Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Aus dem Forschungszentrum Borstel
Leibniz-Zentrum für Medizin und Biowissenschaften
Abteilung Klinische Medizin
Direktor: Prof. Dr. P. Zabel
Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden
Schistosomen-Ei-Proteins IPSE zur Untersuchung eines
neuartigen Mechanismus der Basophilenaktivierung
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Technisch-Naturwissenschaftliche Fakultät -
vorgelegt von
Maren Wodrich
aus Hamburg
Lübeck 2006

Diese Arbeit wurde in der Laborgruppe
Zelluläre Allergologie
(Leiter: PD Dr. med. H. Haas)
am Forschungszentrum Borstel angefertigt
1. Berichterstatter: Prof. Dr. K.-O. Holst
2. Berichterstatter: PD Dr. H. Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 5. Juli 2006

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................................ 6
Zusammenfassung................................................................................................................................................. 8
1 Einleitung..................................................................................................................................................... 10
1.1 Das Th1/Th2-Konzept .......................................................................................................................... 11
1.2 Induktion einer differenzierten Th-Antwort.......................................................................................... 12
1.3 Basophile Granulozyten....................................................................................................................... 13
1.4 Helminthen induzieren eine Th2-Immunantwort.................................................................................. 14
1.5 Schistosoma mansoni als Modellorganismus zur Untersuchung der Th2-Induktion ........................... 16
1.6 IPSE - ein sekretiertes Schistosoma mansoni-Protein setzt IL-4 aus humanen Basophilen frei .......... 17
1.7 Ziel dieser Arbeit.................................................................................................................................. 19
2 Materialien................................................................................................................................................... 20
2.1 Reagenzien ........................................................................................................................................... 20
2.2 Häufig verwendete Puffer und Nährmedien......................................................................................... 23
2.2.1 Puffer ........................................................................................................................................ 23
2.2.2 Nährmedien............................................................................................................................... 24
2.3 Antibiotika............................................................................................................................................ 25
2.4 Antikörper ............................................................................................................................................ 25
2.5 Synthetische Oligonukleotide ............................................................................................................... 26
2.6 Plasmidvektoren................................................................................................................................... 28
2.7 Zelllinien .............................................................................................................................................. 29
2.7.1 Bakterienstämme ...................................................................................................................... 29
2.7.2 Eukaryotische Zelllinien ........................................................................................................... 29
1

Inhaltsverzeichnis
3 Methoden ..................................................................................................................................................... 30
3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeiten.......................................................................................... 30
3.1.1 Kultur und Lagerung von E. coli .............................................................................................. 30
3.1.2 Transformation von E. coli-Zellen............................................................................................ 30
3.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen ........................................................... 30
3.1.2.2 Elektroporation von E. coli-Zellen.............................................................................. 31
3.1.3 Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................................. 31
3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................... 32
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration ...................................................................................... 32
3.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) ............................................. 33
3.1.7 Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Ansätzen .............................................................. 33
3.1.8 Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor............................................................... 34
3.1.9 Fällung von DNA...................................................................................................................... 34
3.1.10 DNA-Sequenzierung................................................................................................................. 34
3.1.11 Restriktion von DNA ................................................................................................................ 35
3.1.12 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Gelelution.................................................................. 35
3.1.13 Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten ......................................................................... 35
3.1.14 Klonierung der verwendeten Plasmid-Vektoren....................................................................... 36
3.2 Expression von IPSE in E. coli............................................................................................................. 37
3.2.1 Expression von rekombinantem IPSE in E. coli im kleinen Maßstab (20 ml).......................... 37
3.2.2 Expression von rekombinantem IPSE in E. coli im großen Maßstab (2000 ml)....................... 37
3.3 Reinigung von rekombinantem IPSE aus E. coli.................................................................................. 38
3.3.1 Reinigung von MBP-IPSE........................................................................................................ 38
3.3.1.1 Reinigung von MBP-IPSE über Amylose-Affinitätschromatographie ....................... 38
3.3.1.2 Reinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration ............................................................. 38
3.3.2 Reinigung von IPSE aus E. coli Origami-Zellen ...................................................................... 39
3.4 293 HEK-Zellen ................................................................................................................................... 40
3.4.1 Kultur und Lagerung von 293 HEK-Zellen .............................................................................. 40
3.4.2 Transfektion von 293 HEK-Zellen ........................................................................................... 40
3.4.3 Expression von rekombinantem IPSE in 293 HEK-Zellen ....................................................... 41
3.5 Insektenzellen ....................................................................................................................................... 42
3.5.1 Kultur und Lagerung von Insektenzellen.................................................................................. 42
3.5.2 Transfektion von Insektenzellen ............................................................................................... 42
3.5.3 Expression von rekombinantem IPSE in Insektenzellen........................................................... 43
2

Inhaltsverzeichnis
3.6 Reinigung von rekombinantem IPSE aus eurkaryotischen Zellen........................................................ 44
3.6.1 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)......................................................... 44
3.6.2 Immunoaffinitätschromatographie............................................................................................ 44
3.6.2.1 Herstellung einer anti-IPSE-Säule .............................................................................. 44
3.6.2.2 Proteinreinigung von IPSE über eine anti-IPSE-Säule ............................................... 45
3.6.3 Reinigung von HEK-IPSE über Gelfiltration ........................................................................... 45
3.7 Allgemeine proteinchemische Methoden.............................................................................................. 46
3.7.1 Bestimmung der Proteinkonzentration...................................................................................... 46
3.7.1.1 Bestimmung der Proteinkonzentration über spektralphotometrische
Absorptionsmessung................................................................................................... 46
3.7.1.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode (Smith et al. 1985) ................................. 46
3.7.2 Dialyse von Proteinlösungen .................................................................................................... 47
3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970) .......................... 47
3.7.4 Färbung von Polyacrylamidgelen ............................................................................................. 49
3.7.4.1 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988)............................................... 49
3.7.4.2 Coomassie-Färbung nach Neuhoff et al. (1988) ......................................................... 50
3.7.5 Westernblot............................................................................................................................... 50
3.7.5.1 Proteinnachweis im Westernblot über India Ink-Färbung
(Hancock und Tsang, 1983)........................................................................................ 51
3.7.5.2 Spezifischer Proteinnachweis und Antikörperbindung im Westernblot ..................... 51
3.7.6 Biotinylierung von Proteinen.................................................................................................... 52
3.8 Methoden zur Untersuchung von IPSE ................................................................................................ 53
3.8.1 Doppelimmunodiffusionsassay nach Ouchterlony.................................................................... 53
3.8.2 Deglycosylierung von Proteinen............................................................................................... 54
3.8.3 Massenspektrometrische Untersuchung mit MALDI-TOF-MS................................................ 54
3.8.4 Kristallisation............................................................................................................................ 55
3.9 Methoden zur Untersuchung der Wirkung von IPSE auf basophile Granulozyten .............................. 57
3.9.1 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten...................................................................... 57
3.9.1.1 Ficoll/Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation .......................................................... 57
3.9.1.2 Gegenstrom-Elutriation .............................................................................................. 57
3.9.1.3 Bestimmung von Zellzahl und Basophilenreinheit ..................................................... 58
3.9.1.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads................................................. 58
3.9.2 Stimulation der Basophilen zur IL-4-Freisetzung..................................................................... 58
3.9.3 Stripping und Resensibilisierung von Basophilen .................................................................... 59
3.9.4 IL-4-ELISA............................................................................................................................... 59
3.9.5 Anfertigung von Zytospinpräparaten ........................................................................................ 60
3.9.6 Durchflusszytometrie (FACS) .................................................................................................. 60
3.9.6.1 Nachweis der Bindung von IPSE an Basophile .......................................................... 60
3.9.6.2 Nachweis von CD203c an der Oberfläche von Basophilen ........................................ 61
3

Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse.................................................................................................................................................... 62
4.1 Expression von IPSE in E. coli............................................................................................................. 62
4.1.1 Klonierung der Sequenz von IPSE in unterschiedliche Expressionsvektoren .......................... 62
4.1.1.1 pET26-IPSE................................................................................................................ 62
4.1.1.2 pBM1.1-IPSE.............................................................................................................. 63
4.1.1.3 pMalC-IPSE und pMalP-IPSE.................................................................................... 64
4.1.2 Optimierung der Expression von IPSE in E. coli durch Variation der Expressionsparameter.. 65
4.1.2.1 Periplasmatische Expression von IPSE....................................................................... 65
4.1.2.2 Einfluss der Temperatur auf die IPSE-Expression...................................................... 65
4.1.2.3 Einfluss von Salzstress auf die IPSE-Expression........................................................ 66
4.1.2.4 Einfluss der IPTG-Konzentration auf die IPSE-Expression ....................................... 67
4.1.3 Optimierung der Expression von IPSE in E. coli durch Expression als Fusionsprotein ........... 68
4.1.3.1 Expression von IPSE als MBP-Fusionsprotein........................................................... 68
4.1.3.2 Expression von IPSE als Thioredoxin-Fusionsprotein................................................ 71
4.2 Expression von IPSE in eukaryotischen Zellen.................................................................................... 73
4.2.1 Expression und Reinigung von IPSE aus 293 HEK-Zellen (HEK-IPSE)................................. 73
4.2.1.1 IPSE wird von 293 HEK-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert..................... 73
4.2.1.2 Das Expressionsoptimum für HEK-IPSE liegt bei 10 bis 11 Tagen........................... 74
4.2.1.3 HEK-IPSE kann über zwei Schritte aus dem Expressionsmedium
aufgereinigt werden .................................................................................................... 75
4.2.1.4 Bilanzierung der Aufreinigung von HEK-IPSE.......................................................... 78
4.2.2 Strukturelle Untersuchungen von HEK-IPSE........................................................................... 79
4.2.2.1 HEK-IPSE ist ein Dimer............................................................................................. 79
4.2.2.2 Auftrennung von gereinigtem HEK-IPSE in der Gelfiltration.................................... 79
4.2.2.3 Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über MALDI-TOF-MS .................. 81
4.2.2.4 HEK-IPSE ist glycosyliert .......................................................................................... 82
4.2.2.5 Kristallisation von HEK-IPSE .................................................................................... 84
4.2.3 Expression und Reinigung von IPSE aus High Five-Zellen (High Five-IPSE) ........................ 86
4.2.3.1 IPSE wird von High Five-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert .................... 86
4.2.3.2 Das Expressionsoptimum für High Five-IPSE liegt bei 8 Tagen................................ 87
4.2.3.3 High Five-IPSE kann über zwei Schritte aufgereinigt werden ................................... 88
4.2.3.4 High Five-IPSE ist ein Dimer ..................................................................................... 91
4.3 Funktionelle Untersuchungen von rekombinantem IPSE..................................................................... 92
4.3.1 HEK-IPSE und High Five-IPSE führen zur IL-4-Freisetzung aus Basophilen......................... 92
4.3.2 Die IL-4-Freisetzung der Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE ist IgE-abhängig ....... 93
4.3.3 Basophile degranulieren nach Stimulation mit HEK-IPSE und High Five-IPSE ..................... 94
4.3.4 Inkubation mit HEK-IPSE führt zu einer allgemeinen Aktivierung der Basophilen ................ 96
4.3.5 HEK-IPSE und High Five-IPSE binden Immunglobuline........................................................ 97
4.3.6 HEK-IPSE führt nicht zu einer Quervernetzung von Immunglobulinen .................................. 99
4

Inhaltsverzeichnis
5 Diskussion .................................................................................................................................................. 101
5.1 Expression von IPSE in E. coli........................................................................................................... 101
5.1.1 Proteingewinnung über in vitro-Rückfaltung.......................................................................... 101
5.1.2 Strategien zur Gewinnung von löslichem IPSE in E. coli....................................................... 103
5.1.2.1 Variation der Expressionstemperatur........................................................................ 103
5.1.2.2 Periplasmatische Expression..................................................................................... 103
5.1.2.3 Erniedrigung der Induktorkonzentration................................................................... 105
5.1.2.4 Expression von IPSE als Fusionsprotein .................................................................. 106
5.2 Expression von IPSE in eukaryotischen Zellen.................................................................................. 108
5.2.1 Expression von IPSE in 293 HEK-Zellen............................................................................... 108
5.2.1.1 Expression................................................................................................................. 108
5.2.1.2 Reinigung.................................................................................................................. 108
5.2.1.3 Ausbeute ................................................................................................................... 109
5.2.1.4 Dimerisierung ........................................................................................................... 110
5.2.1.5 Molekulargewicht ..................................................................................................... 110
5.2.1.6 Glycosylierung.......................................................................................................... 111
5.2.1.7 Kristallisation............................................................................................................ 113
5.3.1 Expression von IPSE in High Five-Zellen .............................................................................. 114
5.3.1.1 Expression................................................................................................................. 114
5.3.1.2 Aufreinigung............................................................................................................. 115
5.3.1.3 Ausbeute ................................................................................................................... 115
5.3.1.4 Struktur ..................................................................................................................... 116
5.4 Funktionelle Charakterisierung ......................................................................................................... 116
5.5 Vergleich der Expressionssysteme ..................................................................................................... 119
6 Literatur..................................................................................................................................................... 121
6.1 Literaturquellen ................................................................................................................................. 121
6.2 Zitierte Internetseiten ......................................................................................................................... 132
7 Veröffentlichungen.................................................................................................................................... 133
8 Danksagung ............................................................................................................................................... 134
9 Lebenslauf.................................................................................................................................................. 136
5

Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Neben den SI-Einheiten wurden folgende Abkürzungen verwendet:
AAA Aleuria aurantia Agglutinin
AP
Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumperoxodisulfat
aqua dest. destilliertes Wasser
BCA Bicinchoninsäure
BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat
bio
biotinyliert
bp
Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (englisch „bovine serum albumin“)
cDNA komplementäre DNA (englisch „complementary DNA“)
DMSO Dimethylsulfoxid
DTT 1,4-Dithioerytriol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure
ELISA englisch „enzyme linked immunosorbent assay“
EtOH Ethanol
FACS englisch „fluorescence activated cell sorter“
FBS fötales Rinderserum (englisch „fetal bovine serum”)
FcεRI Fcε-Rezeptor I
FITC Fluoresceinisothiocyanat
h
Stunde (englisch „hour”)
HBSS englisch „Hank´s balanced Salt Solution“
HRP Meerrettichperoxidase (englisch „horseradish peroxidase”)
IFN Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IMAC immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie
IMDM englisch „Iscove´s modified Dulbecco´s medium”
IPSE Interleukin-4-induzierendes Prinzip aus Schistosoma mansoni-Eiern
IPTG Isopropylthiogalactosid
kD
Kilodalton
6

Abkürzungsverzeichnis
LB
Luria-Broth
LG
Laborgruppe
MALDI englisch „matrix assisted laser desorption/ionisation“
MBP Maltosebindeprotein
min Minute
MS Massenspektroskopie
n
natürlich
NBT 4-Nitroblautetrazoliumchlorid
NTA N-Nitrilo-tri-essigsäure
OD optische Dichte
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (englisch „phosphate-buffered saline“)
PE
Phycoerythrin
Phl p Allergen des Wiesenlieschgrases Phleum pratense
rpm Umdrehungen pro Minute (englisch „rounds per minute“)
SavAP Streptavidin, das mit Alkalischer Phosphatase markiert ist
SDS Natriumdodecylsulfat (englisch „sodium dodecyl sulfate“)
S. mansoni Schistosoma mansoni
SmEA Schistosoma mansoni-Ei-Antigen
TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung (englisch „Tris-buffered saline“)
TBST TBS mit Tween 20
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
Th1 T-Helferzelle Typ 1
Th2 T-Helferzelle Typ 2
Th-Zelle T-Helferzelle
TNF Tumornekrosefaktor
TGF englisch „transforming growth factor”
TOF englisch „time of flight”
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
TRX Thioredoxin
v/v
englisch „volume per volume”
w/v englisch „weight per volume“
x g
Vielfaches der Erdbeschleunigung
7

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Typ-I-Allergien sind durch eine Th2-Immunantwort mit gesteigerter IgE-Synthese gekennzeichnet,
wobei der Mechanismus der Entstehung einer Allergie immer noch nicht vollständig geklärt ist.
Infektionen mit parasitären Würmern manifestieren sich ebenfalls in einer Th2-Immunantwort. Im
Gegensatz zur Allergie, die nur einen Teil der Bevölkerung betrifft, führen Infektionen mit parasitären
Würmern, wie z. B. Schistosoma mansoni sehr zuverlässig zu einer Th2-Immunantwort und stellen
daher ein geeignetes Modell dar, den Mechanismus der Th2-Induktion zu untersuchen. Das
Schlüsselzytokin für die Th2-Induktion ist Interleukin-(IL-)4, für welches basophile Granulozyten eine
mögliche Primärquelle darstellen. In Tat wurde gefunden, dass Basophile nach Inkubation mit
wässrigen Extrakten von S. mansoni-Eiern (SmEA), dem für die Th2-Induktion verantwortliche
Entwicklungsstadium dieses Wurms, sehr schnell große Mengen IL-4 freisetzen. Der für diesen Effekt
verantwortliche Faktor konnte aus dem Gesamtextrakt isoliert werden und wurde IPSE (IL-4-
induzierendes Prinzip aus Schistosoma mansoni Eiern) genannt. IPSE ist ein sekretiertes
Glycoprotein, das Immunglobuline bindet und Basophile zwar durch die Bindung an FcεRIgebundenem
IgΕ allerdings nach bisherigen Befunden ohne Quervernetzung über einen neuartigen
Mechanismus aktiviert. Für die weitere Untersuchung des Mechanismus der Wirkung von IPSE
werden Mengen benötigt, die durch natürliches IPSE (nIPSE) nicht realisiert werden können, da
nIPSE im SmEA nur in sehr geringer Konzentration vorliegt. Für weitere Untersuchungen muss IPSE
in rekombinanter Form hergestellt werden. Rekombinantes in E. coli-Zellen exprimiertes IPSE
(E. coli-IPSE) wird unlöslich in inclusion bodies abgelegt und muss chemisch zurückgefaltet werden.
E. coli-IPSE ist zwar funktionell aktiv, jedoch zum Teil auch aufgrund der fehlenden Glycosylierung
sehr schlecht löslich.
Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit, ein geeignetes Expressionssystem zu finden, in dem
IPSE löslich und in ausreichender Menge exprimiert wird. Dafür wurden unterschiedliche
Expressionsvektoren und -bedingungen in E. coli ausgetestet und humane 293 HEK-Zellen und
Insektenzellen, in denen das Protein glycosyliert wird, als Expressionssysteme untersucht.
In E. coli-Zellen konnte weder durch periplasmatische Expression noch durch Temperaturabsenkung,
Herabsetzung der Induktorkonzentration und Salzstressbedingungen lösliches IPSE gewonnen werden.
Lediglich die Expression als Maltosebindeprotein-(MBP)-Fusionsprotein oder Thioredoxin-(TRX)-
Fusionsprotein führt zu löslichem Protein, welches jedoch bei der weiteren Aufarbeitung Aggregate
bildet oder aus der Lösung präzipitiert.
Im Gegensatz dazu lässt sich IPSE sowohl in 293 HEK-Zellen wie auch in Insektenzellen löslich
exprimieren (HEK- bzw. High Five-IPSE). Dieses wird von den Zellen in den Kulturüberstand
sekretiert und ließ sich aus diesem über ein zweistufiges Reinigungsverfahren bis zu einer sehr guten
8

