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Die Rolle der Plasmaproteine Kallikrein, Plasmin und
beta2-Glykoprotein I (β2GPI) bei der Regulation des
alternativen Komplementaktivierungsweges
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller- Universität Jena
von Diplom Biologin Nadia Döring geb. Weber
geboren am 17. Juni 1979 in Sondershausen

1. Gutachter: PD Dr. Christine Skerka
Hans-Knöll-Institut, Infektionsbiologie
Beutenbergstraße 11a, D-07745 Jena
2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Henke
Institut für Virologie und Antivirale Therapie
Hans-Knöll-Str. 2, D-07745 Jena
3. Gutachter: Prof. Dr. Michael Kirschfink
Institut für Immunologie, Immunchemie
Im Neuenheimer Feld 305, D-69120 Heidelberg
Eingereicht: 31.01.2013
Disputation: 10.06.2013
2

ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Bei Infektionen und/oder Verletzungen werden im menschlichen Blut neben dem
Komplementsystem auch das Kallikrein-Kinin-System, das Gerinnungssystem und die
Fibrinolyse aktiviert. Alle diese Kaskaden sind auch Teil der angeborenen Immunantwort und
eng untereinander vernetzt. Das Komplementsystem spielt eine besonders wichtige Rolle bei
der Abwehr von Infektionserregern. C3 ist das zentrale Protein des Komplementsystems und
wird bei einer Aktivierung zum Opsonin C3b und Anaphylatoxin C3a gespalten. Neben den
Komplement C3-Konvertasen können auch Plasmaproteasen außerhalb des
Komplementsystems, wie z.B. Kallikrein (Kontaktaktivierung) und Plasmin (Fibrinolyse) auf
C3 einwirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein deutlicher Unterschied zwischen den
Funktionen von Kallikrein und Plasmin im Komplementsystem aufgezeigt. Während für
Kallikrein eine komplementaktivierende, C3b-generierende Funktion nachgewiesen wurde,
übt Plasmin im Gegensatz dazu eine komplementhemmende Wirkung als C3b-Prozessierer
aus. Erstmals wurde für Kallikrein eine C3-Spaltung unter Freisetzung von aktivem C3b
nachgewiesen. Weiterhin spaltet Kallikrein auch Faktor B zu den Produkten Bb und Ba. Die
gebildeten Spaltprodukte C3b und Bb formieren eine aktive C3-Konvertase. Demnach ist
Kallikrein -sobald es über die Kontaktaktivierung aus Präkallikrein generiert wird- alleine in
der Lage, eine aktive C3-Konvertase C3bBb auszubilden. Diese kallikreinvermittelte
Komplementaktivierung wurde, vergleichbar mit dem alternativen Komplementweg, durch
den Komplementregulator des alternativen Weges Faktor H inhibiert. Diese Ergebnisse
lassen folglich auf einen neuen Komplementaktivierungsweg schließen, der über die
Erkennung von fremden Oberflächen Kallikrein erzeugt, welches dann C3 und Faktor B
aktiviert und der über Faktor H reguliert wird. Im Gegensatz zu Kallikrein wirkt das zentrale
Enzym der Fibrinolyse Plasmin als Komplementinhibitor. Plasmin inaktiviert neben C3 und
C3b auch Faktor B sowie die C3-Konvertase des alternativen Weges C3bBb. Neben Plasmin
können auch weitere „Nicht-Komplementproteine“ die Komplementantwort beeinflussen. In
dieser Promotionsarbeit konnte außerdem das Gerinnungs-und Fibrinolyse regulierende
Plasmaprotein β2GPI als neuer Komplementinhibitor identifiziert werden. Dabei bindet das
β2GPI I-IV Fragment an C3b und verstärkt die Faktor I vermittelte C3b-Inaktivierung in
Gegenwart von Faktor H. Weiterhin reguliert β2GPI die Assemblierung des terminalen
Komplementkomplexes (TCC).
I

SUMMARY
summary
Upon infection and/or injury several different parts of the innate immune system become
immediately activated in human blood. Besides the complement also the kallikrein-kininsystem,
the coagulation system and the fibrinolysis are induced to restrict infection and
tissue damage. Thereby one system can modulate also the other to ensure a fast and
efficient reaction. The complement system plays an important role in the defence against
infectious agents. Once activated, C3, the central protein of the complement system, is
cleaved into the opsonin C3b and the anaphylatoxin C3a. In addition to the newly formed
complement C3 convertases, plasma proteases that are not part of the complement system
such as kallikrein (contact activation) and plasmin (fibrinolysis) can act on C3. In this work a
clear function of both kallikrein and plasmin in the complement system is demonstrated.
However, while kallikrein exerts complement activating functions, plasmin has a complement
inhibitory function. For the first time C3 cleavage by kallikrein is shown that releases active
C3b and C3a. Furthermore kallikrein cleaves factor B to Bb and Ba. The resulting cleavage
products C3b and Bb form an active C3 convertase. Thus kallikrein which is generated from
Präkallikrein by factor XI after contact activation also can induce formation of an active C3
convertase C3bBb. This kallikrein mediated complement activation is shown to be regulated
by factor H, the complement regulator of the alternative pathway. These results show a new
complement activation pathway (the kallikrein way) that is activated by recognition of
extrinsic surfaces and the generation of kallikrein which subsequently activates C3 and factor
B to form an active C3 convertase which is regulated by factor H. In contrast to kallikrein the
central enzyme of fibrinolysis plasmin is confirmed to act as a complement inhibitor. Plasmin
in addition to C3 and C3b degrades and inactivates factor B as well as the C3 convertase of
the alternative pathway C3bBb. Besides plasmin further “non-complement proteins” are able
to act on the complement response. In this study the plasma protein β2GPI, that has
regulatory functions in the coagulation system and fibrinolysis, is identified as a new
complement inhibitor. The experiments demonstrate that the β2GPI I-IV fragment binds to
C3b and in the presence of factor H increases the C3b inactivation by factor I. In addition
β2GP I-IV also regulates the assembly of the terminal complement complex (TCC).
II

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
A
Ampere
A
Alanin
Abb. Abbildung
ADP Adenosindiphosphat
aHUS atypical hemolytic ure mic syndrom
AK Antikörper
APC aktivierter Protein C-Komplex
aPL Antiphospholipidantikörper
β2GPI beta2-Glykoprotein I
BMGY buffered glycerol complex media
BMMY buffered methanol complex media
C
Cystein
°C Grad Celsius
C3d-K kallikreingeneriertes C3d
ca. circa
CEWA combined ELISA western blot assay
CR complement receptor
C-Terminus Carboxy-Terminus
CK1 Cytokeratin 1
DDD Dense deposit disease
DAF decay-accelerating factor
DAMP damage-associated patterns
DNA deoxyribonucleic acid
DPBS dulbecco´s phosphate buffered saline
E
Glutaminsäure
EDTA ethylen-diamin-tetra-acetic acid
EGTA ethylene glycol-bis-tetra acetic acid
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
EPGF epidermal growth factor
F
Phenylalanin
FN I fibronectin type I
g
Gramm
gC1qR globular C1q receptor
Gla gamma carboxyglutamic acid-rich
GP1b glycoprotein 1b
h
Stunde
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HMWK high molecular weight kininogen
III

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
HRP horseradish peroxidase
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IMAC immobilized metal ion affinity chromatography
kDa Kilodalton
l
Liter
L
Leucin
LB Luria-Bertani-Broth-Nährmedium
LPS Lipopolysaccharid
MASP MBL-associated serine protease
MBL Mannanbindender Lektinweg
MCP membrane cofactor protein
m
Milli
M
Molar
Mg 2+
min
N
nβ2GPI
NO
N-Terminus
nm
OD
OPD
PAGE
Magnesiumionen
Minute
Asparagin
nicked β2GPI
Nitritoxid
Amino-Terminus
Nanometer
Optische Dichte
o-Phenyldiamin-dihydrochlorid
poly-acrylamid-gel electrophoresis
PAI-1 plasminogen activator inhibitor 1
PAN plasminogen, apple, nematode
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
PG2 Prostaglandin 2
PRR pattern recognition receptor
TCC terminal complement complex
TNFα tumor necrosis factor α
t-PA tissue plasminogen activator
u.a. unter anderem
u-PA urocinase plasminogen activator
u-PAR urocinase plasminogen activator receptor
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PS Phosphatidylserin
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
IV

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
S
sec
SCR
SDS
Tab.
TAFI
TFPI
TLR
Tris
U
usw.
V
v.a.
VWA
vWF
W
WGD
YP
YNB
YPD
z.B.
ZNS
Serin
Sekunde
short consensus repeat
sodium-dodecyl-sulphate
Tabelle
thrombin activatable fibrinolysis inhibitor
tissue factor pathway inhibitor
toll-like-receptor
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Unit
und so weiter
Volt
vor allem
von Willebrand-Domäne
Willebrand-Faktor
Tryptophan
whole genome duplication
yeast pepton
yeast nitrogen base
yeast pepton dextrose
zum Beispiel
zentrales Nervensystem
V

ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Immunsystems ................................................................................. 2
Abb. 2 : Das Komplementsystem ............................................................................................................ 4
Abb. 3: C3 und seine Spaltprodukte........................................................................................................ 6
Abb. 4: Ablauf und Regulation der Amplifikationsschleife des alternativen Weges................................ 8
Abb. 5: Das Kallikrein-Kinin-System und seine Verbindung zur Gerinnungskaskade .......................... 11
Abb. 6: Ablauf der Gerinnselbildung...................................................................................................... 13
Abb. 7: Sekundäre Gerinnung............................................................................................................... 15
Abb. 8: Struktur von β2GPI ................................................................................................................... 18
Abb. 9: Die Fibrinolyse .......................................................................................................................... 20
Abb. 10: Typische Domänen der Serinproteasen des Blutes ............................................................... 22
Abb. 11: C3-Spaltung durch verschiedene Proteasen .......................................................................... 41
Abb. 12: C3-Spaltungskinetik durch Kallikrein ...................................................................................... 42
Abb. 13: C3-Spaltung durch Plasmin .................................................................................................... 44
Abb. 14: C3b-Deposition auf HK2-Zellen .............................................................................................. 46
Abb. 15: C3b-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin ........................................................................... 48
Abb. 16: Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin .................................................................... 50
Abb. 17: Bb-Generierung durch Kallikrein und Plasmin........................................................................ 52
Abb. 18: Aufbau der C3-Konvertase aus C3 und Faktor B durch Kallikrein ......................................... 53
Abb. 19: Beschleunigung des Zerfalls der C3-Konvertase vermittelt durch Kallikrein und Plasmin..... 54
Abb. 20: C3-Spaltung von Kallikrein und Plasmin in humanem Plasma............................................... 56
Abb. 21: Faktor B-Spaltung von Kallikrein und Plasmin in humanem Plasma...................................... 57
Abb. 22: Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die Komplementaktivität von Plasma....................... 58
Abb. 23: Interaktion von C3b generiert durch Kallikrein mit Faktor H ................................................... 60
Abb. 24: Kofaktoraktivität von Faktor H bei der Faktor I-vermittelten Inaktivierung von
kallikreingeneriertem C3b...................................................................................................................... 61
Abb. 25: Beschleunigung des Zerfalls der kallikreingenerierten C3-Konvertase.................................. 62
Abb. 26: Charakterisierung der rekombinanten β2GPI-Proteine .......................................................... 64
Abb. 27: Komplementregulation durch β2GPI und Fragmente im Zymosanversuch............................ 65
Abb. 28: Interaktion von β2GPI mit C3b................................................................................................ 66
Abb. 29: Verstärkung der Kofaktoraktivität von Faktor H durch β2GPI I-IV.......................................... 67
Abb. 30: Inhibierung des TCCs- durch β2GPI I-IV ................................................................................ 68
Abb. 31: Prozessierung von β2GPI durch Proteinase 3........................................................................ 70
Abb. 32: Kategorien der C3-Prozessierer ............................................................................................. 74
Abb. 33: Komplementaktivierung über den Kallikreinweg und den alternativen Komplementweg....... 77
Abb. 34: Regulation der Komplementaktivierungswege ....................................................................... 78
VI

ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 35: C3-Spaltung durch Plasmin .................................................................................................... 79
Abb. 36: Hemmung des alternativen Komplementweg durch Plasmin ................................................. 82
Abb. 37: Modell der β2GPI-Transformation während Entzündungsprozessen..................................... 86
Abb. 38: Regulation des Komplementsystems durch Kallikrein, Plasmin und β2GPI I-IV.................... 88
VII

INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung...........................................................................................1
1.1 Aufbau des menschlichen Immunsystems........................................................................ 1
1.2 Das Komplementsystem...................................................................................................... 2
1.2.1 Komplementaktivierungswege......................................................................................... 3
1.2.2 Terminaler Komplementweg............................................................................................ 4
1.2.3 Komplementprotein C3.................................................................................................... 5
1.2.4 Faktor B ........................................................................................................................... 7
1.2.5 Faktor H........................................................................................................................... 7
1.3 Kallikrein-Kinin-System ....................................................................................................... 8
1.3.1 Aktivierungswege............................................................................................................. 9
1.3.2 Plasma-Kallikrein............................................................................................................. 9
1.4 Gerinnungssystem ............................................................................................................. 12
1.4.1 Ablauf der Gerinnselbildung .......................................................................................... 12
1.4.2 Primäre Gerinnung ........................................................................................................ 13
1.4.3 Sekundäre Gerinnung ................................................................................................... 13
1.4.4 Regulation des Gerinnungssystems durch β2GPI ........................................................ 15
1.5 Fibrinolyse........................................................................................................................... 18
1.6 Vernetzungen zwischen den Enzymkaskaden des Blutes............................................. 20
1.6.1 Strukturelle Gemeinsamkeiten ...................................................................................... 20
1.6.2 Funktionelle Verknüpfungen.......................................................................................... 22
1.6.3 Systemische Erkrankungen der Enzymkaskaden......................................................... 23
1.7 Ziel der Arbeit...................................................................................................................... 25
2 Material und Methoden....................................................................26
2.1 Materialien und Medien...................................................................................................... 26
2.1.1 Chemikalien, Puffer und Lösungen ............................................................................... 26
2.1.2 Materialien und Geräte .................................................................................................. 27
2.1.3 Verwendete Stämme, Zelllinien und Kultivierung.......................................................... 27
2.2 Klonierung der β2GPI-Proteine ......................................................................................... 28
2.3 Proteinchemische Methoden............................................................................................. 28
2.3.1 Proteinexpression.......................................................................................................... 28
2.3.2 Proteinaufreinigung ....................................................................................................... 29
2.3.3 Umpufferung, Aufkonzentrierung und Konzentrationsbestimmung............................... 29
2.3.4 SDS-PAGE .................................................................................................................... 29
2.3.5 Westernblot.................................................................................................................... 30
2.3.6 Silberfärbung ................................................................................................................. 31
2.3.7 Deglykosylierung von rekombinantem β2GPI I-IV......................................................... 32
2.4 Immunbiologische Methoden............................................................................................ 32
VIII

INHALTSVERZEICHNIS
2.4.1 ELISA............................................................................................................................. 32
2.4.2 Detektion der C3-Konvertase mittels ELISA ................................................................. 34
2.4.3 Detektion der C3-Konvertase mittels CEWA................................................................. 35
2.4.4 Detektion der β2GPI-Cardiolipin-Interaktion mittels CEWA .......................................... 36
2.4.5 C3b-Inaktivierung durch Faktor I (Kofaktorversuch)...................................................... 36
2.4.6 Detektion der Komplementaktivität (Zymosanversuch)................................................. 37
2.4.7 Durchflusszytometrie ..................................................................................................... 38
2.4.8 Hämolyseversuch .......................................................................................................... 38
2.4.9 TCC-Inhibierungsversuch.............................................................................................. 39
2.4.10 Statistische Analysen .................................................................................................... 39
3 Ergebnisse ......................................................................................40
3.1 C3-Spaltung durch verschiedene Plasmaproteasen ...................................................... 40
3.2 Charakterisierung der C3b-Generierung durch Kallikrein und Plasmin....................... 41
3.2.1 C3-Spaltungskinetik durch Kallikrein............................................................................. 42
3.2.2 C3-Spaltungskinetik durch Plasmin............................................................................... 43
3.2.3 C3b-Deposition.............................................................................................................. 45
3.3 C3b-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin ................................................................... 47
3.4 Charakterisierung der Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin..................... 49
3.4.1 Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin........................................................... 49
3.4.2 Bb-Generierung durch Kallikrein und Plasmin .............................................................. 50
3.5 Aufbau einer C3-Konvertase aus C3 und Faktor B durch Kallikrein............................. 52
3.6 Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die aktive C3-Konvertase .............................. 54
3.7 Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die Komplementaktivität von humanem
Plasma ................................................................................................................................. 55
3.7.1 C3-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin im Plasma .................................................. 55
3.7.2 Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin in Plasma .......................................... 56
3.7.3 Komplementaktivierung durch Kallikrein und Plasmin .................................................. 57
3.8 Regulation der kallikreinvermittelten Komplement-aktivierung durch Faktor H ......... 58
3.8.1 Bindung von Faktor H an kallikreingeneriertes C3b...................................................... 59
3.8.2 Inaktivierung von kallikreingeneriertem C3b durch Faktor H und Faktor I .................... 61
3.8.3 Beschleunigung des Zerfalls der kallikreingenerierten C3-Konvertase durch Faktor H 62
3.9 Charakterisierung der komplementregulatorischen Funktion von β2GPI.................... 63
3.9.1 Klonierung und Charakterisierung von ßGPI und ßGPI-Fragmenten ........................... 63
3.9.2 Regulation der Komplementantwort durch β2GPI......................................................... 65
3.9.3 Interaktion von β2GPI I-IV mit C3b................................................................................ 66
3.9.4 Einfluss von β2GPI I-IV bei der Faktor I-vermittelten C3b-Spaltung............................. 66
3.9.5 Hemmung des terminalen Komplementkomplexes (TCC) durch β2GPI I-IV................ 67
3.9.6 Aktivierung der komplementregulatorischen Funktion von β2GPI ................................ 69
4 Diskussion.......................................................................................72
IX

INHALTSVERZEICHNIS
4.1 Proteasen des Kallikrein-Kinin-Systems, der Fibrinolyse und des Gerinnungssystems
wirken auf das Komplementprotein C3............................................................................ 72
4.2 Der Einfluss von Kallikrein auf das Komplementsystem............................................... 74
4.2.1 Kallikrein ist ein C3b-Generierer.................................................................................... 74
4.2.2 Kallikrein generiert Bb ................................................................................................... 75
4.2.3 Kallikrein ist ein neuer Aktivator des alternativen Komplementsystems ....................... 75
4.3 Die kallikreinvermittelte Komplementaktivierung wird durch den
Komplementregulator Faktor H gehemmt........................................................................ 77
4.4 Der Einfluss von Plasmin auf das Komplementsystem ................................................. 79
4.4.1 Plasmin ist ein C3b-Degradierer.................................................................................... 79
4.4.2 Plasmin degradiert Faktor B .......................................................................................... 80
4.4.3 Plasmin ist ein Inhibitor des alternativen Komplementsystems .................................... 81
4.5 Komplementregulation durch β2GPI................................................................................ 82
4.5.1 Das Proteinfragment β2GPI I-IV ist ein Komplementinhibitor ....................................... 82
4.5.2 Die Komplementaktivität von β2GPI.............................................................................. 83
4.5.3 Proteinase 3 prozessiert β2GPI .................................................................................... 84
4.5.4 Modell der Aktivierung von β2GPI................................................................................. 84
4.6 Regulation der Komplementaktivierung durch Kallikrein, Plasmin und β2GPI........... 86
5 Referenzen......................................................................................90
6 Appendix .........................................................................................98
6.1 Eigenständigkeitserklärung .............................................................................................. 98
6.2 Publikationen und Konferenzbeiträge.............................................................................. 99
6.3 Danksagung .................................................................................................................... 1000
X

EINLEITUNG
1 Einleitung
1.1 Aufbau des menschlichen Immunsystems
Der Mensch verfügt über ein vielschichtiges Immunsystem zur Abwehr von pathogenen
Eindringlingen, wie Bakterien, Pilzen, Parasiten und Viren. Allgemein unterscheidet man
zwischen der angeborenen und der erworbenen Immunantwort.
Das angeborene Immunsystem wird nach Aktivierung sofort wirksam und erkennt infektiöse
Mikroorganismen, sowie apoptotische oder nekrotische körpereigene Zellen anhand
konservierter Merkmale, welche als DAMPs (damage-associated patterns) bezeichnet
werden. Das angeborene Immunsystem verfügt einerseits über eine humorale
Immunantwort. Eine tragende Rolle spielt hierbei das Komplementsystem, welches
pathogene Erreger für die Phagozytose opsonisiert, Membranen lysiert und Anaphylatoxine
generiert. Weiterhin übernehmen auch das Kallikrein-Kinin-System, das Gerinnungsystem
und die Fibrinolyse wichtige Funktionen bei der Abwehr von infektiösen Mikroorganismen.
Die humorale Immunantwort steht durch z.B. Generierung von pro-und antiinflammatorischen
Proteinmediatoren in enger Beziehung zur zweiten Säule des
angeborenen Immunsystems, der zellvermittelten Immunantwort. Dieser Teil der Abwehr
wird von Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellen und neutrophilen Granulozyten
vermittelt. Die Aktivierung dieser Immunzellen erfolgt durch die Interaktion von Rezeptoren,
den sogenannten PRRs (pattern recognition receptors) mit den entsprechenden DAMPs.
Neben der Phagozytose von eingedrungenen Mikroorganismen und apoptotischen Zellen
modulieren Phagozyten die Immunantwort durch die Freisetzung proinflammatorischer und
gerinnungsfördernder Stoffe, wie TNFα (tumor necrosis factor α) und Thromboplastin.
Weiterhin spielen die Phagozyten eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der erworbenen
Immunantwort [1]. Eingedrungene Mikroorganismen, die nicht durch das angeborene
Immunsystem abgewehrt wurden, werden vom adaptiven Immunsystem erfasst. Dieser
zeitlich verzögerte Teil der Immunabwehr wird von B- und T-Zellen vermittelt und beruht auf
der Generierung hochspezifischer Antikörper sowie T-Zell-Rezeptoren (Abb. 1) [2].
1

EINLEITUNG
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Immunsystems
Schematischer Aufbau des menschlichen Immunsystems, geordnet nach dem zeitlichen Ablauf. Zunächst
schützen natürliche Barrieren vor dem Eindringen pathogener Erreger in den Organismus. Das angeborene
Immunsystem hat nur eine kurze Aktivierungszeit und lässt sich in eine humorale Antwort, welche von
Enzymsystemen organisiert wird und eine zelluläre Antwort, welche von Phagozyten vermittelt wird, unterteilen.
Die erworbene Immunantwort wird von B-und T-Zellen vermittelt, ist hochspezifisch, benötigt jedoch einige Tage
Aktivierungszeit.
1.2 Das Komplementsystem
Das Komplementsystem ist eine wichtige frühe Barriere zur Abwehr infektiöser Erreger. Über
30 Proteine sorgen für eine regulierte Opsonisierung und Lyse von pathogenen
Eindringlingen unter Generierung potenter Anaphylatoxine. Die Aktivierung der
Komplementkaskade kann über den alternativen, den klassischen und den MBL-Weg
erfolgen. Die drei Signalwege unterscheiden sich in ihren initialen Schritten, führen jedoch
2

EINLEITUNG
alle zur Bildung von C3b und C5b und leiten den terminalen Komplementweg [terminal
complement complex (TCC)] ein (Abb. 2).
1.2.1 Komplementaktivierungswege
Die Aktivierung des alternativen Komplementweges erfolgt über spontane Hydrolyse einer
im C3-Molekül enthaltenen hochreaktiven Thioesterbindung [3]. In Anwesenheit von Mg 2+ -
Ionen bindet das entstandene C3(H 2 O) den Komplementfaktor B. Die Plasmaprotease Faktor
D spaltet den gebundenen Faktor B in Ba und Bb [4]). Die aktivierte Serinprotease Bb bleibt
an C3(H 2 O) gebunden und spaltet C3-Moleküle in C3a und C3b. Die generierten C3b-
Fragmente besitzen, wie C3(H 2 O) eine freigelegte reaktive Thioestergruppe, die mit
Hydroxyl-und Aminogruppen auf Zelloberflächen reagieren kann. Kovalent gebundene C3b-
Moleküle interagieren mit Faktor B und ermöglichen seine Spaltung in Bb und Ba durch
Faktor D. Der C3bBb-Komplex bildet die Konvertase des alternativen Weges. Die C3bBb-
Konvertase generiert C3b und C3a. Das generierte C3b dient der Opsonisierung von
Oberflächen und bildet die Grundlage für den Aufbau weiterer C3-Konvertasen des
alternativen Weges. Dadurch wird ein positiver Rückkopplungsmechanismus, welcher als
Amplifikationsschleife bezeichnet wird, induziert. Aufgrund dieser Amplifikationsschleife
verfügt der alternative Komplementweg über 80% der Komplementaktivierungskraft [5].
Der klassische Weg der Komplementaktivierung wird durch die Bindung von C1 an
antigengebundene Antikörper induziert. C1 besteht aus den Untereinheiten C1r, C1s und
C1q [6]. Die Interaktion der C1q-Untereinheit mit dem Fc-Teil der Antikörper führt zu einer
Konformationsänderung des C1-Komplexes, wodurch das Zymogen C1r aktiviert wird. Die
akivierte Serinprotease C1r führt zur Aktivierung von C1s. C1s spaltet den Komplementfaktor
C4 in C4a und C4b. Das C4b-Fragment kann über eine aktivierte Thioesterbindung
kovalente Bindungen mit Hydroxylgruppen auf Oberflächen eingehen. Weiterhin kann C4b
mit dem Komplementprotein C2 interagieren. Gebundenes C2 wird durch C1s in C2a und
C2b gespalten. Letzteres formt mit C4b die C3-Konvertase des klassischen Weges (C4b2b),
welche C3 unter Generierung von C3b und C3a spaltet [7].
Der MBL-Weg wird durch die Bindung des mannanbindenden Lektins (MBL) an spezifische
Mannanreste oder andere Zuckermoleküle die auf Pathogenen vorkommen induziert. MBL
bildet einen Komplex mit den Zymogenen MASP (MBL-associated serine protease) 1 und
MASP 2. Durch die Interaktion von MBL mit einem Antigen, wird durch Autokatalyse MASP1
3

