Aus dem Institut für experimentelle und klinische - Universität zu ...

3. Material und Methoden 22
O 2 , 5 % CO 2 ) bei 90 % relativer Feuchtigkeit belüftet. Konfluenz der Zellen war
nach 48-72 h erreicht; die Zellen wurden mit Trypsin, NCI H 295 Zellen mit
Accutase abgelöst.
Medium und Zellen wurden entnommen, für eine Inkubation wurden die Zellen aus
einer Gewebeschale verwendet. Solubilisierte Zellen wurden bei 3000 g sedimentiert
und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden anschließend zur Entfernung
von restlichem Medium zweimal mit 0,9 %iger Kochsalzlösung (4°C) gewaschen.
Das verbleibende Zellpellet wurde mit 180 µl Inkubationspuffer versetzt und die
Reaktion durch Zugabe von 20 µl einer 0,042 mmol/l 6-Thioguanin-Lösung bzw.
20 µl einer 0,6 mmol/l 6-Mercaptopurin-Lösung gestartet. Die Inkubation erfolgte
für 0, 5, 20, 45, 90 min bzw. 3, 6, 12 und 24 h.
Nach dem Inkubationsende wurden die Zellen analog zum Vorgehen bei
Inkubationen mit gepackten Erythrozyten erhitzt und zentrifugiert. Ca. 180 µl eines
klaren Überstands konnten gewonnen werden. Wurden die Proben nicht direkt
analysiert, so wurde der klare Überstand abpippetiert und bei –20°C eingefroren.
3.4. HPLC-Analytik
3.4.1. Nachsäulenderivatisierung der freien Thiole durch photochemische
Reaktion
Zur Oxidation der Thiolgruppen wurde dem Fließmittel nach Austritt aus der Säule
über ein T-Stück (T-junction) 10 µl/min einer 0,3 % Wasserstoffperoxid-Lösung mit
einer Knauer WellChromHPLC Pumpe K 1001 (KNAUER, Berlin) hinzugefügt. Die
Reaktion (Oxidation) erfolgte in einer PTFE-Reaktionsschleife (ICT, Wien) von
2,5 m Länge, 0,3 mm Innendurchmesser, die um eine 8 W UV-Lampe (λ=254 nm)
aufgerollt war (Abb. 3). Die Reaktionsschleife und UV-Lampe bilden die photochemische
Reaktionseinheit (PCRE). Unter diesen Bedingungen werden photolytisch
OH-Radikale gebildet, die die Sulfhydryl-Gruppen der Thiopurine und deren
Metabolite zum Sulfonat oxidieren. Nach dem Verlassen der PCRE werden die
oxidierten, z. T. stark fluoreszierenden Substanzen mit einem Fluoreszenz-Detektor
bei einer Anregungswellenlänge von 315 nm und einer Emissionswellenlänge
von 390 nm nachgewiesen.