Zusammenfassung
Reinheit aufreinigen. Dabei zeigten HEK-Zellen eine deutlich bessere Expressionsleistung. Analog zu
nIPSE, einem Homodimer, sind auch die beiden rekombinanten IPSE-Proteine dimerisiert, wobei
High Five-IPSE auch noch eine gewisse Menge an Monomer aufweist. Beide rekombinanten IPSE-
Proteine sind wie auch nIPSE glycosyliert, wobei nIPSE zwei, HEK-IPSE vier und High Five-IPSE
drei Glycoformen nach Auftrennung in der SDS-PAGE zeigt. Das Molekulargewicht von HEK-IPSE
wurde über MALDI-TOF-MS bestimmt und ist mit 34 bis 39 kD vergleichbar mit dem des nIPSE .
HEK-IPSE ist sehr gut löslich und lässt sich auf mindestens 22 mg/ml konzentrieren. Dadurch war es
mit diesem Material erstmals möglich ein Kristallisationsexperiment anzusetzen.
Sowohl HEK-IPSE als auch High Five-IPSE sind funktionell aktiv, d. h. sie binden Immunglobuline,
bewirken eine Degranulation der Basophilen und induzieren die Freisetzung von IL-4. Dabei zeigt
sich, dass HEK-IPSE die gleiche IL-4-Freisetzungskapazität besitzt wie nIPSE, die von High Five-
IPSE ist etwas schwächer. Des Weiteren konnte in FACS-Experimenten gezeigt werden, dass HEK-
IPSE IgE-abhängig an die Basophilen bindet und dass dabei der Basophilenaktivierungsmarker
CD203c hochreguliert wird. Bezüglich des Aktivierungsmechanismus konnte auch mit HEK-IPSE,
wie zuvor mit dem weniger löslichen E. coli-IPSE, keine Quervernetzung der Immunglobuline
nachgewiesen werden, was die bisherige Hypothese eines neuartigen Aktivierungsmechanismus
untermauert.
Mit den 293 HEK-Zellen konnte in dieser Arbeit ein geeignetes Expressionssystem gefunden und
etabliert werden, mit dem größere Mengen an rekombinantem, funktionell aktivem und löslichem
IPSE gewonnen werden können. Mit diesem Material ist es nun möglich, Versuche zur Aufklärung
des Mechanismus der Basophilenaktivierung durchzuführen, bei denen höhere Proteinkonzentrationen
unerlässlich sind.
9

Einleitung
1 Einleitung
Allergien haben in den letzten Jahrzehnten weltweit stark zugenommen und stellen mittlerweile die
häufigste durch Umweltfaktoren ausgelöste Erkrankung dar. 20 bis 30 % der Weltbevölkerung leiden
unter einer Allergie (Ring et al. 2001) und nach Schätzungen der WHO könnte die Zahl bis zum Jahr
2010 auf 40 bis 50 % angestiegen sein [1]. Es gibt mehrere Formen der Allergie (Typ I bis Typ IV
nach Coombs und Gell, 1963). Die häufigste Form stellt die Allergie vom Typ I (im Folgenden als
Allergie bezeichnet) dar. Darunter versteht man eine Hyperreaktivität des Immunsystems gegenüber
harmlosen Antigenen (Proteine aus Pollenkörnern, Katzenhaaren, etc.) unter Schädigung des
körpereigenen Gewebes. Typ-I-Allergien werden auch Allergien vom Soforttyp genannt, da die
Symptome bei sensibilisierten Personen bereits wenige Minuten nach Allergenkontakt auftreten. Das
Symptomspektrum reicht von allergischer Rhinitis („Heuschnupfen“), atopischem Ekzem, Urtikaria
bis zum bronchialen Asthma. In seltenen Fällen kann die Allergie durch einen anaphylaktischen
Schock zum Tode führen. Die Faktoren, die zu der Entstehung einer Allergie führen, sind
vielschichtig. Neben genetischer Prädisposition haben auch Infektionen, Umwelteinflüsse und der
psycho-soziale Status einer Person einen Einfluss. Über den Einsatz von anti-Histaminika und
Kortison lassen sich die Symptome der Allergie bei einigen Patienten in den Griff bekommen, jedoch
wären kausale Therapiekonzepte, die die Ursache der Allergie bekämpfen, den symptomatischen
Therapien vorzuziehen. Hierfür steht zurzeit nur die Hyposensibilisierungstherapie, die nur bei einigen
wenigen Allergenen zum Erfolg führt, zur Verfügung.
Charakteristisch für eine Allergie ist die gesteigerte Synthese des Immunglobulin E (IgE). Der
Klassenwechsel von IgG zu IgE wird durch T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2-Zellen) vermittelt. Diese
schütten u. a. das Zytokin Interleukin (IL)-4 aus, welches nachfolgend den Klassenwechsel in
B-Zellen auslöst. Die Induktion des Klassenwechsels ist recht gut untersucht. Die Faktoren bei einer
Allergie, die eine Differenzierung von Th0-Zellen zu Th2-Zellen auslösen, sind jedoch weitgehend
unklar. Daher wäre es für die Allergieforschung von Bedeutung den Mechanismus dieser Reaktion
weiter aufzuklären. Bedingt durch den multifaktoriellen Charakter einer Allergie ist die Aufklärung
dieses Mechanismus über die Untersuchung des Effektes von Allergenen jedoch schwierig.
Infektionen mit helminthischen Parasiten sind wie auch die Allergie vom Typ I durch eine gesteigerte
IgE-Synthese und Eosinophilie gekennzeichnet, die durch Th2-Zellen vermittelt wird (Maizels und
Yazdanbaksh 2003). Im Gegensatz zur Allergie wird diese Reaktion nicht von vielschichtigen
exogenen und endogenen Faktoren beeinflusst, sondern führt zuverlässig bei jedem Menschen zu einer
Th2-Induktion. Aus diesem Grund erscheint es sinnvoll, diesen Reaktionsweg der Immunantwort in
dem weniger komplexen Wurmmodell zu untersuchen, um bessere Kenntnis über die Induktion der
IgE-Synthese bei der Typ-I-Allergie zu erlangen.
10

Einleitung
Bei dem Pärchenegel Schistosoma mansoni ist es das Ei-Stadium, welches zu einer Th2-Induktion
führt (Grzych et al. 1991). Der wasserlösliche Extrakt aus diesen Eiern (SmEA = Schistosoma
mansoni Ei Antigen) bewirkt bei humanen basophilen Granulozyten eine potente IL-4-Freisetzung
(Falcone et al. 1996). Das für diesen Effekt verantwortliche aktive Prinzip konnte aus SmEA isoliert
und charakterisiert werden und wurde IPSE („IL-4-inducing principle from Schistosoma mansoni
eggs“) genannt (Schramm et al. 2003). IPSE ist das einzige Protein aus SmEA, das zu solch einer
IL-4-Freisetzung fähig ist und ist daher ein geeignetes Werkzeug, den Mechanismus der
Basophilenaktivierung und der Th2-Induktion zu untersuchen.
Die immunologischen und immunparasitologischen Grundlagen, auf denen die vorliegende Arbeit
aufbaut, werden im Folgenden detailliert erläutert.
1.1 Das Th1/Th2-Konzept
Das Immunsystem hat verschiedene Strategien auf eindringende Organismen und andere Antigene zu
reagieren. Die erste Verteidigungslinie - und auch die evolutiv ältere Strategie - stellt die angeborene
Immunität dar, die schnell auf eine Vielzahl von Pathogenen reagieren kann. Wird diese
Verteidigungslinie von den Pathogenen überwunden, wird die Abwehr von der antigenspezifischen,
erworbenen Immunität übernommen.
Für die Koordination der antigenspezifischen Immunantwort sind die T-Helferzellen (Th-Zellen)
verantwortlich. Mosman et al. (1986) konnten erstmals im Mausmodell zeigen, dass sich diese Th-
Zellen in zwei Subtypen einteilen lassen, die sich durch das von ihnen sezernierte Zytokinprofil
unterscheiden. Th1-Zellen produzieren vorwiegend die Zytokine IL-2, Interferon (IFN)-γ und den
Tumornekrosefaktor (TNF)-β, wohingegen Th2-Zellen die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13
freisetzen. Diese Dichotomie der Zytokinproduktion konnte später auch vom murinen System auf das
humane System übertragen werden (Romangnani 1991). Die Art des Zytokinprofils hat Auswirkungen
auf die nachfolgende Immunantwort. So aktivieren Th1-Zellen mit ihren Zytokinen eher die zelluläre
Immunität während Th2-Zellen die humorale Immunität stimulieren.
Das Konzept von Mosman mit einer strengen Th1-Th2-Dichotomie ist jedoch lediglich als
Modellvorstellung zu verstehen, da es mit einigen Einschränkungen behaftet ist. So gibt es
beispielsweise auch Th-Zellen, die sowohl Th1-artige als auch Th2-artige Zytokine produzieren, die so
genannten Th0-Zellen. Eine strenge Einteilung in eine der beiden Zellpopulationen ist somit nicht
möglich und jegliche Übergangsformen im Zytokinprofil einer Th-Zelle sind beobachtet worden
(Kelso 1995). Ging Mosman noch davon aus, dass die Gene von Th1- bzw. Th2-Zytokinen
gleichzeitig transkribiert werden, so zeigt sich heute, dass jedes Zytokin auf genetischer Ebene
unabhängig von den anderen Zytokinen reguliert wird (Kim et al. 1999; Szabo et al. 2000).
11