EINLEITUNG
aktiviert und spaltet MASP2. Die aktivierte Serinprotease MASP2 spaltet die
Komplementkomponenten C4 und C2. Vergleichbar mit der Komplementaktivierung über den
klassischen Weg, setzt sich generiertes C4b auf Oberflächen und bildet mit C2b eine C3-
Konvertase [8].
1.2.2 Terminaler Komplementweg
Durch die Bindung eines weiteren C3b-Moleküls an die C3-Konvertase des klassischen/
MBL- oder des alternativen Weges, entstehen die C5-Konvertasen C42b3b bzw.C3bBb3b.
Die C5-Konvertasen spalten die Komplementkomponente C5 in C5a und C5b. Das C5a-
Fragment wirkt als potenter Entzündungsmediator. C5b bindet C6 und C7. Der dabei
entstehende Komplex ist hydrophob und lagert sich in Zellmembranen ein. Durch die weitere
Anlagerung von C8 und mehreren C9-Molekülen, wird durch die Bildung einer Pore die
Zelllyse induziert [9, 10].
Abb. 2 : Das Komplementsystem
4

EINLEITUNG
Aktivierung: Das Komplementsystem kann über drei Wege induziert werden. Der alternative
Komplementweg wird kontinuierlich durch spontane Hydrolyse von C3 aktiviert. Der
klassische Weg wird durch Bindung von C1 an antigengebundene Antikörper induziert. Die
Aktivierung des Lektinweges erfolgt durch die Interaktion des mannanbindenen Lektins
(MBL) mit Zuckermolekülen auf Pathogenoberflächen. C3-Konvertase: Alle drei
Aktivierungswege führen zur Bildung von C3-Konvertasen (C3bBb durch den alternativen
Weg, C4b2b durch den klassischen und Lektin-Weg). Die C3-Konvertasen spalten C3-
Moleküle in das Anaphylatoxin C3a und das Opsonin C3b. Die C3b-Bildung wird durch
positive Rückkopplung (Amplifikationsschleife) verstärkt. C5-Konvertasen: Durch Anlagerung
von jeweils einem C3b-Molekül an die C3-Konvertasen entstehen die C5-Konvertasen
(C3bBb3b, C4b2b3b), welche C5 in C5a und C5b spalten. Terminaler Weg: Das C5b-
Spaltprodukt bildet mit C6 und C7 einen hydrophoben Komplex, welcher sich an die
Aktivatormembran anlagert und sich mit C8 und mehreren C9-Molekülen zum TCC formiert
(modifiziert nach Zipfel et al [11]).
1.2.3 Komplementprotein C3
Das Komplementprotein C3 ist vor mehr als 700 Mio. Jahren, damit lange vor dem ersten
Erscheinen von Immunglobulinen, entstanden [12, 13]. C3 ist das zentrale Protein des
Komplementsystems und ist mit einer Konzentration von 1,2 mg/ml im humanen Plasma
vertreten. C3 hat ein Molekulargewicht von 199 kDa und besteht aus einer α-Kette (110 kDa)
und einer β-Kette (75 kDa). Beide Ketten sind über eine Disulfidbrücke miteinander
verbunden [13, 14]. Das Komplementprotein C3 besteht aus 13 Domänen, von denen 8
Domänen vom Makroglobulintyp sind und das C3-Kerngerüst bilden. Die anderen 5
Domänen sind vom ANA-(Anaphylatoxin), LNK-(linker region), TED-(thioester containing
domain), CUB-(complement C1r/C1s, Uegf, Bmp1), und C345C-Typ und sind in das C3-
Kerngerüst integriert [15]. Alle drei Komplementaktivierungswege führen zur Spaltung von
C3 unter Generierung von C3b und C3a und induzieren damit eine Vielzahl biologischer
Antworten. C3 verfügt über eine reaktive intramolekulare Thioesterbindung, welche nach der
proteolytische Aktivierung von C3 zu C3b (oder durch spontane Hydrolyse zu C3(H 2 O)) mit
Amino- oder Hydroxylgruppen auf Oberflächen kovalente Bindungen eingehen kann. Auf
diese Weise werden Oberflächen opsonisiert [16, 17]. Diesen einzigartigen intramolekularen
Thioester findet man bei allen Mitgliedern der α2-Makroglobulinfamilie, zu welcher neben C3
und α2-Makroglobulin auch das Komplementprotein C4 zählt. Die Aktivierung von C3 zu C3b
führt weiterhin zur Freilegung kryptischer Bindestellen, welche Interaktionen mit einer
Vielzahl anderer Plasmaproteine, wie Faktor B, Faktor H, DAF (decay-accelerating factor)
und CR1 (complement receptor 1) ermöglichen [7]. C3b ist sowohl Bestandteil der C3-
Konvertase des alternativen Weges als auch Bestandteil aller C5-Konvertasen [4]. C3a
5

EINLEITUNG
fungiert als Anaphylatoxin und induziert Entzündungsreaktionen [18]. Durch die weitere
proteolytische Spaltung von C3b können die Fragmente iC3b, C3c, C3dg und C3d generiert
werden [10, 19-21]. Die Spaltprodukte iC3b, C3dg und C3d stimulieren durch die Bindung an
den Komplementrezeptor 2 (CR2) B-Zellen und stellen damit eine wichtige Verbindung zum
adaptiven Immunsystem her [20]. Die Bindung von iC3b an den Komplementrezeptor 3
(CR3), welcher vorzugsweise von Leukozyten exprimiert wird, stimuliert die Phagozytose
und induziert die Ausschüttung entzündungsfördernder Stoffe [22, 23]. Die C3-Fragmente
sind in Abb. 3 dargestellt.
Abb. 3: C3 und seine Spaltprodukte
Die C3-Konvertase spaltet C3 (199 kDa) in C3a (10 kDa) und C3b (189 kDa). Durch weitere
proteolytische Spaltungsvorgänge entstehen die C3-Fragmente iC3b 1 (189 kDa), iC3b 2 (186 kDa), C3f
(3 kDa), C3c (145 kDa), C3dg (41 KDa), C3g (6 kDa) und C3d (35 kDa). Es wurden die intakte α –und
6

EINLEITUNG
β-Kette komplett in schwarz, die α´-Kette in orange und die Fragmente der α-Kette in grau mit
orangefarbener Umrandung dargestellt (modifiziert nach Sahu, [13]).
1.2.4 Faktor B
Faktor B ist mit einer Konzentration von 200 µg/ml im humanen Plasma vertreten und hat ein
Molekulargewicht von 90 kDa. Faktor B besteht aus nur einer Kette von 739 Aminosäuren,
welche in drei Domänen vom SCR-Typ, einer von Willebrand-Domäne (VWA) und einer
Serinproteasedomäne organisiert sind [24]. Erst die Interaktion von Faktor B mit Mg 2+ -Ionen
ermöglicht die Interaktion mit C3b. Durch Bindung an C3b wird eine weitere
Konformationsänderung veranlaßt, durch welche Faktor B für die proteolytische Aktivierung
durch die Serinprotease Faktor D zugänglich wird. Faktor D spaltet Faktor B in Ba (30 kDa),
bestehend aus den drei SCR-Domänen und Bb (60 kDa), bestehend aus dem VWA-Modul
sowie der Serinproteasedomäne [25]. Nur der Bb-Teil bleibt an C3b gebunden und vermittelt
die Spaltung von C3 zu C3b und C3a. Faktor B ist eng verwandt mit dem Komplementprotein
C2. Die Gene beider Proteine gehören zum Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) [7].
1.2.5 Faktor H
Weder C3b noch C4b können zwischen körpereigenen und –fremden Oberflächen
unterscheiden. Eine gerichtete Komplementantwort wird erst durch die Aktivität einer Vielzahl
löslicher und zellgebundener Regulatoren möglich. Das Plasmaprotein Faktor H übernimmt
eine wichtige Funktion bei der Regulation des alternativen Komplementweges [26]. Faktor H
besitzt ein Molekulargewicht von 155 kDa, hat eine Plasmakonzentration von ca. 0,5 mg/ml
und besteht aus 20 Domänen vom SCR-Typ (Abb. 4B) [27, 28]. Faktor H führt durch
Verdrängung des Faktor B zum beschleunigten Zerfall der C3-Konvertase (decay
accelerating activity). Weiterhin ist Faktor H gebundenes C3b anfällig für die Faktor I
vermittelte Inaktivierung. Dieser Regulationsmechanismus ist ein wichtiger Gegenspieler der
Amplifikationsschleife des alternativen Weges. Das inaktivierte C3b (iC3b) steht nicht mehr
für den Aufbau einer C3-Konvertase zur Verfügung, kann jedoch durch Bindung an
Rezeptoren Phagozytose induzieren [29-31]. Die Affinität von Faktor H zu C3b ist davon
abhängig, ob sich C3b auf körpereigenen nicht-Aktivatoroberflächen oder auf körperfremden
Aktivatoroberflächen befindet. Nicht-Aktivatoroberflächen sind durch negativ geladene
Strukturen [Polyanionen, wie Sialinsäure oder Glykosaminoglykane (Heparin)]
7

EINLEITUNG
gekennzeichnet. In Gegenwart dieser Polyanionen bindet Faktor H mit hoher Affinität an
C3b, wodurch eine effektive Faktor I vermittelte Spaltung von C3b und damit ein Abbruch der
Komplementkaskade ermöglicht wird. Auf Aktivatoroberflächen, wie z.B. der von
Pathogenen, ist die Bindeaffinität von Faktor H sehr viel geringer. Die Bildung der C3-
Konvertase kann induziert werden (Abb. 4A) [32, 33]. Die zellgebundenen Regulatoren CR1
und DAF verfügen wie Faktor H, über Kofaktoraktivität und „decay accelerating activity“ [34].
A
B
Abb. 4: Ablauf und Regulation der Amplifikationsschleife des alternativen Weges
(A) Abhängig von der gebundenen Oberfläche wird C3b amplifiziert oder inaktiviert. Auf
Fremdoberflächen entsteht durch die Faktor B-Interaktion mit oberflächengebundenem C3b die Pro-
C3-Konvertase, welche durch Faktor D aktiviert werden kann. Die entstandene C3-Konvertase des
alternativen Weges kann weitere C3- Moleküle in C3b und C3a spalten und erzeugt so eine positive
Rückkopplung. Auf körpereigenen Zellen kann abgelagertes C3b nach Bindung von Faktor H durch
Faktor I inaktiviert werden. (B) Faktor H setzt sich aus 20 SCR-Domänen zusammen (modifiziert nach
Lachmann et al. [35]).
1.3 Kallikrein-Kinin-System
Das Kallikrein-Kinin-System moduliert die Immunantwort unter anderem durch Generierung
des Vasodilators Bradykinin. Durch die Dilation beschädigter und/oder entzündeter
Blutgefäße, wird die Versorgung mit Immunzellen und anderen Faktoren optimiert und der
Übertritt von Flüssigkeit, Proteinen und Abwehrzellen in das verletzte Gewebe erleichtert [2].
Das Kallikrein-Kinin-System kann über die Kontaktaktivierung oder über die
Prolylkarboxypeptidase aktiviert werden (Abb. 5B).
8

EINLEITUNG
1.3.1 Aktivierungswege
Über den Kontaktaktivierungsweg kann sowohl das Kallikrein-Kinin-System, als auch die
Gerinnungskaskade aktiviert werden. Dabei interagiert das Plasmaprotein FXII mit
anionischen Strukturen, wie Phosphatidylserin oder Kollagenen, verändert dadurch seine
Konformation und wird proteolytisch aktiv. Weiterhin können Oberflächenstrukturen von
Mikroorganismen, wie die Teichonsäure grampositiver Bakterienzellwände, das
Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterienzellwände sowie Zellwandstrukturen
verschiedener Candida-Stämme FXII binden und aktivieren [36-40]. Nach Aktivierung
katalysiert FXII die Spaltung von Präkallikrein zu Kallikrein. In einer positiven
Rückkopplungsreaktion generiert Kallikrein F XIIa. Das gebildete Kallikrein induziert eine
Reihe proinflammatorischer Prozesse, welche unter Punkt 1.3.2 aufgeführt sind. Die
Aktivierung der Gerinnungskaskade über die Kontaktaktivierung wird im Kapitel 1.4.3 erklärt.
Unabhängig von der Kontaktaktivierung kann weiterhin eine Aktivierung des Kallikrein-Kinin-
Systems über die Serinprotease Prolykarboxypeptidase erfolgen. Dieses Enzym wird
konstitutiv von Endothelzellen exprimiert und ist Bestandteil eines endothelialen
Multiproteinkomplexes, bestehend aus CK1 (Cytokeratin), u-PAR (urocinase plasminogen
activator receptor) und gC1qR (globular C1q receptor). Präkallikrein kann vermittelt durch
HMWK (high molecular weight kininogen) an diesen Komplex binden und durch die
Prolylkarboxypeptidase zu Kallikrein gespalten werden [41].
1.3.2 Plasma-Kallikrein
Plasma-Kallikrein wird als die inaktive Enzymvorstufe Präkallikrein von Leberzellen
exprimiert und zirkuliert im Plasma mit einer Konzentration von 450 nM [42]. Ca. 75% des
Plasma-Präkallikreins bilden einen nichtkovalenten Komplex mit HMWK [43]. Präkallikrein
besteht aus einer Kette mit 619 Aminosäuren, welche sich in vier N-terminale PAN
(plasminogen, apple, nematode)-Domänen und einer C-terminalen Serinproteasedomäne
organisieren (Abb. 5A). Präkallikrein trägt einen Kohlenhydratanteil von 15%. Aufgrund der
Modifizierungen in der Glykosylierung findet man zwei Präkallikrein-Varianten im Blut. Die
Molekulargewichte betragen 88 kDa und 85 kDa [44]. Die partielle proteolytische Spaltung
von Präkallikrein vermittelt durch FXIIa beziehungsweise der Prolylkarboxypeptidase führt
zur Aktivierung. Das generierte α-Kallikrein besteht aus einer N-terminalen schweren Kette
(52 kDa) mit den vier PAN-Domänen und einer C-terminalen leichten Kette (38 kDa bzw. 36
9

EINLEITUNG
kDa), welche die Serinproteasedomäne umfasst. Beide Ketten sind durch Disulfidbrücken
miteinander verbunden [44]. Die Proteasedomäne besitzt das für Serinproteasen typische
katalytische Zentrum Serin-Histidin-Asparagin und vermittelt die amidolytische Aktivität. Die
N-terminale schwere Kette vermittelt die Substratspezifität und ermöglicht die
Kallikreinbindung an Zelloberflächen [45]. α-Kallikrein zeichnet sich durch ein umfassendes
Substratspektrum aus. Durch die Spaltung von HMWK generiert α-Kallikrein das
hochinflammatorische Peptid Bradykinin [46]. Bradykinin bindet den G-Protein-gekoppelten
Kinin B2-Rezeptor, welcher konstitutiv von Endothelzellen exprimiert wird und führt zur
Sekretion von Nitritoxid (NO) und Prostaglandin 2 (PG2). Beide Faktoren diffundieren zu den
glatten Muskelzellen und induzieren dort durch Reduktion der intrazellulären
Kalziumkonzentration eine blutdrucksenkende Zellrelaxation [47, 48]. α-Kallikrein aktiviert
FXII, Plasminogen und Prourokinase, trägt damit zur Aufrechterhalung der Balance zwischen
Gerinnungsaktivierung und Gerinnungshemmung bei [49-51]. α-Kallikrein kann aus iC3b den
T-und B-Zellaktivator C3d-K freisetzen sowie durch Spaltung von C5 das Anaphylatoxin C5a
generieren [52, 53]. Weiterhin bindet α-Kallikrein an neutrophile Granulozyten und induziert
so unter anderem die Exozytose ihrer Lysosomen [54]. α-Kallikrein übernimmt damit wichtige
Funktionen bei der Aktivierung von Entzündungsreaktionen sowie der Modulation des
Blutdrucks. Durch eine weitere Spaltung innerhalb der N-terminalen schweren Kette des α-
Kallikreins vermittelt durch α-Kallikrein oder β-FIIa entsteht β-Kallikrein [44]. β-Kallikrein hat
seine Fähigkeit an neutrophile Granulozyten zu binden und zu aktivieren verloren. Weiterhin
zeigt Kallikrein nur noch 1% seiner HMWK-Spaltungsaktivität. Die Fähigkeit FXII zu
aktivieren bleibt unbeeinflusst [44, 45]. Die autokatalytische Spaltung von α-Kallikrein trägt
zur Vermeidung einer überschießenden Entzündungsreaktion bei. Über 90% der Plasma-
Kallikreinaktivität wird durch die beiden Inhibitoren C1-Inhibitor und α2-Makroglobulin
gehemmt [45, 55].
Trotz der ähnlichen Bezeichnung ist das Plasma-Kallikrein deutlich vom Gewebe-Kallikrein
abzugrenzen. Während Plasma-Kallikrein von einem Gen auf Chromosom 4 codiert wird,
liegt die Erbinformation für Gewebe-Kallikrein als Gencluster auf Chromosom 19. Gewebe-
Kallikrein umfasst eine Proteingruppe mit 15 Mitgliedern und wird jeweils als Proenzym von
zahlreichen Gewebearten (Pankreas, Nieren, ZNS, Darm usw.) exprimiert. Alle Gewebe-
Kallikreine bestehen nur aus einer Serinproteasendomäne mit einem Molekulargewicht
zwischen 24 kDa bis 46 kDa. Die Sequenzhomologie der Serinproteasendomänen zwischen
Plasma- und Gewebe-Kallikrein liegt nur bei 30-36%. Beide Kallikreinkategorien
10

EINLEITUNG
unterscheiden sich weiterhin in ihrer Substratspezifität sowie ihrer biologischen Funktion [47,
56].
Diese Arbeit befasst sich ausschließlich mit Plasma-α-Kallikrein. Zur Vereinfachung der
Nomenklatur wird nur noch die Bezeichnung Kallikrein verwendet.
A
B
Abb. 5: Das Kallikrein-Kinin-System und seine Verbindung zur Gerinnungskaskade
(A) Präkallikrein besteht aus vier PAN (plasminogen, apple, nematode) -Domänen und einer
Serinproteasendomäne. (B) Das Kallikrein-Kinin-System wird durch Spaltung von Präkallikrein zu
Kallikrein, vermittelt durch die Prolylcarboxypeptidase, welche Bestandteil des endothelialem
Multiproteinkomplexes ist, aktiviert werden. Weiterhin kann durch die Kontaktaktivierung von FXII
Kallikrein gebildet werden. Zusätzlich aktiviert FXIIa durch Spaltung von FXI die Gerinnungskaskade.
11

EINLEITUNG
1.4 Gerinnungssystem
1.4.1 Ablauf der Gerinnselbildung
Das Blut übernimmt wichtige Funktionen beim Transport von Nährstoffen, der
Kommunikation zwischen Organen und Geweben und in der Immunabwehr. Im Falle einer
Verletzung eines Blutgefäßes wird zum Schutz vor Blutverlusten das Gerinnungssystem
aktiviert. Dabei sorgen komplexe Regulationsmechanismen für eine angemessene örtlich
und zeitlich begrenzte Gerinnselbildung.
Unter physiologischen Bedingungen übernehmen die Endothelzellen wichtige Funktionen zur
Aufrechterhaltung der Fluidität des Blutes. Endothelzellen hemmen die Gerinnungskaskade,
inhibieren die Blättchenaggregation und unterstützen die Fibrinolyse. Im Falle einer
Verletzung eines Gefäßes, kommt das Blut mit subendothelialem Gewebe und damit mit
zahlreichen Gerinnungsaktivatoren (Kollagen, Laminin, Vitronektin, Von Willebrand Faktor) in
Kontakt. Die damit verbundene Aktivierung des Gerinnungssystems führt zur Bildung eines
Gerinnsels. Unterstützt wird die Gerinnungsreaktion durch aktivierte Endothelzellen am Ort
der Verletzung, durch Generierung gerinnungsfördernder Stoffe (wie die Exposition von
Thromboplastin) und gleichzeitigem Verlust der gerinnungshemmenden Endothelfunktion.
Prinzipiell kann der Gerinnungsmechanismus in drei Phasen eingeteilt werden (Abb. 6). In
der Aktivierungsphase, werden Thrombozyten und die Gerinnungskaskade durch Kontakt mit
aktivierenden subendothelialen Molekülen aktiviert. In der Amplifikationsphase werden zur
Bildung eines mehrschichtigen Thrombozytenaggregats, weitere Blutplättchen rekrutiert und
zur Bildung eines Fibrinnetzes Thrombin amplifizert. In Phase drei, der Stabilisierungsphase,
erreicht die Thrombinaktivierung ihren Höhepunkt, was zur Generierung eines
stabilisierenden Fibrinnetzes, in welchem das Thrombozytenaggregat eingebettet ist, führt
[57].
12

EINLEITUNG
Abb. 6: Ablauf der Gerinnselbildung
Intakte Endothelzellen verfügen über gerinnungshemmende Eigenschaften. Aktivierung: Durch die
Verletzung der Endothelwand kommen subendotheliale Substanzen (Thromboplastin (TP) und
Kollagene) mit Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren in Kontakt. Thrombozyten bilden eine primäre
Schicht auf der subendothelialen Matrix. Durch Aktivierung der Gerinnungskaskade wird Thrombin
gebildet. Amplifikation: Weitere Plättchen werden rekrutiert und bilden zusätzliche Schichten. Wurde
ausreichend Thrombin aktiviert, setzt die Fibrinbildung ein. Stabilisierung: Das
Thrombozytenaggregat wird in ein dichtes Fibrinnetz eingebettet (modifiziert nach Mackman [58]).
Nach den Funktionsträgern unterscheidet man zwischen der primären Gerinnung
(Thrombozyten vermittelt) und der sekundären Gerinnung (Gerinnungsfaktoren vermittelt).
1.4.2 Primäre Gerinnung
Durch den Kontakt mit subendothelialem Gewebe interagieren die Thrombozyten über den
Rezeptor GP1b (glycoprotein 1b) mit kollagengebundenem Von Willebrand-Faktor (vWF).
Auf diese Weise gefangene Thrombozyten können mit ihrem Rezeptor GPVI direkt an
Kollagene oder Laminin binden und werden aktiviert. Aktivierte Blutplättchen setzen
gerinnungs- und entzündungsfördernde Substanzen (ADP, Thromboxan A2, Calcium,
Fibrinogen, vWF usw.) aus ihren Granulas frei. Weiterhin bilden aktivierte Thrombozyten
Pseudopodien und stellen durch Exposition der inneren Phospholipidschicht eine
aktivierende Oberfläche für Gerinnungsfaktoren bereit. Die Plättchen in dem wachsenden
Aggregat werden u.a. durch Interaktion mit Integrinen oder vWF verbunden. Der primäre
Thrombus muss durch ein Fibrinnetz stabilisiert werden. Thrombozyten übernehmen dabei
eine wichtige Funktion bei der Aktivierung der Gerinnungskaskade [57, 59].
1.4.3 Sekundäre Gerinnung
Ziel der sekundären Gerinnung ist es, Thrombin zu aktivieren und ein stabilisierendes
Fibrinnetz zu generieren. Thrombin ist das zentrale Enzym der Gerinnung. Neben der
Spaltung von Fibrinogen, spaltet Thrombin u.a. die Kofaktoren FV und FVIII, aktiviert die
13

EINLEITUNG
Transglutaminase FXII und katalysiert die Aktivierung von Thrombozyten. Man unterscheidet
zwei Gerinnungswege, die zur Bildung von Thrombin führen. Der extrinsische Weg wird
durch Thromboplastin (TP) aktiviert. Der intrinsische Weg fungiert als
Thrombinamplifikationsweg und wird sowohl durch Thrombin als auch durch die
Kontaktaktivierung induziert (Abb. 7).
Der Aktivator des extrinsischen Gerinnungsweges Thromboplastin ist ein
Transmembranglykoprotein und wird konstitutiv von subendothelialem Gewebe exprimiert.
Thromboplastin bildet durch Interaktion mit FVII die extrinsische Tenase, welche FX aktiviert.
Die Generierung von FXa kann durch Aktivierung der intrinsischen Gerinnungskaskade
amplifiziert werden. Dabei wird, vermittelt durch Thrombin, FIX aktiviert. FIXa bildet mit dem
phospholipidgebundenem Kofaktor FVIIIa die intrinsische Tenase, welche zusätzliches FXa
generieren kann.
Weiterhin kann die intrinsische Tenase durch die Kontaktaktivierung gebildet werden. Der
aktivierte FXII generiert in Gegenwart des Kofaktors HMWK F IXa. F IXa aktiviert schließlich
den Enzymbestandteil der intrinsischen Tenase FXI.
F Xa bildet mit F Va auf anionischen Phospholipiden (v.a. exponiertes Phosphatidylserin auf
Plättchenoberflächen) den Prothrombinasekomplex. Dieser Komplex spaltet Prothrombin.
Das generierte Thrombin spaltet Fibrinogen zu Fibrin. Weiterhin bildet Thrombin einen
Komplex aus Fibrin und F XIII zur Generierung von F XIIIa. Die Transglutaminase F XIIIa
katalysiert die kovalente Quervernetzung des Fibrinnetzes [57, 58].
Die Gerinnungsreaktion wird maßgeblich von drei Regulatoren gehemmt. Antithrombin III
hemmt neben Thrombin auch FIXa, FXa und FXIIa. Die Wirkung von Antithrombin III wird
durch Heparin verstärkt [60]. TFPI (tissue factor pathway inhibitor) wird von Endothelzellen
gebildet und neutralisiert FXa sowie die extrinsische Tenase [61]. Der aktivierte Protein C-
Komplex (APC) hemmt die Kofaktoren FVa und FVIIIa [62]. Weiterhin wird das
Gerinnungssystem durch das Plasmaprotein β2GPI reguliert.
14

EINLEITUNG
Abb. 7: Sekundäre Gerinnung
Subendotheliales Thromboplastin (TP) interagiert mit FVII und bildet so die extrinsische Tenase. In
diesem Komplex ist FVII proteolytische aktiv und spaltet FX zu FXa. Faktor Xa bildet mit dem Kofaktor
FVa auf einer Phospholipidoberfläche (bereitgestellt von aktivierten Thrombozyten) die
Prothrombinase, welche Prothrombin zu Thrombin spaltet. Thrombin generiert Fibrin und aktiviert in
einer positiven Rückkopplungsschleife die intrinsische Tenase durch Spaltung von FXIa. FXIa bildet
mit dem Kofaktor FVIIIa auf Phospholipiden den intrinsischen Tenasekomplex. Weiterhin aktiviert
Thrombin die beiden Kofaktoren FVIII und FV. Die intrinsische Tenase kann alternativ durch die
Kontaktaktivierung von FXIIa generiert werden. FXIIa spaltet FIX zu FIXa. FIXa generiert FXIa. Eine
weitere wichtige Thrombinfunktion ist die Aktivierung der Transglutaminas FXIII, welche dann die
Fibrinstränge quervernetzen kann (modifiziert nach Adams [57]).
1.4.4 Regulation des Gerinnungssystems durch β2GPI
β2GPI wurde 1961 von Schultze et al zum ersten Mal beschrieben [63]. Die normale β2GPI-
Konzentration liegt zwischen 150 und 300 µg/ml, kann aber bedingt durch genetische oder
andere Faktoren von Mensch zu Mensch sehr variieren [64]. Der größte β2GPI-Anteil im
15

