to prevent CNS-tissue infiltrating the food- and feeding-chain. 

The method used in thesis in order to detect CNS-tissue in retail meat products is based on the 

detection of a168 bp sized fragment of mRNA of the glial acidic fibrillary protein (GFAP) by 

using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Subsequent to the RT-PCR 

the classification of the species cattle by using a restriction fragment length polymorphism 

analysis (RFLP) had been carried out. 

Investigations made with regard to the tissue specificity of the GFAP-mRNA in porcine and 

ovine tissues revealed that the specification of CNS-tissue of these species is not possible so 

far, using the168 bp sized amplification product of the GFAP-mRNA as marker. Therefore 

only the bovine GFAP-mRNA is considered to be a save marker for the presence of CNStissue. 

Consequently the bovine origin of the detected GFAP-mRNA has to be proved. By the 

development of the RT-PCR using the primer pair bGFAPw1 and bGFAPw2 the necessary 

sequence information from sheep, pork, horse, fallow deer, roe deer and red deer to 

differentiate the respective amplification products were obtained. Using the restriction 

enzymes Hae III and Msc I the bovine GFAP-mRNA can be clearly identified. 

With beef sausage-products and liver sausages, which were spiked with bovine CNS-tissue in 

concentrations of 0 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 % and 5 %, and which had a heating process up to 

100°C temperature to undergo, the proof of GFAP-mRNA up to a concentration of 0,25 % 

was possible over a period of 35 days. Over a period of 28 days, the sensitivity of this method 

117

Summary 

is up to 97 % in retail meat products, which were produced by a heating temperature up to 

100°C. The specificity of the GFAP-mRNA RT-PCR assay for bovine CNS-tissue is 100 % in 

the experiments conducted here. Examination of canned food endowed with bovine CNS 

which were heated to F S -values over 5 revealed that the proof of GFAP-mRNA with the 

described method was not safely possible. 

Within the present thesis it can be stated that the used method is suitable to detect bovine 

CNS-tissue in meat products which were heated up to a temperature of 100°C. 

118

Literatur 

8 Literatur 

AGAZZI, M.-E., J. BARRERO-MORENO, E. LÜCKER, C. v. HOLST, E. ANKLAM (2002) 

Performance comparison of two analytical methods for the detection of tissues of the 

central nervous system in sausages: results of an interlaboratory study. 

Eur. Food Res. Technol. 215, 334 – 339 

AGGARWAL, R., K.A. MCCAUSTLAND (1998) 

Hepatitis E virus RNA detection in serum and feces specimens with the use of 

microspin columns. 

J. Virol. Methods 74, 209 – 213 

AGUZZI, A. (2002) 

Die Prion-Hypothese und Prionen-Krankheiten des Menschen. 

Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 115, 91 – 98 

AGUZZI, A., C. Weissmann (1997) 

Prion research: the next frontiers. 

Nature 389, 795 – 798 

ALMOND, J., J. PATTISON (1997) 

Human BSE. 

Nature 389, 437 – 438 

ALPEROVITCH, A., P. BROWN, T. WEBER, M. POCCHIARI, A: HOFMAN, u. R. WILL 

(1994) 

Incidence of Creutzfeldt-Jakob disease in Europe in 1993. 

Lancet 343, 918 

ALPERS, M., D. GAJDUSEK (1965) 

Changing patterns of Kuru: epidemiological changes in the period of increasing contact 

of the fore people with western civilization. 

Am. J. Trop. Med. Hyg. 14 (5), 852 – 879 

ANIL, M., S. LOVE, C.R. HELPS, D.A. HARBOUR (2002) 

Potential for carcass contamination with brain tissue following stunning and slaughter in 

cattle and sheep. 

Food Control 13 (6-7), 431 – 436 

ANIL, M., S. LOVE, S. WILLIAMS (1999) 

Potential contamination of beef carcasses with brain tissue at slaughter. 

Vet. Rec. 145, 460 

119

Literatur 

ANKLAM, E., R. BATTAGLIA (2001) 

Food analysis and consumer protection. 

Trends in Food Science & Technology 12, 197 – 202 

ANONYM (1994) 

Lebensmittel und Bedarfsgegenstände Gesetz vom 25. November 1994, 

BGBl. I, S. 3538 

ANONYM (1994a) 

Pschyrembel klinisches Wörterbuch. 

257. Auflage, W. de Gruyter, Berlin, New York, S. 1690 

ANONYM (1998) 

Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse. 

Dt. Lebensmittelbuch, Bundesanzeiger, Köln, 49 – 150 


Gesetz über das Verbot des Verfütterns, des innergemeinschaftlichen Verbringens und 

der Ausfuhr bestimmter Futtermittel vom 1. Dezember 2000. 

BGBI. I, 1635 

ANONYM (2000b) 

Verordnung zur fleischhygienerechtlichen Untersuchung von geschlachteten Rindern 

auf BSE vom 1. Dezember 2000. 

BGBI. I, 1659 

ANONYM (2000c) 

Verordnung zur Änderung tierkörperbeseitigungsrechtlicher Vorschriften vom 12. 

Oktober 2000. 

BGBI. I, 1422 

ANONYM (2001) 

Futtermittel-Verfütterungsverbotsverordnung vom 20. Februar 2001. 

BAnz. S. 3105 


Erste Verordnung zur Änderung der Verordnung zur fleischhygienerechtlichen 

Untersuchung von geschlachteten Rindern auf BSE vom 25. Januar 2001 

BGBI. I, 164 

120

Literatur 

ANONYM (2001b) 

Achte Verordnung zur Änderung von Vorschriften zum Schutz der Verbraucher vor der 

bovinen Spongiformen Enzephalopathie vom 23. Mai 2001. 

BGBI. I, 982 

ANONYM (2001c) 

Probennahme und Durchführung diagnostischer Arbeiten im Rahmen der 

epidemiologischen BSE- und Scrapie-Überwachungsprogramme, sowie der 

Untersuchung konkreter Verdachtsfälle. Beschluss 603. 

Bundesgesundheitsbl.-Gesundheitsforsch.-Gesundheitsschutz 44, 413 – 415 

ANONYM (2001d) 

Spezielle Maßnahmen zum Schutz der Beschäftigten vor Infektionen durch BSE- 

Erreger. Beschliss 602. 


ANONYM (2001e) 

Änderung der Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse vom 2.10.01. 

Dt. Lebensmittelbuch, Bundesanzeiger Nr. 199 vom 24.10.2001 

ANONYM (2003) 

Fleischhygienegesetz-FlHG vom 30. Juni 2003. 

BGBl. I S. 1242 zuletzt geändert am 28. Juli 2003 durch BGBl. I, S. 1585 vom 8. 

August 2003 

ASANTE, E.A., J.M. LINEHAN, M. DESBRUSLAIS, S. JOINER, I. GOWLAND, A.L. 

WOOD, J. WELCH, A.F. HILL, S.E. LLOYD, J-D.F. WADSWORTH, J. COLLINGE 

(2002) 

BSE prions propagate as either variant CJD-like or sporadic CJD-like prion strains in 

transgenic mice expressing human prion protein 

The EMBO J. 21 (23), 6358 – 6366 

AUPPERLE, H., E. LÜCKER, M. OVERHOFF, H.-A. SCHOON (2002) 

Verfahren zum Nachweis von im Hinblick auf die BSE unerwünschten Zutaten in 

Fleischerzeugnissen. 6. Immunhistologischer Nachweis von zentralem und peripherem 

Nervengewebe in Fleischerzeugnissen. 

Fleischwirtschaft 3, 100 – 104 

AUSTIN, A.R., M.M. SIMMONS (1993) 

Reduced rumination in bovine spongiform encephalopathy and scrapie. 

Vet. Rec. 132, 324 – 325 

121

Literatur 

BAKER, H.E., M. POULTER, T.J. CROW, C.D. FRITH, R. LOFTHOUSE, R.M. RIDLEY, 

J. COLLINGE (1991) 

Aminoacid polymorphism in human prion protein and age at death in inherited prion 

disease. Lancet 337, 1286 

BARLETT, S.E., W.S. DAVIDSON (1992) 

FINS (forensically informative nucleotide sequencing): a procedure for indentifying the 

animal origin of biological specimens. 

BioTechniques 12, 408 – 411 

BARON, T.G., J.Y. MADEC, D. CALAVAS (1999) 

Similar signature of the prion protein in natural sheep scrapie and bovine spongiform 

encephalopathy-linked diseases. 

J. Clin. Microbiol. 37, 3701 – 3704 

BATEMAN, D., D. HILTON, S. LOVE, M. ZEIDLER, J. BECK, J. COLLINGE (1995) 

Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease in a 18-year-old in the UK. 

Lancet 346, 1155 – 1156 

BAUER, N.E., T. GARLAND, J.F. EDWARDS (1996) 

Brain emboli in slaughtered cattle. 

Vet. Pathol. 33, 600 

BEELMAN, C.A., R. PARKER (1995) 

Degradation of mRNA in eukaryotes. 

Cell 81, 179 – 183 

BELAY, E.D., P. GAMBETTI, L.B. SCHONBERGER, P. PARCHI. D.R. LYON, S. 

CAPELLARI, J.H. MCQUISTON, K. BRADLEY, G. DOWDLE, J.M. CRUTCHER, C.R. 

NICHOLS (2001) 

Creutzfeldt-Jakob disease in unusually young patiens who consumed venison. 

Arch. Neurol. 58, 1673 – 1678 

BELLAGAMBA, F., V.M. MORETTI, S. COMINCINI, F. VALFRÉ (2001) 

Identification of species in animal feedstuffs by polymerase chain reaction-restriction 

fragment length polymorphism analysis of mitochondrial DNA. 

J. Agric. Food Chem. 49, 3775 – 3781 

122

Literatur 

BENVENISTE, E.N., J.N. WHITAKER, D.A. GIBBS, S.M. SPARACIO, J.L. BUTLER 

(1989) 

Human B cell growth factor enhances proliferation and glial fibrillary acidic protein 

gene expression in rat astrocytes. 

Intern. Immunol. 1, 219 – 228 

BERNSTEIN, P., J. ROSS (1989) 

Poly (A), Poly (A) binding protein and the regulation of mRNA stability. 

Trends Biochem. Sci. 14, 373 – 377 

BgVV (2001a) 

Verwendbarkeit von Herz, Lunge und Blut bei Rindern nach Bolzenschussbetäubung. 

Stellungnahme vom 15.03.2001, 

http://www.bgvv.de/lebensmittel/lebensmittelsicherheit/mikrob_risiken/bse/files/schlach 

ttechnik/15-03-01.pdf 

BgVV (2001b) 

Fleischhygienerechtliche Maßregelungen von Tierkörpern bei positiven BSE-Befund. 

Mit der Bundesanstalt für Fleischforschung (BAFF) abgestimmte Stellungnahme vom 

10. 01. 2001 


ttechnik/10-01-01-baff.pdf 

BgVV (2001c) 

Spaltung der Wirbelsäule von Rindern – Änderung der Fleischhygiene-Verordnung. 

Stellungnahme vom 30. Januar 2001. 


ttechnik/30-01-2001.pdf 

BgVV (2001d) 

BSE-Entfernung bestimmter Darmgekröseteile. Stellungnahme des BgVV vom 30. Juli 

2001. 

http://www.bgvv.de/lebensmittel/lebensmittelsicherheit/mikrob_risiken/bse/files/risiko 

materialien/30-07-2001.pdf 

BIEDERMANN, W., E. LÜCKER, A. HENSEL (2002) 

Detection of tissues of the central nervous system (CNS) as specified risk material 

(SRM) in meat products by means of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). 


123

Literatur 

BONS, N., N. MESTRE-FRANCES, I. GUIRAUD, Y. CHARNAY (1997) 

Prion immunoreactivity in brain, tonsil, gastrointestinal epithelial cells, and blood and 

lymph vessels in lemurian zoo primates with spongiform encephalopathy. 