Einleitung
Th1- bzw. Th2-Immunantworten sind für den Organismus jedoch nicht immer protektiv, sondern
können bei überschießenden Immunantworten zu pathologischen Reaktionen führen. Bei einer
dominanten Th1-Reaktion können das beispielsweise Autoimmunerkrankungen (Diabetes mellitus,
Morbus Crohn, Multiple Sklerose etc.), Transplantatabstoßungsreaktionen oder Kontaktdermatitis
sein. Überschießende Th2-Immunantworten führen dagegen zu Typ-I-Allergien.
Es exisitiert noch eine weitere Th-Zellpopulation, die in der Lage ist, diese pathologischen
Immunantworten zu supprimieren: die regulatorischen T-Zellen (T reg ) (Mills 2004). T reg -Zellen
hemmen die Immunantwort vornehmlich durch die Ausschüttung der Zytokine IL-10 und
transforming growth factor (TGF)-β, indem die Differenzierung von naiven Th-Zellen inhibiert wird.
Diese Suppression des Immunsystems scheint ein wichtiger Mechanismus gegen überschießende
Immunantworten zu sein, wie dies bei Allergien und Autoimmunkrankheiten der Fall ist.
Dies zeigt, dass es sich bei der Immunantwort durch Th-Zellen um ein komplexes System handelt,
welches nicht durch zwei distinkt voneinander getrennte Zellpopulationen beschrieben werden kann.
Im Folgenden werden jedoch die Begriffe „Th1-Antwort“ bzw. „Th2-Antwort“ aufgrund ihres
plakativen Charakters verwendet, auch wenn darunter eher „Th1-artige“ bzw. „Th2-artige“
Immunantworten unter den genannten Einschränkungen zu verstehen sind.
1.2 Induktion einer differenzierten Th-Antwort
Wird ein Pathogen nicht über die geeignete Th-Immunantwort bekämpft, so kann das schwerwiegende
Folgen für den Organismus haben. Ein Beispiel dafür bietet die Lepra. Eine zelluläre Th1-vermittelte
Immunantwort führt zu einer milden Verlaufsform der Krankheit (Lepra tuberculosa), die zur Heilung
und Eliminierung der Bakterien aus dem Körper führt. Eine humorale Th2-vermittelte Immunantwort
führt dagegen zur Ausbreitung der Bakterien im Körper und nimmt einen schwerwiegenden Verlauf
(Lepra lepromatosa) (Review in Modlin 1994).
Welche Immunantwort zur Bekämpfung des jeweiligen Pathogens zum Einsatz kommt, hängt unter
anderem von der Art der Antigenpräsentation, der Konzentration des Antigens, dem Ort der
Antigenaufnahme, genetischen Faktoren aber vor allem dem umgebenden Zytokinmilieu ab. IL-12
stellt das Schlüsselzytokin für eine Weichenstellung in Richtung Th1-Differenzierung dar. Die
zelluläre Quelle des IL-12 sind vor allem dendritische Zellen. Diese werden mit einigen Ausnahmen
vornehmlich durch virale, bakterielle oder protozoische Pathogene aktiviert.
Das Schlüsselzytokin für die Th2-Differenzierung ist IL-4. Um dieses IL-4, das für die Induktion der
Th2-Differenzierung verantwortlich ist, von dem IL-4, welches später von Th2-Zellen selbst sezerniert
wird, abzugrenzen, spricht man hier von dem so genannten „frühen IL-4“. Allergene und parasitäre
Würmer sind die wichtigsten Auslöser der frühen IL-4-Synthese, jedoch ist hier die zelluläre Quelle
12

Einleitung
des Zytokins noch nicht eindeutig bestimmt. Neben Th2-Zellen sind Mastzellen, eosinophile und
basophile Granulozyten in der Lage IL-4 freizusetzen. T-Zellen sind als Quelle des frühen IL-4
unwahrscheinlich, da zum Zeitpunkt einer ersten polarisierenden Immunreaktion noch keine
spezifischen T-Zellen vorhanden sind. Des Weiteren konnte in Arbeiten von Sabin und Pearce (1995)
gezeigt werden, dass selbst CD4 + -depletierte C57BL/6-Mäuse, die mit Schistosoma mansoni-Eiern
infiziert wurden, mit einer „frühen-IL-4“-Antwort auf die Infektion reagieren. Mastzellen sind als
gewebsständige Zellen nicht mobil und eosinophile Granulozyten können lediglich geringe Mengen an
IL-4 sezernieren. Basophile hingegen sind in der Lage große Mengen IL-4 freizusetzen und sind als
Blutzellen auch mobil. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass Basophile die zelluläre Quelle des
frühen IL-4 sind.
Die Induktion der Th-Differenzierung ist ein komplexes System bei dem IL-4 und IL-12 als
Gegenspieler fungieren und sich gegenseitig inhibieren können. Szabo et al. (1997) konnten zeigen,
das in der Maus naive Th-Zellen nach Aktivierung über den T-Zell-Rezeptor die β-Untereinheit des
IL-12-Rezeptors exprimieren. Ist IL-4 bei der Th-Zell-Aktivierung anwesend, so wird diese
Expression inhibiert und IL-12 ist für die Differenzierung der Th-Zelle wirkungslos und es kann keine
Th1-Antwort erfolgen. Umgekehrt verhindert IFN-γ die Wirkung von IL-4 auf die Th-Zell-
Differenzierung.
1.3 Basophile Granulozyten
Neben den neutrophilen und eosinophilen Granulozyten stellen die basophilen Granulozyten mit
0,5 - 1 % der Gesamtleukozyten eine sehr kleine Zellpopulation dar. Ihr Name leitet sich von der
Anfärbbarkeit ihrer Granula mit basischen Farbstoffen wie z. B. Methylenblau ab. Die anfärbbaren
Granula enthalten vor allem präformiertes Histamin, Heparin und Leukotriene. Aufgrund ihrer
geringen Anzahl, der schlechten Nachweisbarkeit und fehlenden Aufreinigungsmethoden wurden sie
lange Zeit nicht beachtet und galten lediglich als „Mastzellen des Blutes“ (Gibbs 2005). Mittlerweile
geht man jedoch davon aus, dass im humanen System eher die Basophilen als die Mastzellen für die
Initiation der Th2-Antwort über Ausschüttung der Zytokine IL-4 und IL-13 verantwortlich sind. Im
Mausmodell konnte die Quelle für frühes IL-4 auf eine myeloide Zelle eingegrenzt werden, die IgE +
aber Kit - und I-A/I-E - ist. Die Autoren schlossen daraus, dass es sich dabei nur um Basophile handeln
kann (Luccioli et al. 2002). Weiterhin konnten Mukai et al. (2005) zeigen, dass Basophile eine
wichtige Rolle bei der Entstehung einer chronischen allergischen Entzündung spielen unabhängig von
Mastzellen und T-Zellen. MacGlashan et al. (1994) fanden eine Korrelation zwischen der mRNA für
IL-4 und dem Anteil an Basophilen in den peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). Insofern
scheinen die Basophilen auch im humanen System eine wichtige Quelle für frühes IL-4 zu sein.
13