EINLEITUNG
Plasma zirkuliert in freier Form. 30% der β2GPI-Moleküle bilden Komplexe mit Lipoproteinen
[65, 66].
1.4.4.1 Funktionen von β2GPI
β2GPI ist an der Regulation einer Vielzahl physiologischer Vorgänge beteiligt. β2GPI zeigt
sowohl gerinnungsfördernde als auch gerinnungshemmende Aktivitäten. Aufgrund seiner
Fähigkeit anionische Phospholipide zu binden, kann β2GPI mit Gerinnungsfaktoren um
Bindestellen auf aktivierenden Oberflächen konkurrieren und so die Gerinnung hemmen [66].
β2GPI inhibiert durch die Interaktion mit dem vWF die Plättchenaggregation und hemmt
durch Bindung an FXI dessen Aktivierung über den intrinsischen Gerinnungsweg [67].
Weiterhin fördert β2GPI die Gerinnung, indem es das APC hemmt [68]. Die durch Plasmin
proteolytisch gespaltene β2GPI-Form (nβ2GPI) bindet Plasminogen und inhibiert so die t-PAvermittelte
Plasmingenerierung [69]. Weiterhin spielt β2GPI als Adaptermolekül bei der
Beseitigung apoptotischer Zellen eine Rolle [70]. β2GPI bindet über Domäne V an
Phosphatidylserin, das von apoptotischen Zellen exponiert wird. Durch die Interaktion von
Phosphatidylserin gebundenem β2GPI mit Makrophagenrezeptoren, wird die Erkennung und
Beseitigung apoptotischer Zellen induziert.
1.4.4.2 Struktur von β2GPI
β2GPI besteht aus einem Proteineinzelstrang mit 326 AS und hat ein Molekulargewicht von
55 kDa. β2GPI lässt sich in fünf Domänen vom SCR (short consensus repeat) -Typ
unterteilen [71]. Die N-terminalen Domänen I-IV umfassen jeweils 60 AS und zeigen die
typische Struktur, die allen Proteindomänen der SCR-Familie gemein ist. Die Domäne V
weist eine abgewandelte SCR-Struktur auf. Dieses Modul verfügt über drei Disulfidbrücken
und vier ß-Faltblätter. Der C-Terminus trägt einen hoch konservierten und sehr mobilen 19
Moleküle umfassenden Aminosäureanhang. Durch die Ausbildung einer Disulfidbrücke liegt
der C-Terminus als Schleife gefaltet vor. Die C-terminale Schleife trägt das hydrophobe
Sequenzmotiv LAFW [71, 72]. Weiterhin trägt die fünfte Domäne eine positiv geladene
lysinreiche Region mit dem markanten Sequenzmotiv CKNKEKKC (Heparinbindesequenz,
Abb. 8B). Die strukturellen Eigenschaften der fünften Domäne sind für die Bindung an
Membranen und andere negativ geladene, amphiphile Moleküle geeignet. Vermutlich wird
die Membranbindung durch die Interaktion der positiv geladenen Oberfläche von Domäne V
mit den negativen Gruppen der Phospholipide vermittelt, wobei sich die flexible hydrophobe
16

EINLEITUNG
Schleife in die Membran integriert (Abb. 8). β2GPI bindet an anionische Phospholipide, wie
Phosphatidylserin und Cardiolipin [73]. Weiterhin konnten Interaktionen mit Liposomen,
Endothelzellen, Thrombozyten, Mitochondrien, apoptotischen Zellen und Makrophagen
nachgewiesen werden [70, 74-76]. Ungebundenes β2GPI zeigt nur geringe immunologische
Aktivität. Laut Agar et al. besitzt β2GPI in Flüssigphase, durch die Interaktion zwischen
Domäne I und Domäne V, eine zirkuläre Konformation. Bindet β2GPI an anionische
Strukturen, öffnet sich das Protein und nimmt eine angelhakenförmige Konformation ein [77].
Erst durch diese Strukturänderung erlangt β2GPI seine volle Funktionstüchtigkeit, wie z.B.
die Fähigkeit mit Makrophagenrezeptoren zu interagieren. Weiterhin führt der
Konformationswechsel zur Freilegung kryptischer Epitope, welche durch bestimmte
Antikörper, wie z.B Antiphospholipidantikörper (aPL) nur im geöffneten β2GPI-Zustand
erkannt werden [78]. β2GPI zählt zu den am stärksten glykosylierten Plasmaproteinen. Man
unterscheidet entsprechend der Zusammensetzung und Struktur der Kohlenhydratketten
multiple β2GPI-Isoformen. Die physiologische Bedeutung dieser Diversität ist unbekannt. Die
hydrophobe Schleife der Domäne V ist sehr anfällig für Proteolyse und kann durch
verschiedene Enzyme, mit Funktionen in der Gerinnung, wie Faktor Xa und Faktor XIa sowie
in der Fibrinolyse, wie Plasmin, gespalten werden [67, 79, 80]. Das β2GPI-Spaltprodukt
(nβ2GPI) hat seine Fähigkeit an negativ geladene Phospholipide zu binden verloren.
Nβ2GPI bindet jedoch neutrale Phospholipide, wie Phosphatidylcholin und Sphingomyesin
[81]. β2GPI ist unter den Säugetieren hoch konserviert. Die größte Sequenzhomologie liegt
in der Domäne V vor [82-84].
17

EINLEITUNG
A
B
Abb. 8: Struktur von β2GPI
(A) β2GPI besteht aus fünf Domänen. In Flüssigphase interagieren Domäne I (Lys19, Arg39, Arg43)
und Domäne V (Lys324, Lys336) miteinander, wobei β2GPI eine zirkuläre Konformation einnimmt.
Bindet β2GPI mit Domäne V an anionische Strukturen (z.B. Phospholipidmembranen) öffnet sich das
Protein und nimmt eine angelhakenförmige Konformation ein. (B) Die fünfte Domäne von β2GPI
besteht aus 83 AS (263-345, ExPASy, UniProtKB, P02749). Durch die Ausbildung von drei
Disulfidbrücken (Cys264-Cys315, Cys300-Cys325, Cys307-Cys345) zeigt Domäne V eine sehr
kompakte Konformation. Charakteristisch für Domäne V sind eine positiv geladene
Heparinbindesequenz (300-307, CKNKEKKC) und eine sehr mobile C-terminale Schleife, welche über
eine hydrophobe Sequenz verfügt (332-335, LAFW). Diese beiden strukturellen Eigenschaften
verleihen Domäne V die Fähigkeit an Phospholipidmembranen zu binden, wobei sich der hydrophobe
Bereich in den Lipidanteil der Membran integriert. Proteasen (Plasmin, FXa, FXIa) können Domäne V
zwischen Lysin332 und Tyrosin337 (schwarzer Pfeil) spalten. Dadurch wird die C-terminale Schleife
geöffnet und Domäne V kann sich nicht mehr in Phospholipidmembranen integrieren (modifiziert nach
Bouma et al. und Sanghera et al. [72, 85]).
1.5 Fibrinolyse
Das Fibrinolysesystem sorgt für die Begrenzung der Gerinnselbildung am Ort der Verletzung
durch die Auflösung des Fibrinnetzes (Abb. 9B). Plasmin ist das zentrale Enzym der
Fibrinolyse und wird als die inaktive Enzymvorstufe Plasminogen von Leberzellen exprimiert.
Plasminogen hat ein Molekulargewicht von 92 kDa, zirkuliert im Plasma mit einer
Konzentration von 2 µM und besteht aus einer Kette von 291 Aminosäuren [86]. Die
Plasminogen-Sekundärstruktur umfasst fünf Kringle-Domänen und eine
18

EINLEITUNG
Serinproteasedomäne (Abb. 9A) [87, 88]. Die partielle proteolytische Spaltung von
Plasminogen vermittelt durch t-PA (tissue plasminogen activator) oder u-PA (urokinase
plasminogen activator) führt zur Aktivierung [89]. Das generierte Plasmin besteht aus einer
regulatorischen N-terminalen schweren Kette (60 kDa) mit einer PAN-Domäne sowie fünf
Kringle-Domänen und einer C-terminalen leichten Kette (32 kDa), welche die
Serinproteasedomäne umfasst. Beide Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander
verbunden. Plasmin spaltet neben Fibrinogen und Fibrin Komponenten der extrazellulären
Matrix, wie Fibronektin, Laminin und Vitronektin sowie Proteine des Komplementsystems,
wie C1, C2, C3, C3b, C4 und C5 [90-95]. Im Plasma liegen verschiedene
Plasminogenvarianten vor. Durch Autokatalyse des nativen Glu-Plasminogens, bei welcher
ein 8 kDa umfassenends N-terminales Peptid abgespalten wird, entsteht Lys-Plasminogen.
Das Lys-Plasminogen zeichnet sich durch eine höhere Substrataffinität aus [96]. Weiterhin
kann durch partielle Proteolyse von Plasminogen Mini-Plasminogen generiert werden,
welches sich aus der fünften Kringel-Domäne sowie der Serinproteasedomäne
zusammensetzt. Das Fibrinolysesystems kann durch Hemmung von Plasmin, vermittelt
durch α 2 -Antiplasmin, α 2 -Makroglobulin bzw. C1-Inhibitor, oder durch Inhibierung der
Plasminogenaktivatoren (t-PA, u-PA) durch PAI-1 bzw. PAI-2 (plasminogen activator
inhibitor) reguliert werden [97, 98].
19

EINLEITUNG
A
B
Abb. 9: Die Fibrinolyse
(A) Plasminogen ist die inaktive Vorstufe des zentralen Fibrinolyseenzyms Plasmin und besteht aus
fünf Kringel-Domänen, einer PAN-Domäne und einer Serinproteasedomäne. (B) Die Endothelzellen
sezernieren die beiden Aktivatoren t-PA und u-PA, welche Plasminogen zu Plasmin spalten. Plasmin
zerschneidet Fibrin und stellt damit einen wichtigen Gegenspieler des Gerinnnungssystems dar
(modifiziert nach Sun et al. [99])
1.6 Vernetzungen zwischen den Enzymkaskaden des Blutes
1.6.1 Strukturelle Gemeinsamkeiten
Das Komplementsystem, das Kallikrein-System, die Gerinnung und die Fibrinolyse sind in
Form von Enzymkaskaden organisiert. Alle Enzyme dieser Enzymkaskaden gehören zur
Familie der Chymotrypsin-Serinproteasen. Den Mitgliedern dieser Familie ist eine hoch
konservierte C-terminale Serinproteasedomäne gemein mit der charakteristischen
katalytischen Triade Aspartat, Histidin und Serin [100]. Weiterhin besitzen die
20

EINLEITUNG
Serinproteasen der Enzymkaskaden des Blutes regulatorische N-terminale Domänen,
welche die Substratspezifität vermitteln. Die Module des nichtkatalytischen Proteinbereiches
sind typischerweise vom Kringle-, PAN (plasminogen, apple, nematode), EPGF(epidermal
growth factor)-, Gla(gamma carboxyglutamic acid-rich)-, FN I(fibronectin type I)- oder
SCR(short consensus repeats)-Typ (Abb. 10) [101, 102]. Alle diese Serinproteasen werden
zunächst als Zymogene exprimiert und im Laufe des Aktivierungsprozesses funktionell aktiv.
Genetische Analysen lassen den Schluss zu, dass sich das Komplementsystem, das
Kallikrein-Kinin-System und das Gerinnungssystem im Laufe der Evolution aus einem
gemeinsamen Ur-Abwehrsystem entwickelten. Dieses Ur-Abwehrsystem schützte
gleichzeitig vor Flüssigkeitsverlusten und eliminierte pathogene Eindringlinge. Die
Serinproteasen der Fibrinolyse sind evolutionär näher mit den Enzymen des
Verdauungstraktes verwandt [101].
Motor für die Evolution der komplexen Serinproteasenkaskaden waren möglicherweise zwei
evolutionäre Prozesse: Zum einen fanden laut der WGD-Hypothese (whole genome
duplication) im Laufe der Vertebratenevolution zwei Genomverdopplungen statt [103]. So
gab es aufgrund der kompletten Vervielfachungen des gesamten Genoms genügend
Spielraum zur Entwicklung spezialisierter Systeme. Nach der ersten Genomverdopplung vor
ca. 500 Millionen Jahren entwickelten sich ein Komplementsystem, welches über den
alternativen und den Lektinweg aktiviert werden konnte und ein extrinsisches
Gerinnungssystem. Die zweite Genomverdopplung vor 430 Millionen Jahren brachte
schließlich den klassischen Komplementaktivierungsweg und die Kontaktaktivierung hervor
[104].
Zum anderen fand ein umfangreiches „exon-shuffling“ statt. Bei diesem evolutionären
Werkzeug werden Exons verschiedener Gene neu kombiniert. Dabei können neue Proteine
mit neuen Funktionen erschaffen werden [105, 106]. Ursprünglich existierten die Domänen
vom Kringle-, PAN-, EPGF-, Gla-, FN- oder SCR-Typ in Form von Miniproteinen und wurden
durch „exon shuffling“ den Serinproteasedomänen vorangestellt. Diese nichtkatalytischen
Domänen zeigen dabei ein ungewöhnlich hohes Maß an Mobilität, was den Prozess der
Proteinneukombination stark vorantrieb [101, 102, 104].
21

EINLEITUNG
Abb. 10: Typische Domänen der Serinproteasen des Blutes
Schematische Darstellung, strukturelle Eigenschaften und Vorkommen der Domänen vom Kringle-,
PAN,- und SCR-Typ [107-110].
1.6.2 Funktionelle Verknüpfungen
Die Enzymkaskaden des Blutes sind untereinander stark vernetzt. Die Gerinnungsfaktoren
Thrombin, FIXa, FXa und FXIa sowie das zentrale Protein der Fibrinolyse Plasmin können
durch Spaltung von C3 und C5 die aktiven Anaphylatoxine C3a und C5a generieren und
damit zahlreiche biologische Antworten induzieren [92, 111]. C5a ist ein hoch
inflammatorischer Mediator, welcher u.a. auch die Expression von Thromboplastin
induzieren und damit den extrinsischen Gerinnungsweg aktivieren kann [112]. Das FXII-
Fragment FXIIf, generiert durch Kallikrein, kann durch Aktivierung von C1s den klassischen
Komplementweg aktivieren [113]. Die Serinprotease MASP2 des Lektinweges kann durch
Spaltung von Prothrombin die Gerinnung aktivieren [114]. Sowohl Kallikrein als auch die C3-
Konvertase C3bBb können Plasminogen zu Plasmin spalten [50, 115]. Der
Komplementrezeptor gC1qR ist Bestandteil des Kallikreinaktivierungskomplexes (CK1/u-
PAR/Prolylkarboxypeptidase) [41].
Neben den Zusammenhängen bei der Aktivierung der Systeme, findet man weiterhin
zahlreiche Vernetzungen auf Ebene der Regulation. Der C1-Inhibitor bindet und hemmt FXII,
FXI, Thrombin, C1r, C1s, MASP1, MASP2, Plasmin, t-PA und Kallikrein [116].
Endothelzellen exprimieren das Membranprotein Thrombomodulin, welches Thrombin bindet
und damit seine Funktion moduliert. Unter anderem aktiviert das gebundene Thrombin die
22

EINLEITUNG
Karboxypeptidase TAFI (thrombin activable fibrinolysis inhibitor), welche sowohl die
Anaphylatoxine C3a und C5a als auch den Immunmediator Bradykinin inaktivieren kann
[117]. Das Plasmaprotein β2GPI moduliert die Aktivität des Gerinnungssystems, des
Kallikrein-Kinin-Systems und der Fibrinolyse [66, 67, 69].
1.6.3 Systemische Erkrankungen der Enzymkaskaden
Die engen Beziehungen zwischen den Enzymkaskaden werden auch bei Erkrankungen des
Blutes ersichtlich. Menschen mit der Erkrankung HAE (hereditary angioedema) haben einen
Mangel an C1-Inhibitor, was sich in Schüben lokaler subkutaner Schwellungen manifestiert,
verursacht durch Episoden unkontrollierter Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems, des
Komplementsystems und in abgeschwächter Form auch des intrinsischen Gerinnungsweges
und der Fibrinolyse [118]. Die engen Beziehungen zwischen den Enzymkaskaden werden
bei der Pathophysiologie der Erkrankung Sepsis noch viel deutlicher.
Sepsis ist eine systemische unkontrollierte Immunantwort auf eine Infektion. Weltweit
erkranken jährlich 13 Mio. Menschen an dieser schweren Krankheit. Trotz intensiver
medizinischer Versorgung sterben ca. 30% der Sepsispatienten [119]. Die katastrophale
Prognose für Sepsispatienten zeigt, dass diese Erkrankung bisher nur ansatzweise
verstanden wird. Sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien sowie Pilze und
deren Produkte können Ursache einer Sepsis sein. Eine übergeordnete Rolle bei der
Sepsisentstehung spielt das Endotoxin LPS [120].
LPS, ein Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, kann eine komplexe
Entzündungsreaktion in Gang setzen, bei der eine Aktivierung aller Enzymkaskaden und
Zellsysteme des Blutes erfolgt. Normalerweise finden diese Entzündungsprozesse lokal, zur
Abgrenzung und Eliminierung pathogener Eindringlinge statt. Unter bestimmten
Bedingungen, wie Störungen in der Immunabwehr, einer massiven Infektion mit erhöhter
Erregerzahl, einer gesteigerten Pathogenität der Erreger oder Infektionen in schlecht
abgrenzbaren Körperregionen kann es zu einer systemischen Ausbreitung der
Entzündungsreaktion, damit zur Entstehung einer Sepsis kommen [121]. Eine derart
überschießende Immunantwort kann zu einer massiven Schädigung von Geweben und
Organen führen. Paradoxerweise wird bei einer Sepsis der Körper von seiner eigenen
Immunabwehr mehr bedroht, als von den auslösenden Erregern selbst. Eine Sepsis läuft in
zwei Phasen ab.
23

EINLEITUNG
In der ersten Phase der LPS-induzierten Sepsis wird LPS vorzugsweise von dem Toll-like-
Rezeptor 4 (TLR4) auf Monozyten erkannt und veranlasst die Freisetzung der klassischen
inflammatorischen Zytokine IL(Interleukin)-1, IL-6 und TNF-α [122]. Diese Zytokine führen
durch Induktion der Freisetzung weiterer Zytokine, Lipidmediatoren und reaktiver
Sauerstoffverbindungen zu einem sekundären Entzündungsschub. Dabei wird unter
anderem eine verstärkte Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen induziert,
welche zu einer Wanderung von Entzündungszellen in das Gewebe sowie die Freisetzung
zytotoxischer Substanzen führt. Die erhöhte Expression von Thomboplastin auf
Endothelzellen und Monozyten führt zur Aktivierung der extrinsischen Gerinnung.
Gleichzeitig wird die Expression von Gerinnungsregulatoren wie Thrombomodulin blockiert
[123]. Inflammationsmediatoren (wie z.B. Bradykinin) induzieren Vasodilation [47]. Neben
Stimulation des TLR4 kann LPS auch direkt das Komplementsystem und das Kallikrein-
Kinin-System aktivieren [37, 124]. Die überschießende Immunreaktion bei der Erkrankung
Sepsis kann Organe schwer schädigen. Eine massive Produktion von NO durch
Endothelzellen stört die Funktion von Mitochondrien. Weiterhin können Thromben in kleinen
Blutgefäßen die Versorgung mit Blut stören. Beide Vorgänge führen zu Nekrosen [125].
Die zweite Phase der Sepsis ist durch eine Immunsuppression gekennzeichnet. Unter
anderem werden in neutrophilen Granulozyten intrazelluläre Signalwege blockiert und damit
eine Immunparalyse dieser Zellen hervorgerufen [126]. Die adaptive Immunreaktion
verändert sich von einer inflammatorischen T H 1-Anwort zu einer immunsuppremierenden
T H 2-Antwort [127]. Außerdem findet eine vermehrte Apoptose von Lymphozyten und
dendritischen Zellen statt [128, 129]. Weiterhin sind durch Verbrauch von Serinproteasen die
Gerinnungsfunktion und die Komplementkaskade gehemmt. In dieser Phase der Sepsis sind
die Patienten verstärkt anfällig für nosokomiale Infektionen sowie für die Mobilisierung
latenter Viren, was die Überlebenswahrscheinlichkeit weiterhin stark beinträchtigen kann
[130].
Entscheidend für die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten nach der Sepsisdiagnose
ist eine unmittelbare Behandlung mit geeigneten Antibiotika beziehungsweise die Entfernung
des Infektionsherdes [121].
24

EINLEITUNG
1.7 Ziel der Arbeit
Dem aufeinander abgestimmten Zusammenspiel der Enzymsysteme im menschlichen Blut
ist es zu verdanken, dass eindringende Mikroorganismen schnell erkannt, immobilisiert und
eliminiert werden können. Durch die Aktivierung des Komplementsystems, des
Gerinnungssystems und des Kallikrein-Kinin-Systems werden wichtige Abwehrmechanismen
zur Opsonisierung, Immobilisierung und Eliminierung von infektiösen Mikroorganismen
induziert. Die Fibrinolyse ist ein Gegenspieler der Gerinnung und sorgt für die Begrenzung
der Fibrinbildung auf den Ort der Verletzung. Nur ein ausgeglichenes Verhältnis zwischen
Aktivierung und Inhibierung dieser Enzymsysteme ermöglicht eine zielgerichtete effektive
Immunantwort. Eine unkontrollierte Aktivierung der Enzymkaskaden kann zu
lebensbedrohlichen Erkrankungen führen.
Ziel dieser Arbeit war es neue Interaktionen zwischen dem Komplementsystem und dem
Kallikrein-Kinin-System, dem Gerinnungssystem sowie der Fibrinolyse aufzuzeigen und zu
charakterisieren. Diese Analysen tragen dazu bei die komplexen Symptome bei
Krankheitsbildern, wie zum Beispiel Sepsis besser zu verstehen. Im ersten Teil der Arbeit
wurde der Einfluss des Kallikrein-Kinin-Systems und der Fibrinolyse auf den alternativen
Komplementaktivierungsweg auf Ebene der einzelnen Komponenten C3, C3b, Faktor B
sowie der C3-Konvertase C3bBb untersucht. Weiterhin wurde die regulatorische Funktion
von Faktor H auf die Kallikrein vermittelte Aktivierung des Komplementsystems analysiert.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von
komplementregulatorischen Eigenschaften des Gerinnungsregulators β2GPI. Dabei wurde
der Einfluss von β2GPI auf das Komplementprotein C3b und auf die Bildung des TCCs
untersucht. Da die β2GPI-Funktion konformationsabhängig ist, wurde auch die Aktivierung
von β2GPI durch PMN-Proteasen analysiert.
25

MATERIAL UND METHODEN
2 Material und Methoden
2.1 Materialien und Medien
2.1.1 Chemikalien, Puffer und Lösungen
Chemikalien, die nicht gesondert aufgeführt wurden, stammen von den Firmen Merck (VWR
International, Dresden) und Roth (Karlsruhe). Die Puffer und Medien wurden mit
bidestilliertem Wasser hergestellt und bei Bedarf für 20 min bei 212°C und 2x10 5 Pa
autoklaviert. Luria-Bertani-Broth (LB-Medium) war das Standardmedium für die Anzucht
der E.coli-Kulturen. Es enthielt 10 g/l NaCl, 10 g/l Trypton und 5 g/l Hefeextrakt. Die Anzucht
von Pichia pastoris erfolgte in YPD-Medium, bestehend aus 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton
und 20 g/l Dextrose. YPD-Festmedium wurde durch den Zusatz von 0,5% Agarose
hergestellt. Als Selektionsantibiotikum wurden 100 µg/ml Zeocin bei Bedarf zugesetzt. Die
Medien für die Proteinexpression BMGY und BMMY enthielten 70 ml YP-Medium, 10 ml
YNB (Yeast Nitrogen Base), 10 ml 1 M Kalium-Phosphat-Puffer und 200 µl 0,02% Biotin. Des
Weiteren wurden 10% Glycerol und Zeocin für das BMGY-Medium verwendet. Das BMMY-
Medium enthielt anstelle von Glycerol 10% Methanol. Zeocin wurde wegen seines
expressionshemmenden Effekts nicht zugesetzt. Die Proteinaufreinigung erfolgte mit Puffer
A und B. Beide bestanden aus 10 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM NaH 2 PO 4 , 500 M NaCl und 10%
Glyerol mit einem pH-Wert von 7,4. Allerdings wurden Puffer A 10 mM und Puffer B 500 mM
Imidazol zugesetzt. Die Polyacrylamidgele setzten sich aus Sammelgelpuffer (6,05 g
Tris/base, 0,4 g SDS, ad 100 ml ddH 2 O, pH 6,8) und Trenngelpuffer (91 g Tris/base, 2 g
SDS, ad 100 ml ddH 2 O, pH 8,8) zusammen. Der Laufpuffer für die Elektrophorese
beinhaltete 30,4g Tris/base, 10 g SDS und 144 g Glycerin. 10x PBS (Phosphat gepufferte
Salzlösung) II-Lösung beinhaltete 1,4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na 2 HPO 4 und 18 mM
KH 2 PO 4 . Der Proteintransfer auf die Nitrozellulosemembran fand mit Western-Transfer-
Puffer (5,5 g/l Tris, 2,9 g/l Glycin, 20% Methanol, 0,1% SDS) statt. Nach dem Proteintransfer
wurde die Nitrozellulosemembran zur Absättigung freier Bindestellen 1h in Blockpuffer 1
(4% Milchpulver, 1% BSA, 0,1% Tween20 in 1xPBS II) inkubiert. In den ELISAs wurde
Blockpuffer 2 (blocking solution I, Applichem) verwendet. Zum Reinigen der Membran
beziehungsweise der ELISA-Platten wurde Waschpuffer (0,05% Tween20 in 1xPBSII)
benutzt. Für die immunbiologischen Versuche wurden folgende Puffer eingesetzt: DPBS
(Lonza), HEPES-EGTA-Puffer (20 mM Hepes, 7 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, 144 mM NaCl,
pH 7,4), TC-Puffer (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 2 mM CaCl 2 ,1 mM MgCl, pH 7,4),
26