C. R. Acad. Sci. III, 320, 971 – 979 

BONS, N., N. MESTRE-FRANCES, P. BELLI, F. CATHALA, D.C. GAJDUSEK, P. 

BROWN (1999) 

Natural and experimental oral infection of nonhuman primates by bovine spongiform 

encephalopathy agents. 

Proc. Natl. Acad. Sci. (PNAS) 96, 4046 – 4051 

BORCHERS, K. (2002) 

Transmissible Spongiforme Enzephalopathie (TSE): Alte Krankheiten mit neuer 

Brisanz. 


BRAUN, E., U. KIHM, N. PUSTERLA, M. SCHÖNMANN (2001) Klinischer 

Untersuchungsgang bei Verdacht auf bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE). 

Deutsches Tierärztebl. 2, 124 – 129 

BRAUN, U. (1998) 

Klinische Symptome und Diagnose von BSE. In: BSE und andere spongiforme 

Enzephalopathien; 

ed. Braun, U., Parey Buchverlag 

BRAUN, U., E. AMREIN, U. ESTERMANN, J. EGLI, T. SCHWEIZER, H. LUTZ, F. 

EHRENSPERGER, M. VANDEVELDE, U. KIHM (1998) 

Offspring of cowes with bovine spongiform encephalopathy (BSE) in Switzerland. 1. 

Clinical findings. 

Schweiz. Arch. Tierheilkd. 140, 240 – 249 

BRAUN, U., E. AMREIN, U. ESTERMANN, N. PUSTERLA, M. SCHÖNMANN, T. 

SCHWEIZER, F. EHRENSPERGER, M. VANDEVELDE, U. KIHM (1999) 

Reliability of a diagnosis of BSE made on the basis of clinical signs. 

Vet. Rec. 145, 198 – 200 

BRAUN, U., E. SCHICKER, B. HÖRNLIMANN (1998a) 

Diagnostic reliability of clinical signs in cows with suspected bovine spongiform 

encephalopathy. 

Vet. Rec. 143, 101 – 105 

124

Literatur 

BRAUN, U., E. SCHICKER, N. PUSTERLA, M. SCHÖNMANN (1998b) 

Clinical findings in 50 cows with bovine spongiform encephalopathy (BSE). 


BRAUN, U., U. KIHM, N. PUSTERLA, M. SCHÖNMANN (1997) 

Clinical examination upon suspicion of bovine spongiform encephalopathy (BSE). 


BRENNER, M. (1994) 

Structure and transcriptional regulation of the GFAP gene. 

Brain Pathol. 4, 245 – 257 

BRITTON, T., S. AL-SARRAJ, C. SHAW, T. CAMPBELL, J. COLLINGE (1995) 

Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease in a 16-year-old in the UK. 

Lancet 346, 1155 

BROWN, P. (1988) 

The decline and fall of Creutzfeldt-Jakob disease associated with human growth 

hormone therapy. 

Neurology 38, 1135 – 1137 

BROWN, P., M.A. PREECE, R.G. WILL (1992) 

Friendly fire in medicine-hormones, homografts, and Creutzfeldt-Jakob disease. 

Lancet 340, 24 – 27 

BROWN, P., P.R. JOHNSON, F. CATHALA, C.J. GIBBS, D.C. GAJDUSEK (1984) 

Creutzfeldt-Jakob Disease of long duration: clinico-pathological characteristics, 

transmissibility, and differential diagnosis. 

Ann. Nerol. 16, 295 – 304 

BROWN, P., R.G. ROHWER, D.C. GAJDUSEK (1986) 

Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in 

brain tissue. 

J. Infect. Dis. 153, 1145 – 1148 

BROWN, P., R.G. WILL, R. BRADLEY, D.M. ASHER, L. DETWILER (2001) 

Bovine spongiform encephalopathy and variant Creutzfeldt-Jakob disease: background, 

evolution, and current concerns. 

Emerg. Infect. Dis. 7, 6 – 16 

125

Literatur 

BRUCE, M.E., A. CHREE, I. MCCONNELL, J. FOSTER, G. PEARSON, H. FRASER 

(1993) 

Agent strain variation in BSE and scrapie. 

Scientific Veterinary Committee of the Commission of the European Communitties, 14 

– 15. September 

BRUCE, M.E., A. CHREE, I. MCCONNELL, J. FOSTER, G. PEARSON, H. FRASER 

(1994) 

Transmission of bovine spongiform encephalopathy and scrapie to mice: strain variation 

and the species barrier. 

Philos. Trans. R. Soc. London 343, 405 – 411 

BRUCE, M.E., R.G. WILL, J.W. IRONSIDE, I. MCCONNELL, D. DRUMMOND, A. 

SUTTIE, L. MCCARDLE, A. CHREE, J. HOPE, C. BIRKETT, S. COUSENS, H. FRASER, 

C.J. BOSTOCK (1997) 

Transmissions to mice indicate, that “new variant” CJD is caused by the BSE agent. 

Nature 389, 498 – 501 

BUDKA, H., D. DORMONT, H. KRETZSCHMAR, M. POCCHIARI, C.v. DUIJN (2002) 

BSE and variant Creutzfeldt-Jakob disease: never say never. 

Acta Neuropathol. 103, 627 – 628 

BUDKA, H., H.A. HAINFELLNER (1996) 

The Human Prion Diseases – Neuropathology, Pathobiology, and Molecular Genetics – 

Vienna, Austria, 16. October 1995 

Neuropathology & Applied Neurobiology 22, 171 – 173 

BÜELER, H., A. AGUZZI, A. SAILER, R.A. GREINER, P. AUTENRIED, M. AGUET, C. 

WEISSMANN (1993) 

Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. 

Cell 73, 1339 – 1347 

BURKE, W.J., K.L. O´MALLEY, H.D. CHUNG, S.K. HARMON, J.P. MILLER, L. BERG 

(1991) 

Effect of pre- and postmortem variables on specific mRNA levels in human brain. 

Mol. Brain Res. 11, 37 – 41 

CAUGHEY, B. G.S. BARON (2002) 

Factors affecting interactions between prion protein isoforms. 

Biochem. Soc. Trans. 30 (4), 565 – 569 

126

Literatur 

CESPEDES, A., T. GARCIA, E. CARRERA, I. GONZALEZ, B. SANZ, P.E. 

HERNANDEZ, R. MARTIN (1998) 

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of a short 

fragment of the cytochrome b gene for identification of flatfish species. 

J. Food Prot. 61 (12), 1684 – 1685 

CHAZOT, G., E. BROUSSOLE, T. BLATTIER, A. AGUZZI, N. KNOPP (1996) 

New of Creutzfeldt-Jakob disease in a 26-year-old French man. 

Lancet 347, 1181 

CHEN, C., A.N. XU, A.B. SHYU (1995) 

mRNA decay mediated by two distinct AU-rich elements from c-fos and GM-CSF 

transcripts: different deadenylation kinetics and uncoupling from translation. 

Mol. Cell Biol. 15, 5777 – 5788 

CHEN, L., D.M. SEGAL, D.C. MASH (1999) 

Semi-quantitative reverese-transcriptase polymerase chain reaction: an approach for the 

measurement of target gene expression in human brain. 

Brain Res. Protoc. 4, 132 – 139 

CHOMCZYNSKI, P., N. SACCI (1987) 

Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform 

extraction. 

Anal. Biochem. 162 (1), 156 – 159 

COHEN, F., K. PAN, Z. HUANG, M. BALDWIN, R. FLETTERICK, S. PRUSINER (1994) 

Structural clues to prion replication. 

Science 264, 530 – 531 

COLLEE, J.G., R. BRADLEY (1997) 

BSE: a decade on. Part 2. 

Lancet 349, 715 – 721 

COLLINGE, J., K.C.L. SIDLE, J. MEADS, J. IRONSIDE, A.F. HILL (1996) 

Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of “new variant” CJD. 

Nature 383, 685 – 690 

COLLINGE, J., M.S. PALMER, A.J. DRYDEN (1991) 

Genetic predisposition to iatrogenic Creutzfeldt-Jakob Disease. 

Lancet 337, 1441 – 1442 

127

Literatur 

CONDORELLI, D.F., V.G. NICOLETTI, V. BARESI, S.G. CONTICELLO, A. CARUSO, 

E.A. TENDI, A.M. GIUFFRIDA STELLA (1999) 

Structural features of the rat GFAP gene and identification of a novel alternative 

transcript. 

J. Neurosi. Res. 56, 219 – 228 

CONRATHS, F.J., T. SELHORST, M.H. GROSCHUP (2002) 

Bovine spongiforme Enzephalpathie (BSE) bei in Deutschland geborenen Rindern. 


COULTHART, M.B., N.R. CASHMAN (2001) 

Variant Creutzfeldt-Jakob disease: a summary of current scientific knowledge in 

relation to public health. 

CMAJ 165 (1), 51 – 58 

COUSENS, S.N., L. LINSELL, P.G. SMITH, M. CHANDRAKUMAR, J.W. WILESMITH, 

R.S. KNIGHT, M. ZEIDLER, G. STEWART, R.G. WILL (1999) 

Geographical distribution of variant CJD in the UK (excluding Northern Ireland). 

Lancet 353, 18 – 21 

COUSENS, S.N., P.G. SMITH, H. WARD, D. EVERINGTON, R.S.G. KNIGHT, M. 

ZEIDLER, G. STEWART, E.A.B. SMITH-BATHGATE, M.-A. MACLEOD, J. 

MACKENZIE, R.G. WILL (2001) 

Geographical distribution of variant Creutzfeldt-Jakob disease in Great Britain, 1994 – 

2000. 

Lancet 357, 1002 – 1007 

CREUTZFELDT, H. (1920) 

Über eine eigenartige herdförmige Erkrankung des Zentralnervensystems. 

Z. ges. Neurlol. Psychiatr. 57, 1 – 20 

CULBERTSON, M.R. (1999) 

RNA surveillance. Unforeseen consequences for gene expression, inherited genetic 

disorders and cancer. 

Trends Genet. 15, 74 – 80 

DALY, D.J., D.M. PRENDERGAST, J.J. SHERIDAN, I.S. BLAIR, D.A. MCDOWELL 

(2002) 

Use of a marker organism to model the spread of central nervous system tissue in cattle 

and the abattoir environment during commercial stunning and carcass dressing. 

Appl. Environ. Microbiol. 68 (2), 791 – 798 

128

Literatur 

DAMODARAN, T.V., M.B. ABOU-DONIA (2000) 

Alteration levels of mRNAs coding for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and 

vimentin genes in the central nervous system of hens treated with Diisopropyl 

Phosphorofluoridate (DFP). 

Neurochem. Res. 25 (6), 809 – 816 

DERRIGO, M., A. CESTELLI, G. SAVETTIERI, I. DI LIEGRO (2000) 

RNA-protein interactions in the control of stability and localisation of messenger RNA. 

Int. J. Mol. Med. 5, 111 – 123 

DIRINGER, H., M. BEEKES, M. OZEL, D.SIMON, I. QUECK, F. CARDONE, M. 

POCCHIARI, J.W. IRONSIDE (1997) 

Highly infectious purified preparations of disease-specific amyloid of transmissible 

spongiform encephalopathies are not devoid of nucleic acids of viral size. 

Intervirology 40, 238 – 246 

DIRINGER, H., M. BEEKES, U. OBERDIECK (1994) 

The nature of the scrapie agent: the virus theory. 

Ann. N Y Acad. Sci. 724, 246 – 258 

DORMONT, D. (2002) 

Prion Diseases: pathogenesis and public health concerns. 

FEBS Letters 529, 17 – 21 

DORMONT, D. (2002a) 

Prions, BSE and food. 

