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MATERIAL UND METHODEN
2.4.7 Durchflusszytometrie
Mittels Durchflusszytometrie werden Zellen hinsichtlich ihrer Größe, Granularität und
Fluoreszenzeigenschaften analysiert. Dabei werden die zu untersuchenden Partikel von
einem Laserstrahl erfasst. Es kommt zur Anregung gekoppelter Fluoreszenzfarbstoffe, die
daraufhin Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren. Dieses Licht kann durch ein
komplexes System aus Spiegeln und Filtern gebündelt und zerlegt und anschließend
detektiert werden.
Die Durchflusszytometrie wurde zur Untersuchung des Einflusses von Kallikrein und Plasmin
auf die Komplementaktivität von humanem Plasma verwendet. Dafür wurde die Stärke der
C3b-Deposition auf HK2-Zellen nach Inkubation mit humanem Plasma und ansteigenden
Mengen Kallikrein beziehungsweise Plasmin gemessen. 2x10 5 HK-Zellen wurden mit 2,5%
Plasma und 10; 50 oder 100 nM Kallikrein beziehungsweise Plasmin für 30 min bei 37°C und
800 rpm inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit FITC gekoppeltem Ziege-anti-C3-Fab-
Antikörper (Protos Immunoresearch, 1:5000 verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur. Alle
Ansätze wurden in TC-Puffer durchgeführt. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Zellen
zwei Mal mit 500 µl TC-Puffer gewaschen (2000 rpm, 4 min). Abschließend wurden die
Zellen in 400 µl TC-Puffer gelöst und am LSR II (BD) analysiert.
2.4.8 Hämolyseversuch
Mittels Hämolyseversuch erfolgte die Bestimmung der Komplementaktivität von humanem
Plasma in Gegenwart von Kallikrein beziehungsweise Plasmin. Die Inkubation von Plasma
mit Kaninchenerythrozyten führte zur Komplementaktivierung. Folglich wurden auf den
Erythrozyten TCC-Komplexe generiert, welche die Lyse und damit die Freisetzung des
photometrisch messbaren Farbstoffs Hämoglobin verursachten. Als Maß für die Stärke der
Komplementaktivierung diente die optische Dichte des Probenüberstandes bei 414 nm.
Es wurden 1x10 8 Kaninchenerythrozyten/ml mit 10% humanem Plasma und ansteigenden
Mengen von Kallikrein beziehungsweise Plasmin (25 ,100 und 250 nM) für 30 min bei 37°C
und 650 rpm inkubiert. Alle Ansätze wurden in HEPES-EGTA-Puffer gelöst. Das
Gesamtvolumen betrug 50 µl. Nach der Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 min wurden die
optische Dichte der Überstände bei 414 nm gemessen.
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