MATERIAL UND METHODEN
Konvertasepuffer 1 (TC, 2 mM NiCl 2 ), Konvertasepuffer 2 (4% BSA, 10 mM MgCl 2 , ½
DPBS), Eluierungspuffer (60 mM Tris HCl, 20% Glyzerin, 2% SDS, pH 6,5)
2.1.2 Materialien und Geräte
Für Reaktionen mit Volumina von 0,5 bis 2 ml wurden Eppendorf-Reaktionsgefäße (Greiner,
Frickenhausen), für Volumina bis 50 ml wurden Falkonröhrchen (Greiner) verwendet.
Pipettierabeiten wurden mit Pipetten von Gilson (Bad Camberg) und Eppendorf (Hamburg)
durchgeführt. Zu den häufig genutzten Geräten zählten eine Tischzentrifuge 5414C
(Eppendorf), Multifuge 3 L-R (Heraeus), Waage (Denver Instrument, Göttingen),
Thermomixer (Eppendorf), Whirlgerät (Vortex Genie, Scientific Industries, New York, USA)
und Magnetrührer (IKA Werke, Staufen). Die Zellzahlbestimmung der Erythrozyten erfolgte
gelöst in Coulter® Isoton® II Diluent (Beckman Coulter) mittels Particle Count & Size
Analizer (Beckman Coulter GmbH). Die Ermittlung der Zellzahl von HK2-Zellen fand am
CASY Zellanalysator (Innovatis AG, Reutlingen) mit physiologischer Kochsalzlösung
CASYTON (Innovatis AG, Reutlingen) statt. Optische Dichten wurden mittels ELISA-Reader
(SpektraMAX 190, Molecular Devices) ermittelt. Weitere Geräte wurden an entsprechender
Stelle aufgeführt.
2.1.3 Verwendete Stämme, Zelllinien und Kultivierung
Für alle Klonierungen mittels TOPO TA Cloning ® Kit (Invitrogen, Karlsruhe) wurden „One-
Shot-TOP10-Escherichia-coli-Zellen“ verwendet. Die Anzucht von E.coli erfolgte auf LB-
Agarplatten oder in LB-Flüssigmedium bei 37°C. Die Proteinexpression fand in Pichia
pastoris X33 statt. Die Kultivierung von Pichia pastoris erfolgte auf YPD-Agarplatten
beziehungsweise in den Flüssigmedien YPD, BMGY oder BMMY bei 30°C. Die Anzucht in
Flüssigmedien wurde je nach Umfang des Ansatzes in Röhrchen, Steilbruströhrchen oder
Schikanekolben bei 180 rpm durchgeführt. Zur vorübergehenden Konservierung der Pichia
pastoris-Kulturen mit einem pCR-Blunt II-Topo-Derivat wurde jeweils 1 ml einer Glycerin-
YPD-Kutur mit einem Glycerinanteil von 25% angefertigt und bei -80°C gelagert. Für die
Bestimmung der C3b-Deposition wurde die Zelllinie HK2 (ATCC-CRL-2190) verwendet. Die
Kultivierung der HK2-Zellen erfolgte bei 37°C in DMEM mit den Zusätzen 10 ng/ml EGF
(epidermal growth factor), 1% Ultraglutamin (LONZA), 10% FKS (PAA Laboraties, Cölbe)
und 27,5 µg/ml Gentamycinsulfat (LONZA).
27

MATERIAL UND METHODEN
2.2 Klonierung der β2GPI-Proteine
Die β2GPI-Fragmente wurden mittels Phusion-High-Fidelity PCR-Kit (New England BioLabs,
NEB, Frankfurt, Main) aus humaner Leber-cDNA (Gene Pool cDNA von Invitrogen) unter
Verwendung der Primer: P1Fw (5´-CGAATTCTTAGGGAAGTAAAATGCCCATT-3´) und
P5rev (5´-GTCTAGAGCGCATGGCTTTACATCGGATG-3´) für β2GPI I-V, P1Fw und P4Rev
(5´-GTCTAGAGATGCTTTACAACTTGGCATG-3´) für β2GPI I-IV und P4Fw (5´-
CGAATTCTTAGGGAAGTAAAATGCCCATT-3´) und P5rev für β2GPI IV-V mittels PCR
(GeneAmp ® PCR System 9700, Applied Biosystems) amplifiziert.
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in den pCR-Blunt II-Topo-Vektor ligiert und mittels
TOPO TA Cloning ® Kit der Firma Invitrogen kloniert. Die Isolierung der klonierten Plasmide
erfolgte mittels HiSpeed Plasmid Midi/Maxi Kit von Qiagen.
Die Aufreinigung der klonierten PCR-Produkte erfolgte via präparativen Doppelverdau von
2 µg Vektor-DNA in einem 50 µl-Ansatz über 3h bei 37°C mit jeweils 100 untis EcoRI
(BioLabs) und XbaI (BioLabs) und 5 µl P2-Puffer. Die klonierten PCR-Produkte wurden in
den Expressionsvektor pPICZαB (Invitrogen) für Pichia pastoris unter Verwendung des Quick
Ligation TM Kit von BioLabs ligiert. Die Klonierung erfolgte auch hier mittels TOPO TA Cloning ®
Kit der Firma Invitrogen.
Anschließend erfolgte die Isolierung des pPICZαB-Vektors per HiSpeed Plasmid Midi/Maxi
Kit von Qiagen. Zur Linearisierung der pPICZαB-Derivate wurden 8 µg Vektor-DNA mit 80
units SacI (NEB) sowie 20 µl P1-Puffer in einem 200 µl-Ansatz inkubiert und mittels „GFX
DNA and Gel Band Purification Kit“ (GE-Healthcare, Freiburg) nach Anweisungen des
Herstellers aufgereinigt. Kompetente Pichia pastoris-Zellen wurden mit 3 µg linearisiertem
pPICZαB-Derivat mittels des Pichia pastoris Expressionskit von Invitrogen nach den
Anweisungen im Manual transformiert.
2.3 Proteinchemische Methoden
2.3.1 Proteinexpression
Die Expression der rekombinanten β2GPI-Proteine wurde mit Hilfe des Pichia pastoris-
Expressions Kit (Invitrogen) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Es wurde
eine Pichia pastoris Vorkultur in glycerinhaltigem BMGY über Nacht bei 30°C und 180 rpm
angezogen. Aus den Zellen der Vorkultur wurde steril eine Hauptkultur mit einer optischen
28

MATERIAL UND METHODEN
Zelldichte (OD 600 ) von 1 angefertigt. Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte in 200 ml
methanolhaltigem BMMY bei 30°C und 180 rpm. Um den Methanolverbrauch aufrecht zu
erhalten, wurden der Kultur alle 24 h 1% Methanol zugesetzt. Die Ernte der
Kulturüberstände, in den die rekombinanten β2GPI-Proteine abgebenen wurden, erfolgte
nach einer Inkubationsdauer von 96 h. Der Kulturüberstand wurde nach Zentrifugation bei
4000 rpm für 10 min mit 5 x Puffer A und Aqua bidest auf ein Gesamtvolumen von 500 ml
komplettiert und unter Verwendung des Membranfilters MicronSep (Roth) mit einer
Porengröße von 0,22 µm sterilfiltriert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
2.3.2 Proteinaufreinigung
Die Aufreinigung der rekombinanten Proteine aus den Kulturüberstand erfolgte mittels
Metallchelat-Affinitätschromatographie („Immobilized metal ion affinity chromatography“,
IMAC). Die rekombinanten Proteine tragen am C-terminus einen Histidin-Tag, welcher hoch
affin an die nickelbeladene Oberfläche einer HisTrap TM HP-Säule (GE-Healthcare) bindet.
Die Beladung der Säulen mit dem Puffer A-haltigen Kulturüberstand fand mit einer
Peristaltikpumpe („Econo Pump“ von BIO-RAD) bei 4°C und einer Geschwindigkeit von 0,5
ml/min statt. Die Eluierung der rekombinanten β2GPI-Proteine basierte auf imidazolhaltigem
Puffer B und wurde mittels ÄKTA TM -FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Dabei wurde die beladene Säule zunächst mit 12 ml Puffer A gespült und anschließend zur
Entfernung unspezifisch gebundener Proteine mit 10 ml 5% Puffer B-Lösung gewaschen.
Die Eluierung erfolgte mit 7 ml Puffer B. Vor- und Nachbehandlung der Säulen und der ÄKTA
wurden wie von den Herstellern empfohlen durchgeführt.
2.3.3 Umpufferung, Aufkonzentrierung und Konzentrationsbestimmung
Die eluierten Proteinfraktionen wurden mittels Vivaspin 6 and 20 ml (Sartorius stedin bioted)
wie vom Hersteller angegeben in DPBS umgepuffert und auf 1 ml aufkonzentriert. Dafür
wurden drei Waschvorgänge der Proteinfraktion für je 30 min bei 4000 rpm durchgeführt. Die
Proteinbestimmung erfolgte am NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer, Peqlab) wie vom
Hersteller empfohlen.
2.3.4 SDS-PAGE
Mittels SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) erfolgte die
Autrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht. Verwendet wurde die
Elektrophoreseapparatur Mini-Protean 3 Cell (BioRad). Soweit nicht anders angegeben,
29

MATERIAL UND METHODEN
wurden die Proben mit reduzierendem Probenpuffer (Roti®-Load 1, Roth) vorbehandelt und
10 min bei 95°C inkubiert. Es wurden vorwiegend 10%-ige Polyacrylamidgele verwendet.
Andere Gel-Prozentigkeiten wurden an entsprechender Stelle erwähnt. Die
Proteinauftrennung fand am PowerPac 300 (BioRad) bei 120 bis 160 Volt statt. Als Protein-
Größenmarker diente „PageRuler Prestained Protein Ladder” (Fermentas).
2.3.5 Westernblot
Mit Hilfe des semi-dry Blotsystems (Keutz-Labortechnik, Reiskirchen) wurden die Proteine
aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Protran, Schleicher und Schuell, Dassel)
transferiert. Zwischen dreilagigen Blotpapierstapeln (Whatman-Papier, Whatman, Dassel)
wurde das Gel luftblasenfrei auf die Membran platziert. Membran und Blotpapier wurden
zuvor mit Westerntransferpuffer durchdrängt. Der Transfer erfolgte bei 48 mA (1 Gel)
beziehungsweise 96 mA (2 Gele) für 70 min. Vor der antikörpervermittelten Detektion der
Proteine wurden freie Proteinbindestellen auf der Nitrocellulosemembran durch die
Inkubation in Blockpuffer 1 über Nacht bei 4°C abgesättigt. Anschließend wurde die
Membran 1h mit proteinspezifischem Antikörper in 3 ml Blockpuffer 1 behandelt (Tab. 1).
Nachdem ungebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen für jeweils 5 min mit 25 ml
Waschpuffer entfernt wurden, erfolgte die Inkubation mit dem HRP (horse radish
peroxidase)-gekoppelten Sekundär-Antikörper. Dieser wurde 1:3000 in 3 ml Blockpuffer 1
verdünnt. Nach sorgfältigem Waschen der Membran in Waschpuffer fand die Detektion der
Proteine mit ECL-Lösung (AppliChem) statt. Die Lichtemission wurde mittels MF-ChemiBIS
3.2 (Bio-Imaging System, DNR) gemessen.
30

MATERIAL UND METHODEN
Tab. 1: Auflistung der Westernblot-Antikörper
Die primären Antikörper wurden in der angegebenen Verdünnung eingesetzt. In der letzten Spalte
sind die entsprechenden sekundären Antikörper aufgelistet. Sie stammen alle von der Firma DAKO,
sind HRP-gekoppelt und wurden mit einer Verdünnung von 1:3000 eingesetzt.
Primärer
Antikörper
Spezifität
Firma
Verdünnung
Sekundärer
(Klonalität)
/Quelle
Antikörper
Ziege-anti-C3
(polyklonal)
C3, C3b,
C3d,iC3b,
C3c
Calbiochem 1:3000 Kaninchen-anti-
Ziege-HRP
Kaninchen-anti-C3a
(polyklonal)
C3, C3a Comptech 1:3000 Schwein-anti-
Kaninchen-HRP
Kaninchen-anti-C3d
(polyklonal)
C3, C3b,
C3d,iC3b,
C3d,C3dg
DAKO 1:3000 Schwein-anti-
Kaninchen-HRP
Ziege-anti-Faktor B
(polyclonal)
Faktor B,
Ba, Bb
Comptech 1:3000 Kaninchen-anti-
Ziege-HRP
Kaninchen-anti-β2GPI
β2GPI,
Abd-
1:3000 Schwein-anti-
(polyklonal)
β2GPI I-V,
Serotech
Kaninchen-HRP
β2GPI I-IV,
β2GPI IV-V
2.3.6 Silberfärbung
Diese Methode diente der direkten Visualisierung von Proteinen im SDS-Gel. Dafür wurden
die SDS-Gele für 30 min in Fixierlösung (30% Ethanol, 30% Essigsäure) inkubiert und
anschließend für je 10 min mit 20% Ethanol und Aqua dest. gewaschen. Danach erfolgte die
Sensibilisierung mit frisch angesetzter Natriumthiosulfatlösung (0,2 g/l) für 1 min. Nachdem
das Gel 3 x 20 sec mit Aqua dest gewaschen wurde, fand die eigentliche Silberfärbung mit 2
g/l Silbernitrat für 30 min statt. Nach mehrfachen Waschen mit Aqua dest wurden die
Proteine mittels Entwicklerlösung (0,7 ml 37%iges Formaldehyd, 30 g/l Natriumcarbonat, 10
mg/l Natriumthiosulfat) visualisiert und die Reaktion durch Zugabe der Stopplösung (50 g/l
31

MATERIAL UND METHODEN
Tris Base, 2,5% Essigsäure) beendet. Nach 5 min Inkubation in Trockenlösung (10%
Ethanol, 5% Glycerin) wurden die Silbergele zwischen Cellophanfolien (Roth) in einen
Trockenrahmen eingespannt und über Nacht getrocknet.
2.3.7 Deglykosylierung von rekombinantem β2GPI I-IV
Die Deglykosyslierung von β2GPI I-IV erfolgte mit PNGase F der Firma Roche. Dabei
wurden 5 µM β2GPI I-IV mit 4 µM PNGase in Gegenwart von 0,1 mM EDTA für 6h bei 37°C
inkubiert. Das Gesamtvolumen betrug 40 µl. Als Puffer diente DPBS. Der Erfolg der
Deglykosylierung wurde mittels SDS-PAGE und Westernblot überprüft.
2.4 Immunbiologische Methoden
2.4.1 ELISA
Mittels ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) konnte die Interaktion zwischen zwei
Proteinen bestimmt werden. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene ELISA-Protokolle
angewandt. Folgende Schritte waren allen Protokollen gemein: zunächst wurde Protein 1 in
50 µl DPBS gelöst und in einer. 96-Well-Maxisorb-Mikrotiterplatte (Nunc, Wiesbaden) über
Nacht bei 4°C immobilisiert. Unbesetzte Bindestellen wurden durch Inkubation mit 150 µl
Blocklösung 2 für 2h bei 37°C abgesättigt. Anschließend erfolgte die Inkubation mit Protein 2
(Ligand) in 50 µl Puffer. Zwischen allen Schritten erfolgte eine Waschprozedur bei welcher
alle Probenvertiefungen der Mikrotiterplatte durch dreimaliges Befüllen mit Waschlösung und
anschließendem Ausschütten der Lösung von ungebundenen Proteinen gereinigt wurden.
Die Detektion des gebundenen Liganden erfolgte durch Inkubation mit einem primären
ligandenspezifischen und einem sekundären Meerettichperoxdase (HRP)-gekoppelten
Antikörper jeweils für 1h bei Raumtemperatur (Tab. 2). Die Umsetzung des Substrats durch
die Meerettichperoxidase und die damit verbundene Farbstoffentwicklung, erfolgte mit einer
der zwei Varianten.
Variante 1:
100 µl des Substrats o-Phenylendiamin-dihydrochlorid (OPD) (Sigma-Aldrich, München)
wurden zum Ansatz hinzugegeben und je nach der Stärke der Farbreaktion für 1-10 min
inkubiert. Die Substratumsetzung wurde mit 2 M Schwefelsäure gestoppt. Die
Quantifizierung erfolgte am ELISA-Reader (SpektraMAX 190, Molecular Devices) bei 490
nm.
32

MATERIAL UND METHODEN
Variante 2:
Es wurden 50 µl TMB Plus-Lösung (Kem-En-Tec Diagnostics A/S, Dänemark) hinzugegeben
und je nach Stärke der Farbreaktion 0,5-5 min inkubiert. Die Substratumsetzung wurde mit
0,25 M Schwefelsäure gestoppt. Die Quantifizierung erfolgte am ELISA-Reader
(SpektraMAX 190, Molecular Devices) bei 450 nm.
Tab. 2: : Antikörper für ELISA und Konvertaseabbauversuch
Aufgelistet wurden die verwendeten primären Antikörper mit den dazu passenden HRPgekoppelten
Sekundärantikörpern
Primärer
Antikörper
(Klonalität /
Wirt)
Spezifität
Firma
/Quelle
Verdünnung
des primären
Antikörpers
sekundärer
Antikörper
Verdünnung
des
sekundären
Antikörpers
Anti-C3c-HRP C3, C3c DAKO 1:1000
Kaninchenanti-C3a
(polyclonal)
C3, C3a Comptech 1:1000 Schwein-
anti-
Kaninchen-
HRP
1:1000
Ziege-anti-
Faktor B,
Comptech 1:4000 Kaninchen-
1:2000
Faktor B
Ba, Bb
anti-Ziege-
HRP
Kaninchen-
β2GPI,
Abd-
1:1000 Schwein-
1:1000
anti-β2GPI
β2GPI I-V,
Serotech
anti-
(polyclonal)
β2GPI I-
IV,β2GPI
Kaninchen-
HRP
IV-V
Im Folgenden werden die in dieser Arbeit durchgeführten ELISA näher erklärt:
33

MATERIAL UND METHODEN
ELISA zur Messung der Interaktion zwischen FH und enzymgeneriertem C3b
In zwei getrennten Ansätzen (Ansatz 1 und Ansatz 2) wurden 50 nM Faktor H immobilisiert.
Während der Blockierung der unspezifischen Bindestellen fand die C3b-Generierung durch
Inkubation von 10, 25 und 50 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin mit 50 nM C3 für 2 h
bei 37°C statt. Anschließend wurde der C3-Verdau mit dem immobilisierten Faktor H beider
Ansätze für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ansatz 1 wurde mittels HRP-gekoppeltem
Kaninchen-anti-C3c-Antikörper (DAKO) und Ansatz 2 mit Kaninchen-anti-C3a und dem
spezifischen sekundären Antikörper detektiert (Tab. 2). Die Antikörper wurden in Crossdown-Puffer
(Applichem) gelöst. Die Visualisierung erfolgte mit Variante 2.
ELISA zur Messung der Interaktion zwischen β2GPI und C3b
Zur Messung der Interaktion zwischen C3b und den β2GPI-Proteinen, wurden 25 nM C3b
immobilisiert und mit 0, 0,5 und 1 µM β2GPI I-V, β2GPI I-IV sowie β2GPI IV-V gelöst in 50 µl
DPBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Detektion erfolgte mit Kaninchen-antiβ2GPI-Antikörper
und dem spezifischen HRP-gekoppelten Sekundärantikörper (Tab. 2). Zur
Visualisierung wurde Variante 1 angewandt.
2.4.2 Detektion der C3-Konvertase mittels ELISA
Mittels des Konvertaseversuchs konnte der Aufbau und der beschleunigte Zerfall der C3-
Konvertase vermittelt durch Faktor H visualisiert werden. Dafür wurde in einer 96-Well-
Maxisorb-Mikrotiterplatte die C3-Konvertase generiert und via anti-Faktor B-Antikörper
detektiert. Da der verwendete anti-Faktor B-Antikörper eine höhere Affinität zu Bb hatte,
konnte zwischen unprozessierem Faktor B und Bb der generierten C3-Konvertase
unterschieden werden.
Für die Versuche wurden 28 nM C3b gelöst in DPBS über Nacht bei 4°C immobilisiert. Je
nach Fragestellung unterschieden sich die weiteren Versuchsbedingungen der
nachfolgenden Schritte:
Konvertaseaufbau-ELISA
Dieser Versuch diente dem Nachweis der Generierung einer C3-Konvertase. Dafür wurde
immobilisiertes C3b gleichzeitig mit 5 nM Faktor B, 20 nM Properdin und ansteigender
Menge von Kallikrein beziehungsweise Plasmin (1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100 nM) gelöst in
Konvertasepuffer 2 für 1 h bei 37°C inkubiert.
34

MATERIAL UND METHODEN
Konvertaseabbau-ELISA I
Mittels Konvertaseabbauversuch I wurde der beschleunigte Zerfall der Kallikrein generierten
C3-Konvertase in Gegenwart Faktor H nachgewiesen. Das immobilisierte C3b wurde mit
5 nM Faktor B, 20 nM Faktor P und 25 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin oder 1 nM
Faktor D für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte der beschleunigte Zerfall der
generierten C3-Konvertase durch Zugabe ansteigenden Mengen Faktor H (0,5; 1,5; 3; 6 nM).
Konvertaseabbau-ELISA II
Der Konvertaseabbauversuch II wurde angewandt, um den Einfluss von Kallikrein und
Plasmin auf den Zerfall der C3-Konvertase des alternativen Weges zu analysieren. Der
Aufbau der C3-Konvertase des alternativen Weges erfolgte durch Inkubation von
immobilisiertem C3b mit 5 nM Faktor B, 20 nM Faktor P und 1 nM Faktor D gelöst in
Konvertasepuffer 2, welcher statt MgCl 2 2 mM NiCl 2 enthielt, für 1 h bei 37°C. Anschließend
erfolgte die Inkubation mit ansteigenden Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin (1;
2,5; 5; 10; 25; 50 nM) für 1 h bei 37°C.
Die Faktor B/Bb-Detektion erfolgte bei allen Versuchen in gleicher Form durch Inkubation mit
den Antikörpern Ziege-anti-Faktor B und Kaninchen-anti-Ziege-HRP für jeweils 30 min bei
Raumtemperatur gelöst in ½ DPBS mit 10 mM MgCl 2 (Tab. 2). Zur Visualisierung wurde
Variante 2 verwendet.
2.4.3 Detektion der C3-Konvertase mittels CEWA
Mittels Konvertase-CEWA (combined ELISA Western blot assay) wurden generierte C3-
Konvertasen auf ihre Fähigkeit C3 in C3a und C3b zu spalten, untersucht. Zunächst wurden
55 nM C3b gelöst in DPBS, in einer 96-Well-Maxisorb-Mikrotiterplatte (Nunc, Wiesbaden) 2 h
bei 37°C immobilisiert. Anschließend wurden freie Bindestellen mit 150 µl Blocklösung 2 über
Nacht bei 4°C abgesättigt. Zum Aufbau der C3-Konvertase wurden 215 nM Faktor B, 190 nM
Faktor P und 20 nM Faktor D in Konvertasepuffer appliziert und für 1 h bei 37°C inkubiert.
Zwischen jedem Versuchsschritt wurde ungebundenes Protein durch Waschen mit
Waschpuffer entfernt. Nachfolgend wurden 155 nM C3 in Konvertasepuffer 1 als Substrat zur
generierten C3-Konvertase gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden
mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die C3a- und C3b- Generieung per Westernblot mit
spezifischen Antikörpern detektiert (Tab. 1).
35

MATERIAL UND METHODEN
Zur Klärung der verschiedenen Fragestellungen in dieser Arbeit wurde der C3-Konvertase-
CEWA in verschiedenen Varianten durchgeführt:
Aufbau einer C3-Konvertase auf enzymbehandeltem C3b
Das immobilisierte C3b wurde für 2h mit 200 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin
inkubiert. Danach erfolgten der Aufbau der C3-Konvertase sowie die Analyse der
Probenüberstände.
Aufbau der C3-Konvertase durch Inkubation mit Kallikrein beziehungsweise Plasmin
Das immobilisierte C3b wurde für 2 h bei 37°C mit 215 nM Faktor B, 190 n Faktor P und zur
Generierung der C3-Konvertase mit einem der Enzyme Faktor D (20 nM), Kallikrein (200 nM)
oder Plasmin (200 nM) in Konvertasepuffer 1 für 1 h bei 37°C inkubiert.
2.4.4 Detektion der β2GPI-Cardiolipin-Interaktion mittels CEWA
Die Untersuchung der Interaktion von β2GPI mit Cardiolipin wurde mittels ELISA und
Westernblot (CEWA) durchgeführt. Es wurden 4,5 µM Cardiolipin (Sigma-Aldrich) für 2 h bei
37°C in einer 96-Well-Maxisorb-Mikrotiterplatte immobilisiert. Freie Bindestellen wurden
durch Inkubation mit 150 µl Blocklösung I über Nacht bei 4°C abgesättigt. Anschließend
erfolgte die Applikation von 0,3 µM β2GPI I-V, β2GPI I-IV beziehungsweise β2GPI IV-V.
Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden ungebundene Proteine durch extensives Waschen mit
Waschpuffer entfernt. Durch Gabe von 30 µl Eluierungspuffer für 10 min bei 37°C wurde
gebundenes Protein gelöst und mittels SDS-PAGE aufgetrennt und via Westernblot mit
Kaninchen anti-β2GPI-Antikörper (Tab. 1) detektiert.
Für den Nachweis der Cardiolipin-Bindeeigenschaft des durch Proteinase 3 generierten
β2GPI-Fragmentes wurde der Versuch modifiziert. Dafür wurden 0,4 µM β2GPI (SCIPAC)
mit 0,125 µM Proteinase 3 (Athens Research) für 30 min inkubiert, auf immobilisiertes
Cardiolipin appliziert und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Eluierung und die Detektion des
gebundenen Proteins erfolgten wie bereits beschrieben.
2.4.5 C3b-Inaktivierung durch Faktor I (Kofaktorversuch)
Mittels Kofaktorversuch wurde die Faktor I-vermittelte C3b-Inaktivierung induziert durch
Faktor H untersucht. Zur Klärung der verschiedenen Fragestellungen in dieser Arbeit,
wurden folgende zwei Kofaktorversuche durchgeführt:
36