Int. J. Food Microbiol. 78, 181 – 189 

DREBOT, M.A., S.H. LEE (1997) 

RT-PCR detection of RNA viruses in stool specimens. 

BioTechniques 23, 458 – 465 

DUFFY, P., J. WOLF, G. COLLINS, A. DEVOE, B. STREETEN, D: COWEN (1974) 

Possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob Disease. 

N. Engl. J. Med. 290, 692 – 693 

EASTWOOD, S.L., B. MCDONALD, P.W.J. BURNET, J. BECKWITH, R.W. KERWIN, 

P.J. HARRISON (1995) 

Decreased expression of mRNAs encoding non-NMDA glutamate receptors GluR1 and 

GluR2in medial temporal lobe neurons in schizophrenia. 

Mol. Brain Res. 29, 211 – 223 

129

Literatur 

EBRINGER, A., C. THORPE, J. PIRT, C. WILSON, P. CUNNINGHAM, C. ETTELAIE 

(1997) 

Bovine Spongiform Encephalopathy: Is It An Autoimmune Disease Due To Bacteria 

Showing Molecular Mimikry With Brain Antigens? 

Environmental Health Perspectives 105, 1172 – 1174 

EHRENSPERGER, F., M. VANDEVELDE (1998) 

Neuropathologie der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien bei Tieren. In: BSE 

und andere spongiforme Enzephalopathien. 

ed. Braun U., Parey Buchverlag 

EHRLICH, H.A. (1996) 

PCR Technology. 

In: Meyers, R.A. (Ed.): Encyclopaedia of molecular biology and molecular medicine. 

Bd. 4, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, S. 333 – 340 

ENG, L.F., R.S. GHIRNIKAR (1994) 

GFAP and astrogliosis. 


ENG, L.F., R.S. GHIRNIKAR, Y.L. LEE (2000) 

Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969 – 2000) 

Neurochem. Res. 25 (9-10), 1439 – 1451 

ENG, L.F., S.J. DEARMOND (1983) 

Immunhistochemistry of the glial fibrillary acidic protein. 

In: Progress in Neuropathology 5, 19 – 40; Ed: H.M. Zimmermann, Raven Press, N.Y. 

ERNST, D.R., R.E. RACE (1993) 

Comparative analysis of scrapie agent inactivation methods. 

J. Virol. Methods 41, 193 – 201 

EU (1990a) 

90/667/EWG Richtlinie über tierische Abfälle (Beseitigung, Verarbeitung und 

Vermarktung). 

ABI. EG Nr. L 363, S. 51 

130

Literatur 

EU (1990) 

90/134/EWG: Entscheidung der Kommission vom 6. März 1990 zur zweiten Änderung 

der Richtlinie 82/894/EWG des Rates über die Mitteilung von Viehseuchen in der 

Gemeinschaft und zur zeitweiligen Änderung der Häufigkeit der Meldepflicht bei 

Auftreten der spongiformen Rinderenzephalopathie. 

ABI. EG Nr. L 76, S.23 

EU (1994) 

94/381/EG: Entscheidung der Kommission vom 27. Juni 1994 über Schutzmaßnahmen 

in Bezug auf spongiforme Rinderenzephalopathie und die Verfütterung von aus 

Säugetieren gewonnenen Futtermitteln. 

ABI. EG Nr. L 172, S. 23 

EU (1995) 

95/348/EG: Entscheidung über die im Vereinigten Königreich und in Irland 

anwendbaren veterinär- und tierseuchenrechtlichen Vorschriften für die Behandlung 

bestimmter Abfälle, die zur lokalen Vermarktung als Futtermittel für bestimmte 

Tierkategorien bestimmt sind. 

ABI. EG Nr. L 202, S. 8 

EU (1996) 

96/449/EG: Entscheidung der Kommission vom 18. Juli 1996 über die Zulassung 

alternativer verfahren zur Hitzebehandlung von tierischen Abfällen im Hinblick auf die 

Inaktivierung der Erreger der spongiformen Enzephalopathie. 

ABI. EG Nr. L 184 vom 24.07. 1996, S. 43 – 46 

EU (1997) 

97/534/EG: Entscheidung der Kommission vom 30. Juli 1997 über das Verbot der 

Verwendung von Material angesichts der Möglichkeit der Übertragung transmissibler 

spongiformer Enzephalopathien. 

ABI. EG Nr. L 126 vom 08.08. 1997, S. 95 

EU (1998) 

98/272/EG: Entscheidung der Kommission vom 23. April 1998 über epidemiologische 

Überwachung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und zur Änderung der 

Entscheidung 94/47417EG. 

ABI EG Nr. L 122, S. 59 

131

Literatur 

EU (1999) 

99/534/EG: Entscheidung über Maßnahmen zum Schutz gegen die transmissiblen 

spongiformen Enzephalopatien bei der Verarbeitung bestimmter tierischer Abfälle und 

zur Änderung der Entscheidung 97/735/EG der Kommission. 

ABI EG Nr. L 204, S. 37 

EU (2000) 

2000/418/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Juli 2000 zur Regelung der 

Verwendung von bestimmten Tiermaterial angesichts des Risikos der Übertragung von 

TSE-Erregern und zur Änderung der Entscheidung 94/474/EG. 

ABI EG Nr. L 157, S. 76 – 82 

EU (2000a) 

2000/374/EG: Entscheidung der Kommission vom 5. Juni 2000 zur Änderung der 

Entscheidung 98/272/EG über die epidemiologische Überwachung transmissibler 

spongiformer Enzephalopatien. 

ABI EG Nr. L 135, S. 27 

EU (2000b) 

2000/766/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Dezember 2000 über 

Schutzmaßnahmen in Bezug auf die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien und 

die Verfütterung von tierischen Protein 

ABI. EG Nr. L 306, S. 32 

EU (2000c) 

2000/764/EG Entscheidung der Kommission vom 29. November 2000 über die 

Untersuchung von Rindern auf bovine spongiforme Enzephalopathie und zur Änderung 

der Entscheidung 98/272/EG über epidemiologische Überwachung der transmissiblen 

spongiformen Enzephalopathien 

ABI. EG Nr. L 305, S. 35 

EU (2001) 

2001/1326/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Juni 2001 mit 

Übergangsmaßnahmen zu Erleichterung des Übergangs zur Verordnung EG Nr. 

999/2001 des Europäischen Parlamentes und des Rates mit Vorschriften zur Verhütung, 

Bekämpfung und Tilgung bestimmter transmissibler spongiformer Enzephalopathien 

(TSE) sowie zur Änderung der Anhänge VII und XI dieser Verordnung. 

ABI. EG Nr. L 177, S. 60 

132

Literatur 

EU (2001a) 

2001/25/EG Entscheidung der Kommission vom 27. Dezember 2000 zur Untersagung 

der Verwendung bestimmter tierischer Nebenerzeugnisse in Tierfutter. 

ABI. EG Nr. L 6, S. 16 

EU (2001b) 

2001/999/EG Verordnung des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. Mai 

2001 mit Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler 

spongiformer Enzephalopathien. 

ABI. EG Nr. L 147, S. 1 

EU (2001c) 

2001/233/EG Entscheidung der Kommission vom 14. März 2001 zur Änderung der 

Entscheidung 2000/418/EG im Hinblick auf Separatorenfleisch und Rinderwirbelsäulen. 

ABI. EG Nr. L 84, S. 59 

EU (2001d) 

2001/1248/EG Entscheidung der Kommission vom 22.06.2001 zur Änderung der 

Anhänge III, X und XI der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen 

Parlaments und des Rates im Hinblick auf die epidemiologische Überwachung von 

transmissibler spongiformer Enzephalopathien und die entsprechenden Nachweistests. 

ABI. EG Nr. L 173 

EU (2001e) 

2001/9/EG Entscheidung der Kommission vom 29. Dezember 2000 über 

Kontrollmaßnahmen zur Umsetzung der Entscheidung 2000/766/EG des Rates über 


die Verfütterung von tierischen Protein. 

ABI. EG Nr. L 2, S. 32 

EU (2001f) 

2001/165/EG Entscheidung der Kommission vom 27. Februar 2001 zur Änderung, in 

Bezug auf hydrolysierte Proteine, der Entscheidung 2001/9/EG über 

Kontrollmaßnahmen zur Umsetzung der Entscheidung 2000/766/EG des Rates über 


die Verfütterung von tierischen Protein. 

ABI. EG Nr. L 58, S. 43 

133

Literatur 

EU (2001g) 

2001/101/EG Richtlinie der Kommission zur Änderung der Richtlinie 2000/13/EG des 

Europäischen Parlaments und des Rates zur Angleichung der Rechtsvorschriften der 

Mitgliedsstaaten über die Etikettierung und Aufmachung von Lebensmitteln sowie 

Werbung dafür. 

ABI. EG Nr. L 310, S. 19 

EU (2002) 

2002/270/EG Verordnung der Kommission vom 14. Februar 2002 zur Änderung der 

Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates in Bezug 

auf spezifizierte Risikomaterialien und die epidemiologische Überwachung auf 

bestimmte transmissible spongiforme Enzephalopathien sowie zur Änderung der 

Verordnung (EG) Nr. 1326/2001 in Bezug auf Futtermittel und das Inverkehrbringen 

von Schafen und Ziegen sowie daraus gewonnenen Produkten. 

ABI. EG Nr. L 45 

EU (2002a) 

2002/1494/EG Verordnung der Kommission vom 21. August 2002 zur Änderung der 

Anhänge III, VII und XI der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen 

Parlaments und des Rates hinsichtlich der Überwachung der bovinen spongiformen 

Enzephalopathie, der Tilgung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie, der 

Entfernung von spezifizierten Risikomaterials sowie Regeln für die Einfuhr von 

lebenden Tieren und Erzeugnissen tierischen Ursprungs. 

ABI. EG Nr. L 225, S. 3 

EU (2002b) 

2002/248/EG Entscheidung der Kommission vom 27. März 2002 zur Änderung der 

Entscheidung 2000/766/EG des Rates und der Entscheidung 2001/9/EG der 

Kommission über transmissible spongiforme Enzephalopathien und die Verfütterung 

von tierischen Protein. 

ABI. EG Nr. L 84, S. 71 

EU (2002c) 

2000/1774/EG Verordnung des Europäischen Parlaments und des Rates vom 03. 

Oktober 2002 mit Hygienevorschriften für nicht für den menschlichen Verzehr 

bestimmte Nebenprodukte. 

ABI. EG Nr. L 273, S. 1 

134

Literatur 

EU (2002d) 

2002/86/EG Richtlinie der Kommission zur Änderung der Richtlinie 2001/101/EG 

hinsichtlich des Datums, ab dem der Handel mit Erzeugnissen untersagt ist, die mit der 

Richtlinie 2000/13/EG des Europäischen Parlaments und des Rates nicht 

übereinstimmen. 

ABI. EG Nr. L 305, S. 19 

EU (2003) 

Chronologische Liste der Gemeinschaftsvorschriften. 

http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/legislation_de.hmtl 

EU (2003a) 

2003/260/EG Verordnung der Kommission vom 12. Februar 2003 zur Änderung der 

Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich 

der Tilgung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien bei Schafen und Ziegen 

und der Regeln für den Handel mit lebenden Schafen und Ziegen sowie mit 

Rinderembryonen 

ABI. EG Nr. L 37, S. 7 

EU (2003b) 

2003/100/EG Entscheidung der Kommission vom 13. Februar 2003 zur Festlegung von 

Mindestanforderungen an die Aufstellung von Programmen zur Züchtung von Schafen 

auf Resistenz gegen übertragbare spongiforme Enzephalopathien. 

ABI. EG Nr. L 41, S. 41 

EU (2003c) 

2003/650/EG Verordnung vom 10. April 2003 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 

999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Einfuhr von 

lebenden Schafen und Ziegen. 

