4.2.2.9

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Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten
4.2.2.9 Enzymatische Hydrolyse von meso-cis-4-Cyclohexen-1,2-dicarbonsäuredimethylester
(8) zu (1S,2R)-cis-4-Cyclohexen-1,2-dicarbonsäure-1-methylester
(9) mit Schweineleberesterase
H
O
2 R(S)
1 S(R)
O CH 3
O
CH3
+
H 2
O
PLE
H
2
1
R
S
O
OH
+
O
CH3
H 3
COH
H
O
8
H
O
9
C 10
H 14
NO 4
(198.2)
C 9
H 12
O 4
(184.2)
Arbeitsmethoden: Reaktion mit Enzymen, Drehwertbestimmung
Chemikalien
cis-4-Cyclohexen-1,2-dicarbon- Sdp. 80–81 °C/0.1 hPa, wird in Versuch 4.2.2.8 dargestellt.
säuredimethylester
Schweineleberesterase (PLE) (E.C. 3.1.1.1), rohes Lyophilisat, Aktivität 27 kU/g. 1
Essigsäureethylester
Sdp. 77 °C, Dampfdruck bei 20 °C: 97 hPa, d = 0.90 g/ml.
Kaliumdihydrogenphosphat
Natronlauge (1 M)
Verursacht Verätzungen.
Durchführung
Vor Beginn Betriebsanweisung erstellen.
Darstellung des Phosphatpuffers: 10 mmol (1.36 g) Kaliumdihydrogenphosphat
werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 1 M Natronlauge auf pH
7.5 gebracht (Kontrolle mit pH-Meter).
In einem eingespannten 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben mit Magnetrührstab
und pH-Elektrode werden 50 ml Phosphatpuffer pH 7.5 und 10.0
mmol (2.0 g) cis-4-Cyclohexen-1,2-dicarbonsäuredimethylester vorgelegt
und unter Rühren auf 30 °C thermostatisiert. Anschließend werden 1000 U
(37 mg bei 27 kU/g) PLE zugegeben und der pH-Wert durch Zugabe von 1
M Natronlauge aus einer Bürette auf pH 7.5 gehalten. 2 Die Reaktion ist
beendet, wenn der pH-Wert der Reaktionsmischung konstant bleibt
(Verbrauch NaOH: ca. 10 ml).
Hinweis: Der Versuch kann – abhängig von der Aktivität der Esterase – 6–8 Stunden
dauern, er sollte deshalb gleich zu Beginn des Praktikumtages begonnen werden. Falls die
Reaktion zum Ende des Praktikumstages noch nicht abgeschlossen ist, wird der pH-Wert
auf 8 eingestellt und der Reaktionskolben verschlossen über Nacht in den Kühlschrank
gestellt. Der Versuch kann am nächsten Tag fortgesetzt werden.
Isolierung und Reinigung
Die Reaktionsmischung wird über einen kleinen, mit ca. 1 cm Celite
beschichteten Büchnertrichter abgesaugt und mit wenig Wasser nachgewaschen.
Das wässrige Filtrat wird 3 x mit 25 ml tert-Butylmethylether
gewaschen (→ E 1 ). 3 Die Wasserphase wird mit konz. Salzsäure auf pH 2–3
Versuch 4.2.2.9, Rev. 1.0 1