MATERIAL UND METHODEN
Kofaktorversuch I
Mittels Kofaktorversuch I wurde die Inaktivierbarkeit des Kallikrein generierten C3bs durch
Faktor I und Faktor H untersucht. Dafür wurden 100 nM C3 mit 100 nM Kallikrein, 100 nM
Plasmin oder der C3-Konvertase des alternativen Weges (100 nM Faktor B, 190 nM Faktor
P, 20 nM Faktor D, 2 mM NiCl 2 ) zur Generierung von C3b für 1 h bei 37°C inkubiert. Das
entstandene C3b wurde mit 60 nM Faktor H und 8 nM Faktor I für 30 min bei 37°C inkubiert.
Für alle Ansätze wurde TC-Puffer verwendet. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug
jeweils 50 µl. Die Proben wurden in einem 8%igen SDS-Gel aufgetrennt. Die Visualisierung
erfolgte via SDS-PAGE und Westernblot mit Ziege-anti-C3-Antikörper (Tab. 1).
Kofaktorversuch II
Die Kofaktorfunktion von β2GPI I-IV bei der C3b-Inaktivierung in Gegenwart von Faktor I und
Faktor H wurde durch Inkubation von 55 nM C3b mit 60 nM Faktor H, 8 nM Faktor I und
ansteigenden Mengen von β2GPI I-IV (0,4; 1,8; 3,6 µM) ermittelt. Die C3b-Spaltprodukte
wurden nach Auftrennung mittels SDS-PAGE via Westernblot unter Verwendung von Ziegeanti-C3-Antikörper
analysiert (Tab. 1).
2.4.6 Detektion der Komplementaktivität (Zymosanversuch)
Mittels Zymosanversuch wurde der Einfluss von β2GPI auf den alternativen
Komplementaktivierungsweg getestet. Zymosan ist ein Bestandteil von Hefezellwänden, der
aus sich wiederholenden ß-1-3-verknüpften Glukoseeinheiten besteht. Dieses Polysaccharid
fungierte als C3b-bindende Aktivatoroberfläche und induzierte so die Komplementkaskade
über den alternativen Weg (Fearon, 1977, 1683-1687). Durch die Aktivierung des
Komplementsystems entsteht das Anaphylatoxin C3a, welches als Maß für die Stärke der
Komplementreaktion detektiert wurde. Es wurde eine 1% Zymosan-haltige Lösung (Sigma-
Aldrich) in 0,15 M NaCl angefertigt, bei 96°C für 1 h gekocht und bei -20°C gelagert. In 100
µl-Ansätzen, welche 5% humanes Plasma, 100 µg Zymosan, 3 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA
und DPBS enthielten, wurde jeweils 1 µM β2GPI I-V, β2GPI I-IV beziehungsweise β2GPI IV-
V zugesetzt. Als Positivkontrolle wurde 1 µM Faktor H mitgeführt. Die Ansätze wurden für
20 min bei 37°C und 400 rpm inkubiert und anschließend für 2 min bei 13 000 rpm
zentrifugiert. Die Überstände wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und per Westernblot mit
Kaninchen-anti-C3a-Antikörper auf das Vorhandensein des Spaltprodukts C3a untersucht
37

MATERIAL UND METHODEN
2.4.7 Durchflusszytometrie
Mittels Durchflusszytometrie werden Zellen hinsichtlich ihrer Größe, Granularität und
Fluoreszenzeigenschaften analysiert. Dabei werden die zu untersuchenden Partikel von
einem Laserstrahl erfasst. Es kommt zur Anregung gekoppelter Fluoreszenzfarbstoffe, die
daraufhin Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren. Dieses Licht kann durch ein
komplexes System aus Spiegeln und Filtern gebündelt und zerlegt und anschließend
detektiert werden.
Die Durchflusszytometrie wurde zur Untersuchung des Einflusses von Kallikrein und Plasmin
auf die Komplementaktivität von humanem Plasma verwendet. Dafür wurde die Stärke der
C3b-Deposition auf HK2-Zellen nach Inkubation mit humanem Plasma und ansteigenden
Mengen Kallikrein beziehungsweise Plasmin gemessen. 2x10 5 HK-Zellen wurden mit 2,5%
Plasma und 10; 50 oder 100 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin für 30 min bei 37°C und
800 rpm inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit FITC gekoppeltem Ziege-anti-C3-Fab-
Antikörper (Protos Immunoresearch, 1:5000 verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur. Alle
Ansätze wurden in TC-Puffer durchgeführt. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Zellen
zwei Mal mit 500 µl TC-Puffer gewaschen (2000 rpm, 4 min). Abschließend wurden die
Zellen in 400 µl TC-Puffer gelöst und am LSR II (BD) analysiert.
2.4.8 Hämolyseversuch
Mittels Hämolyseversuch erfolgte die Bestimmung der Komplementaktivität von humanem
Plasma in Gegenwart von Kallikrein beziehungsweise Plasmin. Die Inkubation von Plasma
mit Kaninchenerythrozyten führte zur Komplementaktivierung. Folglich wurden auf den
Erythrozyten TCC-Komplexe generiert, welche die Lyse und damit die Freisetzung des
photometrisch messbaren Farbstoffs Hämoglobin verursachten. Als Maß für die Stärke der
Komplementaktivierung diente die optische Dichte des Probenüberstandes bei 414 nm.
Es wurden 1x10 8 Kaninchenerythrozyten/ml mit 10% humanem Plasma und ansteigenden
Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin (25 ,100 und 250 nM) für 30 min bei 37°C
und 650 rpm inkubiert. Alle Ansätze wurden in HEPES-EGTA-Puffer gelöst. Das
Gesamtvolumen betrug 50 µl. Nach der Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 min wurden die
optische Dichte der Überstände bei 414 nm gemessen.
38

MATERIAL UND METHODEN
2.4.9 TCC-Inhibierungsversuch
Mittels TCC-Inhibierungsversuchs wurde der Einfluss der rekombinanten β2GPI-Proteine auf
die Generierung des lysierenden terminalen Komplementangriffskomplexes (TCCs) in
Gegenwart von Schaferythrozyten untersucht. Der Grad der Hämolyse galt als Maß für die
Stärke der TCC-Generierung. 2x10 8 Schaferythrozyten/ml wurden mit 2,5 nM C5b6
(Calbiochem) in 30 µl HEPES-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Simultan
erfolgte die Inkubation von 9 nM C7; 1,3 nM C8; 14,5 nM C9 (Calbiochem) mit 50, 250 und
500 nM β2GPI I-V, β2GPI I-IV beziehungsweise β2GPI IV-V gelöst in 20 µl HEPES-Puffer für
5 min bei Raumtemperatur. Der C7-C9-β2GPI-Mix wurde zu den C5b6-beladenen
Erythrozyten appliziert und für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden bei 414 nm
am ELISA-Reader gemessen.
2.4.10 Statistische Analysen
Mit Hilfe des ungepaarten t-Tests wurde überprüft, ob sich zwei unabhängige Gruppen
bezüglich ihrer Mittelwerte unterscheiden (www.graphpad.com). P-Werte von *p

ERGEBNISSE
3 Ergebnisse
3.1 C3-Spaltung durch verschiedene Plasmaproteasen
Die Spaltung von C3 unter Generierung von C3b und C3a ist der zentrale Schritt in der
Komplementaktivierung (Abb. 11C). Das gebildete C3b kann körpereigene und –fremde
Oberflächen opsonisieren und ist sowohl Bestandteil der C3-Konvertase des alternativen
Komplementaktivierungweges als auch Bestandteil der C5-Konvertase.
Neben den C3-Konvertasen können eine Vielzahl von Enzymen aus dem
Gerinnungssystem, der Fibrinolyse und dem Kallikrein-Kinin-System C3 unter Freisetzung
von C3a spalten [92, 131]. Plasmaproteasen mit dieser Fähigkeit werden generell als
Komplementaktivatoren bezeichnet, obwohl bisher nicht untersucht wurde, ob neben dem
C3a auch komplementaktives C3b freigesetzt und damit eine Komplementantwort induziert
wird.
Um zu klären, ob C3-Prozessierer neben C3a auch komplementaktives C3b generieren
können, wurde aus humanem Plasma aufgereinigtes Komplementprotein C3 mit den
Plasmaproteasen Kallikrein, Plasmin, Thrombin und Neutrophilenelastase (NE) inkubiert und
die entstandenen C3-Spaltprodukte mittels SDS-Page und Westernblot detektiert. Während
alle untersuchten Proteasen das 10 kDa schwere C3a freisetzten (Abb. 11A), gab es
deutliche Unterschiede in der C3b-Generierung (Abb. 11B). Kallikrein und Thrombin
erzeugten die für C3b charakteristische α´-Kette in Höhe von 114 kDa (Pfeil in orange), ohne
weitere C3-Spaltprodukte zu generieren (Spuren 2 + 4). Im Gegensatz dazu konnten nach
der Inkubation mit Plasmin und NE neben der α´-Kette zusätzliche Spaltprodukte detektiert
werden (Spuren 3 + 5, graue Pfeile).
40

ERGEBNISSE
A
B
C
Abb. 11: C3-Spaltung durch verschiedene Proteasen
Die Plasmaproteasen Kallikrein, Plasmin, Thrombin und NE spalteten C3 unter Freisetzung von C3a
und C3b. Plasmin und NE degradierten C3b weiter (graue Pfeile). 100 nM C3 wurden mit 125 nM
Enzym für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden per SDS-PAGE aufgetrennt und mittels
Westernblot mit (A) Kaninchen-anti-C3a-Antikörper (Proben nicht reduziert) und (B) Ziege-anti-C3-
Antikörper detektiert. (C) Schematische Darstellung der Moleküle C3 und C3b mit Molekulargewichten
in kDa. Die α´-Kette wurde in orange dargestellt.
3.2 Charakterisierung der C3b-Generierung durch Kallikrein
und Plasmin
Nachdem nachgewiesen wurde, dass sich die C3-Spaltprofile der getesteten C3-
Prozessierer zum Teil stark voneinander unterschieden, wurden Kallikrein und Plasmin
ausgewählt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit C3b zu generieren, genauer untersucht.
Für Kallikrein wurde die C3-Prozessierung unter Freisetzung von C3b noch nicht
beschrieben. Die Funktion von Plasmin bei der Komplementantwort ist umstritten. Plasmin
wird sowohl als Komplementaktivator [35, 92, 111] als auch als Komplementinhibitor [91,
132] beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Rolle der beiden Serinproteasen
Kallikrein und Plasmin bei der alternativen Komplementantwort genauer untersucht werden.
41

ERGEBNISSE
3.2.1 C3-Spaltungskinetik durch Kallikrein
Zunächst wurde die Spaltung von C3 dosisabhängig durch Inkubation mit ansteigender
Menge von Kallikrein (Abb. 12A) und zeitabhängig durch ansteigende Inkubationsdauer mit
konstanter Menge Kallikrein (Abb. 12B) untersucht. Die Detektion der Spaltprodukte erfolgte
mittels SDS-Page und Westernblot. Kallikrein generierte ansteigende Mengen an C3b (Pfeil
in orange) ohne dieses weiter zu degradieren. Die α´-Kette mit der Mobilität von 114 kDa
(Pfeil in orange) wurde dosis-, und zeitabhängig intensiver, wobei die Intensität der α-Kette
abnahm.
A
B
Abb. 12: C3-Spaltungskinetik durch Kallikrein
Kallikrein generierte dosis- und zeitabhängig C3b aus C3 ohne Erzeugung zusätzlicher C3-
Degradationsprodukte. 50 nM C3 wurden (A) mit 0, 10, 25 und 100 nM Kallikrein für 1h bei 37°C
inkubiert oder (B) mit 100 nM Kallikrein für 5, 60 und 180 min bei 37°C inkubiert. Die Spaltprodukte
wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und per Westernblot detektiert (Ziege-anti-C3-Antikörper).
42

ERGEBNISSE
3.2.2 C3-Spaltungskinetik durch Plasmin
Weiterhin wurde die C3-Spaltung durch Plasmin genauer analysiert. Dafür erfolgte die
Inkubation von C3 mit ansteigenden Mengen von Plasmin. Die Spaltprodukte wurden per
SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Westernblot detektiert. Auch Plasmin generierte C3b
(Abb. 13A, Pfeil in orange). Zunächst wurde eine Verstärkung der α´-Kette verzeichnet (Spur
2 und 3). Nach weiterer Erhöhung der Plasminkonzentration nahm die Intensität dieser für
C3b charakteristischen Bande ab (Spur 4). Plasmin generierte zusätzliche C3-Spaltprodukte
mit den Mobilitäten von ca. 87, 78, 68, 43, und 27 kDa {Abb. 13A (graue Pfeile]. Während die
beiden Spaltprodukte mit den Molekulargewichten von 78 und 43 kDa mit zunehmender
Menge Plasmin verschwanden, nahm die Intensität der Spaltprodukte in Höhe von 68 und 27
kDa zu. Plasmin degradierte neben der C3-α-Kette auch die C3-β-Kette. Die
Bandenintensität der C3-β-Kette nahm mit ansteigender Plasminmenge ab.
43

ERGEBNISSE
A
B
Abb. 13: C3-Spaltung durch Plasmin
(A) Plasmin generierte und degradierte C3b. 50 nM C3 wurden dosisabhängig mit Plasmin (0, 50, 100
und 200 nM) für 1h bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden per SDS-PAGE aufgetrennt und mittels
Westernblot detektiert (Ziege-anti-C3-Antikörper). Die intakten Ketten (C3α und β) wurden mit
schwarzen, die α´-Kette mit einem orange farbenen Pfeil und die zusätzlichen C3-Spaltprodukte mit
grauen Pfeilen gekennzeichnet. (B) Schematische Übersicht der C3-Spaltprodukte mit
Molekulargewichten generiert durch Plasmin. Die ungeschnittenen C3-α- beziehungsweise C3-β-
Ketten sind schwarz markiert. Die intakte α´-Kette wurde in orange, alle weiteren Spaltprodukte der α´-
Kette in grau dargestellt.
44

ERGEBNISSE
3.2.3 C3b-Deposition
Frisch generiertes C3b trägt eine sehr instabile Thioestergruppe, die vor allem auf
Oberflächen mit Amino- oder Hydroxylgruppen kovalente Bindungen eingehen kann und
somit Zellen opsonisiert [133]. Um zu untersuchen, ob die beiden Plasmaproteasen Kallikrein
und Plasmin funktionell aktives C3b generieren, wurden humane Nierenzellen (HK-2),
welche über sehr wenig membrangebundene Komplementregulatoren verfügen, mit
Kallikrein (Abb. 14A) oder Plasmin (Abb. 14B) und gesundem humanen Plasma inkubiert.
Die C3b-Ablagerung auf den HK2-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen.
HK2-Zellen, die mit Plasma und ansteigenden von Mengen Kallikrein inkubiert wurden,
zeigten eine Verstärkung der C3b-Deposition (Abb. 14C). Die Zugabe von 50 nM Kallikrein
erhöhte die C3b-Ablagerung um 14%. Wurden die HK2-Zellen mit Plasma und Plasmin
inkubiert, reduzierte sich die C3b-Bindung dosisabhängig (Abb. 14C).
45

ERGEBNISSE
A
B
C
Abb. 14: C3b-Deposition auf HK2-Zellen
Kallikrein verstärkte die C3b-Deposition auf HK2-Zellen. Plasmin hemmte die C3b-Ablagerung. Die
C3b-Deposition auf den HK2-Zellen wurde nach Inkubation mit Plasma (Kontrolle) und (A) Kallikrein
beziehungsweise (B) Plasmin am Durchflusszytometer (Ziege-anti-C3-FAB-Antikörper, FITC
gekoppelt) gemessen. (C) Der prozentuale Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die C3b-Beladung
von HK2-Zellen wurden in einem Kurvendiagramm dargestellt. Die C3b-Deposition nach Inkubation
mit Plasma (ohne Kallikrein-beziehungsweise Plasminzugabe) wurde gleich 100 Prozent gesetzt.
Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus mindestens drei unabhängigen
Versuchen (* p < 0,05; ** p < 0,01).
46

ERGEBNISSE
3.3 C3b-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin
Um zu untersuchen, ob Kallikrein und Plasmin das C3-Spaltprodukt C3b degradieren, wurde
aus dem Plasma aufgereinigtes C3b mit beiden Proteasen inkubiert und die Spaltprodukte
analysiert. Während mit ansteigender Menge Kallikrein keine C3b-Spaltprodukte detektiert
werden konnten (Abb. 15A), zeichnete sich bei der Inkubation mit Plasmin eine
Degradierung des C3b-Moleküls ab (Abb. 15B, graue Pfeile). Hier konnten Spaltprodukte mit
den Mobilitäten von 87, 78, 68, 43, 30 kDa und 27 kDa detektiert werden. Mit ansteigender
Plasminmenge wurde die Bandenintensität der Spaltprodukte mit den Molekulargewichten
von 68 und 27 kDa intensiver. Die Banden mit den Mobilitäten von 87, 78 und 43
verschwanden mit ansteigender Menge Plasmin. Plasmin degradierte neben der α´-Kette
auch die β-Kette von C3b.
Auf intaktem, aktivem C3b kann die C3-Konvertase des alternativen
Komplementaktivierungsweges aufgebaut werden. In einem Funktionstest wurde untersucht,
ob Kallikrein beziehungsweise Plasmin C3b inaktivieren und damit den Aufbau der C3-
Konvertase hemmen. Nachdem immobilisiertes C3b mit Kallikrein beziehungsweise Plasmin
inkubiert wurde, erfolgte die Zugabe von Faktor B, Properdin und Faktor D sowie C3. Die
Umsetzung von C3 zu C3b durch die gebildete C3-Konvertase wurde durch Analyse des
Überstand mittels SDS-Page und Westernblot bestimmt. Nach Vorinkubation von C3b mit
Kallikrein konnte im Überstand die C3b-typische α´-Kette mit einem Molekulargewicht von
114 kDa detektiert werden (Abb. 15C, Spur 2, Pfeil in orange). Folglich wurde immobilisiertes
C3b durch Kallikrein nicht degradiert.
Im Gegensatz dazu wurde nach Inkubation mit Plasmin keine α´-Kette nachgewiesen (Spur
3). Daraus folgt, dass Plasmin C3b inaktivierte und somit die Bildung der C3-Konvertase
hemmte, weshalb kein C3 umgesetzt wurde. Auf unbehandeltem immobilisierten C3b konnte
eine C3-Konvertase aufgebaut werden, welche C3 zu C3b spaltete (Spur 4, Pfeil in orange).
Kallikrein und Plasmin haben sich während der Inkubation mit dem immobilisierten C3b nicht
an die Versuchsoberfläche gebunden, konnten somit auch keinen Einfluss auf die Spaltung
des zugegebenen Substrats C3 ausüben (Spuren 5 + 6).
47

ERGEBNISSE
A
B
C
Abb. 15: C3b-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin
Kallikrein beeinflusste C3b nicht, Plasmin inaktivierte C3b. 50 nM C3b wurden mit 0, 10, 25 und 100
nM (A) Kallikrein beziehungsweise (B) Plasmin für 1h bei 37°C inkubiert und per SDS-PAGE
aufgetrennt. Die Detektion der C3b-Spaltprodukte erfolgte mittels Westernblot (Ziege-anti-C3-
Antikörper). Die α´-Kette wurde mit einem Pfeil in orange, alle weiteren C3-Spaltprodukt mit grauen
Pfeilen markiert. (C) In dem Konvertase-CEWA I wurde immobilisiertes C3b mit Kallikrein
beziehungsweise Plasmin inkubiert. Anschließend wurden die Enzyme entfernt und durch Zugabe von
Faktor B, Properdin und Faktor D die C3-Konvertase aufgebaut. Zum Schluss wurde das Substrat C3
hinzugefügt. Die C3b-Generierung durch die C3-Konvertase wurde mittels Westernblot nachgewiesen
(Ziege-anti-C3-Antikörper).
48

ERGEBNISSE
3.4 Charakterisierung der Faktor B-Spaltung durch Kallikrein
und Plasmin
Neben C3 ist Faktor B die zweite Komponente der alternativen C3-Konvertase, die
proteolytisch prozessiert werden muss, damit eine aktive Konvertase gebildet werden kann.
Faktor B bindet in Gegenwart von Magnesiumionen an C3b und bildet zunächst die Pro-
Konvertase C3bFB. Durch diese Komplexbildung ändert Faktor B seine Konformation und
kann durch Faktor D in Bb und Ba gespalten werden (Abb. 16C), wobei die aktive C3-
Konvertase des alternativen Weges C3bBb entsteht.
3.4.1 Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin
Um die Funktion von Kallikrein und Plasmin bei der Komplementantwort weiter
charakterisieren zu können, wurde der Einfluss beider Enzyme auf Faktor B analysiert.
Aus humanem Plasma aufgereinigter Faktor B wurde in Gegenwart zweiwertiger Kationen
mit Kallikrein inkubiert. Zusätzlich wurde C3b in ansteigenden Mengen hinzugegeben. Die
Faktor B-Spaltprodukte wurden mittels Westernblot detektiert. Kallikrein spaltete Faktor B in
zwei Produkte mit den Mobilitäten von 60 kDa und 30 kDa (Abb. 16A, Spuren 2-5). Diese
Produkte zeigten das gleiche Laufverhalten wie die bekannten, durch Faktor D generierten,
Bb und Ba-Fragmente (Spuren 8-10). Die kallikreinvermittelte Faktor B-Spaltung wurde
durch die Anwesenheit von C3b dosisabhängig verstärkt.
Die Inkubation von Plasmin mit Faktor B in Anwesenheit ansteigender Mengen C3b,
resultierte in der Generierung von 6 Faktor-B-Spaltprodukten mit den Mobilitäten 80, 60, 58,
48, 40 und 30 kDa (Abb. 16B). Die Bandenintensitäten der Faktor B-Spaltprodukte mit den
Molekulargewichten von 80, 60 und 30 kDa konnten in Anwesenheit von Plasmin und
ansteigender Menge C3b verstärkt werden. Die Generierung der 58, 48 und 40 kDa Faktor
B-Spaltprodukte erfolgte C3b-unabhängig, da sich die Intensitäten der Banden nicht
veränderten.
49

ERGEBNISSE
A
B
C
Abb. 16: Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin
Kallikrein und Plasmin spalteten Faktor B und generierten die typischen Aktivierungsprodukte Bb und
Ba. Plasmin erzeugte weitere Spaltprodukte. 110 nM Faktor B wurden in Gegenwart von 2 mM NiCl 2
und 0, 5, 25, 50 und 100 nM C3b mit 80 nM (A) Kallikrein beziehungsweise (B) Plasmin für 1h bei
37°C inkubiert. Bei der Positivkontrolle wurden 80 nM Faktor D eingesetzt. (C) Schematische
Darstellung von Faktor B und der Spaltprodukte Bb und Ba mit Molekulargewichten.
3.4.2 Bb-Generierung durch Kallikrein und Plasmin
Um zu untersuchen, ob Kallikrein und Plasmin proteolytisch aktives Bb generieren können,
wurde an immobilisiertes C3b Faktor B gebunden und mit Kallikrein beziehungsweise
Plasmin inkubiert. Entstandenes Bb wurde mittels Faktor B Antikörper im ELISA detektiert.
50

ERGEBNISSE
Dieser Antikörper bindet das Spaltprodukt Bb mit einer höheren Affinität als das intakte
Faktor B-Protein. Während mit zunehmender Menge von Kallikrein ein Anstieg der Bb-
Menge verzeichnet wurde, konnte mit Plasmin kein Bb generiert werden (Abb. 17A).
Ob das kallikreingenerierte Bb über proteolytische Aktivität verfügt und das Substrat C3 zu
C3b umsetzen kann, wurde mittels Konvertase- CEWA II untersucht. Dafür wurde Faktor B
mit immobilisiertem C3b inkubiert, um die Pro-Konvertase zu bilden. Danach erfolgte die
Inkubation mit Kallikrein und Plasmin, um Bb zu generieren. Abschließend wurde der
generierten C3-Konvertase das Substrat C3 hinzugefügt. Die Umsetzung von C3 zu C3b
wurde mittels Westernblot detektiert (Abb. 17B).
Nach der Inkubation mit Kallikrein, konnte im Überstand die für C3b charakteristische Bande
in Höhe von 114 kDa detektiert werden (Spur 4, Pfeil in orange). Folglich verfügte das
kallikreingenerierte Bb über C3-Spaltungsaktivität. Plasmin konnte kein aktives Bb bilden,
weshalb C3 nicht gespalten wurde und folglich keine α´-Kette nachgewiesen werden konnte
(Spur 5). Die C3-Konvertase des alternativen Weges, welche mit Faktor D generiert wurde,
konnte C3 zu C3b spalten (Spur 3, Pfeil in orange). Die Inkubation mit Kallikrein und Plasmin
allein zeigte, dass sich keine Enzyme auf die Reaktionsoberfläche gesetzt und die C3-
Umsetzung beeinflusst haben (Spuren 6 - 8).
51

ERGEBNISSE
A
B
Abb. 17: Bb-Generierung durch Kallikrein und Plasmin
Kallikrein generierte proteolytisch aktives Bb. Plasmin erzeugte kein Bb. (A) Mittels des
Konvertaseabbau-ELISAs I wurde die Generierung von Bb durch Kallikrein und Plasmin gemessen.
Dafür wurden ansteigende Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin sowie Faktor B und
Properdin mit immobilisiertem C3b inkubiert. Generiertes Bb wurde mittels Ziege-anti-Faktor B-
Antikörper nachgewiesen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte mit Standardaweichungen einer
Dreifachbestimmung (* p < 0,05; ** p < 0,01, ***p < 0,001). (B) Die Aktivität des generierten Bbs wurde
mittels Konvertase-CEWA II überprüft. Hierfür wurden Faktor B und Properdin mit immobilisiertem C3b
inkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit Kallikrein oder Plasmin beziehungsweise Faktor D.
Abschließend wurde das Substrat C3 hinzugefügt. Die C3b-Generierung wurde mittels Westernblot
nachgewiesen (Ziege-anti-C3-Antikörper). Dargestellt ist ein repräsentativer Blot aus drei
unabhängigen Versuchen.
3.5 Aufbau einer C3-Konvertase aus C3 und Faktor B durch
Kallikrein
Um eine aktive C3-Konvertase des alternativen Weges zu generieren, sind zwei
proteolytische Schritte notwendig: (I) die Generierung von C3b aus C3 vermittelt durch eine
52

ERGEBNISSE
C3-Konvertase und (II) die Bildung von Bb aus Faktor B durch Faktor D [134]. Da Kallikrein
sowohl C3b als auch Bb generiert, sollte im Folgenden untersucht werden, ob Kallikrein
allein eine aktive C3-Konvertase bilden kann. Dafür wurde Kallikrein mit C3 und Faktor B
inkubiert und die C3-Spaltung mittels SDS-PAGE und Westernblot analysiert. Kallikrein
generierte aus C3 und Fakor B eine aktive C3-Konvertase (Abb. 18A). Wurde Kallikrein mit
C3 inkubiert, konnte die α´-Kette (114 kDa), damit eine C3b-Bildung nachgewiesen werden
(Spur 1, Pfeil in orange). In Gegengwart von Faktor B wurde diese C3b-Freisetzung, durch
Bildung einer kallikreingenerierten C3-Konvertase (C3bBb) verstärkt. (Spur 2).
Ungespaltener Faktor B konnte C3 nicht prozessieren (Spur 4). In einem weiteren Versuch
wurde die kallikreinvermittelte C3a-Generierung analysiert (Abb. 18B). Auch hier verstärkte
Faktor B die C3-Spaltung (Spur 2). Zur Kontrolle wurde die C3-Konvertase durch Inkubation
von C3b und Faktor B mit Faktor D generiert (Spur 4).
A
B
Abb. 18: Aufbau der C3-Konvertase aus C3 und Faktor B durch Kallikrein
Kallikrein generierte aus C3 und Faktor B eine aktive C3-Konvertase. In einem C3-Verdau wurden
80 nM C3 mit 25 nM Kallikrein und 2 mM NiCl 2 mit und ohne 200 nM Faktor B für 1h bei 37°C
inkubiert. (A) Die C3b-Generierung wurde mittels Westernblot nachgewiesen (Ziege-anti-C3-
Antikörper). (B) Der Nachweis der C3a-Freisetzung erfolgte unter nicht reduzierenden Bedingungen
mittels Westernblot (Kaninchen-anti-C3a-Antikörper). Als Positivkontrolle wurde C3 über die C3-
Konvertase umgesetzt. Dafür wurden neben Faktor B auch 50 nM C3b und 40 nM Faktor D mit C3
inkubiert.
53