ABI. EG Nr. L 95, S. 15 

FEIDEN, W. (1998) 

Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD): sporadische und neue Variante Form (vCJD). Ist 

der Mensch durch BSE gefährdet? 

In: BSE und andere spongiforme Enzephalopathien. ed. Braun U., Parey Buchverlag 

FERGUSON, N., A. GHANI, C. DONNELLY, T. HAGENAARS, R. ANDERSON (2002) 

Estimating the human health risk from possible BSE infection of the British sheep flock. 

Nature online vom 09.01.2002 

135

Literatur 

FITZPATRICK, R., O.M. CASEY, D. MORRIS, T. SMITH, R. POWELL, J.M. SREENAN 

(2001) 

Postmortem stability of RNA isolated from bovine reproductive tissues. 

Biochim. Biophys. Acta 93580,1 – 5 

FOOTE, W., W. CLARK, A. MACIULIS, J. CALL, J. HOURRIGAN, E. EVANS, M. 

MARSHALL, M. DECAMP (1993) 

Prevention of scrapie transmission in sheep, using embryo transfer. 

Am. J. Vet. Res. 54, 1863 – 1868 

FORD, L.P., J. WATSON, J.D. KEENE, J. WILUSZ (1999) 

ELAV proteins stabilize deadenylated intermediates in a novel in vitro mRNA 

deadenylation/degradation system. 

Genes Dev. 13, 188 – 201 

FOSTER, J., J. HOPE, H. FRASER (1993) 

Transmission of bovine spongiform encephalopathie to sheep and goats. 

Vet. Rec. 133(14), 339 – 341 

FOSTER, J.D., D. PARNHAM, A. CHONG, W. GOLDMANN, N. HUNTER (2001a) 

Clinical signs, histopathology and genetics of experimental transmission of BSE and 

natural scrapie to sheep and goats. 

Vet. Rec. 148, 165 – 171 

FOSTER, J.D., D. PARNHAM, N. HUNTER, M. BRUCE (2001b) 

Distribution of the prion protein in sheep affected with BSE following experimental oral 

transmission. 

J. Gen. Virol. 82, 2319 – 2326 

FOSTER, J.D., M.E. BRUCE, I. MCCONNELL, A. CHREE, H. FRASER (1996) 

Detection of BSE infectivity in brain and spleen of experimentally infected sheep. 

Vet. Rec. 139, 512 – 515 

FOSTER, J.D., W. GOLDMANN, D. PARNHAM, A. CHONG, N. HUNTER (2001c) 

Partial dissociation of PrP SC deposition and vacuolation in the brains of scrapie and BSE 

experimentally infected goats. 

J. Gen. Virol. 82, 267 – 273 

FRANKHAUSER, R., R. FRATZER, E. FRAUCHIGER (1972) 

Bemerkungen zur spastischen Parese des Rindes. 


136

Literatur 

FRASER, H., J.D. FOSTER (1994) 

Transmissions to mice, sheep and goats and bioassay of bovine tissues. In: ed. Bradley, 

Marchant, Transmissible spongiform encephalopathies. 

Proceedings on a consultation on BSE with the Scientific Veterinary Committee of the 

commission of the European Communities; 1993 Sept. 14 – 15; Brussels: The 

Commission; 1994. p. 145 – 159 

FRIES, R. (2002) 

BSE im Vereinigten Königreich und in der EU. Eckdaten der Entwicklung. 


FUCHS, E., D.W. CLEVELAND (1998) 

A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. 

Science 279, 514 – 519 

FUCHS, E., K. WEBER (1994) 

Intermediate filaments: structure, dynamics, function and disease. 

Annu. Rev. Biochem. 63, 345 – 382 

GAJDUSEK, D., V. ZIGAS (1957) 

Degenerative disease of central nervous system in New Guinea – The endemic 

occurrence of Kuru in the native population. 

N. Engl. J. Med. 257, 974 – 978 

GAJDUSEK, D., V. ZIGAS (1959) 

Kuru: clinical, pathological and epidemiological study of an acute progressive 

degenerative disease of the central nervous system among natives of the Eastern 

Highlands of New Guinea. 

Am. J. Med. 26, 442 – 469 

GALEA, E., P. DUPOUEY, D.L. FEINSTEIN (1995) 

Glial fibrillary acidic protein mRNA isotypes: expression in vitro and in vivo. 

J. Neurosci. Res. 41, 452 – 461 

GAO, F.B. (1998) 

Messenger RNAs in dendrites: localisation, stability, and implications for neural 

function. 

Bioessays 20 (1), 70 – 78 

GAREIS, M. (1995) 

Rinderwahnsinn - Eine Gefahr für den Menschen. 

Kulmbacher Reihe Band 14, 135 – 151 

137

Literatur 

GARLAND, T., N. BAUER, N. BAILEY (1996) 

Brain emboli in the lungs of cattle after stunning. 

Lancet 348, 610 

GERSTMANN, J. (1928) 

Über ein noch nicht beschriebenes Reflexphänomen bei einer Erkrankung des 

zerebellären Systems. 

Wien Med. Wschr. 78, 906 – 908 

GIESE, A., M.H. GROSCHUP, B. HESS, H.A. KRETZSCHMAR (1995) 

Neuronal cell death in scrapie-infected mice is due to apoptosis. 


GOEBEL, H.H., M. SCHLIE, L.F. ENG (1987) 

Immunhistopathologic spectrum of the glial fibrillary acidic protein in neurooncology. 

Acta Histochem. Suppl. 34, 81 – 93 

GOLDMANN, W., N. HUNTER, G. SMITH, J. FOSTER, J. HOPE (1994) 

PrP genotype and agent effects in scrapie: change in allelic interaction with different 

isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie. 

J. Gen. Virol. 75, 989 – 995 

GORLACH, M., C.G. BURD, G. DREYFUSS (1994) 

The mRNA poly(A)-binding protein: localisation, abundance and RNA-binding 

specificity. 

Exp. Cell. Res. 211, 400 – 407 

GROSCHUP, M.H., A. STOLZE (2002) 

BSE- und Scrapie-Diagnostik in Deutschland. 


GUHANIYOGI, J., G. BREWER (2001) 

Regulation of mRNA stability in mammalian cells. 

Gene 265, 11 – 23 

HARRISON, P.J., A.W. PROCTER, A.J. BARTON, S.L. LOWE, A. NAJLERAHIM, P.H. 

BERTOLUCCI, D.M. BOWEN, R.C. PEARSON (1991) 

Terminal coma affects messenger RNA detection in post-mortem human temporal 

cortex. 

Res. Mol. Brain. Res. 9, 161 – 164 

138

Literatur 

HARRISON, P.J., P.R. HEATH, S.L. EASTWOOD, P.W. BURNET, B. MCDONALD, R.C. 

PEARSON (1995) 

The relative importance of premortem acidosis and postmortem interval for human brain 

gene expression studies: selective mRNA vulnerability and comparison with their 

encoded proteins. 

Neurosci. Lett. 200, 151 – 154 

HARRISON, P.J., P.W. BURNET, P. FALKAI, B. BOGERTS, S.L. EASTWOOD (1997) 

Gene expression and neuronal activity in schizophrenia: a study of polyadenylated 

mRNA in the hippocampal formation and cerebral cortex. 

Schizophr. Res. 26, 93 – 102 

HARTSOUGH, W.J., D. BURGER (1965) 

Encephalopathy of mink. I. Epizootologic and clinical observations. 

J. Inf. Dis. 115, 387 – 392 

HELPS, C.R. P. HINDELL, T.J. HILLMAN, A.V. FISCHER, H. ANIL, A.C. KNIGHT, R.T. 

WHYITE, D.H. OŃEILL, T.G. KNOWLES, D.A. HARBOUR (2001) 

Contamination of beef carcasses by spinal cord tissue during splitting. 

Food Control 13 (6-7), 415 – 417 

HILDEBRANDT, G., E. LÜCKER, K. RAUSCHER (2001) BSE-Risiko der 

Lebensmittel Fleisch und Milch. 


HILL, A., R. BUTTERWORTH, S. JOINER, G. JACKSON, M. ROSSOR, D. THOMAS, A. 

FROSH, N. TOLLEY, J. BELL, M. SPENCER, A. KING, S. AL-SARRAJ, J. IRONSIDE, P. 

LENTOS, J. COLLINGE (1999) 

Investigation of variant Creutzfeldt-Jakob disease and other human prion diseases with 

tonsil biopsy samples. 

Lancet 353, 183 – 164 

HILL, A.F., K.C.L. SIDLE, S. JOINER, P. KEYES, T.C. MARTIN, M. DAWSON, . 

COLLINGE (1998) 

Molecular screening of sheep for bovine spongiform encephalopathy. 

Neurosci. Lett. 255, 159 – 162 

HILL, A.F., M. DESBRUSLAIS, S. JOINER, K.C.L. SIDLE, I. GOWLAND, J. COLLINGE, 

J. LAWRENCE, P. LENTOS (1997) 

The same prion strain causes vCJD and BSE. 

Nature 389, 448 – 450 

139

Literatur 

HORIUCHI, M. B. CAUGHEY (1999) 

Prion protein interconversion and the transmissible spongiform encephalopathies. 

Structure 7, 231 – 240 

HORLACHER, S., E. LÜCKER, E. EIGENBRODT, S. WENISCH (2002) 

ZNS-Emboli in der Rinderlunge. 

Berl. u. Münch. Tierärztl. Wschr. 115 (1-2), 1 – 5 

HORLACHER, S., P. SIMON, M. BÜLTE (2002a) 

Vergleich zweier ZNS-Nachweisverfahren in Lebensmitteln. 

Fleischwirtsch. 82 (1), 91 – 93 

HSIAO, K., H.F. BACKER, T.J. CROW, M. POULTER, F. OWEN, J.D. TERWILLIGER, 

D. WESTAWAY, J. OTT, S.B. PRUISENER (1989) 

Linkage of a prion protein missense variant to Gerstmann-Sträussler-Scheinker 

syndrom. 

Nature 338, 342 – 345 

HSIAO, K., S.R. DLOUHY, M.R. FARLOW, C. CASS, M. DA COSTA, P.M. 

CONNEALLY, M.E. HODES, B. GHETTI, S.B. PRUISENER (1992) 

Mutant prion proteins in Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease with neurofibrillary 

tangles. 

Nat. Genet. 1, 68 – 71 

IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) (2003) 

The evaluation of five rapid tests for the diagnosis of transmissible spongiform 

encephalopathy in bovines (2 ND study). 27.03.2003 

http://irmm.jrc.be 

IRONSIDE, J.W., M.W. HEAD, J.E. BELL, L. MCCARDLE, R.G. WILL (2000) 

Laboratory diagnosis of variant Creutzfeldt-Jakob disease. 

Histopathology 37, 1 – 9 

JACKSON, G., L. HOSSZU, A. POWER, A. HILL, J. KENNEY, H. SAIBIL, C. CRAVEN, 

J. WALTHO, A. CLARKE, J. COLLINGE (1999) 

Reversible conversion of monomeric human prion protein between native and 

fibrilogenic conformations. 

Science 283, 1935 – 1937 

140

Literatur 

JAKOB, A. (1921) 

Über eigenartige Erkrankungen des Zentralnervensystems mit bemerkenswerten 

anatomischen Befunden.(Spastische Pseudosklerose-Enzephalomyelopathie mit 

disseminierten Degenerationsherden). 

Z. ges. Neurlol. Psychiatr. 64, 147 – 228 

JEFFREY, M., S. MARTIN, L. GONZÀLEZ, S.J. RYDER, S.J. BELLWORTHY, R. 

JACKMAN (2001a) 

Differential diagnosis of infections with the Bovine Spongiform Encephalopathie (BSE) 

and scrapie agents in sheep. 

