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MATERIAL UND METHODEN
Zur Klärung der verschiedenen Fragestellungen in dieser Arbeit wurde der C3-Konvertase-
CEWA in verschiedenen Varianten durchgeführt:
Aufbau einer C3-Konvertase auf enzymbehandeltem C3b
Das immobilisierte C3b wurde für 2h mit 200 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin
inkubiert. Danach erfolgten der Aufbau der C3-Konvertase sowie die Analyse der
Probenüberstände.
Aufbau der C3-Konvertase durch Inkubation mit Kallikrein beziehungsweise Plasmin
Das immobilisierte C3b wurde für 2 h bei 37°C mit 215 nM Faktor B, 190 n Faktor P und zur
Generierung der C3-Konvertase mit einem der Enzyme Faktor D (20 nM), Kallikrein (200 nM)
oder Plasmin (200 nM) in Konvertasepuffer 1 für 1 h bei 37°C inkubiert.
2.4.4 Detektion der β2GPI-Cardiolipin-Interaktion mittels CEWA
Die Untersuchung der Interaktion von β2GPI mit Cardiolipin wurde mittels ELISA und
Westernblot (CEWA) durchgeführt. Es wurden 4,5 µM Cardiolipin (Sigma-Aldrich) für 2 h bei
37°C in einer 96-Well-Maxisorb-Mikrotiterplatte immobilisiert. Freie Bindestellen wurden
durch Inkubation mit 150 µl Blocklösung I über Nacht bei 4°C abgesättigt. Anschließend
erfolgte die Applikation von 0,3 µM β2GPI I-V, β2GPI I-IV beziehungsweise β2GPI IV-V.
Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden ungebundene Proteine durch extensives Waschen mit
Waschpuffer entfernt. Durch Gabe von 30 µl Eluierungspuffer für 10 min bei 37°C wurde
gebundenes Protein gelöst und mittels SDS-PAGE aufgetrennt und via Westernblot mit
Kaninchen anti-β2GPI-Antikörper (Tab. 1) detektiert.
Für den Nachweis der Cardiolipin-Bindeeigenschaft des durch Proteinase 3 generierten
β2GPI-Fragmentes wurde der Versuch modifiziert. Dafür wurden 0,4 µM β2GPI (SCIPAC)
mit 0,125 µM Proteinase 3 (Athens Research) für 30 min inkubiert, auf immobilisiertes
Cardiolipin appliziert und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Eluierung und die Detektion des
gebundenen Proteins erfolgten wie bereits beschrieben.
2.4.5 C3b-Inaktivierung durch Faktor I (Kofaktorversuch)
Mittels Kofaktorversuch wurde die Faktor I-vermittelte C3b-Inaktivierung induziert durch
Faktor H untersucht. Zur Klärung der verschiedenen Fragestellungen in dieser Arbeit,
wurden folgende zwei Kofaktorversuche durchgeführt:
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