Einleitung
Auf ihrer Oberfläche exprimieren die Basophilen wie auch die Mastzellen den FcεRI-Rezeptor über
den sie freies IgE aus dem Blut binden. Bei einer Allergie werden die Basophilen durch
Quervernetzung dieses FcεRI-ständigen IgEs über ein Allergen antigenspezifisch aktiviert und setzen
die Mediatoren Histamin, Leukotrien und IL-4 frei (Metzger 1992). Histamin liegt dabei präformiert
in den Granula vor und kann über Degranulation sehr schnell freigesetzt werden (Kagey-Sobotka et al.
1981). Leukotriene und IL-4 werden nach Aktivierung größtenteils de novo synthetisiert und werden
somit verzögert abgegeben (Hart 2001). Für die Symptome einer Allergie sind das Histamin und
Leukotrien C4 verantwortlich, da es sich bei diesen Mediatoren um potente Vasodilatatoren handelt.
Zusätzlich wirkt Leukotrien C4 noch schleimfördernd und brochokonstriktorisch. Jedoch können nicht
nur Allergene Basophile aktivieren, auch Lektine (Haas et al. 1999) und B-Zellsuperantigene wie z. B.
Protein L von Peptostreptococcus magnus (Patella et al. 1990) und das Hüllprotein gp120 des HI-
Virus (Florio et al. 2000) sind dazu in der Lage. Lektine binden an die Zuckerseitenketten des IgEs
und vermögen es somit querzuvernetzen. B-Zell-Superantigene binden antigenunspezifisch an
Immunglobuline, wie z. B. das gp120, welches an die VH3-Domäne binden kann und über diese
Bindung Immunglobuline querzuvernetzen vermag.
Für die Etablierung einer Allergie ist die Produktion Antigen-spezifischer IgE´s essentiell. Für den
Isotypwechsel von IgM zu IgE in B-Zellen bedarf es zum einen einer Interaktion zwischen CD40, das
auf B-Zellen exprimiert wird, und CD40-Ligand auf Th2-Zellen und zum anderen muss IL-4
vorliegen. Jedoch exprimieren nicht nur Th2-Zellen den CD40-Liganden, sondern auch Basophile und
Mastzellen. Diese können ebenfalls T-Zell-unabhängig über die Interaktion zwischen CD40 und
CD40-Ligand sowie IL-4 in B-Zellen einen Isotypwechsel zur IgE-Synthese induzieren (Gauchat et al.
1993).
Dies zeigt, dass Basophile auf mehreren Ebenen die Entstehung und den Verlauf einer Allergie
beeinflussen können und somit eine zentrale Rolle einnehmen.
1.4 Helminthen induzieren eine Th2-Immunantwort
Helminthische Parasitosen können sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen, jedoch zeigt
sich primär bei allen diesen Infektionen eine gesteigerte IgE-Synthese, Eosinophilie und Mastozytose.
Diese drei Symptome sind auch typisch für eine Th2-Immunantwort und werden wie schon
beschrieben maßgeblich über IL-4 kontrolliert. Erste direkte Nachweise dafür, dass Helminthen beim
Menschen eine Th2-Antwort generieren, erhielt Del Prete et al. (1991) indem er aus humanen
peripheren Blutleukozyten eine Reihe von spezifischen T-Zellklonen herstellen konnte. T-Zellklone,
die spezifisch für ein exkretorisch/sekretorisches Antigen aus Toxocara canis waren, führten nach
14

Einleitung
antigenspezifischer und antigenunspezifischer Stimulation zu einer Th2-Immunantwort mit IL-4- und
IL-5-Freisetzung. Dagegen setzten T-Zellklone, die spezifisch für ein Protein aus Mycobacterium
tuberculosis waren, die Th1-Zytokine IL-2 und IFN-γ frei. IL-4 konnte auch in G4-Mäusen
nachgewiesen werden, die mit Nippostrongylus brasiliensis infiziert waren. Bei G4-Mäusen ist das
erste Exon des IL-4-Gens durch das enhanced green fluorescent protein (EGFP) ersetzt, so dass
Zellen, die IL-4 exprimieren grün leuchten. Nur infizierte Mäuse zeigten grün leuchtende Zellen. Bei
diesen Zellen handelte es sich um basophile Granulozyten. Dies ist ein weiteres Indiz für die Rolle der
Basophilen als Quelle des „frühen IL-4“ (Min et al. 2004).
Nicht nur die Th2-Zytokine werden durch Infektionen mit parasitären Würmern freigesetzt, sondern es
kommt auch zu einer gesteigerten IgE-Synthese. Dabei werden neben wurmspezifischem IgE auch
große Mengen an unspezifischem IgE synthetisiert. Schon 1969 beschrieben Orr und Blair die
„potenzierte Reaginantwort“ (Reagin = IgE) in Mäusen, die mit Nippostrongylus brasiliensis infiziert
waren. Sie zeigten, dass durch die Infektion eine bestehende IgE-Antwort auf Ovalbumin deutlich
gesteigert werden konnte. Diese Beobachtung konnte auch für weitere Wurminfektionen, gereinigte
Wurmantigene und exkretorisch/sekretorische Produkte von Würmern nachgewiesen werden (Jarret
und Miller 1982; Lee und McGibbon 1993).
Die Th2-Antwort des Immunsystems auf die Infektion mit Helminthen dient der Entfernung des
Parasiten aus dem Körper. Bei suszeptiblen B10.BR- und AKR-Mäusen führt eine Infektion mit
Trichuris muris zu einer chronischen Erkrankung wohingegen BALB/K-Mäuse resistent gegen eine
Infektion sind und die Würmer erfolgreich bekämpfen können. Es zeigte sich, dass die chronisch
infizierten Mäuse mit einer Th1-Antwort reagierten und die Th2-Antwort der BALB/K-Mäuse
protektiv wirkt (Else et al. 1992). Die Entfernung parasitärer intestinaler Würmer aus dem Darm durch
eine Th2-Antwort erfolgt nach Maizels und Holland (1998) auf zwei Ebenen. Zum einen wirken die
Th-2-Zytokine IL-4 und IL-13 direkt auf Zellen der Darmschleimwand und bewirken eine erhöhte
Mucussekretion und Peristaltik, wodurch die Würmer ausgeschleust werden. Zum anderen kommt es
zu einer Degranulation der Mastzellen. Die dabei freigesetzten Mediatoren IL-4, IL-13, Histamin und
Leukotriene intensivieren diese Wirkung noch.
Würmer haben jedoch in Millionen von Jahren währender Co-Evolution mit ihrem jeweiligen Wirt
sehr effektive Strategien entwickelt, dessen Immunantwort zu entfliehen, um so ein Überleben im Wirt
auf lange Zeit zu sichern. Zu diesen Strategien zählen u.a. die Sekretion von immunmodulatorischen
Molekülen, der Einbau von Wirtsantigenen in das Tegument (molekulare Mimikry), die enzymatische
Spaltung von Antikörpern und der schnelle Austausch ihrer Oberflächenmembran durch vorgeformte
Membranvesikel (Pearce und Sher 1987; Damian 1997, Maizels et al. 1993). Für Schistosomen konnte
im Menschen eine Verweildauer von über 30 Jahren festgestellt werden (Chabasse et al. 1985). Dies
verdeutlicht beispielhaft das ausgewogene Kräfteverhältnis in der Wirt-Parasit-Beziehung in diesem
speziellen Fall.
15

Einleitung
1.5 Schistosoma mansoni als Modellorganismus zur Untersuchung der
Th2-Induktion
Der Trematode Schistosoma mansoni (Sambon 1907) ist der Erreger der Darmbilharziose. Weltweit
sind ca. 200 Millionen Menschen von Schistosomiasis betroffen und mehr als 300.000 Menschen
sterben pro Jahr alleine in Afrika in der Sub-Sahara-Zone - dem Hauptverbreitungsgebiet von
Schistosoma mansoni - an der Infektion (van der Werf 2003). Die Hauptinfektionsquelle sind stehende
Süßgewässer in den Tropen, da diese der Lebensraum des Zwischenwirtes - Schnecken der Gattung
Biomphalaria - sind. Die Schnecken scheiden in das Wasser große Mengen an Zerkarien
(Gabelschwanzlarven) aus, die sich durch die Haut exponierter Menschen einbohren. Bei diesem
Prozess verlieren sie ihre Glycokalyx und den Gabelschwanz und entwickeln sich zum
Schistosomulum. Die Schistosomula durchwandern den Körper über das Blutsystem, bis sie
schließlich an ihrem Bestimmungsort - dem Pfortadersystem - angelangt sind. Dort entwickeln sie sich
zu geschlechtsreifen Würmern und wandern anschließend in die Mesenterialgefäße des Darmes. Das
Weibchen lebt in einer Dauerkopula in der ventralen Bauchfalte des Männchens und kann am Tag bis
zu 1000 Eier legen. Die Eier gelangen über Blutgefäße mit Hilfe von proteolytischen Enzymen in den
Darm und werden mit dem Stuhl ausgeschieden. Bei Kontakt der Eier mit Süßwasser schlüpfen durch
den hypotonischen Reiz aus den Eiern Mirazidien (Flimmerlarven), die den Zwischenwirt
chemotaktisch aufsuchen und sich in ihn einbohren. Dort vermehren sie sich parthenogenetisch über
Sporozysten zu Zerkarien und der komplexe Lebenszyklus ist geschlossen.
Für das Immunsystem des Wirtes stellt solch eine Infektion eine große Herausforderung dar, da der
Parasit in drei verschiedenen Entwicklungsstadien (Ei, Schistosomulum, adulter Wurm) mit
unterschiedlichen Oberflächen und Antigenen im Körper auftritt. Tatsächlich reagiert das
Immunsystem auf eine Schistosoma mansoni-Infektion mit unterschiedlichen Immunantworten auf die
Infektion. Nach Eindringen der Zerkarien und während der Wanderung der Schistosomula ist die
Immunantwort durch Th1-Zytokine geprägt. Erst sechs Wochen nach der Infektion, wenn die ersten
Eier nachweisbar sind, entwickelt sich eine starke Th2-Antwort (Pearce und MacDonald 2002). Diese
Th2-Antwort wird begleitet von einer erhöhten Anzahl an Eosinophilen, Basophilen und Mastzellen
und einem hohen IgE-Titer. Ab Woche neun nach der Infektion wird auch die Th2-Reaktion
supprimiert und es kommt zu einer regulatorischen T-Zellreaktion mit Ausschüttung der Zytokine
IL-10 und TGF-β. Dass tatsächlich die Eier das für die Th2-Induktion verantwortliche
Entwicklungsstadium sind, zeigen Untersuchungen von Grzych et al. (1991). Bei normalen
Schistosomen-Infektionen werden zunächst die Th1-Zytokine IFN-γ und IL-2 gemessen. Nach sechs
Wochen Infektion wird diese Immunantwort von einer Th2-Antwort abgelöst mit Ausschüttung der
Zytokine IL-5 und IL-4. Im Gegensatz dazu hält bei eingeschlechtlichen Infektionen, bei denen keine
Eier abgelegt werden können, die anfängliche Th1-Antwort dauerhaft an.
16