ERGEBNISSE
3.6 Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die aktive C3-
Konvertase
Nachdem gezeigt wurde, dass Kallikrein und Plasmin C3 und Faktor B spalten können,
wurde untersucht, ob beide Enzyme eine bereits aktive C3-Konvertase beeinflussen. Hierfür
wurde, in einem Konvertaseabbau-ELISA III, in einer Mikrotiterplatte die C3-Konvertase des
alternativen Weges aufgebaut. Anschließend erfolgte die Inkubation mit Kallikrein und
Plasmin. Nach Entfernung der Enzyme wurde die Menge der verbleibenden C3-Konvertase
durch Detektion von Bb im ELISA ermittelt (Abb. 19).
In Anwesenheit von Kallikrein konnte der Zerfall der C3-Konvertase nicht beschleunigt
werden. Die Zugabe von Kallikrein beeinflusste die Bb-Bindung an C3b nicht. Im Gegensatz
dazu führte Plasmin zum Abbau der C3-Konvertase. Mit Plasmin konnte eine
dosisabhängige Abnahme des Bb-Signals verzeichnet werden.
Abb. 19: Beschleunigung des Zerfalls der C3-Konvertase vermittelt durch Kallikrein und
Plasmin
Kallikrein beeinflusste die C3-Konvertase nicht. Plasmin führte zum beschleunigten Zerfall der C3-
Konvertase. Es wurde ein Konvertaseabbau-ELISA III durchgeführt. Der Nachweis der C3-Konvertase
erfolgte mittels Ziege-anti-Faktor B-Antikörper. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte und
Standardabweichungen einer Dreifachbestimmung (* p < 0,05; ** p < 0,01).
54

ERGEBNISSE
3.7 Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die
Komplementaktivität von humanem Plasma
3.7.1 C3-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin im Plasma
Um zu untersuchen, ob die Spaltung von C3 durch Kallikrein und Plasmin auch in Gegenwart
aller Plasmakomponenten stattfinden kann, wurde gesundes humanes Plasma mit Kallikrein
beziehungsweise Plasmin inkubiert und die C3-Spaltprodukte mittels Westernblot detektiert.
Zunächst wurde der Versuch in Gegenwart von 10 mM EGTA durchgeführt, um zu
überprüfen, ob Kallikrein beziehungsweise Plasmin den alternativen
Komplementaktivierungsweg induzieren können. Das EGTA bindet die Kalzium-Ionen des
Plasmas und hemmt selektiv die Aktivierung des klassischen und des Lektin-
Komplementweges, während der alternative Komplementweg stattfinden kann.
Wurde EGTA-Plasma mit Kallikrein inkubiert, konnte die Generierung von C3b (Abb. 20A)
und C3a (Abb. 20 B, Spur 2) nachgewiesen werden. Daraus folgt, dass Kallikrein als
Aktivator des alternativen Komplementweges fungieren kann. In plasminbehandeltem EGTA-
Plasma konnten neben C3b und C3a weitere Spaltprodukte mit den Mobilitäten von 100 und
68 kDa detektiert werden (Spur 3). Durch Inkubation von EGTA-Plasma mit Properdin, dem
bekannten Komplementaktivator des alternativen Weges, wurden die Aktivierungsprodukte
C3b und C3a generiert (Spur 4).
Um zu untersuchen, ob Kallikrein beziehungsweise Plasmin Plasma-C3 auch ohne aktives
Komplementsystem spalten können, wurde der Versuch in Gegenwart von 10 mM EDTA
wiederholt. Das EDTA bindet sowohl Kalzium- als auch Magnesiumionen. Alle drei
Komplementaktivierungswege werden dabei inhibiert.
Auch unter diesen Bedingungen konnte Kallikrein Plasma-C3 spalten. Sowohl eine C3b-
Bande, als auch eine C3a-Bande konnten im Westernblot nachgewiesen werden (Spur 6).
Auch Plasmin spaltete C3 im EDTA-Plasma unter Freisetzung von C3b und C3a (Spur 7).
Allerdings wurden hier weitere C3-Spaltprodukte in Höhe von ca. 100 und 68 kDa detektiert.
Die Inkubation des Plasmas mit Properdin führte zu keiner Komplementaktivierung. Weder
C3b noch C3a konnten detektiert werden (Spur 8).
55

ERGEBNISSE
A
B
Abb. 20: C3-Spaltung von Kallikrein und Plasmin in humanem Plasma
Kallikrein und Plasmin spalteten sowohl in EGTA- als auch in EDTA-Plasma C3 zu C3b und C3a.
Plasmin degradierte C3b weiter. Ein Prozent NHP wurde mit 200 nM Kallikrein, 200 nM Plasmin
beziehungsweise 350 nM Properdin 30 min bei 37°C inkubiert. Die C3-Spaltprodukte wurden mittels
SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Westernblot mit (A) Ziege-anti-C3-Antikörper und mit (B)
Kaninchen-anti-C3a-Antikörper (Proben nicht reduziert) detektiert. Die α´-Kette wurde mit einem Pfeil
in orange, zusätzliche C3-Spaltprodukte mit grauen Pfeilen markiert.
3.7.2 Faktor B-Spaltung durch Kallikrein und Plasmin in Plasma
Weiterhin wurde die kallikrein- und plasminvermittelte Prozessierung von Faktor B im Plasma
untersucht. Dafür wurde gesundes humanes Plasma mit Kallikrein beziehungsweise Plasmin
inkubiert und die Faktor B-Spaltprodukte im Westernblot nachgewiesen (Abb. 21C).
Unter Bedingungen bei denen das Komplementsystem durch Anwesenheit von 10 mM EDTA
komplett gehemmt wurde, spaltete Kallikrein Faktor B in die typischen Aktivierungsprodukte
Bb und Ba mit den Molekulargewichten 60 und 30 kDa (Spur 3). Wurde Plasma mit Plasmin
in Gegenwart von EDTA inkubiert, entstanden ebenfalls die Faktor B typischen Banden mit
den Molekulargewichten 60 und 30 kDa. Weiterhin wurde durch Plasmin eine zusätzliche
Bande mit der Mobilität von 48 kDa generiert (Spur 4, grauer Pfeil).
56

ERGEBNISSE
Abb. 21: Faktor B-Spaltung von Kallikrein und Plasmin in humanem Plasma
Kallikrein und Plasmin spalteten Plasma-Faktor B unter Freisetzung von Bb und Ba. Plasmin
generierte ein zusätzliches Spaltprodukt mit der Mobilität von 48 kDa. 2,5% Plasma mit EGTA wurden
mit 300 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin und 100 nM Properdin für 1h bei 37°C inkubiert. Die
Faktor B-Spaltprodukte wurden per SDS-PAGE in einem 10%-Gel aufgetrennt und mittels Ziege-anti-
Faktor B-Antikörper im Westernblot detektiert. Die durch Plasmin generierte zusätzliche Faktor B-
Bande wurde mit einem grauen Pfeil markiert.
3.7.3 Komplementaktivierung durch Kallikrein und Plasmin
Nachdem der Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die Komplementkomponenten C3,
C3b, Faktor B sowie die komplette C3-Konvertase im Detail analysiert wurde, sollte
abschließend die Wirkung beider Enzyme auf die Komplementaktivität von Plasma
untersucht werden. Dafür wurden in einem Hämolyseversuch Kaninchenerythrozyten mit
humanem Plasma aktiviert. Unter diesen Bedingungnen wurde das Komplementsystem
aktiviert und die Lyse der Kaninchenerythrozyten induziert. Die Stärke der Hämolyse der
Kaninchenerythrozyten war direkt proportional zur Komplementaktivität des Plasmas und
wurde photometrisch bei 414 nm quantifiziert.
Wurden Kaninchenerythrozyten mit EGTA-Plasma und ansteigenden Mengen von Kallikrein
inkubiert, konnte ein signifikanter Anstieg der Hämolyse verzeichnet werden (Abb. 22).
Folglich wirkte Kallikrein als Aktivator beziehungsweise Verstärker des alternativen
Komplementaktivierungsweges. Im Gegensatz dazu wurde der Grad der Hämolyse mit
ansteigender Menge Plasmin signifikant reduziert. Demnach wurde durch die Wirkung von
Plasmin die Aktivität des alternativen Komplementweges gehemmt.
57

ERGEBNISSE
Abb. 22: Einfluss von Kallikrein und Plasmin auf die Komplementaktivität von Plasma
Kallikrein verstärkte die Komplementaktivität von Plasma. Plasmin wirkte als Komplementinhibitor. In
einem Hämolyseversuch wurden 10% Plasma mit 5x10 6 Kaninchenerythrozyten und ansteigenden
von Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin inkubiert. Die Stärke der
komplementvermittelten Hämolyse der Erythrozyten wurde durch photometrische Analyse der
Probenüberstände bei 414 nm ermittelt. Die Absorptionswerte wurden in Prozent angegeben, wobei
der Hämolysewert ohne Enzymzugabe (Kontrolle) gleich 100% gesetzt wurde. Dargestellt wurden die
Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen (* p < 0,05).
3.8 Regulation der kallikreinvermittelten Komplementaktivierung
durch Faktor H
Da Kallikrein in der Lage ist, aus C3 und Faktor B eine aktive C3-Konvertase zu bilden, sollte
weiterhin untersucht werden wie diese C3-Konvertase reguliert wird. Generiertes C3b kann
nicht zwischen Selbst- und Fremdoberflächen unterscheiden. Damit sich die
Komplementabwehr nicht gegen gesunde Körperzellen richtet, sorgen membrangebundene
und lösliche Komplementregulatoren für die Inhibierung von Komplementattacken auf
intakten Selbstoberflächen. Die Generierung der C3-Konvertase des alternativen Weges wird
maßgeblich durch den löslichen Komplementregulator Faktor H kontrolliert. Einerseits
ermöglicht Faktor H durch die Bindung an C3b die Faktor I-vermittelte Spaltung von C3b zu
iC3b (Kofaktorfunktion). Andererseits beschleunigt Faktor H den Zerfall der C3-Konvertase
durch Verdrängung von Faktor B (decay accelerating activity). Nachfolgend wurde
untersucht, ob auch die kallikreingenerierte C3-Konvertase durch Faktor H gehemmt werden
kann. Dafür wurde zunächst die Interaktion von kallikreingeneriertem C3b mit Faktor H
getestet.
58

ERGEBNISSE
3.8.1 Bindung von Faktor H an kallikreingeneriertes C3b
Wenn Faktor H C3b bindet, ist die C3b-Konformation so verändert, dass die Serinprotease
Faktor I C3b spalten kann. Das auf diese Weise entstandene iC3b steht für die Bildung
weiterer C3-Konvertasen nicht mehr zur Verfügung.
Es wurde untersucht, ob Faktor H als Kofaktor für die Faktor I-vermittelte Spaltung von
kallikreingeneriertem C3b fungiert. Da die Bindung von Faktor H an C3b die Voraussetzung
für die Faktor I-vermittelte C3b-Inaktivierung ist, wurde zunächst getestet, ob Faktor H an
das kallikreingebildete C3b bindet. Hierfür wurde immobilisierter Faktor H mit
kallikreinbehandeltem C3 inkubiert und die Bindung des generierten C3b an Faktor H mit
HRP-gekoppeltem anti-C3c-Antikörper im ELISA nachgewiesen (Abb. 23C, anti-C3c-ELISA).
Zum Vergleich wurde auch die Faktor H-C3b-Interaktion nach Behandlung von C3 mit
Plasmin mitgeführt
Für diesen Versuch wurde aufgereinigtes C3 verwendet. Es handelte sich hierbei um ein
Gemisch aus C3 und C3(H 2 O). Das C3(H 2 O) entstand durch Einfrieren und Auftauen, da das
Protein bei -20°C gelagert wurde. Dieses C3-Derivat war vom Reaktionsverhalten her mit
C3b vergleichbar und interagierte auch mit Faktor H. Deshalb war eine hohe
Hintergrundbindung messbar. In einem zweiten ELISA (Abb. 23C, anti-C3a-ELISA) gleichen
Aufbaus wurde durch die Detektion dieser C3(H 2 O)-Hintergrundbindung an Faktor H mittels
anti-C3a-Antikörper die C3-Umsetzung zu C3b und C3a durch Kallikrein beziehungsweise
Plasmin indirekt nachgewiesen.
Kallikreingeneriertes C3b interagierte mit Faktor H (Abb. 23A, durchgezogene Linie). Für die
Darstellung der C3b-Interaktion mit Faktor H wurde die C3(H 2 O)-Hintergrundbindung gleich
100% gesetzt. Das C3b-Signal stieg mit zunehmender Menge von Kallikrein und erreichte
einen Wert von 175%. Parallel dazu sank das C3a-Signal unter 10% der Hintergrundbindung
ab (gestrichelte Linie). Folglich wurde C3 durch Kallikrein in C3a und C3b gespalten. Wurde
plasminbehandeltes C3 auf immobilisierten Faktor H gegeben, erfolgte eine Reduktion der
Hintergrundbindung (Abb. 23B, durchgezogene Linie). Plasmin degradierte sowohl C3 als
auch C3(H2O), ohne stabiles C3b zu generieren, das mit Faktor H interagieren konnte. Die
Aktivität von Plasmin konnte durch die Abnahme des C3a-Signals bestätigt werden
(gestrichelte Linie).
59

ERGEBNISSE
A
B
C
Abb. 23: Interaktion von C3b generiert durch Kallikrein mit Faktor H
Kallikreingeneriertes C3b interagierte mit Faktor H. (A) Kallikrein beziehungsweise (B) Plasmin (0, 10,
25 und 50 nM) wurden mit 50 nM C3/C3(H 2 O) vorinkubiert und mit 50 nM immobilisiertem Faktor H
inkubiert. Die Detektion von gebundenem Protein erfolgte mittels anti-C3c-HRP Antikörper
beziehungsweise Kaninchen-anti-C3a-Antikörper. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte der
Absorption in Prozent aus drei unabhängigen Versuchen. Dabei wurde die C3(H 2 O)–
Hintergrundbindung (ohne C3-spaltendenem Enzym) gleich 100% gesetzt (** p < 0,01, *** p

ERGEBNISSE
3.8.2 Inaktivierung von kallikreingeneriertem C3b durch Faktor H und Faktor I
Ob das kallikreingenerierte C3b durch Faktor I und Faktor H gespalten werden kann, wurde
im Folgenden untersucht. Dafür wurde kallikreingeneriertes C3b mit Faktor H und Faktor I
inkubiert. Die Generierung von iC3b wurde mittels SDS-Page und Westernblot unter
Verwendung von Ziege-anti-C3-Antikörper nachgewiesen. Dieser Antikörper erkannte ein für
iC3b charakteristisches Fragment mit einem Molekulargewicht von 68 kDa.
Kallikreingeneriertes C3b wurde durch Faktor I in Gegenwart von Faktor H inaktiviert,
ersichtlich durch den Nachweis der C3b-Spaltprodukte mit den Mobilitäten von 68, 46 und 43
kDa (Abb. 24A, Spur 4). Diese charakteristischen Reaktionsprodukte entstehen bei der
Spaltung der α´-Kette durch Faktor I in Anwesenheit von Faktor H (Abb. 24B) und beweisen,
dass iC3b generiert wurde. In einem Kontrollansatz wurde C3b mittels C3-Konvertase des
alternativen Weges gebildet und durch Faktor H und Faktor I inaktiviert (Abb. 24A, Spur 8).
Die iC3b-typischen 68, 46, und 43 kDa-Banden konnte auch hier nachgewiesen werden. Die
Bildung von C3b durch Kallikrein beziehungsweise der C3-Konvertase des alternativen
Weges aus C3 wurde durch die α´-Kette in Höhe von 114 kDa nachgewiesen (Spuren 2+6).
Faktor I, ohne Kofaktor, konnte das generierte C3b nicht abbauen (Spuren 3 und 7)
A
B
Abb. 24: Kofaktoraktivität von Faktor H bei der Faktor I-vermittelten Inaktivierung von
kallikreingeneriertem C3b
C3b generiert durch Kallikrein wurde durch Faktor I in Anwesenheit von Faktor H inaktiviert. (A) Mittels
Kofaktorversuch I wurden zunächst durch Inkuabtion von C3 mit Kallikrein beziehungsweise der C3-
Konvertase des alternativen Weges C3b generiert. Anschließend wurden Faktor H und Faktor I
61

ERGEBNISSE
appliziert und die C3b-Spaltprodukte mittels Westernblot mit Ziege-anti-C3-Antikörper detektiert. (B)
Ablauf der C3-Prozessierung in diesem Versuch. Die C3-Spaltprodukte wurden mit
Molekulargewichten in kDa dargestellt.
3.8.3 Beschleunigung des Zerfalls der kallikreingenerierten C3-Konvertase
durch Faktor H
Neben der Kofaktoraktivität für die C3b-Spaltung inhibiert Faktor H die Komplementreaktion
auf Selbstoberflächen durch die Beschleunigung des Zerfalls der C3-Konvertase. Diese
Faktor H-Funktion sollte für die kallikreingenerierte C3-Konvertase mittels des
Konvertaseabbau-ELISAs II nachgewiesen werden. Immobilisiertes C3b wurde zum Aufbau
einer C3-Konvertase mit Faktor B und Kallikrein, Plasmin oder Faktor D inkubiert.
Anschließend wurde Faktor H hinzugefügt und der Zerfall der C3-Konvertasen durch
Abnahme des Bb-Signals mittels anti-Faktor B-Antikörpers verfolgt. Faktor H beschleunigte
den Zerfall der kallikreingenerierten C3-Konvertase (Abb. 25A, Linie in orange). Dieser Effekt
war dosisabhängig und vergleichbar mit dem Einfluß von Faktor H auf die C3-Konvertase
des alternativen Weges (generiert durch Faktor D, durchgezogene schwarze Linie). Die
Inkubation von Plasmin mit C3b und Faktor B erzeugte keine intakte C3-Konvertase
(gestrichelte Linie), da das Bb-Signal fast auf Hintergrundniveau blieb.
Abb. 25: Beschleunigung des Zerfalls der kallikreingenerierten C3-Konvertase
Faktor H beschleunigte den Zerfall der kallikreingenerierten C3-Konvertase. Mittels des
Konvertaseabbau-ELISAs II wurde der Zerfall der kallikreingenerierten, plasmingenerierten und der
Faktor D-generierten C3-Konvertase in Gegenwart von Faktor H untersucht. Der Aufbau der C3-
Konvertasen erfolgte durch Inkubation von immobilisiertem C3b mit Faktor B, Properdin und 25 nM
Kallikrein, 25 nM Plasmin oder 1 nM Faktor D. Die Detektion erfolgte jeweils mit Ziege-anti-Faktor B-
Antikörper. Gezeigt wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen
Versuchen (** p < 0,01, *** p < 0,001).
62

ERGEBNISSE
3.9 Charakterisierung der komplementregulatorischen
Funktion von β2GPI
Neben den Plasmaproteasen Kallikrein und Plasmin, sollte weiterhin der Einfluss des
Gerinnungsregulators β2GPI auf das Komplementsystem untersucht werden. β2GPI besteht
aus fünf SCR-Domänen. Dieser Domänentyp ist typischerweise bei Komplementregulatoren,
wie z.B. Faktor H, vorzufinden [28]. Aufgrund dieser engen strukturellen Verwandtschaft
sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Rolle von β2GPI bei der Regulation des
alternativen Komplementaktivierungsweges analysiert werden.
3.9.1 Klonierung und Charakterisierung von ßGPI und ßGPI-Fragmenten
β2GPI kann zwei unterschiedliche Konformationen einnehmen. In Flüssigphase weist das
Protein eine zirkuläre Konformation auf. Hier interagieren Domäne I und Domäne V
miteinander. Aufgrund der kompakten Konformation ist das ringförmige β2GPI biologisch nur
schwach aktiv. Bindet β2GPI allerdings an anionische Oberflächen, öffnet sich die Bindung
zwischen Domäne I und V, wobei β2GPI dann eine Kettenstruktur einnimmt [77].
Für nachfolgende Versuche wurden sowohl das Volllängenprotein β2GPI I-V als auch die N-
terminal deletierte Proteinmutante β2GPI IV-V und das C-terminal deletierte Fragment β2GPI
I-IV rekombinant im Pichia pastoris-Expressionsystem hergestellt (Abb. 26D). Die
aufgereinigten Proteine wurden mittels Silbergel detektiert (Abb. 26A). Die Mobilität des
Gesamtmoleküls β2GPI I-V stimmte mit dem kalkulierten Molekulargewicht von ca. 50 kDa
überein. Bei dem Proteinfragment β2GPI IV-V wurden zwei Banden in Höhe von 22 und 15
kDa detektiert. Möglicherweise handelte es sich hierbei um zwei Glykosylierungsvarianten.
Berechnet wurde für β2GPI IV-V ein Molekulargewicht von ca. 20 kDa. Die Mobilität des N-
terminalen Fragments β2GPI I-IV lag bei 60 kDa, berechnet wurde jedoch eine Mobilität von
43 kDa. Um zu klären, ob diese Abweichung auf eine verstärkte Glykolysierung
zurückzuführen ist, wurde β2GPI I-IV zur Deglykosylierung mit der N-Glykosidase PNGase F
behandelt und das deglykolisierte Protein mittels SDS-Page und Westernblot analysiert
(Abb. 26B). Nach der Deglykosylierung zeigte das Proteinfragment β2GPI I-IV eine Mobilität
von 40 kDa und stimmte damit mit dem berechneten Molekulargewicht von 43 kDa überein.
Die Kalkulierung der Molekulargewichte der β2GPI-Proteinfragmente erfolgte mit der Formel:
50 kDa x n
5
63

ERGEBNISSE
Die Variable n gibt die Anzahl der Domänen im Fragment an. Es handelte sich dabei nur um
Schätzwerte, da nicht berücksichtigt wurde, dass die einzelnen β2GPI-Domänen einen
unterschiedlichen Glykosylsierungsgrad aufweisen. Domänen III und IV sind stark
glykosylsiert. Die anderen Domänen tragen keine derartigen posttranslationalen
Modifikationen [82].
Zur Charakterisierung der rekombinanten β2GPI-Proteine wurde ihre Interaktion mit dem
anionischen Phospholipid Cardiolipin in einem Cardiolipin-CEWA getestet. Sowohl das
Volllängenprotein β2GPI I-V als auch die N-terminal deletierte Proteinmutante β2GPI IV-V
banden an Cardiolipin (Abb. 26C, Spur 1 und 2). Folglich besaßen beide Proteine eine
intakte anionische Phospholipid-bindende Domäne V. Das Proteinfragment β2GPI I-IV zeigte
keine Interaktion mit Cardiolipin, da es über keine Domäne V verfügt (Spur 3).
A
B
C
D
Abb. 26: Charakterisierung der rekombinanten β2GPI-Proteine
β2GPI I-V sowie die Fragmente β2GPI IV-V und I-IV wurden mittels Pichia-Expressionssystem
kloniert. (A) Darstellung der rekombinant hergestellten β2GPI-Proteine im Silbergel. (B) Westernblot
64

ERGEBNISSE
mit β2GPI I-IV vor (Spur 1) und nach Deglykosylierung (Spur 2) mittels PNGase (Kaninchen-antiβ2GPI-Antikörper).
(C) In einem CEWA wurde immobilisiertes Cardiolipin mit den rekombinant
hergestellten Proteinen β2GPI I-V, β2GPI IV-V und β2GPI I-IV inkubiert. Nachdem freie Proteine
weggewaschen wurden, erfolgte die Eluierung und Detektion der gebundenen β2GPI-Proteine mittels
Westernblot (Kaninchen-anti-His-HRP-Antikörper). (D) Domänenübersicht und Konformation der
rekombinant hergestellten β2GPI-Proteine.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob β2GPI komplemementregulatorische
Funktionen aufweist. Unter Verwendung der rekombinant hergestellten Proteine β2GPI I-V
(ringförmig) und β2GPI I-IV (kettenförmig) wurde weiterhin die konformationsabhängige
Funktion von β2GPI im Komplementsystem analysiert.
3.9.2 Regulation der Komplementantwort durch β2GPI
Der Effekt von β2GPI auf die Komplementaktivierung wurde zunächst mittels
Zymosanversuch getestet. Dieser Versuch diente der Identifizierung von regulatorischen
Proteinen der alternativen Komplementreaktion durch Analyse der freigesetzten C3a-Menge.
Während das Volllängenprotein β2GPI I-V sowie die N-terminal deletierte Proteinmutante
β2GPI IV-V keinen Einfluss auf den alternativen Komplementaktivierungsweg hatten (Abb.
27, Spuren 1 und 2), reduzierte das Proteinfragment β2GPI I-IV die C3a-Menge und
inhibierte somit die Komplementantwort (Spur 3). Durch Applikation des alternativen
Komplementregulators Faktor H konnte die Intensität der C3a-Bande ebenfalls reduziert
werden (Positivkontrolle, Spur 4). Folglich wurde auch hier der alternative Komplementweg
inhibiert.
Abb. 27: Komplementregulation durch β2GPI und Fragmente im Zymosanversuch
65