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Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten
gebracht und dreimal mit je 50 ml tert-Butylmethylether extrahiert (→ E 2 ).
Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet.
Nach dem Absaugen vom Trockenmittel (→ E 3 ) wird das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer abdestilliert (→ R 1 ), Lösungsmittelreste bei vermindertem
Druck entfernt; das ölige Produkt kristallisiert langsam im Eisbad.
Eine weitere Reinigung ist nicht nötig. Ausbeute Reinprodukt (g, %)? Man
bestimme den spezifischen Drehwert von 9 und berechne den Enantiomerenüberschuss
(ee). Ausbeute an 9: 75–85%, Schmp. 28 °C, [ a]
D
20
=
+11.0° (c = 1.0, Aceton).
1 Die übliche Mengeneinheit bei Einsatz von Enzymen ist 1 U (Unit). Die Aktivität eines
Substrats wird in U/g (Units per g) angegeben, was bei verschiedenen Enzymqualitäten
eine Umrechnung ermöglicht und somit der Reproduzierbarkeit dient. Die hier
verwendete Schweineleberesterase ist bei SIGMA erhältlich (Best.-Nr. E3019).
2 Protokollieren Sie den Verbrauch in Abhängigkeit von der Zeit, graphische Darstellung!
3 Was bewirkt dieser Reinigungsschritt?
Hinweise zur Entsorgung (E), Recycling (R) der Lösungsmittel
E 1 : Organischer Extrakt → Entsorgung (RH).
E 2 : Wässrige Phasen → Entsorgung (H 2 O mit RHal/Halogenid).
E 3 : Trockenmittel → Entsorgung (Anorg. Feststoffe).
R 1 : abdestilliertes Lösungsmittel → Recycling (tert-Butylmethylether).
Auswertung des Versuchs
1 H-NMR-Spektrum von 9 (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ = 2.20–2.47 (4 H), 2.90–3.00 (2 H), 3.57 (3 H), 5.55–5.67
(2 H), 12.28 (1 H).
3.0 2.8 2.6
2.4 2.2
13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 [ppm] 0.0
13 C-NMR-Spektrum von 9 (300 MHz, DMSO-d 6 ): 25.21 (CH 2 ), 25.57 (CH 2 ), 38.54 (CH), 38.66 (CH), 51.26
(CH 3 ), 124.89 (CH), 125.20 (CH), 173.23 (C), 174.23 (C).
LM
40
38
180
160
140 120
100
80
60 40 20 [ppm] 0
Versuch 4.2.2.9, Rev. 1.0 2

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Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten
IR-Spektrum von 9 (KBr):
100
T [%]
50
3030 2960
1735 1710
0
~
4000 3000 2000 1500 1000 ν [cm -1 ]
* Formulieren Sie den zu 9 führenden Reaktionsmechanismus.
Weitere denkbare Reaktionsprodukte:
O
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
A B C
* Mit welchen spektroskopischen Daten lassen sich A–C ausschließen?
* Diskutieren Sie die denkbaren Reaktionsmechanismen.
Literatur, allgemeine Anwendbarkeit der Methode
Literatur, auf der dieser Versuch beruht: [1]. Schweineleberesterase (Pig Liver Eserase, PLE) kann zur stereoselektiven
Hydrolyse einer Vielzahl von Estern eingesetzt werden. [2–4]
Esterasen sind Enzyme (biologische Katalysatoren), die aus pflanzlichen und tierischen Organismen bzw.
Organen (z.B. Schweineleber) isoliert werden können. Sie katalysieren die Hydrolyse von Carbonsäureestern,
mit chiralen Estern reagieren sie enantioselektiv:
O
O OR O OR
O OH
O
C
C
C
C
R S
Schweineleberesterase
H C Me Me C
R
S
H C Me Me C H
+
H C Me H C Me
H C Me H C
S
S H 2
O
S S
C
C
C
C
O OR O OR
O OR
O
meso-
rac-
OR
H
Me
OR
[1] H.-J. Gais, K.L. Lukas, W.A. Ball, S. Braun, H.J. Lindner, Liebigs Ann. Chem. 1986, 687–716.
[2] L.M. Zhu, M.C. Tedford, Tetrahedron, 1990, 46, 6587–6611.
[3] M. Ohno, M. Otsuka, Org. React. 1989, 37, 1–55.
[4] C.-H. Wong, G.M. Whitesides, “Enzymes in Synthetic Organic Chemistry” Pergamon Verlag, 1994.
Versuch 4.2.2.9, Rev. 1.0 3