J. Comp. Path. 125, 271 – 284 

JEFFREY, M., S. RYDER, S. MARTIN, S.A.C. HAWKINS, L. TERRY, C. BERTHELIN- 

BAKER, S.J. BELLWORTHY (2001) 

Oral inoculation of sheep with the agent of bovine spongiform encephalopathy (BSE). 1. 

Onset and distribution of disease-specific PrP accumulation in brain and viscera. 

J. Comp. Pathol. 124, 280 – 289 

JOHNSON, S.A., D.G. MORGAN, C.E. FINCH (1986) 

Extensive postmortem stability of RNA from rat and human brain. 

J. Neurosci. Res. 16, 267 – 280 

JOHNSTON, N.L., A.D. SHORE, E.F. TORREY, R.H. YOLKEN, J. CERVENAK (1997) 

Multivariate analysis of RNA levels from postmortem human brains as measured by 

three different methods of RT.PCR. 

J. Neurosci. Method. 77(1) 83 – 92 

KEENE, J.D. (2001) 

Ribonucleoprotein infrastructure regulating the flow of genetic information between the 

genome and the proteome. 

PNAS 98 (13), 7018 – 7024 

KELES, G.E., M.S. BERGER, R. LIM, A. ZAHEER, A.L. DENTON, J.R. SILBER (1992) 

Expression of glial fibrillary acidic protein in human medullablastoma cells treated with 

recombinant glia maturation factor-β. 

Oncol. Res. 4, 431 – 437 

141

Literatur 

KELLY, L.C., S. HAFFNER, P.C. MCCASKEY, M.T. SUTTON, K.A. LANGHEINRICH 

(2000) 

An evaluation of methods for the detection of spinal cord in product derived from 

advanced meat recovery systems. 

J. Food. Protect. 63, 1107 – 1112 

KIMBERLIN, R.H., C.A. WALKER (1978) 

Pathogenesis of mouse scrapie: effect of route of inoculation on infectivity titres and 

dose-response curves. 

J. Comp. Pathol. 88, 39 – 47 

KINDLER, S., M. MONSHAUSEN (2002) 

Candidate RNA-binding proteins regulating extrasomatic mRNA targeting and 

translation in mammalian neurons. 

Mol. Neurobiol. 25 (2), 149 – 165 

KINGSBURY, A.E., O.J. FOSTER, A.P. NISBET, N. CAIRNS, L. BRAY, D.J. EVE, A.J. 

LEES, C.D. MARSDEN (1995) 

Tissue pH as an indicator of mRNA preservation in human post-mortem brain. 

Brain. Res. Mol. Brain Res. 28, 311 – 318 

KOCH. FUCHS, GEMMER (1992) 

Die Fabrikation feiner Fleisch- und Wurstwaren. 

Deutscher Fachverlag, 20. Auflage 1992 

KOCHER, T.D., W.K. THOMAS, A. MEYER, S.V. EDWARDS, S. PÄÄBO, F.X. 

VILLABIANCA, A.C. WILSON (1989) 

Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing 

with conserved primers. 

Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6196 – 6200 

KOK, T., S. WATI, B. BAYLY, D. DEVONSHIRE-GILL, G. HIGGINS (2000) 

Comparison of six nucleic acid extraction methods for detection of viral DNA or RNA 

sequences in four different non-serum specimen types. 

J. Clin. Virol. 16, 59 – 63 

KORNER, C.G., M. WORMINGTON, M. MUCKENTHALER, S. SCHNEIDER, E. 

DEHLIN, E. WAHLE (1998) 

The deadenylating nuclease (DAN) is involved in poly(A) tail removal during the 

meiotic maturation of Xenopus oocytes. 

EMBO J. 17, 5427 – 5437 

142

Literatur 

KRETZSCHMAR, H., A. GIESE, W. SCHULZ-SCHAEFFER, O. WINDL, M. 

GROSCHUP, D. RIESNER (1996) 

Besteht ein Zusammenhang zwischen BSE und Creutzfeldt-Jakob Krankheit? 

Deutsches Ärzteblatt 93 (15), B-758 – 759 

LANGE, B., A. FROEB, M. OVERHOFF, T. ALTER, E. LÜCKER (2002) 

Molekularbiologische Untersuchungen zur Gewebe- und tierartspezifischen Erfassung 

von spezifizierten Risikomaterialien (SRM) in Fleischerzeugnissen. 

Proceedings DVG Lebensmittelhygiene, Garmisch-Patenkirchen, 2002 

LAPING, N.J., B. TETER, N.R. NICHOLS, I. ROZOVSKY, C.E. FINCH (1994) 

Glial fibrillary acidic protein: regulation by hormones, cytokines, and growth factors. 


LAPING, N.J., T.E. MORGAN, N.R. NICHOLS, I.ROZOVSKY, C.S. YOUNG-CHAN, C. 

ZAROW, C.E. FINCH (1994a) 

Transforming growth factor-β1 induces neuronal and astrocyte genes: Tubulin α1, glial 

fibrillary acidic protein and clusterin. 

Neuroscience 58, 563 – 572 

LASMÉZAS, C.I., J.-G. FOURNIER, V. NOUVEL, H. BOE, D. MARCE, F. LAMOURY, 

N. KOPP, J.-J. HAUW, J. IRONSIDE, M. BRUCE, D. DORMONT, J.-P. DESLYS (2001) 

Adaption of the bovine spongiform encephalopathy agent to primates and comparison 

with Creutzfeldt-Jakob disease: implications for human health. 

PNAS 98 (7), 4142 – 4147 

LASMÉZAS, C.I., J.-P. DESLYS, O. ROBAIN, R. DEMAIMAY, K.T. ADJOU, F. 

LAMOURY, J. IRONSIDE, J.-J. HAUW, D. DORMONT (1996) 

BSE transmission to macaques. 

Nature 381, 743 – 744 

LEGGETT, M.M., J. DUKES, H.M. PIRIE (1990) 

A spongiforme encephalopathy in a cat. 

Vet. Rec. 127, 586 – 588 

LEONARD, S., J. LOGEL, D. LUTHMAN, M. CASANOVA, D. KIRCH, R. FREEDMAN 

(1993) 

Biological stability of mRNA isolated from human postmortem brain collections. 

Biol. Psychatry 33, 456 – 466 

143

Literatur 

LOCKHART, D.J., E.A. WINZELER (2000) 

Genomics, gene expression and DNA arrays. 

Nature 405, 827 – 836 

LOVE, S., C.R. HELPS, S. WILLIAMS, A. SHAND, J.L. MCKINSTRY, S.N. BROWN, 

D.A. HARBOUR, M.H. ANIL (2000) 

Methods for detection of haematogenous dissemination of brain tissue after stunning of 

cattle with captive bolt guns. 

J. Neurosci. Meth. 99, 53 – 58 

LÜCKER, E. E. EIGENBRODT, S. WENISCH, R. LEISER, M. BÜLTE (2000) 

Identification of central nervous tissue in retail meat products. 

J. Food Protect. 63, 258 – 263 

LÜCKER, E., B. SCHLOTTERMÜLLER (2001a) 

Verfahren zum Nachweis von im Hinblick auf die bovine spongiforme Enzephalopathie 

(BSE) unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen. 5. Erfassung von zentralem 

Nervengewebe in erhitzten Fleischerzeugnissen. 

Fleischwirtschaft 81 (11), 102 – 107 

LÜCKER, E., B. SCHLOTTERMÜLLER, A. MARTIN (2002) 

Studies on contamination of beef with tissues of the central nervous system (CNS) as 

pertaining to slaughtering technology and human BSE-exposure risk. 


LÜCKER, E., E. EIGENBRODT, M. BÜLTE (1998) 


(BSE) unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen. 2. Referenzverfahren für den 

Nachweis von zentralem Nervengewebe. 

Fleischwirtsch. 78, 896 – 898 

LÜCKER, E., E. EIGENBRODT, S. WENISCH, K. FAILING, R. LEISER, M. BÜLTE 

(1999) 

Development of an integrated procedure for the detection of nervous tissue in meat 

products using cholesterol and neuron-specific enolase as markers. 

J Food Protect. 62 (3), 268 – 276 

LÜCKER, E., H. AUPERLE, M. OVERHOFF, H.A. SCHOON (2002a) 

Zum Nachweis von zentralem und peripherem Nervensgewebe in 

Fleischereierzeugnissen mit der Immunhistologie. 


144

Literatur 

LÜCKER, E., M. BÜLTE (1997) 


(BSE) unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen. 1. Enzymatische 

Cholesterinbestimmung als Schnellverfahren zur Erfassung von Hirngewebe. 

Fleischwirtsch. 77, 836 – 840 

LÜCKER, E., S. HORLACHER, E. EIGENBRODT (2001) 

Brain in human nutition and variant Creutzfeldt-Jakob disease risk (vCJD): Detection of 

brain in retail liver sausages using cholesterol and neuron specific enolase (NSE) as 

markers. 

Brit. J. Nutrition 86, 115 – 119 

LÜCKER, E., S. HORLACHER, E. EIGENBRODT, M. BÜLTE (2000a) 

Verfahren zum Nachweis von im Hinblick auf BSE unerwünschten Zutaten in 

Fleischerzeugnissen. 


LÜCKER, E., W. BIEDERMANN, S. LACHHAB, A. HENSEL (2002b) 


(BSE) unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen. 7. Nachweis von Hirngewebe mit 

der Gaschromatographie-Massenspektrometrie. 


LUGARESI, E., R. MEDORI, P. MONTAGNA, P. BARUZZI, P. CORTELLI, A. 

LUGARESI, P. TINUPER, M. ZUCCONI, P. GAMBETTI (1986) 

Fatal familiar insomnia and dysautomia, with selective degeneration of thalamic nuclei. 

N. Engl. J. Med. 315, 997 – 1003 

LUKIW, W.J., L. WONG, D.R. MCLACHLAN (1990) 

Cytoskeletal messenger RNA stability in human neocortex; studies in normal aging and 

in Alzheimer´s disease. 

Int. J. Neurosci. 55 (2-4), 81 – 88 

LUMLEY, I.D. (1996) 

Authenticity of meat and meat products. 

In: Food authentication. Eds. Ashurst, P.R. & M.J. Dennis Blackie Academic and 

Professional, London, S. 108 – 139 

MACDONALD, R.J., G.H. SWIFT, A.E. PRZYBYLA, J.M. CHIRGWIN (1987) 

Isolation of RNA using guanidinium salts. 

Methods Enzymol. 152, 219 – 227 

145

Literatur 

MAIGNIEN, T., C. ZAS LASMÉ, V. BERINGUE, D. DORMONT, J.-P. DESLYS (1999) 

Pathogenesis of the oral route of infection of mice with scrapie and bovine spongiform 

encephalopathy agents. 

J. Gen. Virol. 80, 3035 – 3042 

MALTER, J.S. (2001) 

Regulation of mRNA stability in the nervous system and beyond. 

J. Neurosci. Res. 66 (3), 311 – 316 

MARCHUK, L., P. SCIORE, C. RENO, C.B. FRANK, D.A. HART (1998) 

Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon and cartilage. 

Biochim. Biophys. Acta 1379, 171 – 177 

MCGOWAN, J.P: (1922) 

Scrapie in sheep. 

Scott. J. Agri. 5, 365 – 375 

MCLEAN, C.A., J.W. IRONSIDE, M.P. ALPERS, P.W. BROWN, L. CERVENAKOVA, 

R.M. ANDERSON, C.L. MASTERS (1998) 

Comparative neuropathology of Kuru with the new variant of Creutzfeldt-Jakob disease: 

evidence for strain of agent predominating over genotype of host. 