Einleitung
Die Eier sind auch das Stadium, das die meisten pathologischen Veränderungen im Wirt hervorruft
und für das Krankheitsbild verantwortlich ist. Die Hälfte der produzierten Eier gelangt nicht über den
Darm nach außen, sondern verbleibt im Körper. Diese Eier werden in kollagenhaltigen Granulomen
von Immunzellen (Makrophagen, Eosinophile und CD4 + -T-Zellen) eingeschlossen (Pearce und
MacDonald 2002) und stimulieren über lösliche Ei-Antigene die Fibroblastenproliferation und
Kollagensynthese (Prakash und Wyler 1992), so dass es zur Leberfibrose kommt. Die Granulome
können durch Raumforderung und damit Druck von außen die Gefäße einengen und so zu
Hepatosplenomegalie und Ascites führen. Über weitere sekretierte Proteine können Schistosomen die
Immunantwort modulieren und über Proteasen ihre Wanderung durch das Endothel und Darmepithel
vollziehen. Diese Proteine werden vor allem in einem Bereich mit hoher Proteinsyntheserate zwischen
dem Mirazidium und der Eischale - dem Reynold´s layer und dem von Lichtenberg´schen envelope -
gebildet und über Poren in der Eischale in die Umgebung sekretiert (Ashton et al. 2001). Von
besonderer Bedeutung sind die sekretierten immunmodulatorischen Proteine, vor allem auch dadurch,
dass sie eine Quelle für potentielle neue Arzneimittel gegen eine Vielzahl von Krankheiten darstellen
können (Smith et al. 2005).
1.6 IPSE - ein sekretiertes Schistosoma mansoni-Protein setzt IL-4 aus
humanen Basophilen frei
Wie bereits beschrieben sind wässrige Extrakte von Schistosoma mansoni-Eiern starke Th2-
Induktoren. Werden humane Basophile in vitro mit SmEA inkubiert, so lassen sich im
Kulturüberstand die Th2-Mediatoren IL-4, IL-13 und Histamin nachweisen (Falcone et al. 1996,
Schramm et al. 2003). Aus diesen wässrigen Extrakten konnten Schramm et al. (2003) ein Protein
isolieren und charakterisieren, welches als einziges Protein aus dem Extrakt für die
Basophilenaktivierung und Mediatorfreisetzung ist. Dieses Protein erhielt den Namen IPSE als
Abkürzung für „IL-4 inducing principle from Schistosoma mansoni eggs“. IPSE wurde erstmals von
Dunne et al. (1991) unter dem Namen alpha-1 als kationisches Schistosomen-Ei-Antigen beschrieben,
welches möglicherweise in der Serodiagnostik einsetzbar ist. Spätere Untersuchungen zeigten, dass
IPSE mit alpha-1 identisch ist (Schramm et al. 2006). Kürzlich wurde von Smith et al. (2005) ein
Chemokin-bindendes Protein aus Schistosoma mansoni-Eiern (SmCKBP) beschrieben, welches mit
IPSE identisch ist. Dieses Protein bindet an die Chemokine IL-8 und MIP-1α und zeigt in vivo
antiinflammatorische Aktivität. Auch Williams et al. (2005) beschreiben ein Protein aus SmEA,
welches identisch ist mit IPSE. Dieses SmEP25 stimuliert CD4 + Th-Zellen zur Proliferation in BL/6-
und CBA-Mäusen.
17

Einleitung
Im Folgenden wird aufgeführt, was zu Beginn dieser Arbeit bereits über IPSE bekannt war.
Natürliches IPSE (nIPSE) ist ein Homodimer und hat ein Molekulargewicht von 40 kD. Ungefähr ein
Drittel des Molekulargewichtes nehmen dabei die Glycosylierungen ein. IPSE wird von dem Ei in
dem von Lichtenberg´s envelope, einem Gewebe, das sich durch eine sehr hohe Proteinsyntheserate
auszeichnet, synthetisiert und in das Gewebe sekretiert. Immunhistologische Untersuchungen konnten
nachweisen, dass IPSE von den umgebenden Immunzellen des Wirtes aufgenommen wird.
Über N-terminale Sequenzierung des aufgereinigten Proteins und Screening einer cDNA-Bank konnte
über Datenbankrecherche ein expressed sequence tag (EST) gefunden werden (GenBank accession
number AI820476) und die DNA-Sequenz von IPSE aufgeklärt werden (GenBank accession number
AY028436). Die Sequenz des Präproteins besitzt 134 Aminosäuren, wobei ein Signalpeptid von
20 Aminosäuren bei der Sekretion abgespalten wird. Monomeres IPSE weist sieben Cysteinreste und
zwei potentielle N-Glycosylierungstellen auf. Es bestehen keinerlei Homologien zu bereits bekannten
Proteinen; IPSE ist somit ein bisher einzigartiges Protein. Über Klonierung in einen Expressionsvektor
konnte IPSE in E. coli erfolgreich als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert werden. Bei dieser
Expression wird IPSE allerdings unlöslich in inclusion bodies abgelegt. Aus diesen inclusion bodies
kann jedoch über eine Rückfaltungsstrategie aktives IPSE generiert werden. Dieses sogenannte
E. coli-IPSE wurde zur weiteren Charakterisierung eingesetzt. Da in E. coli keine Glycosylierungen
stattfinden, ist es offensichtlich, dass tatsächlich der Proteinanteil dieses Moleküls für die IL-4-
Freisetzung verantwortlich ist.
Humane Basophile nicht-infizierter Spender degranulieren bereits nach Inkubation mit geringen
Mengen (20-100 ng/ml) IPSE unter Freisetzung von IL-4, IL-13 und Histamin. In
Strippingexperimenten, bei denen FcεRI-gebundenes IgE von der Oberfläche der Basophilen entfernt
wird, konnte nachgewiesen werden, dass die Basophilenaktivierung IgE-abhängig ist. Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass IPSE nicht nur an IgE sondern auch speziesübergreifend an die
Immunglobuline IgM, IgA und IgG bindet. Es handelt sich bei dem Protein also um einen allgemeinen
Immunglobulin-bindenden Faktor (Blindow 2004). Dabei scheint IPSE die Basophilen nicht wie
Allergene, B-Zellsuperantigene (Florio et al. 2000) oder Lektine (Haas et al. 1999) über eine
Quervernetzung zu aktivieren. Vielmehr wird hier ein neuartiger Mechanismus der
Basophilenaktivierung ohne Crosslinking angenommen.
18

Einleitung
1.7 Ziel dieser Arbeit
Triggerfaktoren der frühen IL-4-Synthese aus Basophilen sind wichtige Faktoren zur Untersuchung
der Th2-Induktion und der Basophilenaktivierung und nehmen eine zentrale Position bei der
Entstehung einer Allergie ein. Mit IPSE konnte ein solcher Triggerfaktor identifiziert und
charakterisiert werden. Da dieses Molekül im SmEA jedoch nur in sehr geringen Konzentrationen
vorliegt, ist es notwendig, IPSE rekombinant herzustellen, um seinen Wirkungsmechanismus weiter
aufklären zu können. Im bakteriellen Expressionssystem erreicht man zwar hohe Ausbeuten an
rekombinantem Protein, jedoch wird dieses in unlöslicher Form in inclusion bodies abgelegt. Wie
beschrieben kann über eine Rückfaltungsprozedur lösliches und aktives E. coli-IPSE gewonnen
werden, welches sich allerdings nur bis 0,15 mg/ml konzentrieren lässt. Für einige Anwendungen zur
Untersuchung des Wirkungsmechanismus auf den Basophilen sind jedoch höhere
Proteinkonzentrationen von korrekt gefaltetem IPSE notwendig. Dies gilt auch für Untersuchungen
zur Aufklärung der Struktur wie z. B. über Kristallisation.
Aus diesem Grund sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Punkte bearbeitet werden:
- Klonierung von IPSE in verschiedene bakterielle Expressionsvektoren zur Austestung
unterschiedlicher Expressionssysteme und Optimierung der Expressionsbedingungen;
- Klonierung von IPSE in humane und Insekten-Expressionsvektoren zur Austestung und
Etablierung von eukaryotischen Expressionssystemen;
- Optimierung der Aufreinigung der erhaltenen rekombinanten IPSE-Proteine;
- Nachweis der Aktivität der rekombinanten IPSE-Proteine in Bezug auf IL-4-induzierende
Aktivität auf Basophilen und Immunglobulin-Bindung;
- falls möglich Ansetzen eines Kristallisationsexperimentes.
19

Materialien
2 Materialien
2.1 Reagenzien
Für die Arbeit wurden nachstehende Chemikalien und Reagenzien verwendet, die mindestens den
Reinheitsgrad p. a. aufwiesen.
Produkt
Acrylamidlösung (Rotiphorese Gel 30)
Agar-Agar
Agarose
Aktivkohle
6-Aminohexansäure
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Aqua destillata
Basophil Isolation Kit
BCA Protein Assay Reagent Kit
(+)-Biotin-N-hydroxysuccinimidester
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)
Bromphenolblau
BugBuster ®
Cellfectin
Coomassie Brilliant Blue R-250
5,5-Diethylbarbitursäure
5,5-Diethylbarbitursäure-Natriumsalz
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dinatriumhydrogenphosphat
1,4-Dithioerythriol (DTT)
EDTA (Titrierkomplex III)
Eisessig
Endo H
Ethanol, absolut
Ethanol, 96 %, vergällt
Ethanolamin
Ethidiumbromid
Express-Five ® SFM
Ficoll („Pancoll“)
Firma
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Invitrogen, Carlsbad, USA
Roth, Karlsruhe, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Braun, Melsungen, D
Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, D
Pierce Biotechnology, Rockford, USA
Sigma, München, D
Serva, Heidelberg, D
Merck, Darmstadt, D
Novagen, Madison, USA
Invitrogen, Carlsbad, USA
Serva, Heidelberg, D
Merck, Darmstadt, D
Merck, Darmstadt, D
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Roche Applied Science, Mannheim, D
Merck, Darmstadt, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Invitrogen, Carlsbad, USA
PAN Biotech, Aidenbach, D
20

