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MATERIAL UND METHODEN
Konvertaseabbau-ELISA I
Mittels Konvertaseabbauversuch I wurde der beschleunigte Zerfall der Kallikrein generierten
C3-Konvertase in Gegenwart Faktor H nachgewiesen. Das immobilisierte C3b wurde mit
5 nM Faktor B, 20 nM Faktor P und 25 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin oder 1 nM
Faktor D für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte der beschleunigte Zerfall der
generierten C3-Konvertase durch Zugabe ansteigenden Mengen Faktor H (0,5; 1,5; 3; 6 nM).
Konvertaseabbau-ELISA II
Der Konvertaseabbauversuch II wurde angewandt, um den Einfluss von Kallikrein und
Plasmin auf den Zerfall der C3-Konvertase des alternativen Weges zu analysieren. Der
Aufbau der C3-Konvertase des alternativen Weges erfolgte durch Inkubation von
immobilisiertem C3b mit 5 nM Faktor B, 20 nM Faktor P und 1 nM Faktor D gelöst in
Konvertasepuffer 2, welcher statt MgCl 2 2 mM NiCl 2 enthielt, für 1 h bei 37°C. Anschließend
erfolgte die Inkubation mit ansteigenden Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin (1;
2,5; 5; 10; 25; 50 nM) für 1 h bei 37°C.
Die Faktor B/Bb-Detektion erfolgte bei allen Versuchen in gleicher Form durch Inkubation mit
den Antikörpern Ziege-anti-Faktor B und Kaninchen-anti-Ziege-HRP für jeweils 30 min bei
Raumtemperatur gelöst in ½ DPBS mit 10 mM MgCl 2 (Tab. 2). Zur Visualisierung wurde
Variante 2 verwendet.
2.4.3 Detektion der C3-Konvertase mittels CEWA
Mittels Konvertase-CEWA (combined ELISA Western blot assay) wurden generierte C3-
Konvertasen auf ihre Fähigkeit C3 in C3a und C3b zu spalten, untersucht. Zunächst wurden
55 nM C3b gelöst in DPBS, in einer 96-Well-Maxisorb-Mikrotiterplatte (Nunc, Wiesbaden) 2 h
bei 37°C immobilisiert. Anschließend wurden freie Bindestellen mit 150 µl Blocklösung 2 über
Nacht bei 4°C abgesättigt. Zum Aufbau der C3-Konvertase wurden 215 nM Faktor B, 190 nM
Faktor P und 20 nM Faktor D in Konvertasepuffer appliziert und für 1 h bei 37°C inkubiert.
Zwischen jedem Versuchsschritt wurde ungebundenes Protein durch Waschen mit
Waschpuffer entfernt. Nachfolgend wurden 155 nM C3 in Konvertasepuffer 1 als Substrat zur
generierten C3-Konvertase gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden
mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die C3a- und C3b- Generieung per Westernblot mit
spezifischen Antikörpern detektiert (Tab. 1).
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