MERZ, P., R. ROHWER, R. KASCSAK, H. WISNIEWSKI, R. SOMERVILLE, C. GIBBS, 

D. GAJDUSEK (1984) 

Infection-specific particle from the unconventional slow virus diseases. 

Science 225, 437 – 439 

MERZ, P.A., R.A. SOMERVILLE, H.M. WISNIEWSKI, K. IQBAL (1981) 

Abnormal fibrils from scrapie-infected brain. 


MEYER, R., C. HÖFELEIN, J. LÜTHY, U. CANDRIAN (1995) 

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis: a simple 

method for species identification in food. 

J. AOAC Int. 78, 1542 – 1551 

MEYER, R., U. CANDRIAN (1996) 

PCR-based DNA analysis for the identification and characterization of food 

components. 

Lebensm.-Wiss.-Technol. 29, 1 – 9 

146

Literatur 

MILLER, M. (1991) 

Consumer participation in setting international food standards. 

Brit. Food J. 93 (4), 29 – 35 

MOYNAGH, J., H. SCHIMMEL, G. KRAMER (1999) 

The evaluation of tests for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy in 

bovines. 08.07.1999. 

http://europa.eu.int/comm/dg24/health/bse/bse12_en.pdf 

MULLIS, K.B., F.A. FALOONA, S. SCHARF, R.K. SAIKI, G.T. HORN, H.A. EHRLICH 

(1986) 

Specific enzymatic amplification of DNA: the polymerase chain reaction. 

Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 (1), 263 – 273 

NAGEL, E., T. MIERSCH (2002) 

Nachweis von ZNS-Material in hocherhitzten Lebensmitteln 


NIEDERER, M., R. BOLLHALDER (2001) 

Identification of species specific central nervous tissue by Gas Chromatpgraphy-Mass- 

Spectrometry (GC-MS) – a possible method for supervision of meat products and 

cosmetics. 

Mitt. Lebensm. Hyg. 92, 133 – 144 

NIELSEN, A.L., I.E. HOLM, M. JOHANSEN, B. BONVEN, P. JORGENSEN, A.L. 

JORGENSEN (2002) 

A new splice variant of glial fibrillary acidic protein, GFAP ε , interacts with the 

presenilin proteins. 

J. Biol. Chem. 277 (33), 29983 – 29991 

NIEMANN, H. (2000) 

Reverse Transkriptase. 

In: Wiesner, E. u. R. RIBBECK (Ed.): Wörterbuch der Veterinärmedizin. ENKE im 

Hippokrates Verlag, Stuttgart (2000), S. 1240 

NISBET, T. (1989) 

Creutzfeldt-Jakob disease in a second patient who received a cadaveric dura mater graft. 

J. Am. Med. Ass. 261 (8), 1118 

NORENBERG, M.D. (1994) 

Astrocyte responses to CNS injury. 

J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 231 – 220 

147

Literatur 

OESCH, B., D. WESTAWAY, M. WÄLCHLI, M.P. MCKINLEY, S.B.H. KENNT, R. 

AEBERSOLD, R.A. BARRY, P. TEMPST, D.B. TEPLOW, L.E. HOOD, S.B. PRUSINER, 

C. WEISSMANN (1985) 

A cellular gene encodes scrapie PrP 27 – 30 protein. 

Cell 40, 735 – 746 

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (1996) 

Bovine spongiform encephalopathy: an update. 

Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 15 (3), 1087 – 1118 

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2000) 

Bovine spongiform encephalopathy. 

In: Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, Fourth Edition, OIE, Paris 

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2003a) 

Number of reported cases of bovine spongiform encephalopathy (BSE) reported in the 

United Kingdom. 

http://www.oie.int/eng/info/en_esbru.htm 

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2003b) 

Number of reported cases of bovine spongiform encephalopathy (BSE) worldwide 

(excluding the United Kingdom). 

http://www.oie.int/eng/info/en_esbmonde.htm 

OVERHOFF, M., B. SCHLOTTERMÜLLER, E. LÜCKER (2002) 

Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis spezifizierter Risikomaterialien in 

Fleischerzeugnissen. 


PALMER, M.S., A.J. DRYDEN, J.T. HUGHES, J. COLLINGE (1991) 

Homozygous prion protein genotype predisposes to sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. 

Nature 352, 340 – 342 

PARCHI, P., R. CASTELLANI, S. CAPELLARI, B. GHETTI, K. YOUNG, S.G. CHEN, M. 

FARLOW, D.W. DICKSON, A.A. SIMA, J.Q. TROJANOWSKI, R.B. PETERSEN, P. 

GAMBETTI (1996) 

Molecular basis of phenotypic variability in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. 

Ann. Neurol. 39, 767 – 778 

148

Literatur 

PEKNY, M., C.B. JOHANNSSON, C. ELIASSON, J. STAKEBERG, A. WALLEN, T. 

PERLMANN, U. LENDAHL, C. BERTSHOLTZ, C.H. BERTHOLD, J. FRISEN (1999) 

Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillary acidic 

and vimentin. 

J. Cell Biol. 145, 503 – 514 

PEKNY, M., P. LEVEEN, M. PEKNA, C. ELIASSON, C.H. BERTHOLD, B. 

WESTERMARK, C. BERTSHOLTZ (1995) 

Mice lacking glial fibrillary acidic protein display astrocytes devoid of intermediate 

filaments but develop and reproduce normally. 

EMBO J. 14, 1590 – 1598 

PESOLE, G., F. MIGONE, C. GISSI, G. GRILLO, F. LICCIULLI, S. LIUNI (2001) 

Structural and functional features of eukaryotic mRNA untranslated regions. 

Gene 276 (1-2), 73 – 81 

PESOLE, G., G. GRILLO, A. LARIZZA, S. LIUNI (2000) 

The untranslated regions of eukaryotic mRNAs: structure, function and bioinformatic 

tools for their analysis. 

Brief. Bioinform. 1, 236 – 249 

PESOLE, G., S. LIUNI, G. GRILLO, C. SACCONE (1997) 

Structural and compositional features of untranslated regions of eukaryotic mRNAs. 

Gene 205, 95 – 102 

PRUSINER, S.B. (1982) 

Novel proteinacous infectious particles cause scrapie. 

Science 216, 136 – 144 


On the molecular structure of the scrapie agent. 

In: Virus non conventionnels et affections du systéme nerveux central. ed.: Court, L.A.. 

Masson, Paris 


Chemistry and biology of prions. 

Biochemistry 31, 12277 – 12288 


Transgenetic investigations of prion diseases of humans and animals. 

Philos. Trans. R. Soc. London 339, 239 – 254 

149

Literatur 

PRUSINER, S.B. (1993a) 

Genetic and infectious prion diseases. 

Arch. Neurol. 50, 1129 – 1153 


Prionen Erkrankungen. 

Spektrum der Wissenschaft, März, 44 – 54 


The Prion diseases. 


PRUSINER, S.B., D.F. GROTH, S.P. COCHRAN, F.R. MASIARZ, M.P. MCKINLEY, 

H.M. MARTINEZ (1980) 

Molecular properties, partial purifications, and assay by incubation period 

measurements of the hamster scrapie agent. 

Biochemistry 19, 4883 – 4891 

PRUSINER, S.B., M. SCOTT, D. FOSTER, K.M. PAN, D. GROTH, C. MIRENDA, M. 

TORCHIA, S.L. YANG, D. SERBAN, .G.A. CARLSON, P.C. HOPPE, D. WESTAWAY, 

S.J. DEARMOND (1990) 

Transgenetic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie 

prion replication. 

Cell 63, 673 – 686 

PRUSINER, S.B., M.P. MCKINLEY, D.F. GROTH, K.A. BOWMAN, N.I. MOCK, S.P. 

COCHRAN, F.R. MASIARZ (1981) 

Scrapie agent contains a hydrophobic protein. 


QUINTEIRO, J., R. VIDAL, M. IZQUIERDO, C.G. SOTELO, M.J. CHAPELA, R.I. 

PÉREZ-MARTIN, H. REHBEIN, G.L. HOLD, V.J. RUSSELL, S.E. PRYDE, C. ROSA, 

A.T. SANTOS, M. REY-MÉNDEZ (2001) 

Identification of Hake species (Merluccius Genus) using sequencing and PCR-RFLP 

analysis of mitochondrial DNA control region sequences. 


150

Literatur 

RACE, R.E., A. RAINES, T.G.M. BARON, M.W. MILLER, A. JENNY, E.S. WILLIAMS 

(2002) 

Comparison of Abnormal Prion Protein Glycoform Patterns from Transmissible 

Spongiform Encephalopathy Agent-Infected Deer, Elk, Sheep, and Cattle. 

J. Virol. 76, 12365 – 12368 

RAIDEN, R.M., S.S. SUMNER, M.D. PIERSON (2001) 

Bovine Spongiform Encephalopathy: A Brief Summary. 

Dairy, Food and Environmental Sanitation 21, 685 – 690 

RAM, J.L., M.L. RAM, F.F. BAIDOUN (1996) 

Authentication of canned tuna and bonito by sequence and restriction site analysis of 

polymerase chain reaction products of mitochondrial DNA. 


RAYMOND, G.J., A. BOSSERS, L.D. RAYMOND, K.I. O´ROURKE, L.E. MCHOLLAND, 

P.K. BRYANT III, M.W. MILLER, E.S. WILLIAMS, M. SMITS, B. CAUGHEY (2000) 

Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to 

chronic wasting disease. 

EMBO J. 19, 4425 – 4430 

RAYMOND, G.J., J. HOPE, D.A. KOCISKO, S.A. PRIOLA, L.D. RAYMOND, A. 

BOSSERS, J. IRONSIDE, R.G. WILL, S.G. CHEN, R.B. PETERSEN, P. GAMBETTI, R. 

RUBENSTEIN, M.A. SMITS, P.T. LANSBURY, B. CAUGHEY (1997) 

Molecular assessment of the potential transmissibilities of BSE and scrapie to humans. 

Nature 388, 285 – 288 

REEVES, S.A., L.J. HELMAN, A. ALLISON, M.A. ISRAEL (1989) 

Molecular cloning structure of human glial fibrillary acidic protein. 


RIEK, R., G. WIDER, M. BILLETER, S. HORNEMANN, R. GLOCKSHUBER, K. 

WÜTHICH (1998) 

Prion protein NMR structure and familial human spongiform encephalopathies. 


RIEK, R., S. HORNEMANN, G. WIDER, M. BILLETER, R. GLOCKSHUBER, K. 

WÜTHICH (1996) 

NMR structure of the mouse prion protein domain PrP (121 – 231) 

Nature 382, 180 – 182 

151

Literatur 

RIEK, R., S. HORNEMANN, G. WIDER, R. GLOCKSHUBER, K. WÜTHICH (1997) 

NMR characterisation of the full-length recombinant murine prion protein mPrP (23 – 

231) 

FEBS Lett. 413, 282 – 288 

ROSS, J. (1995) 

mRNA stability in mammalian cells. 

Microbiol. Rev. 59, 423 – 450 

RUNQUIST, M., I. PARMYRD, A. THELIN, T. CHOJNACKI, T. DALLNER (1995) 

Distribution of branch point phenyltransferases in regions of bovine brain. 

J. Neurochem. 65, 2299 – 2306 

SACHS, A.B. (1993) 

Messenger RNA degradation in eukaryotes. 

Cell 74, 413 – 421 

SAIKI, R.K., D.H. GELFAND, S. STOFFEL, S.J. SCHARF, R. HIGUCHI, G.T. HORN, 

K.B. MULLIS, H.A. ERLICH (1988) 

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. 

Science 239 (4839), 487 – 491 

SAIR, A.I., D.H. D´SOUZA, C.L. MOE, L.A. JAYKUS (2002) 

Improved detection of human enteric viruses in foods by RT-PCR. 