Materialien
Produkt
Fötales Rinderserum (FBS)
Formaldehyd
Glucose
Glutamin
Glutardialdehyd
Glycerin
Glycin
Glycogen
Hank´s balanced Salt Solution (HBSS)
Hefeextrakt
IL-3
IL-4 Eli-pair (IL-4 ELISA)
Imidazol
Ionomycin
Isopropylgalactosid (IPTG)
Isopropanol
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
Kochsalzlösung, isotonische
Low Molecular Weight Marker (LMW)
Magnesiumchlorid
Maltose
May-Grünwald-Färbelösung (Accustain )
β-Mercaptoethanol
Merthiolat
Methanol
Milchsäure
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumcarbonat
Natriumchlorid
Natriumdihydrogenphosphat
Natriumdodeylsulfat (SDS)
Natriumhydrogencarbonat
Natriumhydroxid
Natriumthiosulfat
Firma
Invitrogen, Carlsbad, USA
Roth, Karlsruhe, D
Merck, Darmstadt, D
Invitrogen, Carlsbad, USA
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Roche Applied Science, Mannheim, D
PAA, Pasching, A
Merck, Darmstadt, D
Kirin Brewery, Takasaki-shi, Gunma, J
Diaclone, Besancon, F
Sigma, München, D
Sigma, München, D
Roth, Karlruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
Braun, Melsungen, D
Bio-Rad, München, D
Roth, Karlsruhe, D
Merck, Darmstadt, D
Sigma Diagnostics, St. Louis, USA
Sigma, München, D
Sigma, München, D
Merck, Darmstadt, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Sigma, München, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Roth, Karlsruhe, D
ICN, Eschwege, D
Merck, Darmstadt, D
Roth, Karlsruhe, D
Merck, Darmstadt, D
21

Materialien
Produkt
Firma
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)
Serva, Heidelberg, D
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure-Monohydrat (MES)Roth, Karlsruhe, D
Pepton aus Casein
Roth, Karlsruhe, D
Percoll
Amersham Biosciences, Uppsala, S
PNGase F
Roche Applied Science, Mannheim, D
Protectomed basal Iscoves Medium (IMDM) PAA, Pasching, A
Protein L
Sigma, München, D
Pyronin G
Serva, Heidelberg, D
Rinderserumalbumin (BSA)
PAA, Pasching, A
RPMI 1640
PAA, Pasching, A
Salzsäure
Roth, Karlsruhe, D
Silbernitrat
Roth, Karlsruhe, D
Streptavidin-PE
BD Pharmingen, San Diego, USA
Taq-Polymerase
Peqlab, Erlangen, D
N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Merck, Darmstadt, D
Trypanblaulösung
Sigma, München, D
Transfast
Promega, Madison, USA
Transferrin, human
Sigma, München, D
Tris
Roth, Karlsruhe, D
Tween ® 20
Merck, Darmstadt, D
Xylenxyanol
Serva, Heidelberg, D
22

Materialien
2.2 Häufig verwendete Puffer und Nährmedien
Zum Ansetzen von Lösungen und Medien wird destilliertes entionisiertes Wasser verwendet. Medien
für die Bakterienzellkultur werden 20 min bei 200 kPa autoklaviert. Medien für die humane oder
Insektenzellkultur werden sterilfiltriert (0,2 µm Spitzenfilter, Firma Sarstedt). Puffer, die in der
Chromatographie eingesetzt werden, werden filtriert (0,2 µm Membranfilter, Firma Millipore) und
entgast. Spezielle Puffer, Lösungen oder Medien sind am Ende jeweiligen Methode aufgeführt.
2.2.1 Puffer
10x PBS-Stammlösung
1,37 M NaCl
27 mM KCl
100 mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O
20 mM KH 2 PO 4
Für die Gebrauchslösung wird die Stammlösung 1:10 verdünnt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt.
10x TBS-Stammlösung (pH 7,5)
1 M Tris-HCl
1 M NaCl
25 mM MgCl 2
Für die Gebrauchslösung wird die Stammlösung 1:10 verdünnt und der pH-Wert auf 7,5 eingestellt.
TBST
Entspricht 1x TBS-Lösung (pH 7,5) mit Zusatz von 0,05 % (v/v) Tween.
50x TAE-Stammlösung
2 M Tris-HCl
50 mM EDTA
5,71 (v/v) Eisessig
100 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) werden zu 242 g Tris-HCl und 57,1 ml Eisessig gegeben
und auf 1000 ml mit aqua dest. aufgefüllt.
23

Materialien
2.2.2 Nährmedien
LB-Medium
1 % (w/v) Pepton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
0,5 % (w/v) NaCl
ad 1000 ml aqua dest.
LB-Agar
LB-Medium mit Zusatz von 1,5 % (w/v) Agar. Nach Autoklavierung und Abkühlung werden ggf.
Antibiotika zugesetzt.
50x Kaliumphosphatpuffer für TB-Medium
170 mM KH 2 PO 4
720 mM K 2 HPO 4
TB-Medium
1,2 % (w/v) Pepton
2,4 % (w/v) Hefeextrakt
0,4 % (v/v) Glycerin
ad 1000 ml aqua dest. Vor Gebrauch werden 20 ml 50x Kaliumphosphatpuffer zugesetzt.
24

Materialien
2.3 Antibiotika
Folgende in Tabelle 2.1 aufgeführte Antibiotika wurden in den angegebenen Konzentrationen
eingesetzt.
Tabelle 2.1: Liste der verwendeten Antibiotika.
Antibiotikum Konzentration gelöst in
Endkonzentration
Stammlösung
Ampicillin 100 mg/ml aqua dest. 100 µg/ml
Blasticidin 10 mg/ml aqua dest. 10-80 µg/ml
Chloramphenicol 34 mg/ml in EtOH 34 µg/ml
Gentamicin 10 mg/ml aqua dest. 10 µg/ml
Kanamycin 15 mg/ml aqua dest. 15 µg/ml
Penicillin 10000 U/ml aqua dest. 100 U/ml
Streptomycin 10 mg/ml aqua dest. 100 µg/ml
Tetracyclin 12,5 mg/ml in EtOH 12,5 mg/ml
Zeocin 100 mg/ml aqua dest. 100 µg/ml
2.4 Antikörper
Tabelle 2.2: Liste der verwendeten Antikörper
Bezeichnung Konjugation Firma eingesetzte
Verdünnung
IgG (human, polyklonal, “Octagam”) - Octapharma unterschiedlich
IgE (human, polyklonal) - Acris unterschiedlich
IgE (human, monoklonal, Klon HE1) - Diatec unterschiedlich
anti-IPSE (monoklonal, Klon 74-4B7) - Labsoft 1:50
anti-Maus IgG (aus Ziege) AP Dianova 1:10.000
anti-human IgG-Fc (aus Ziege) AP Dianova 1:30.000
anti-human IgE (aus Ziege) AP Tago 1:2.000
anti-human IgE (aus Ziege) Bio Tago 1:2.000
anti-human IgE (aus Ziege) FITC Serotec 1:75
anti-human CD203c (monoklonal, Klon 97A6) PE Beckman 1:20
Coulter
25

Materialien
2.5 Synthetische Oligonukleotide
Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (Primer) wurden von MWG Biotech synthetisiert
und einer HPSF-Reinigung unterzogen. Zur Lagerung wurden sie in 100 µl sterilem aqua dest.
aufgenommen und für die PCR-Reaktion 20 µM Gebrauchslösungen angesetzt. Folgende Primer
wurden in dieser Arbeit verwendet (Restriktionsschnittstellen kursiv gedruckt).
Klonierungsprimer
• IPSEMALpsense 5´-ATATATGGATCCGATTCATGCAAATATTGTC-3´
Sense-Primer mit BamHI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMalP
• P IPSE Mal anti 5´-ATATAAGCTTACATCAGTTCATATGC-3´
Antisense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMalP
• pET26BamHI sense 5´-ATATATGGATCCGATTCATGCAAATATTGTC
Sense-Primer mit BamHI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pET26(+)
• pETHindIII anti 5´-ATATATAAGCTTGAATCGACAGTATGTCCTTC
Antisense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pET26(+)
• pBM1.1HindIII sense 5´-ATATATAAGCTTGATTCATGCAAATATTGTC-3´
Sense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pBM1.1
• pBM1.1EcoRI anti 5´-ATATATGAATTCTCATCATTAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´
Antisense-Primer mit EcoRI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pBM1.1
• Sfi MS-IPSE sense 5´-ATATATGGCCCAGCCGGCCGATTCATGCAAATATTGTC-3´
Sense-Primer mit SfiI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMSII
• CelII MS-IPSE rev 5´-ATATATGCTCAGCGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´
Antisense-Primer mit CelII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMSII
• pIB sense HindIII 5´-ATATATAAGCTTGCCACCATGTTTCTTATTGCCGTATTG-3´
Sense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pIB/V5-His
26