ERGEBNISSE
Das Fragment β2GPI I-IV hemmte den alternativen Komplementweg. Mittels Zymosanversuch wurde
humanes Plasma mit Zymosan und β2GPI I-V beziehungsweise den Proteinfragmenten β2GPI IV-V
und β2GPI I-IV sowie dem Komplementregulator Faktor H inkubiert und mittels SDS-PAGE und
Westernblot auf die Generierung von C3a untersucht (Kaninchen-anti-C3a-Antikörper).
3.9.3 Interaktion von β2GPI I-IV mit C3b
Das Spaltprodukt C3b spielt sowohl als Teil der C3-Konvertase eine zentrale Rolle bei der
Komplementaktivierung als auch bei der Markierung von Fremdoberflächen. Um zu
überprüfen, ob β2GPI Einfluss auf die Funktion von C3b hat, wurde zunächst mittels ELISA
die Interaktion von β2GPI mit C3b untersucht. Das C-terminal deletierte Fragment β2GPI I-IV
interagierte dosisabhängig mit C3b (Abb. 28). Die Absorptionskurve stieg mit zunehmender
Menge von β2GPI I-IV. Das ringförmig geschlossene Protein β2GPI I-V sowie die N-terminal
deletierte Proteinmutante β2GPI VI-V zeigten keine Interaktion mit C3b.
Abb. 28: Interaktion von β2GPI mit C3b
β2GPI I-IV band dosisabhängig C3b. In einem ELISA wurde immobilisiertes C3b mit β2GPI I-V, β2GPI
I-IV und β2GPI IV-V inkubiert und Interaktionen mittels Kaninchen-anti-β2GPI-Antikörper detektiert.
Dargestellt wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängig durchgeführten
Versuchen (* p < 0,05).
3.9.4 Einfluss von β2GPI I-IV bei der Faktor I-vermittelten C3b-Spaltung
Die Generierung von C3b ist streng reguliert, damit eine Überaktivierung der
Komplementreaktion verhindert wird. Auf gesunden körpereigenen Zellen kann C3b
vermittelt durch Faktor I in Gegenwart von Faktor H zu iC3b gespalten werden (Abb. 29B)
und steht nicht mehr für die Generierung weiterer C3-Konvertasen zur Verfügung. Da β2GPI
I-IV C3b bindet, wurde überprüft, ob diese Interaktion die C3b-Inaktivierung durch Faktor I
und Faktor H beeinflusst. C3b, Faktor I und Faktor H wurden mit ansteigenden Mengen von
β2GPI I-IV inkubiert und die C3b-Spaltprodukte per Westernblot analysiert (Abb. 29A).
β2GPI I-IV verstärkte die Kofaktoraktivität von Faktor H bei der Faktor I-vermittelten C3b-
66

ERGEBNISSE
Inaktivierung. In Gegenwart von Faktor H und Faktor I wurde C3b zu iC3b inaktiviert. Hier
konnten die iC3b typischen Banden in Höhe von 68, 46 und 43 kDa detektiert werden (Spur
2, graue Pfeile). Mit zunehmender β2GPI I-IV-Konzentration konnte die Intensität dieser
markanten Banden verstärkt werden (Spuren 3 - 5, graue Pfeile).
A
B
Abb. 29: Verstärkung der Kofaktoraktivität von Faktor H durch β2GPI I-IV
β2GPI I-IV verstärkte die Kofaktoraktivität von Faktor H bei der Faktor I vermittelten Inaktivierung von
C3b. (A) Mittels Kofaktorversuch II wurde C3b mit Faktor H und Faktor I sowie ansteigenden Mengen
von β2GPI I-IV inkubiert. Die C3b-Spaltprodukte wurden per SDS-PAGE aufgetrennt und per
Westernblot mit Ziege-anti-C3-Antikörper detektiert. Die iC3b-typischen C3-Spaltprodukte wurden mit
grauen Pfeilen markiert. (B) Übersicht der C3b-Spaltprodukte mit Molekulargewichten generiert durch
Faktor I in Anwesenheit von Faktor H.
3.9.5 Hemmung des terminalen Komplementkomplexes (TCC) durch β2GPI I-IV
Neben der Opsonisierung von Fremdoberflächen erfüllt das Komplementsystem weitere
immunregulatorische Funktionen. Durch Generierung eines terminalen
Komplementkomplexes bestehend aus den aktivierten Komplementkomponenten C5, C6,
C7, C8 und C9, werden Zellmembranen von Gram-negativen Bakterien, wie zum Beispiel
von Escherichia coli lysiert [135]. Deshalb wurde der Einfluss der rekombinanten β2GPI-
Proteine auf die Generierung dieses lytischen Komplementkomplexes auf Schaferythrozyten
untersucht. Integrierte sich der Membranangriffskomplex in die Erythrozytenmembran, kam
es zur Lyse der Erythrozyten und damit zur Freisetzung von Hämoglobin in den Überstand.
β2GPI I-IV reduzierte die Hämolyse (Abb. 30A). Das Volllängenprotein β2GPI I-V sowie das
Fragment β2GPI IV-V zeigten keine signifikante Wirkung auf den terminalen
67

ERGEBNISSE
Membranangriffskomplex. Der bekannte terminale Komplementregulator Vitronektin konnte
die Hämolyse reduzieren. Als Negativkontrolle wurde Faktor H mitgeführt. Hier konnte keine
signifikante Reduktion der Hämolyse verzeichnet werden.
Die Aktivität von β2GPI I-V wurde weiter charakterisiert (Abb. 30B). β2GPI I-IV reduzierte die
Stärke der Hämolyse dosisabhängig. 500 nM β2GPI I-IV konnten die Aktivität des terminalen
Komplementkomplexes fast vollständig hemmen. Das Volllängenprotein β2GPI I-V hatte
keinen Einfluss auf die Stärke der Hämolyse.
A
B
Abb. 30: Inhibierung des TCCs- durch β2GPI I-IV
Rekombinantes β2GPI I-IV fungierte als terminaler Komplementinhibitor. In einem TCC-
Inhibierungsversuch wurde der Einfluss von β2GPI I-V sowie der Fragmente β2GPI I-IV und β2GPI IV-
V auf die Bildung des terminalen Komplementkomplexes untersucht. (A) Einfluss der rekombinanten
68

ERGEBNISSE
Proteine β2GPI I-V, β2GPI I-IV und β2GPI IV-V auf die Generierung des TCCs, dargestellt in einem
Balkendiagramm. Als Positivkontrolle wurde Vitronektin eingesetzt. Faktor H diente als
Negativkontrolle. (B) Dosisabhängige Inhibierung des TCCs mittels β2GPI I-IV und β2GPI I-V. Die
Hämolyse wurde in Prozent angegeben, wobei die Hämolyse der Schaferythrozyten ohne Zugabe
eines Regulatorproteins auf 100% gesetzt wurde. Es wurden die Mittelwerte und
Standardabweichungen aus jeweils drei unabhängigen Versuchen dargestellt (*** p < 0,001).
3.9.6 Aktivierung der komplementregulatorischen Funktion von β2GPI
Die vorangegangenen Versuche zeigten, dass nur das kettenförmig geöffnete β2GPI I-IV-
Proteinfragment über komplementregulatorische Aktivität verfügt. Die Transformation zur
Kettenform erlangt β2GPI laut Literatur durch Bindung an anionische Phospholipide [78]. Da
während eines Entzündungsprozesses polymorphkernige Neutrophilen (PMN) -Proteasen
sezernieren, welche β2GPI spalten [136], sollte im Folgenden untersucht werden, ob das
β2GPI-Fragment I-IV auch durch proteolytische Prozessierung gebildet werden kann.
Polymorphkernige Neutrophile sezernieren unter anderem Proteinase 3. Um zu untersuchen,
ob eine Prozessierung stattfindet, wurde β2GPI mit der Proteinase 3 inkubiert und die
β2GPI-Spaltprodukte mittels SDS-Page und Westernblot detektiert. Proteinase 3 spaltete
β2GPI in zwei prominente Fragmente mit den Molekulargewichten 43 und 12 kDa (Abb.
31A). Das 43 kDa Fragment besaß die gleiche Mobilität wie das rekombinant hergestellte
Proteinfragment β2GPI I-IV nach Deglykosylierung. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob
es sich bei dem 43 kDa-Fragment um die C-terminal deletierte β2GPI I-IV-Proteinmutante
handelte.
Die Proteinase 3 spaltete β2GPI entweder N- oder C-terminal (Abb. 31C). Eine N-terminale
Prozessierung generiert ein β2GPI-Fragment, das über die fünfte SCR-Domäne verfügt und
folglich an anionische Strukturen, wie Cardiolipin binden kann. Eine C-terminale Spaltung
setzt ein β2GPI-Fragment frei, das keine Domäne V besitzt, damit nicht an Cardiolipin binden
kann. Um zu klären, welche der beiden Prozessierungsvarianten stattgefunden hat, wurde
das gebildete β2GPI-Fragment auf seine Fähigkeit an Cardiolipin zu binden untersucht.
Dafür wurden Proteinase 3 und β2GPI vorinkubiert und immobilisiertem Cardiolipin appliziert.
Cardiolipin-gebundene Proteine wurden nach gründlichem Waschen mit Waschpuffer eluiert
Die Probenüberstände (Ü) und die Eluate (E) wurden mittels SDS-PAGE und Westernblot
analysiert.
Das durch Proteinase 3 generierte 43 kDa-Fragment von β2GPI interagierte nicht mit
Cardiolipin (Abb. 31B, Spur 4) und konnte nur im Überstand nachgewiesen werden (Spur 3).
Daraus folgt, dass bei der Proteinase 3-vermittelten Spaltung von β2GPI die fünfte Domäne
69

ERGEBNISSE
abgespalten wurde und dabei ein C-terminal deletiertes β2GPI-Fragment entstand. β2GPI,
das nicht von Proteinase 3 degradiert wurde, band an Cardiolipin (Spuren 2 + 4).
A
B
C
Abb. 31: Prozessierung von β2GPI durch Proteinase 3
(A) Proteinase 3 prozessierte β2GPI unter Freisetzung von zwei Spaltprodukten in Höhe von 43 und
12 kDa. Die Detektion des β2GPI-Verdaus erfolgt mittels SDS-PAGE und Westernblot (Kaninchenanti-β2GPI-Antikörper).
(B) Das Proteinase 3-generierte 43 kDa-β2GPI-Fragment bindet nicht an
Cardiopin, folglich ist es C-terminal deletiert. In einem modifizierten Cardiolipin-ELISA wurde β2GPI
mit Proteinase 3 vorinkubiert und auf immobilisiertes Cardiolipin appliziert. Gebundene Proteine
wurden eluiert und mittels Westernblot detektiert (Kaninchen-anti-β2GPI-Antikörper). (C) Modell der
70

ERGEBNISSE
möglichen Prozessierungsvarianten von β2GPI vermittelt durch Proteinase 3. Entweder es findet eine
C-terminale Spaltung statt, welche ein 43 kDa-β2GPI-Fragmen generiert, dass nicht mit Cardiolipin
interagiert oder die Spaltung ist N-terminal unter Freisetzung eines β2GPI-Spaltprodukt, dass an
Cardiolipin bindet. Ü=Überstand, E=Eluat
71

DISKUSSION
4 Diskussion
Enzymsysteme sorgen als Teil der angeborenen Immunantwort für eine schnelle und
regulierte Eliminierung von Mikroorganismen sowie für einen unmittelbaren Wundverschluss
bei Verletzungen. Dazu zählen: das Komplementsystem, das Kallikrein-Kinin-System und
das Gerinnungssystem einschließlich der Fibrinolyse. Jedes System erfüllt dabei seine
spezifische Funktion. Das Komplementsystem spielt eine tragende Rolle bei der Abwehr von
Krankheitserregern. Es opsonisiert Mikroorganismen für die Phagozytose, attackiert diese
mittels lytischen terminalen Komplementkomplexes (TCC) und generiert Anaphylatoxine um
Immunzellen anzulocken [7]. Das Kallikrein-Kinin-System wirkt vor allem auf Gefäßwände
und reduziert den Blutdruck am Ort der Entzündung, was das Ausbreiten von Pathogenen
minimiert und die Immunkomponenten am Inflammationsherd konzentriert. Weiterhin wird die
Wanderung von Makrophagen in infiziertes Gewebe erleichtert. Das Gerinnungssystem sorgt
bei Verletzungen für einen schnellen Wundverschluss, schützt damit vor Blutverlusten sowie
vor der Infektion mit pathogenen Erregern. Weiterhin können Mikroorganismen im
generierten Fibrinnetz immobilisiert werden. Die Fibrinolyse löst das Fibrinnetz wieder auf
und begrenzt damit die Gerinnselbildung auf den Ort der Verletzung. Die Fibrinolyse ist
aufgrund seiner regulatorischen Funktion ein wichtiger Gegenspieler der Gerinnung [98].
Für eine effiziente Immunreaktion ist es nötig, dass die Enzymsysteme miteinander
interagieren und koordiniert ablaufen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von
Komponenten des Kallikrein-Kinin-Systems und des Gerinnungssystems einschließlich der
Fibrinolyse auf die Aktivität des Komplementsystems untersucht. Dabei wurden die
Plasmaproteasen Kallikrein und Plasmin sowie β2GPI, ein Protein des Gerinnungssystems,
als wirksame Agitatoren im Komplementsystem nachgewiesen.
4.1 Proteasen des Kallikrein-Kinin-Systems, der Fibrinolyse
und des Gerinnungssystems wirken auf das
Komplementprotein C3.
Die Spaltung von C3 zu C3b und C3a durch die neu gebildete C3-Konvertase ist ein
zentraler Schritt der Komplementaktivierung [15]. Während einer Immunantwort werden
neben der C3-Konvertase weitere Proteasen, wie Kallikrein, Plasmin, Thrombin und die
Neutrophilenelastase generiert, welche ebenfalls auf C3 einwirken können und C3 unter
Bildung von C3a prozessieren [92, 131]. In dieser Arbeit wird aufgezeigt, dass von diesen
72

DISKUSSION
Enzymen nur Kallikrein und Thrombin komplementaktives C3b generieren. Sowohl Plasmin
als auch die Neutrophilenelastase degradieren gebildetes C3b in weitere Fragmente. Die
Bildung von C3b ist die Grundvoraussetzung für eine Komplementaktivierung. C3b lagert
sich auf Oberflächen ab und wenn nicht sofort inaktiviert, bildet es die C3-Konvertase des
alternativen Weges. Durch eine positive Rückkopplungsreaktion, welche auch als
Amplifikationsschleife bezeichnet wird, werden weitere C3 Moleküle gespalten. Das
generierte C3b führt zur Opsonisierung von pathogenen Mikroorganismen zu deren
Phagozytose und initiiert die Ausbildung von C5-Konvertasen. Eine Degradierung von C3b
bedeutet, dass weder der alternative Komplementaktivierungsweg mit der integrierten
Amplifikationsschleife noch der terminale Komplementweg stattfinden können.
Aufgrund des beobachteten unterschiedlichen Spaltverhaltens der Proteasen hinsichtlich
C3b, können die C3-spaltenden Proteasen in zwei Kategorien eingeteilt werden. Proteasen,
die, wie Kallikrein und Thrombin, C3 spalten und dabei aktives C3b freisetzen, welches nicht
weiter degradiert wird, repräsentieren C3b-Generierer. Diese Proteasen können demnach
das Komplementsystem aktivieren und eine Komplementantwort verstärken. Im Gegensatz
dazu zählen Proteasen wie Plasmin und Neutrophilenelastase zur Kategorie der C3b-
Degradierer. Diese Proteasen spalten generiertes C3b in weitere Fragmente und haben
folglich eine komplementhemmende Wirkung (Abb. 32). Obwohl Plasmin und Elastase
zunächst, durch die Abspaltung des C3a Fragmentes eine Aktivierung des C3 Moleküls
induzieren, wie bei Lachmann et al., Amara et al. und Huber-Lang et al. beschrieben, sind
Plasmin und Elastase eher als Inhibitoren zu verstehen, da sie zügig sowohl das generierte
C3b als auch das gebildete C3a degradieren [35, 91, 92, 111].
73

DISKUSSION
Abb. 32: Kategorien der C3-Prozessierer
Die C3-Prozessierer können in zwei Kategorien eingeteilt werden: 1. Die C3b-Generierer spalten C3
zu C3b, aktivieren dadurch das Komplementsystem. Zu den C3b-Generierern zählen Kallikrein aus
dem Kallikrein-Kinin-System und Thrombin aus dem Gerinnungssystem. 2. Die C3b-Degradierer
spalten generiertes C3b weiter und hemmen damit das Komplementsystem. In diese Kategorie
gehören Plasmin aus der Fibrinolyse und die Neutrophilenelastase, welche von PMNs sekretiert
werden.
4.2 Der Einfluss von Kallikrein auf das Komplementsystem
Kallikrein ist das zentrale Enzym des Kallikrein-Kinin-Systems und wurde in dieser Arbeit auf
seine Funktion im Komplementsystem untersucht. Kallikrein ist dabei als
Komplementaktivator identifiziert worden.
4.2.1 Kallikrein ist ein C3b-Generierer
Kallikrein spaltet C3 in C3a und komplementaktives C3b. Das kallikreingenerierte C3b ist in
der Lage Oberflächen zu opsonisieren und bildet die Grundlage für den Aufbau weiterer C3-
Konvertasen. Kallikrein prozessiert C3 spezifisch durch die Spaltung einer einzigen
Peptidbindung und setzt dabei C3a und C3b frei. Auch nach längerer Inkubation mit C3
treten keine weiteren Spaltprodukte auf. Folglich kann durch die Aktivierung des Kallikrein-
Kinin-Systems nach Erkennung von Aktivatoroberflächen, wie der von Infektionserregern und
apoptotischen Zellen die alternative Komplementantwort induziert und verstärkt werden [36-
74

DISKUSSION
38, 137, 138]. Dadurch wird die Erkennung und Beseitigung von pathogenen Eindringlingen
optimiert.
4.2.2 Kallikrein generiert Bb
Kallikrein,spaltet neben C3 auch Faktor B gebunden an C3b in Gegenwart von zweiwertigen
Kationen in Ba und Bb. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen von Discipio et al.
überein [139]. Die Resultate dieser Arbeit zeigen darüber hinaus, dass Kallikrein generiertes
Bb über proteolytische Aktivität verfügt und in Gegenwart von C3b eine C3-Konvertase
bilden kann. Damit wurde erstmalig auch die physiologische Relevanz der Faktor B Spaltung
durch Kallikrein gezeigt.
Kallikrein spaltet Faktor B in Bb und Ba im Plasma auch unter Bedingungen, wenn das
Komplementsystem durch Bindung aller zweiwertig positiv geladenen Ionen komplett
gehemmt ist. Folglich kann Kallikrein Faktor B im Plasma auch unabhängig von positiv
geladenen Ionen spalten.
4.2.3 Kallikrein ist ein neuer Aktivator des alternativen Komplementsystems
Mit den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen kann ein neuer Aktivierungsweg des
alternativen Komplementsystems beschrieben werden, in welchem Kallikrein durch die
Spaltung von C3 und Faktor B die Komponenten C3b und Bb erzeugen, die zusammen eine
aktive C3-Konvertase bilden. Im Vergleich dazu werden zur Generierung einer C3-
Konvertase über den alternativen Weg zwei Proteasen benötigt. (I) Zum einen eine bereits
gebildete C3-Konvertase und zum anderen (II) Die Serinprotease Faktor D die Faktor B zu
Bb und Ba prozessiert. Diese beiden Spaltprozesse können von Kallikrein alleine ausgeübt
werden. Demnach aktiviert Kallikrein das Komplementsystem auf einzigartige Weise, sobald
Präkallikrein zu Kallikrein prozessiert wird (Abb. 33).
Diese spezielle komplementaktivierende Funktion von Kallikrein wurde auch im Plasma einer
gesunden Person nachgewiesen. Wenn die alternative und die klassische
Komplementaktivierung durch Zugabe von EDTA blockiert war, konnte trotzdem eine C3
Spaltung beobachtet werden, die auf die Wirkung von Kallikrein zurückzuführen ist.
Bisher war bekannt, dass das Komplementsystem über drei Wege aktiviert werden kann. Der
klassische und der Lektin-Weg sind einander ähnlich. Beide Wege erkennen Zuckermoleküle
auf Pathogenoberflächen und führen zur Bildung der C3-Konvertase C4b2a. Der alternative
75

DISKUSSION
Weg hingegen ist durch die spontane Generierung von C3b gekennzeichnet, das sich auf
nichtregulierten Oberflächen absetzt und so die Bildung der C3-Konvertase C3bBb induziert.
Der in dieser Arbeit beschriebene kallikreinvermittelte Komplementaktivierungsweg
(Kallikreinweg) führt ebenfalls zur Assemblierung der C3-Konvertase C3Bb und mündet in
den alternativen Komplementweg. Kallikrein wird unter anderem durch die
Kontaktaktivierung an negativ geladenen Oberflächen aktiviert. Negativ geladene
Oberflächen repräsentieren „danger associated molecular patterns“ (DAMPs) und sind zum
Beispiel auf Mikroorganismen zu finden. Folglich erweitert der Kallikreinweg das Spektrum
an Fremd-Merkmalen, die durch das Komplementsystem erkannt werden können und zur
Aktivierung führen.
Der Zusammenhang zwischen der Aktivierung von Kallikrein und der Induktion einer
Komplementantwort stimmt mit Ergebnissen von Schwartz et al. überein, der zeigte, dass
durch die Injektion von kontaminiertem Heparin, im Plasma von Probanden die
Kontaktaktivierung induziert wurde. Neben Bradykinin wurden dabei auch große Mengen an
C3a und C5a nachgewiesen. Mit der Hemmung der Kontaktaktivierung konnte auch die
Freisetzung dieser Komplementaktivierungsprodukte reduziert werden [140].
Bisher wurde angenommen, dass eine kallikreinvermittelte Komplementaktivierung
ausschließlich über den klassischen Weg stattfindet [113]. Dabei schneidet Kallikrein FXII
unter Freisetzung des Fragments FXIIf. FXIIf aktiviert C1s und setzt damit den klassischen
Komplementweg in Gang. In Krankheitsbildern, wie HAE, welches durch einen C1-Inhibitor–
Mangel gekennzeichnet ist und Sepsis, bei denen es unter anderem zur unkontrollierten
Aktivierung des Komplementsystems kommt wird eine. kallikreinvermittelte
Komplementaktivierung angenommen [141, 142]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
lassen den Schluss zu, dass Kallikrein zusätzlich als ein Aktivator des alternativen
Komplementsystems fungiert.
76

DISKUSSION
Abb. 33: Komplementaktivierung über den Kallikreinweg und den alternativen Komplementweg
Kallikreinweg: Kallikrein spaltet C3 zu C3b und C3a. Das generierte C3b setzt sich an Oberflächen
und bindet Faktor B. Kallikrein prozessiert weiterhin Faktor B zu Bb und Ba, bildet so eine aktive C3-
Konvertase, welche wiederum C3 zu C3b und C3a spaltet. Alternativer Komplementweg: Die C3-
Konvertase des alternativen Weges (Amplifikationsschleife) oder eine der anderen C3-Konvertasen
des klassischen oder Lektin-Weges prozessieren C3 zu C3b und C3a. Das gebildete C3b interagiert
mit Oberflächen und bindet Faktor B, der nun von Faktor D in Bb und Ba gespalten werden kann,
wodurch die C3-Konvertase des alternativen Weges generiert wird.
4.3 Die kallikreinvermittelte Komplementaktivierung wird durch
den Komplementregulator Faktor H gehemmt
Kallikrein aktiviert das Komplementsystem. Um körpereigene gesunde Zellen vor den
Effektorfunktionen der Komplementattacke zu schützen, ist zu erwarten, dass auch der
kallikreinvermittelte Aktivierungsweg reguliert wird.
In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Faktor H die kallikreinvermittelte
Aktivierung des Komplementsystems reguliert. Faktor H ist der Hauptregulator des
alternativen Komplementsystems. Sowohl im Plasma als auch auf gesunden, körpereigenen
Zellen verhindert Faktor H die Etablierung einer Komplementreaktion indem es den Zerfall
bereits gebildeter C3-Konvertasen des alternativen Weges beschleunigt und die Faktor I-
vermittelte Spaltung von C3b unterstützt [29, 33, 143]. Die Ergebnisse der vorliegenden
Arbeit zeigen, dass Faktor H mit kallikreingeneriertem C3b interagiert. Dabei wird die C3b-
Konformation so verändert, dass Faktor I das kallikreingenerierte C3b zu iC3b spalten und
damit inaktivieren kann. Weiterhin vermittelt Faktor H den beschleunigten Abbau der
kallikreingenerierten C3-Konvertase. Folglich reguliert Faktor H die kallikreinvermittelte
Aktivierung der C3-Konvertase, um körpereigene gesunde Zellen vor Komplementattacken
77

DISKUSSION
zu schützen. Die C3-Konvertase des Kallikreinweges ist demnach strukturell und funktionell
vergleichbar mit der C3-Konvertase des alternativen Weges und wird auch durch denselben
Inhibitor reguliert.
Diese Regulation ist analog zur Regulation der C3-Konvertase C4b2a. C4b2a kann sowohl
über den klassischen, als auch über den Lektin-Weg gebildet werden. Unabhängig von
seiner Herkunft wird die C3-Konvertase C4b2a von dem Plasmaprotein C4BP reguliert.
C4BP vermittelt, vergleichbar mit Faktor H, den beschleunigten Abbau der C3-Konvertase
C4b2a und wirkt als Kofaktor für die C3b-Inaktivierung durch Faktor I (Abb. 34).
Abb. 34: Regulation der Komplementaktivierungswege
Die C3-Konvertase C3bBb, gebildet durch den Kallikreinweg oder durch den alternativen
Komplementweg, wird durch Faktor H reguliert. Die C3-Konvertase C4b2a, generiert durch den
klassischen oder den Lektin-Weg, wird durch das Plasmaprotein C4BP reguliert.
Das durch Faktor H und Faktor I generierte iC3b kann durch Kallikrein weiter abgebaut
werden. Dabei bildet Kallikrein das biologisch aktive Peptid C3dK, welches unter anderem
die Proliferation von T-Zellen hemmt [144]. Weiterhin inhibiert Kallikrein auf diese Weise die
iC3b-vermittelte Opsonisierung. Folglich verfügt Kallikrein nicht nur über
komplementaktivierende Funktionen, sondern unterstützt nach dem regulatorischen Agieren
von Faktor H und Faktor I die Komplement- und Entzündungshemmung.
78

4.4 Der Einfluss von Plasmin auf das Komplementsystem
DISKUSSION
4.4.1 Plasmin ist ein C3b-Degradierer.
Im Gegensatz zu Kallikrein prozessiert die Plasmaprotease Plasmin die α-Kette von
Komplementprotein C3 durch Spaltung an vier Schnittstellen (Abb. 35A). Abhängig von den
initialen Schnittstellen setzt Plasmin Spaltprodukte mit unterschiedlichen Funktionen frei.
Nach ihrer funktionellen Bedeutung können die Spaltvorgänge in drei Kategorien eingeteilt
werden:
1. Plasmin kann C3 unter Generierung von iC3 (78 und 43 kDa) direkt inaktivieren. Dieser
Spaltvorgang führt zu einer C3-Depletion und zur Hemmung der Komplementaktivierung.
Durch weitere Abspaltung von C3a (10 kDa) entstehen aus iC3 die Fragmente iC3b (68 und
43 kDa), C3c (27 und 43 kDa) und C3dg (41 kDa).
2. Plasmin spaltet C3 unter Freisetzung von C3b (114 kDa) und C3a. Das plasmingenerierte
C3b könnte als Opsonin Oberflächen markieren und für den Aufbau weiterer C3-
Konvertasen zur Verfügung stehen. Dieser Spaltvorgang kann zur vorübergehenden
Aktivierung des Komplementsystems führen.
3. Plasmin inaktiviert C3b unter Generierung von iC3b (68 und 43 kDa) und C3b* (27 und 87
kDa). Die inaktivierten C3b-Varianten werden weiter zu C3c und C3dg und C3d abgebaut.
Da plasminbehandeltes C3b keine C3-Konvertase mehr ausbilden kann, reguliert Plasmin
die Komplementaktivierung (Abb. 35B).
A
B
Abb. 35: C3-Spaltung durch Plasmin
79