J. Virol. Methods 100 (1-2), 57 – 69 

SANGER, F., S. NICKLEN, A.R. COULSON (1977) 

DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. 


SCHALLER, O., R. FATZER, M. STACK, J. CLARK, W. COOLEY, K. BIFFIGER, S. 

EGLI, M. DOHERR, M. VANDEVELDE, D. HEIM, B. OESCH, M. MOSER (1999) 

Validation of a Western immunoblotting procedure for bovine PrP SC detection and its 

use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform 

encephalopathy (BSE). 


SCHICKER, E. (1998) 

Spongiforme Enzephalopathien bei Mensch und Tier. 

In: BSE und andere spongiforme Enzephalopathien. ed. Braun, U., Parey Buchverlag 

152

Literatur 

SCHICKER, E. (2001) 

Klinik der BSE. 

In: Prionen und Prionenkrankheiten. Hrsg: Hörnlimann, B., D. Riesner, H. Kretzschmar, 

Walter de Guyter, Berlin, New York, 277 – 283 

SCHLOTTERMÜLLER, B., E. LÜCKER, M. HARDT, M:H: GROSCHUP (2002) 

Direkter Nachweis von PrP SC in Fleischerzeugnissen und Vergleich mit ZNS- 

Nachweisverfahren. 


SCHMIDT, G.R., K.L. HOSSNER, R.S. YEMM, D.H. GOULD (1999) 

Potential for disruption of central nervous system tissue in beef cattle by different types 

of captive bolt stunners. 

J. Food Protect. 62, 390 – 393 

SCHMIDT, G.R., K.L. HOSSNER, R.S. YEMM, D.H. GOULD, J.P. OĆALLAGHAN 

(1999a) 

An enzyme-linked immunosorbent assay for glial fibrillary acidic protein as an indicator 

of the presence of brain or spinal cord in meat. 

J. Food. Protect. 62 (4), 394 – 397 

SCHMIDT, G.R., R.S. YEMM, K.D. CHILDS, J.P. OĆALLAGHAN, K.L. HOSSNER 

(2001) 

The detection of central nervous system tissue on beef carcasses and in comminuted 

beef. 

J. Food Protect. 64, 2047 – 2052 

SCHRAMM, M., P. FALKAI, R. TEPEST, T. SCHNEIDER-AXMANN, R. PRZKORA, A. 

WAHA, T. PIETSCH, W. BONTE, T.A. BAYER (1999) 

Stability of RNA transcripts in post-mortem psychatric brains. 

J. Neural. Transm. 106, 329 – 335 

SCHREUDER, B., R. GEERTSMA, L. v. KEULEN, A. v. ASTEN, P. ENTHOVEN, R. 

OBERTHÜR, A. de KOEIJER, A. OSTERHAUS (1998) 

Studies on the efficacy of hyperbaric rendering procedures in inactivating bovine 

spongiform encephalopthy (BSE) and scrapie agents. 

Vet. Rec. 142, 474 – 480 

SCHÜTT-ABRAHAM, I. (2002) 

BSE-Präventivmaßnahmen bei der Schlachtung von Rindern. 


153

Literatur 

SCOTT, A.C., G.A. WELLS, H.J. CHAPLIN, M. DAWSON (1991) 

Bovine spongiform encephalopathy: detection of fibrils in the central nervous system is 

not affected by autolysis. 

Res. Vet. Sci. 52, 332 – 336 

SCOTT, A.C., G.A. WELLS, M.J. STACK, H. WHITE, M. DAWSON (1990) 

Bovine spongiform encephalopthy: detection and quantitation of fibrils, fibril protein 

(PrP) and vacuolation in brain. 

Vet. Microbiol. 23, 295 – 304 

SCOTT, M.R., D. FOSTER, C. MIRENDA, D. SERBAN, F. COUFAL, M. WÄLCHLI, M. 

TORCHIA, D. GROTH, G. CARLSON, S.J. DEARMOND (1989) 

Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie 

infectivity and amyloid plaques. 

Cell 59, 847 – 857 

SCOTT, M.R., R. WILL, J. IRONSIDE, H.O. NGUYEN, P. TREMBLAY, S.J. 

DEARMOND (1999) 

Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform 

encephalopathy prions to humans. 


SEBASTIO, P., P. ZANELLI, T.M. NERI (2001) 

Identification of Anchovy (Engraulis encrasicholus L.) and Gilt Sardine (Sardinella 

aurita) by polymerase chain reaction, sequence of their mitochondrial cytochrome b 

gene, and restriction analysis of polymerase chain reaction products in semipreserves. 


SELMAJ K., B. SHAFIT-ZAGARDO, D.A. AQUINO, M. FAROOQ, C.S. RAINE, W.T. 

NORTON, C.F, BROSNAN (1991) 

Tumor necrosis factor-induced proliferation of astrocytes from mature brain is 

associated with down-regulation of glial fibrillary acidic protein mRNA. 

J. Neurochem 57, 823 – 830 

SEYBOLD, C., A. JOHN, T. MÜFFLING, B. NOVAK, S. WENZEL (2003) 

A reverse Transcription-Polymerase chain reaction assay for species specific detection 

of bovine central nervous system tissue in meat and meat products. 

J. Food Protect. 66 (4), 644 – 651 

154

Literatur 

SHAW, G., R. KAMEN (1986) 

A conserved AU-sequence from the 3úntranslated region of GM-CSF mRNA mediates 

selective mRNA degradation. 

Cell 46, 659 – 667 

SHIEH, Y.C., K.R. CALCI, R.S. BARIC (1999) 

A method to detect low levels of enteric viruses in contaminated oysters. 

Appl. Environ. Microbiol. 65, 4709 – 4714 

SIMON, D. (1996) 

Zusammenhänge zwischen menschlichen und tierischen übertragbaren spongiformen 

Enzephalopathien. 

Infektionsepidemiologische Forschung InfFO I/97, 1 – 6 

SMITH, G.C. (2002) 

Bovine spongioform encephalopathy and new variant Creutzfeldt-Jakob disease. 

Presentation AC 02, American Society for Microbiology, Audioconference Series 2002 

on February 6, 2002, 1 – 26 

SOBEL, R.A., S.J. DEARMOND, L.S. FORNO, L.F. ENG (1981) 

Glial fibrillary acidic protein in hepatic encephalopathy: an immunohistochemical study. 


SOTELO, C., C. PINEIRO, J.M. GALLARDO, R.I. PÉREZ-MARTIN (1993) 

Fish species identification in seafood products. 

Trends Food Sci. Technol. 4, 395 – 401 

SPIRIN, A.S. (1994) 

Storage of messenger RNA in eukaryotes: envelopment with protein, translational 

barrier at 5´side, or conformational masking by 3´side. 

Mol. Reprod. Dev. 38, 107 – 117 

SSC (1999) 

Opinion of the Scientific Steering Committee on the human exposure risk (HER) via 

food with respect to BSE – adopted on 10.12.1999. 

http.//europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/outcome_en.hmtl 

SSC (2001) 

Prelimnary scientific opinion and report on stunning methods and BSE risks – the risk 

of dissemination of brain particles into the blood and carcass when applying certain 

stunning methods: 06.09.2001. 


155

Literatur 

SSC (2002) 

Scientific opinion and report on stunning methods and BSE risks – the risk of 

dissemination of brain particles into the blood and carcass when applying certain 

stunning methods: 10. – 11.01.2002 


SSC (2003) 

The field trial evaluation of two new rapid BSE post mortem tests. Results achieved 

using the LIA Test (Prionics) and the aCDI Test (InPro) in the field trial. 06.03.2003 


STAUFENBIEL, R., M. HÄMÄLÄINEN (2002) 

Zur klinischen Diagnostik der BSE. 


STOLLE, C.A., E.J. BENZ (1988) 

Cellular factor affecting the stability of β-Globin mRNA. 

Gene 62, 65 – 74 

STOLTENBURG-DIDINGER, G. (2002) 

Durch Prione verursachte Krankheiten. 


TAYLOR, D., H. FRASER, I. MCCONNELL, D. BROWN, K. BROWN, K. LAMZA, G. 

SMITH (1994) 

Decontamination studies with the agents of bovine spongiform encephalopathy and 

scrapie. 

Arch. Virol. 139 (3-4), 313 - 326 

TAYLOR, D., S. WOODGATE, M. ATKINSON (1995) 

Inactivation of the bovine spongiform encephalopathy agent by rendering procedures. 

Vet. Rec. 137, 605 – 610 

TAYLOR, G.R., G.I. CARTER, T.J.CROW, J.A. JOHNSON, A.F. FAIRBAIRN, E.K. 

PERRY, R.H. PERRY (1986) 

Recovery and measurement of specific RNA species from postmortem brain tissue: a 

general reduction in Alzheimer´s disease detected by molecular hybridisation. 

Exp. Mol. Pathol. 44, 111 – 116 

156

Literatur 

TENENBAUM, S.A., C.C. CARSON, P.J. LAGER J.D. KEENE (2000) 

Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA 

arrays. 


TERSTEEG, M.H.G., P.A. KOOLMEES, F. van KNAPEN (2002) 

Immunhistochemical detection of brain tissue in heated meat products. 

Meat Science 61, 67 – 72 

TROEGER, K. (2001) 

Neue Techniken sind verfügbar. 

Fleischwirtschaft 81 (1), 27 – 28 

TROTTER, S.A., L.B. BRILL II, J. P. JR. BENNETT (2002) 

Stability of gene expression in postmortem brain revealed by cDNA gene array analysis. 

Brain Res. 942, 120 – 123 

USDA-APHIS (1999) 

Fact Sheet: Veterinary Services: Bovine Spongiform Encephalopathy. 

www.aphis.usda.gov/oa/pubs/fsbe.html 

VAN KEULEN L., B. SCHREUDER, R. MELOEN, M. POELEN-VAN DEN BERG, G. 

MOOIJ-HARKES, M. VROMANS, J. LANGEVELD (1995) 

Immunohistochemical detection and localisation of prion protein in brain tissue of sheep 

with natural scrapie. 

Vet. Pathol. 32, 299 – 308 

VANDEVELDE, M., A. ZURBRIGGEN, R. FATZER (1992) 

Die spongiformen Enzephalopathien mit besonderer Brücksichtigung der bovinen 

spongiformen Enzephalopathie. 

Schweiz. Med. Wschr. 122 (22), 887 – 892 

VONSATTEL, J.P., H. AIZAWA, P. GE, M. DIFIGLIA, A.C. MCKEE, M. MACDONALD, 

J.F. GUSELLA, G.B. LANDWEHRMEYER, E.D. BIRD, E.P. RICHARDSON (1995) 

An improved approach to prepare human brains for research. 


WALKER, E., A.M. MCNICOL (1992) 

Insitu hybridisation demonstrates the stability of messenger-RNA in postmortem rattissues. 

J. Pathol. 168 (1), 67 – 73 

157

Literatur 

WELLS, G.A., A.C. SCOTT, C.T. JOHNSON, R.F. GUNNING, R.D. HANCOCK, M. 

JEFFREY, M. DAWSON, R. BRADLEY (1987) 

A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. 

Vet. Rec. 121, 419 – 420 

WELLS, G.A., M. DAWSON, S.A.C. HAWKINS, R.B. GREEN, I. DEXTER, M.E. 

FRANCIS, M.M. SIMMONS, A.R. AUSTIN, M.W. HORRIGAN (1994) 

Infectivity in the ileum of cattle challenged orally with bovine spongiform 

encephalopathy. 

Vet. Rec. 135, 40 – 41 

WELLS, G.A., R.D. HANCOCK, W.A. COOLEY, M.S. RICHARDS, R.J. HIGGINS, G.P. 

DAVID (1989) 

Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic significance of vacuolar changes in 

selected nuclei of the medulla oblongata. 

