Aus dem Institut für experimentelle und klinische - Universität zu ...

4. Ergebnisse 34
Phosphatreste keinen wesentlichen Einfluss auf die UV-Absorption der natürlichen
Purin-Nukleotide. Deshalb habe ich die Quantifizierung der 6-Methylthioinosin-
Nukleotide mit einem wässrigen Einpunkt-Standard (1 µg/ml) von 6-MMP durchgeführt.
Im Januar 2003 konnte ich von der Firma Jena Bioscience 6-Thioguanosin-5’-
Triphosphat erwerben. Die Substanz wurde als 1 mmol/l wässrige Lösung vertrieben.
Eigene Untersuchungen mit HPLC und UV-Absorption ergaben, dass die
nominale Konzentration nicht stimmen konnte, dies wurde auch von anderen
Arbeitsgruppen bestätigt. Somit konnte die Substanz ebenso wie das gleichzeitig
gelieferte 6-Thioguanosin-5’-Diphosphat nur zur Identifizierung aber nicht zur
Quantifizierung verwendet werden.
4.1.3. Bestimmung von 6-Thioguanosin-Nukleotiden durch Gradienten-HPLC
Durch die Umstellung des isokratischen HPLC-Verfahrens auf eine HPLC mit
binärem Gradienten wurde die Trennleistung deutlich verbessert. Die Verwendung
einer kürzeren Säule (LiChroCART ® 55-4, Purosphere ® Star RP 18 endcapped
60x4 mm, Partikeldurchmesser 3 µm, Firma E. Merck, Darmstadt), die Senkung
des pH-Wertes von 7,9 auf 7,0 und eine Erhöhung der Fließgeschwindigkeit auf
1 ml/min verkürzte die Retentionszeit und erhöhte die Symmetrie der Peaks.
Da die Nachweisbarkeit des nicht fluoreszierenden 6-Thioguanins und seiner
Nukleotide von der Menge an H 2 O 2 , sowie der UV-Bestrahlung abhängt, wurden
diese beiden Parameter variiert. Die Erhöhung des Wasserstoffperoxids von
5 µl/min auf 10 µl/min führte zum Anstieg des Fluoreszenzsignals (Abb. 9). Im
Bereich zwischen 10 und 20 µl/ml H 2 O 2 blieb die Fluoreszenzintensität von
6-Thioguanin konstant.
Für die HPLC-Analytik wurde 10 µl/min H 2 O 2 gewählt, da durch größere Mengen
an H 2 O 2 das 6-Methylthioguanin und seine Nukleotide zerstört wurden.