DISKUSSION
(A) Plasmin spaltet die C3 α-Kette an vier verschiedenen Stellen (Pfeile in orange). (B) Nach ihrer
funktionellen Bedeutung können die plasminvermittelten Spaltvorgänge von C3 in drei Kategorien
unterteilt werden. Die Spaltung von C3 erzeugt 1. komplementinaktives iC3 und 2. komplementaktives
C3b. 3. Das generierte C3b wird sofort weiter degradiert. Dabei entstehen iC3b, C3b*, C3c und C3dg.
Bei der Spaltung von C3 im Plasma konnten neben C3b nur zwei weitere Spaltprodukte in
Höhe von 100 und 68 kDa detektiert werden. Die 68 kDa-Bande ist ein Indiz dafür, dass das
plasmingenerierte C3b zu iC3b inaktiviert wurde. Dies erfolgte entweder direkt durch Plasmin
oder wurde von Faktor I und Faktor H vermittelt. Die Bande in Höhe von 100 kDa konnte
keinem bekannten C3-Spaltprodukt zugeordnet werden, zeigt jedoch, dass auch Plasma-
C3/C3b durch Plasmin degradiert wird.
Plasmin spaltet C3 in C3a und C3b [35, 92, 111]. Das gebildete C3b wird von Plasmin
vermutlich sehr schnell weiter degradiert und inaktiviert (Spaltkategorie 3). Plasmin ist
ebenso in der Lage C3a abzubauen, sodass es nur vorübergehend aktiv ist [132]. Folglich
wirkt Plasmin auch auf Ebene von C3a als Komplementregulator. Nicht auszuschließen ist
jedoch, dass Plasmin in ganz geringen Mengen oder bei kurzer Inkubation durch Bildung von
C3a und C3b eine komplemenaktivierende Wirkung hat. So kann bei Immunreaktionen die
Menge eines Enzyms oder Mediators unterschiedliche Funktionen ausüben. Ein Beispiel
dafür ist die Fähigkeit von Plasmin in geringen Mengen den Plättchenrezeptor PAR1 für die
Aktivierung durch Thrombin zu desensibilisieren, ohne eine Zellreaktion auszulösen. Jedoch
aktiviert Plasmin in größeren Mengen den Rezeptor PAR 1 und löst eine
proinflammatorische Plättchenreakttion aus [145].
4.4.2 Plasmin degradiert Faktor B
Um den Einfluss von Plasmin auf das Komplementsystem noch besser definieren zu können,
wurde auch die Wirkung von Plasmin auf Faktor B untersucht. Nur in Anwesenheit von
aktivem Faktor B können in einer Amplifikationsschleife weitere C3-Konvertasen generiert
werden. Plasmin prozessiert Faktor B unter Generierung von 6 Spaltprodukten. Der Kofaktor
C3b verstärkte diese Faktor B-Spaltung. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit den
Ergebnissen von Ikari et al., der ebenfalls eine Degradierung von Faktor B durch Plasmin
beobachtete [146]. Eine Funktionsanalyse der Faktor B-Spaltprodukte hinsichtlich ihrer
weiteren proteolytischen Aktivität in der C3-Konvertase zeigte für keine der Spaltprodukte
eine Aktivität, obwohl sich unter den generierten Faktor B-Spaltprodukten ein Fragment mit
der gleichen Mobilität wie die Protease Bb befand. Demnach generiert Plasmin kein aktives
80

DISKUSSION
Bb, welches mit C3b eine aktive C3-Konvertase bilden kann. Insgesamt wirkt Plasmin auch
auf Ebene von Faktor B komplementinhibierend.
Plasmin spaltet auch in humanem Plasma Faktor B, da neben den Spaltprodukten Bb und
Ba ein zusätzliches Faktor B Fragment mit einer Mobilität von 48 kDa generiert wird. Plasmin
wird im Plasma relativ schnell durch Regulatoren wie α-2 Antiplasmin inhibiert, wodurch die
plasminvermittelte Enzymaktivität gehemmt und reguliert wird.
4.4.3 Plasmin ist ein Inhibitor des alternativen Komplementsystems
Plasmin verfügt in humanem Plasma über eine komplementinhibierende Funktion und
schützt Kaninchenerythrozyten vor der Komplement vermittelten Lyse. Dieser Effekt beruht
höchstwahrscheinlich auf der proteolytischen Inaktivierung von C3 und C3b (Spaltkategorien
1 und 3) sowie Faktor B durch Plasmin. Außerdem beschleunigt Plasmin den Zerfall
generierter aktiver C3-Konvertasen. Dieser Effekt kann dadurch erklärt werden, dass
Plasmin sowohl den Kofaktor C3b als auch das proteolytisch aktive Fragment Bb degradiert
und damit den Abbau der C3-Konvertase verursacht (Abb. 36).
Für die komplementinhibierende Wirkung von Plasmin spricht außerdem, dass eine Vielzahl
von pathogenen Mikroorganismen Plasmin(ogen) an ihre Oberfläche binden. Beispielsweise
rekrutiert und aktiviert Staphyloccocus aureus Plasminogen [147]. Die Aktivierung von
Plasminogen erfolgt über die humanen Aktivatoren t-PA und u-PA oder durch den von S.
aureus exprimierten Plasminogenaktivator Staphylokinase. Das erzeugte Plasmin kann, wie
die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, Faktor B abbauen und den Zerfall generierter
C3-Konvertasen beschleunigen. Außerdem spaltet Plasmin neben den
Komplementproteinen C3 und C3b auch Fibrin [91, 148]. Folglich schützt Plasmin das
humane Gewebe vor Komplement- und Gerinnungseffekten, was pathogene
Mikroorganismen ausnutzen um der Immunreaktion des Wirtes zu entgehen.
81

DISKUSSION
Abb. 36: Hemmung des alternativen Komplementweg durch Plasmin
Plasmin reguliert den alternativen Komplementweg durch fünf Spaltprozesse, wodurch die
Amplifikationsschleife komplett gehemmt wird. Plasmin degradiert (I) C3, (II) C3b, (III) Faktor B, (IV)
die Prokonvertase C3b/Faktor B und (V) die C3-Konvertase des alternativen Weges.
4.5 Komplementregulation durch β2GPI
4.5.1 Das Proteinfragment β2GPI I-IV ist ein Komplementinhibitor
β2GPI, ein Plasmaprotein mit ähnlicher Struktur wie Komplement Faktor H und mit
inhibierenden Funktionen auf die Koagulation, besitzt auch komplementregulatorische
Eigenschaften. Erstmals wurde hier gezeigt, dass das N-terminale Proteinfragment β2GPI I-
IV die Generierung des Anaphylatoxins C3a in komplementaktiviertem humanen Plasma
hemmt. Der molekulare Mechanismus hinter diesem inhibierenden Effekt wurde untersucht
und zeigte, dass β2GPI I-IV mit C3b interagieren und die Faktor I vermittelte C3b-
Inaktivierung in Gegenwart von Faktor H verstärken kann. Durch die verstärkte Proteolyse
von C3b, reduziert β2GPI I-V die Ausbildung weiterer C3-Konvertasen
(Amplifikationsschleife), folglich wurde weniger C3b und C3a freigesetzt und damit der
alternative Komplementaktivierungsweg gehemmt.
Durch die Interaktion von β2GPI I-IV mit C3b, wird vermutlich die Konformation von C3b so
beeinflusst, dass die Faktor I-vermittelte C3b-Spaltung in Gegenwart von Faktor H erleichtert
wird [149]. Ein ähnlicher Effekt wurde für das Staphylokokkenprotein Efb beschrieben. Mittels
Strukturanalyse konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von Efb mit C3b die C3b-
Konformation veränderte [150]. Diese Konformationsänderung verstärkte auch die C3b-
Inaktivierung durch Proteasen [132].
82

DISKUSSION
Die Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zeigen weiterhin, dass β2GPI I-IV auch auf den
terminalen Komplementweg wirkt. β2GPI I-IV verhinderte über einen noch unidentifizierten
Mechanismus den Aufbau des TCCs und damit die komplementinduzierte Zelllyse. Folglich
ist β2GPI I-IV neben Vitronektin, Clusterin und CFHR1 ein weiterer humaner Regulator des
terminalen Komplementkomplexes.
Die komplementregulatorischen Funktionen von β2GPI werden durch die Domänen I-III
vermittelt, da das Proteinfragment β2GPI IV-V keine Aktivität zeigt. Die β2GPI-Domäne IV
dient möglicherweise als „Linker“ zwischen den komplementregulatorischen N-terminalen
Domänen und der Domäne V, welche die Interaktion mit anionischen Oberflächen vermittelt.
Diese Proteinorganisation ist analog zu dem Komplementregulator Faktor H, welcher wie
β2GPI, nur aus SCR-Domänen besteht. Während die komplementregulatorische Funktion
von Faktor H ebenfalls von den N-terminalen Domänen SCR1-4 vermittelt wird, interagieren
die C-terminalen Domänen SCR 18-20 von Faktor H mit Zelloberflächen [151-153]. Ein
entscheidender Unterschied zwischen Faktor H und β2GPI ist, dass Faktor H mit
Glykosaminoglykanen interagiert, und damit körpereigene Zellen vor Komplementattacken
schützt, während β2GPI an oxidierte Phospholipide bindet, wie z.B. auf apoptotische Zellen
und hier vermutlich eine überschießende Komplementreaktionen verhindert. Beide
Regulatoren, Faktor H und β2GPI, schützen den Organismus vor den fatalen Auswirkungen
unkontrollierter Komplementattacken.
4.5.2 Die Komplementaktivität von β2GPI
Interessanterweise hatte im Gegensatz zum N-terminalen Fragment β2GPI I-IV das
Volllängenprotein β2GPI I-V unter den gewählten Versuchsbedingungen keinen
regulatorischen Einfluss auf das Komplementsystem. Erklärt werden kann diese
Beobachtung damit, dass die funktionelle Aktivität von β2GPI von seiner Konformation
bestimmt wird. β2GPI verfügt über zwei strukturelle Konformationen. (I) In gelöster Form
interagieren Domäne I und V miteinander, wodurch β2GPI eine zirkuläre kompakte
Konformation einnimmt. (II) Durch Bindung der Domäne V an anionische Strukturen, wie
Phosphatidylserin oder Cardiolipin, wird die Interaktion mit Domäne I gelöst, wodurch β2GPI
eine langgestreckte Konformation aufweist. Erst durch die Öffnung der kompakten Struktur
wird β2GPI funktionell aktiv. So kann nur Phosphatidylserin gebundenes β2GPI mit
Makrophagenrezeptoren interagieren und damit die Phagozytose induzieren [70]. Gelöstes,
ringförmiges β2GPI interagiert nicht mit Makrophagen.
83

DISKUSSION
Demzufolge besaß das Volllängenprotein β2GPI I-V in den Versuchen eine zirkuläre, inerte
Konformation. Dadurch konnte das Protein nicht mit C3b oder Komponenten des TCCs
interagieren und regulatorisch eingreifen. Die Proteinmutante β2GPI I-IV besitzt keine
Domäne V und kann keine intramolekulare Bindung zwischen Domäne I und V bilden.
Folglich liegt β2GPI I-IV, vergleichbar mit oberflächengebundenem β2GPI, langgestreckt vor.
In dieser Konformation verfügt β2GPI über funktionelle Aktivität und kann das
Komplementsystem regulieren. Diese Ergebnisse stimmen damit überein, dass β2GPI nur
gebunden an anionische Oberflächen als Komplementregulator wirkt [149].
4.5.3 Proteinase 3 prozessiert β2GPI
Die Neutrophilenprotease Proteinase 3 schneidet β2GPI in zwei Fragmente (43 und 12 kDa).
Das 43 kDa β2GPI-Fragment stimmt hinsichtlich seines Molekulargewichts mit dem
rekombinant hergestellten β2GPI I-IV überein. Dieses Fragment interagiert nicht mit
Cardiolipin und verfügt genau wie das rekombinant hergestellte β2GPI I-IV über keine
Domäne V. Möglicherweise wird durch die Proteinase 3-vermittelte Prozesssierung von
β2GPI ein Fragment freigesetzt, das, vergleichbar mit β2GPI I-IV, auch in Flüssigphase über
komplementregulatorische Funktionen verfügt. Die Aktivierung von Plasmaproteinen durch
proteolytische Prozessierung ist ein verbreiteter Mechanismus, der auch die Aktivität von
Regulatoren reglementiert. Beispielsweise wird das Plasmaprotein Plasminogen durch die t-
PA- oder u-PA-vermittelte proteolytische Spaltung aktiviert. Das entstandene Plasmin
degradiert Fibringerinsel und wirkt, wie in dieser Arbeit gezeigt, als Komplementinhibitor
[154].
4.5.4 Modell der Aktivierung von β2GPI
Zusammenfassend lassen sich die Eigenschaften und die Funktionen des β2GPI-Moleküls,
während eines Entzündungsprozesses wie folgt darstellen (Abb. 37):
Veränderte eigene Oberflächen exponieren Strukturen wie oxidierte Lipide; die wie DAMPs
wirken. Diese Strukturen führen zur Aktivierung des Komplementsystems, des
Gerinnungssystems und des Kallikrein-Kinin-Systems und sollen die schnelle Opsonisierung
und Beseitigung der veränderten Strukturen gewährleisten [42, 155]. Gleichzeitig müssen
inflammatorische Reaktionen verhindert werden. Aus diesem Grund werden zum Beispiel
apoptotische Zellen, welche natürlicherweise ständig vorkommen, vermittelt durch β2GPI
oder Faktor H unmittelbar anti-inflammatorisch eliminiert [76, 156, 157]. Auch geringe
lösliche Mengen an LPS, dessen Quelle die natürliche Darmflora sein können, kann von
84

DISKUSSION
β2GPI gebunden und neutralisiert werden, um eine unangebrachte Aktivierung der
angeborenen Immunantwort zu verhindern [158]. β2GPI bindet mit Domäne V an LPS. Die
daraus resultierende Konformationsänderung führt zur Öffnung von β2GPI und ermöglicht
die Interaktion des N-Terminus mit Makrophagenrezeptoren [70]. Gleichzeitig verhindert
β2GPI die Aktivierung der Gerinnung und, wie die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, auch der
Komplementkaskade.
Während eines Infektionsprozesses werden auch polymorphkernige Neutrophile (PMNs)
rekrutiert. Aktivierte PMNs setzen unter anderem Proteinase 3 frei, die, wie in dieser
Promotionsarbeit gezeigt, β2GPI prozessiert. Unter diesen Bedingungen hemmen laut
Ohkura et al. aktivierte Plasmaproteasen die anti-inflammatorische und opsonisierende
Funktion von β2GPI. Dabei wird β2GPI, zum Beispiel durch Plasmin oder FXa, innerhalb der
apolaren Schleife der fünften SCR-Domäne geschnitten [159]. Dadurch verliert β2GPI seine
Fähigkeit an Oberflächen zu binden, kann folglich nicht die funktionell aktive langgestreckte
Konformation einnehmen und verliert seine regulierenden und opsonisierenden
Eigenschaften. Ein möglicher Effekt der Spaltung von β2GPI durch PMN-Proteasen wäre
auch die Generierung von antimikrobiellen Peptiden, da die antimikrobielle Aktivität von der
fünften Domäne vermittelt wird [136].
85

DISKUSSION
Abb. 37: Modell der β2GPI-Transformation während Entzündungsprozessen
β2GPI liegt im Plasma als zirkuläres inaktives Protein vor. Geringe Mengen anionischer Strukturen
(z.B. Phosphatidylserin, Cardiolipin) werden von β2GPI gebunden. Dabei interagiert die β2GPI-
Domäne V mit der negativ geladenen Oberfläche, was in einer Konformationsänderung resultiert.
β2GPI vermittelt die antiinflammatorische Opsonisierung der anionischen Struktur und hemmt
gleichzeitig die Über-Aktivierung des Komplement- und des Gerinnungssystems, verhindert so die
Entstehung einer Entzündung und vermittelt die Phagozytose. Große Mengen fremder Oberflächen
lösen eine angeborene Immunantwort und einen Entzündungsprozess aus. Dabei prozessieren
aktivierte Plasmaproteasen wie Plasmin und F Xa die apolare Schleife der β2GPI-Domäne V und
verhindern dadurch die Interaktion von β2GPI mit der Oberfläche. Das auf diese Weise entstandene
nβ2GPI ist inaktiv. Im Laufe des Entzündungsprozesses sezernieren PMNs Proteinase 3.
Proteinase 3 schneidet β2GPI/nβ2GPI in zwei Fragmente. Das N-terminale Fragment umfasst
möglicherweise die Domänen I-IV und könnte als Flüssigphasenregulator die Über-Aktivierung des
Komplement- und Gerinnungssystems hemmen, zum Schutz vor überschießenden
Entzündungsprozessen. Das C-terminale Fragment umfasst wahrscheinlich die β2GPI-Domäne V und
könnte antimikrobielle Peptide freisetzten.
4.6 Regulation der Komplementaktivierung durch Kallikrein,
Plasmin und β2GPI
Kallikrein, Plasmin und β2GPI modulieren den alternativen Komplementaktivierungsweg. Alle
drei Plasmaproteine benötigen einen aktivierenden Stimulus zur Induktion ihrer
komplementregulatorischen Funktion. β2GPI wird durch Bindung an anionische Oberflächen
aktiviert oder erhält, wie Kallikrein und Plasmin, durch proteolytische Spaltung seine aktive
86

DISKUSSION
Form. Alle drei Plasmaproteine regulieren das Komplementsystem auf der Ebene des
zentralen Komplementproteins C3. Darüber hinaus wirken Kallikrein und Plasmin auf Faktor
B. Die Modulation der Komplementantwort erfolgt bei allen drei Plasmaproteinen auf ganz
unterschiedliche Weise. Während Kallikrein das alternative Komplementsystem aktiviert,
haben sowohl β2GPI als auch Plasmin einen komplementinhibierenden Einfluss. β2GPI wirkt
als verstärkender Kofaktor des Faktor I- und Faktor H-vermittelten C3b-Abbaus. Kallikrein
und Plasmin regulieren den alternativen Komplementweg durch die enzymatische Spaltung
von C3 und Faktor B. Dabei sind Kallikrein und Plasmin Gegenspieler. Während Plasmin C3
und Faktor B durch Degradierung inaktiviert, setzt Kallikrein aus C3 und Faktor B C3b
beziehungsweise Bb frei. Folglich generiert Kallikrein eine aktive C3-Konvertase und initiiert
damit die Aktivierung des Komplementsystems. Sowohl Kallikrein als auch die C3-
Konvertase des alternativen Weges aktivieren Plasmin durch Prozessierung von
Plasminogen [50, 115]. Diese Verknüpfung zwischen dem Komplementsystem und dem
komplementaktivierendem Kallikrein-Kinin-System mit der Fibrinolyse könnte ein wichtiger
Autoregulationsmechanismus zur Vermeidung überschießender Komplementreaktionen sein.
Damit hemmt Plasmin nicht nur die Gerinnungsreaktion, sondern ist auch ein Terminator der
alternativen Komplementantwort.
Die drei Plasmaproteine Kallikrein, Plasmin und β2GPI modulieren nicht nur gemeinsam das
Komplementsystem, sondern beeinflussen sich auch gegenseitig. So hemmt β2GPI die
Aktivierung von Kallikrein durch Neutralisierung anionischer Oberflächen [160]. Kallikrein
aktiviert Plasmin und Plasmin inhibiert die Interaktion von β2GPI mit anionischen
Oberflächen [69]. Das plasmingespaltene β2GPI wiederum interagiert mit Plasminogen und
hemmt die t-PA-vermittelte Plasmingenerierung. Diese funktionalen wechselseitigen
Einflüsse tragen vermutlich wesentlich zur Koordination der Aktivitäten von Kallikrein,
Plasmin und β2GPI während einer Immunantwort bei. Wie wichtig diese Autoregulation ist
zeigen Krankheitsbilder wie die Systemerkrankung Sepsis. Das Überschießen der
kaskadenartig wirkenden Immunantwort bei der Sepsis kann körpereigenes Gewebe schwer
schädigen. Bei der Sepsis werden unter anderem das Komplementsystem, das
Gerinnungssystem und das Kallikrein-Kinin-System unkontrolliert aktiviert. Gleichzeitig wird
die Fibrinolyse z.B. durch erhöhte Expression des Regulators PAI-1 unterdrückt [161]. Der
unkontrollierten Aktivierung des Komplementsystems bei Sepsis wird neuerdings besondere
Bedeutung beigemessen. Klinische Studien belegen, dass sich mit steigender
Komplementaktivierung der Krankheitsverlauf verschlimmert [162, 163]. Vor allem die
erhöhte Generierung des potenten Anaphylatoxins C5a hat fatale Auswirkungen. Unter
87

DISKUSSION
anderem induziert C5a die Paralyse von neutrophilen Granulozyten, steigert die Freisetzung
proinflammatorischer Zytokine aus Makrophagen und stimuliert die Expression von
Thromboplastin bei Endothelzellen [164].
Abb. 38: Regulation des Komplementsystems durch Kallikrein, Plasmin und β2GPI I-IV
Kallikrein: Das Komplementsystem kann neben dem alternativen, dem klassischen und dem Lektin-
Weg auch über den Kallikreinweg induziert werden. Dabei wird Kallikrein durch die Interaktion von
FXII mit Aktivatoroberflächen aktiviert (Kontaktaktivierung). Kallikrein generiert durch Spaltung von C3
und Faktor B die C3-Konvertase C3Bb. Plasmin: Plasmin hemmt die Ausbildung einer C3-Konvertase
des alternativen Weges durch Degradierung von C3, C3b und Faktor B. Weiterhin führt Plasmin zum
beschleunigten Abbau der C3-Konvertase des alternativen Weges. β2GPI I-IV: β2GPI I-IV
beschleunigt den Faktor I-vermittelten Abbau von C3b in Gegenwart von Faktor H, inhibiert damit die
Ausbildung weiterer C3-Konvertasen. Außerdem hemmt β2GPI I-IV die Assemblierung des terminalen
Komplementkomplexes (modifiziert nach Zipfel et al. [11]).
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass es einen neuen
Komplementaktivierungsweg über Kallikrein gibt, der zusätzlich zum alternativen Weg aktive
C3-Konvertasen generiert, die ebenfalls von Faktor H reguliert werden. Faktor H-Mutationen
sind in mehreren Erkrankungen der Niere, wie dem atypischen hämolytisch urämischen
88

DISKUSSION
Syndrom (aHUS) oder bei der „dense deposit disease“ (DDD), ursächlich nachgewiesen [11,
165, 166]. Beide Krankheitsbilder sind durch eine Fehlregulation des alternativen
Komplementweges gekennzeichnet. Aufgrund der damit verbundenen unkontrollierten
Komplementaktivierung werden Nierengefäße, die sogenannten Glomeruli, schwer
geschädigt [165]. Es ist zu vermuten dass Faktor H-Mutationen nicht nur zu einer
Fehlregulation des alternativen Weges sondern auch des Kallikreinweges führen. Außerdem
könnten genetische Veränderungen im Kallikreinweg zur Überaktivierung des
Komplementsystems führen und eventuell für einige der aHUS oder DDD Fälle
verantwortlich sein, für die bisher keine genetische Ursache gefunden wurde. In diesem Fall
könnte die Hemmung von Kallikrein auch zu einer effektiven Komplementinhibierung führen.
Ein besseres Verständnis der übergreifenden Regulationsmechanismen zwischen den
verschiedenen Enzymsystemen des Blutes wird helfen, Erkrankungen wie aHUS oder
Sepsis, besser zu verstehen und neue Therapiemaßnahmen zu entwickeln.
89

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97

APPENDIX
6 Appendix
6.1 Eigenständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich,
• dass mir die geltende Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität Jena bekannt ist.
• dass die Promotionsarbeit von mir selbst angefertigt wurde, keine Textabschnitte eines
Dritten ohne Kennzeichnung übernommen wurden, und alle Hilfsmittel und Quellen
angegeben wurden.
• dass alle Personen benannt wurden, die an der Auswahl, Erstellung und Auswertung der
Manuskripte beteiligt waren.
• dass kein Promotionsberater in Anspruch genommen wurde und Dritte weder unmittelbar
noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der Dissertation stehen.
• dass die vorgelegte Dissertation nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere
wissenschaftliche Prüfung eingereicht wurde.
• dass weder die gleiche noch eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere
Abhandlung bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht wurde.
Jena, den 30. Januar 2013
Nadia Döring
98

APPENDIX
6.2 Publikationen und Konferenzbeiträge
Gropp K, Weber N, Reuter M, Micklisch S, Kopka I, Hallström T, Skerka C, Beta2-
glycoprotein I, the major target in antiphospholipid syndrome, is a special human
complement regulator. Blood. 2011 Sep 8;118(10):2774-83. Epub 2011 Jul 14.
Doering N, Gropp K, Kopka I, Hartman A, Skerka C, Candida albicans recruits human beta 2
glycoprotein 1 (β2GPI) for immune evasion (eingereicht)
Doering N, Gropp K, Kopka I, Hartman A, Skerka C, Candida albicans recruits human beta 2
Glycoprotein 1 (β2GPI) for immune evasion, 18th Congress of ISHAM, June 11 – 15, 2012,
Berlin (Vortrag)
Gropp K, Weber N and Skerka C, Candida albicans blocks β2GPI antifungal activity
7thMeeting of innate immunity, 4th July 2010, Greece, Rhodos (Poster)
99

APPENDIX
6.3 Danksagung
Mein Dank gilt meiner Doktormutter PD Dr. Christine Skerka für die Bereitstellung und die
intensive Betreuung meiner Promotionsarbeit. Ich danke ihr, sowie Prof. Peter F. Zipfel für
die hilfreichen Diskussionen und Anregungen.
Ich danke meinen Kollegen der Abteilung Infektionsbiologie für die familiäre
Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders bedanke ich mich bei meinen Laborkollegen der A017,
die mich mit viel Geduld und Humor stets motiviert und unterstützt haben. Mein Dank gilt
Isabell Kopka für die Bereitstellung der HK2-Zellen und die Unterstützung am
Durchflusszytometer. Ich bedanke mich bei Tina Koch für die vielen kritischen Anregungen
und die enge Freundschaft.
Abschließend möchte ich mich bei meinem wunderbaren Ehemann Volker bedanken, der
immer an meiner Seite stand.
100