Vet. Rec. 125, 521 – 524 

WELLS, G.A., S.A. HAWKINS, R.B. GREEN, A.R. AUSTIN, I. DEXTER, Y.I. SPENCER 

(1998) 

Preliminary observations on the pathogenesis of experimental bovine spongiform 

encephalopathy (BSE): an update. 

Vet. Rec. 142, 103 – 106 

WELLS, G.A., S.A. HAWKINS, R.B. GREEN, A.R. AUSTIN, Y.I. SPENCER, I. DEXTER, 

M. DAWSON (1999) 

Limited detection of sternal bone marrow infectivity in the clinical phase of 

experimental bovine spongiform encephalopathy (BSE). 

Vet. Rec. 144, 292 – 294 

WELLS. G.A., A.R. SAYERS, J.W. WILESMITH (1995) 

Clinical and epidemiological correlates of the neurohistologically unconfirmed, 

clinically suspect bovine spongiform encephalopathy. 

Vet. Rec. 136, 211 – 216 

WELLS. G.A., J.W. WILESMITH (1995) 

The neuropathology and epidemiology of bovine spongiform encephalopathy. 

Brain Pathol. 5 (1), 91 – 103 

158

Literatur 

WENISCH, S., E. LÜCKER, E. EIGENBRODT, R. LEISER, M. BÜLTE (1999) 

Detection of central nervous tissue in meat products. An immunohistochemical 

approach. 

Nutrition Research 19 (8), 1165 – 1172 

WEYANDT, R.G. (2001) 

Detection of BSE-Risk materials. 

Fresenius J. Anal. Chem. 371, 574 – 575 

WILESMITH, J.W., J.B.M. RYAN (1992) 

Bovine spongiform encephalopathy: recent observations on the age specific incidences. 

Vet. Rec. 130, 491 – 492 

WILL, R., MATTHEWS, W. (1982) 

Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. 

J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr. 45, 235 – 238 

WILL, R.G., J. IRONSIDE, M. ZEIDLER, S.N. COUSENS, K. ESTIBEIRO, A. 

ALPEROVITCH, S. POSER, M. POCCHIARI, A. HOFMAN (1996) 

A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK. 

Lancet 347, 921 – 925 

WILL, R.G., J.W. IRONSIDE (1999) 

Oral infection by bovine spongiform encephalopathy prion. 


WILL, R.G., M. ZEIDLER (1996) 

Diagnosting Creutzfeldt-Jakob disease. 

BMJ 313, 833 – 834 

WILL, R.G., M. ZEIDLER, G.E. STEWART, M.A. MACLEOD, J.W. IRONSIDE, S.N. 

COUSENS, J. MACKENZIE, K. ESTIBEIRO, A.J. GREEN, R.S. KNIGHT (2000) 

Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease. 

Ann. Neurol. 47, 575 – 582 

WILLIAMS, E., S. YOUNG (1980) 

Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. 

J. Wildl. Dis. 16, 89 – 98 

WILLIAMS, E., S. YOUNG (1982) 

Spongiform encephalopathy of rocky mountain elk. 

J. Wildl. Dis. 18, 465 – 471 

159

Literatur 

WISNIEWSKI, H., S. SIGURDARSON, R. RUBENSTEIN, R. KASCAK, R. CARP (1996) 

Mites as vectors for scrapie. 

Lancet 347, 1114 

WOLF, C., J. RENTSCH, P. HÜBNER (1999) 

PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. 


YASOJIMA, K., E.G. MCGEER, P.L. MCGEER (2001) 

High stability of mRNAs postmortem and protocols for their assessment. 

Brain Res. Prot. 8, 212 – 218 

ZEIDLER, M., R.J. SELLAR, D.A. COLLIE, R.S. KNIGHT, G.E. STEWART, M.A. 

MACLEOD, J.W. IRONSIDE, S.N. COUSENS, A.F. COLCHESTER, D.M. HADLEY, R.G 

WILL (2000) 

The pulvinar sign on magnetic resonance imaging in variant Creutzfeldt-Jakob disease. 

Lancet 355, 1412 – 1418 

ZELENIKA, D., B. GRIMA, M. BERNNER, B. PESSAC (1995) 

A novel glial fibrillary acidic protein mRNA lacking exon 1. 

Brain Res. Mol. Brain Res. 30, 251 – 258 

ZERR, I., M. BODEMER, S. RÄCKER, S. GROSCHE, S. POSER, H. KETZSCHMAR, T. 

WEBER (1995) 

Cerebrospinal fluid concentration of neuron-specific enolase in diagnosis of Creutzfeldt- 

Jakob disease. 

Lancet 345, 1609 – 1610 

ZLOTNIK, I. (1958) 

The histopathology of the brain stem of sheep affected with natural scrapie. 

J. Comp. Pathol. 68, 148 – 166 

160

Tabellenverzeichnis 

9 Tabellenverzeichnis 

Tabelle 1: BSE – Schnelltests ............................................................................................14 

Tabelle 2: Potentielle BSE-Infektiosität verschiedener Gewebe .......................................16 

Tabelle 3: Modulatoren der GFAP-Expression .................................................................35 

Tabelle 4: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev .....................49 

Tabelle 5: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern GFAPforw 

und GFAPrev ....................................................................................................50 

Tabelle 6: Mastermix für PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 ....................51 

Tabelle 7: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern 

bGFAPw1 und bGFAPw2 ................................................................................51 

Tabelle 8: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2 .............. 52 

Tabelle 9: Restriktionsenzyme ..........................................................................................55 

Tabelle 10: Dotierung des Brätes mit bovinem Gehirngewebe ...........................................59 



Tabelle 13: Dotierung der Leberwurstmasse mit Rindergehirngewebe ..............................63 

Tabelle 14: Dotierung des Brätes mit bovinem peripheren Nervengewebe ........................64 

Tabelle 15: Dotierung des Brätes aus Schweinefleisch mit porcinem 

Gehirngewebe ...................................................................................................65 

Tabelle 16: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen Schweinegeweben..........................67 

Tabelle 17: Nachweis von GFAP-mRNA aus erhitzten Schweinegeweben 

(75°C, 20 min) ..................................................................................................68 


(80°C, 30 min) ..................................................................................................70 


(95°C, 30 min; 95°C, 60 min) ..........................................................................71 

Tabelle 20: Nachweis von GFAP-mRNA aus tiefgekühlten (-20°C, 24 h) 

und nachfolgend erhitzten Geweben (80°C, 30 min) .......................................72 

Tabelle 21: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativem und erhitztem peripheren 

porcinen Nervengewebe (PNS) ........................................................................73 

161


Tabelle 22: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten 

Schafgeweben (75°C, 20 min) ..........................................................................74 


Schafgeweben (80°C, 30 min) ..........................................................................75 


Schafgeweben (95°C, 30 min, 95°C, 60 min) ..................................................76 

Tabelle 25: Nachweis von GFAP-mRNA aus tiefgekühltem (-20°C, 24 h) 

und nachfolgend erhitztem Schafgewebe (80°C, 20 min) ................................77 

Tabelle 26: Nachweis von GFAP-mRNA aus nativem und erhitztem 

ovinem peripheren Nervengewebe (80°C, 60 min) ..........................................77 

Tabelle 27: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierter 

Brühwurst vom Rind (Brühtemperatur 75°C) über einen Zeitraum 

von 42 Tagen (T) ..............................................................................................79 

Tabelle 28: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierter 



Tabelle 29: 

Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierter 



Tabelle 30: 

Nachweis von GFAPmRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten 

Leberwürsten über einen Zeitraum von 35 Tagen (T) ......................................83 

Tabelle 31: 

Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten 

Brühwürsten (Vollkonserve I) über einen Zeitraum von 21 Tagen (T) ...........85 

Tabelle 32: 

Tabelle 33: 

Nachweis von GFAP-mRNA aus mit Rindergehirn (%) dotierten 

Brühwürsten (Vollkonserve II) über einen Zeitraum 


Nachweis von GFAPmRNA aus mit peripheren Nervengewebe 

dotierten Brühwursterzeugnissen .....................................................................88 

162


Tabelle 34: Nachweis von GFAP-mRNA aus mit porcinem Gehirngewebe (%) 

dotierten Brühwürsten (Brühtemperatur 80°C, 65 min) über einen 

Zeitraum von 35 Tagen (T) ..............................................................................90 

Tabelle 35: 

Darstellung der Bandenmuster der GFAPmRNA-Fragmente bei 

Aufspaltung mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen ...........................97 

Tabelle 36: Nachweis boviner GFAP-mRNA aus Fleischerzeugnissen – 

Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse in Hinblick auf Spezifität 

(falsch positive Ergebnisse) und Wiederfindung 

(falsch negative Ergebnisse) ...........................................................................111 

Tabelle 37: Nachweis boviner GFAP-mRNA aus Fleischerzeugnissen – 

Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse unter Berücksichtigung 

der ZNS-Konzentration ..................................................................................112 

163

Abbildungsverzeichnis 

10 Abbildungsverzeichnis 

Abbildung 1: Nachweis porciner GFAP-mRNA aus nativen und erhitzten (75°C, 20 min) 

Geweben durch RT-PCR ..................................................................................69 

Abbildung 2: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit Rindergehirn dotierten Brühwurst .....80 

Abbildung 3: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit Rindergehirn dotierten Vollkonserve .86 

Abbildung 4: GFAP-mRNA Nachweis aus einer Brühwurst dotiert mit bovinem 

PNS-Gewebe ....................................................................................................89 

Abbildung 5: GFAP-mRNA Nachweis aus einer mit porcinem Gehirngewebe dotierten 

Brühwurst .........................................................................................................91 

Abbildung 6: Nachweis der 399 bp großen GFAP-mRNA-Amplifikate ...............................92 

Abbildung 7: Vorgehensweise bei der Sequenzierung und Detektion der procinen 

GFAP-mRNA ...................................................................................................93 

Abbildung 8: Vergleichende Darstellung der 168 bp großen GFAP-mRNA-Sequenzen bei 

den verschiedenen Tierarten .............................................................................95 

Abbildung 9: RFLP des 168 bp großen Fragments der GFAP-mRNA ................................100 

164

Danksagung 

Für die Überlassung des interessanten Themas bedanke ich mich bei Herrn Professor Doktor 

Siegfried Wenzel. 

Herrn Privatdozent Doktor Bernhard Nowak danke ich für die freundliche Übernahme der 

Dissertationsbetreuung, sowie für die bereitwillige Unterstützung dieser Arbeit. 

Herrn Doktor Christian Seyboldt gilt mein besonderer Dank für die bereitwillige Einweisung 

in die molekularbiologische Untersuchungspraxis, sowie für die jederzeit gewährte 

freundliche Unterstützung und tatkräftige Hilfe bei der Versuchsplanung, Durchführung 

sowie Korrektur dieser Arbeit. 

Den Assistenten und den technischen Mitarbeitern der Zentrumsabteilung für 

Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover 

danke ich für die freundliche Aufnahme und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Insbesondere 

danke ich Herrn Fleischermeister Adolf Heise für die Hilfe und Unterstützung bei der 

Herstellung der Fleischerzeugnisse. 

Den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der tierärztlichen Hochschule Hannover möchte 

ich für die gute Zusammenarbeit bei der Beschaffung der Gehirngewebeproben danken. 

Herrn Professor Doktor Tosso Leeb und den Mitarbeitern des Instituts für Tierzucht und 

Vererbungslehre der tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich für die bereitwillige 

Durchführung der Sequenzierung. 

Meinem Mann Björn Küfen danke ich für die Mühe beim Korrekturlesen und die moralische 

Unterstützung. 

Bei meiner Familie, besonders meinen Eltern und Großeltern, bedanke ich mich ganz herzlich 

für ihr Vertrauen in mich, und für die Ermöglichung meines Studiums und der Promotion.

Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

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