Materialien
• pIB anti XhoI 5´ATATATCTCGAGTTATTATGAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´
Antisense-Primer mit XhoI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE ohne His-Tag in pIB/V5-His
• pIB-His anti XhoI 5´-ATATATCTCGAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´
Antisense-Primer mit XhoI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE mit His-Tag in pIB/V5-His
Sequenzierungsprimer
• pBM11.seqs1 5´-CGACTCACTATAGGGGAA-3´
Sequenzierungsprimer für den Vektor pBM1.1 in sense-Orientierung
• pBM11.seqas2 5´-ACGGGTGAAAGTCTCCA-3´
Sequenzierungsprimer für den Vektor pBM1.1 in antisense-Orientierung
• pMS-KON-fo 5´-ATAGGGAGACCCAAGCTGGC-3´
Sequenzierungsprimer für pMSII in sense-Orientierung
• pMS-KON-re 5´-GAGAATTCGTGCTCAAAACT-3´
Sequenzierungsprimer für pMSII in antisense-Orientierung
• OpIE2 Forward 5´-CGCAACGATCTGGTAAACAC-3´
Sequenzierungsprimer für pIB/V5-His in sense-Orientierung
• OpIE2 Reverse 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´
Sequenzierungsprimer für pIB/V5-His in antisense-Orientierung
27

Materialien
2.6 Plasmidvektoren
In der vorliegenden Arbeit wurden die in der Tabelle 2.3 angegebenen Plasmidvektoren verwendet.
Tabelle 2.3: Verwendete Plasmidvektoren
Vektor
pPROEX
Htb
pMalC
bzw.
pMalP
Größe
[bp]
Pro-
motor
Resistenz
Expressions-
system
Verwendung und
Eigenschaften
4778 Trc Ampicillin E. coli - zytoplasmatische
Expression
- N-terminaler His 6 -Tag
- TEV-Schnittstelle
6723 tac Ampicillin E. coli - Protein wird als MBP-
Fusionsprotein exprimiert
- Factor Xa-Schnittstelle-
malE-Signalpeptid für
Transport in Periplasma
(nur bei pMalP)
pET26(+) 5360 T7 Kanamycin E. coli - pelB-Signalpeptid für
Transport in Periplasma
- C-terminaler His 6 -Tag
pBM1.1 1) 5595 T7 Kanamycin E. coli - pelB-Signalpeptid für
Transport in Periplasma
- N-terminaler His 10 -Tag
- Enterokinase-Schnittstelle
pET32 5900 T7 Ampicillin E. coli - Protein wird als TRX-
pMSII 1) 7099 CMV Ampicillin
Zeocin
pIB/V5- 3521 OpIE2 Ampicillin
His 2) Blasticidin
Fusionsprotein exprimiert
- N- und C-terminaler
His 6 -Tag
- Enterokinase-Schnittstelle
293 HEK - Igκ-Signalsequenz für
Insekten-
zellen
Sekretion
- C-terminaler
His 6 /cMyc-Tag
- bicistronische mRNA
für EGFP
- C-terminales V5-Epitop
- C-terminaler His 6 -Tag
Referenz
Gibco
New England
Biolabs
Novagen
Matthey et. al
(2003)
Novagen
Stöcker et. al
(2003)
Invitrogen
1) von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt.
2) von Dr. P. Ziegelmüller (Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt.
28

Materialien
2.7 Zelllinien
2.7.1 Bakterienstämme
BL21(DE3) F - ompT hsdS B (r - B m - B ) gal dcm (DE3)
(Studier et al. 1986)
DH5α
supE44 ∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
(Hanahan 1983)
JM109
recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi ∆(lac-proAB)
(Yanisch-Perron et al. 1985)
Origami(DE3) ∆(ara-leu)7697 ∆lacX74 ∆phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL
F’[lac + lac q pro] (DE3) gor522::Tn 10 trxB (Kan R , Str R , Tet R )
(Prinz et al. 1997)
2.7.2 Eukaryotische Zelllinien
293 HEK-Zellen humane embryonale Nierenzelllinie, ATCC Nr. CRL-1573
(Graham et al. 1977)
Von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie,
Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt.
High Five -Zellen Insektenzelllinie von Trichoplusia ni Eizellen, BTI-Tn-5B1-4
(Invitrogen)
Von Dr. P. Ziegelmüller (Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie,
Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt.
29

Methoden
3 Methoden
3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeiten
3.1.1 Kultur und Lagerung von E. coli
Kurzzeitkultur
Für eine Kurzzeitkultur werden E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten (eventuell mit Antibiotikazusatz)
ausgestrichen und über Nacht im Brutraum bei 37 °C inkubiert. Danach lassen sich die Platten
4 Wochen bei 4 °C lagern, bevor sie erneut ausgestrichen werden müssen.
Übernachtkultur
Für eine Übernachtkultur werden 5 ml LB-Medium (eventuell mit Antibiotikumszusatz) mit einer
Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Brutraum unter Schütteln (225 rpm)
inkubiert.
Langzeitkultur
E. coli-Zellen können bei -80 °C über lange Zeit eingefroren werden. Dafür werden 850 µl einer
Übernachtkultur mit 150 µl sterilem Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
anschließend in -80 °C überführt. Durch leichtes Antauen können die so gelagerten Zellen wieder
ausgestrichen werden.
3.1.2 Transformation von E. coli-Zellen
Die am häufigsten angewendeten Methoden zum Einbringen von DNA in Bakterienzellen sind die
Hitzeschocktransformation und Elektroporation. In der vorliegenden Arbeit wurde die Elektroporation
verwendet, da hier die Transformationseffizienz mit 10 9 bis 10 10 Transformanten pro µg DNA
ungefähr um den Faktor 10 3 höher liegt gegenüber der Hitzeschocktransformation (Sambrook et al.
1989). Bei der Elektroporation wird durch einen Elektroschock die Zytoplasmamembran kurzfristig
permeabilisiert, so dass DNA aus der Umgebung aufgenommen werden kann.
3.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen
Da bei der Elektroporation hohe Stromspannungen eingesetzt werden, müssen die Bakterienzellen in
ein salzfreies Medium überführt werden. Dafür werden 350 ml LB-Medium (ggf. mit Antibiotikum)
mit einer 1:50-Verdünnung einer frischen E. coli-Übernachtkultur angeimpft, bei 37 °C auf einem
Schüttler bis zu einer OD 600 von 1,0 inkubiert und anschließend auf Eis für 20 Minuten abgekühlt. Alle
30

Methoden
folgenden Zentrifugationsschritte finden bei 4 °C in sterilen Zentrifugationsgefäßen und bei
ausgeschalteter Bremse statt. Die Zellen werden für 10 Minuten bei 12.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wird mit einer Pipette vollständig abgenommen und verworfen. Das Bakterienpellet wird
drei Mal mit 80 ml sterilem, eiskalten aqua dest. gewaschen und zentrifugiert (12.000 x g, 20 min).
Die Zellen werden in 10 %igem (v/v) kalten Glycerin aufgenommen und noch mal bei 12.000 x g für
10 Minuten zentrifugiert. Abschließend wird das Pellet in 500 bis 1000 µl 10 %iger (v/v)
Glycerinlösung aufgenommen, in Portionen à 50 µl in Cryoröhrchen aliquotiert, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.
3.1.2.2 Elektroporation von E. coli-Zellen
Für die Transformation werden 50 µl elektrokompetente E. coli-Zellen mit ca. 1 µl Plasmid-DNA
bzw. 5 µl Ligationsansatz für eine Minute auf Eis inkubiert und anschließend in eine gekühlte
Elektroporationsküvette mit einer Schichtdicke von 0,2 cm gefüllt. Die Elektroporation erfolgte mit
dem Gene Pulser II der Firma BioRad bei 25 µF, 2,5 kV und 200 Ω. Die elektroporierten Zellen
werden sofort in 1 ml LB-Medium aufgenommen und zur Regeneration für eine Stunde bei 37 °C
unter Schütteln inkubiert. Anschließend werden 100 µl und 900 µl der Zellsuspension auf selektiven
LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3.1.3 Präparation von Plasmid-DNA
Alle Präparationen von Plasmid-DNA aus E. coli wurden mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“
(Firma Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Methode beruht auf der alkalischen
Lyse von Bakterienzellen nach Birnboim und Doly (1979) und der anschließenden Adsorption der
DNA an eine Silicamembran unter Hochsalzbedingungen. Alle Zentrifugationsschritte werden soweit
nicht anders angegeben bei 18.000 x g für eine Minute bei 4 °C in einer Tischzentrifuge durchgeführt.
Um größere Mengen hochreine DNA für die Transfektion von Insektenzellen oder 293 HEK-Zellen zu
isolieren, werden Plasmidpräparationen in größerem Maßstab (100 µg bzw. 500 µg) vorgenommen.
Für die Transfektion von Insektenzellen wurde das „QIAGEN Plasmid Midi Kit“ und für die
Transfektion von 293 HEK-Zellen das „EndoFree Plasmid Maxi Kit“ (beide von der Firma Qiagen)
nach Herstellerangaben verwendet. Dabei werden die Zellen aus 25 ml bzw. 100 ml E. coli-
Übernachtkultur wie oben angegeben lysiert. Eine zusätzliche Reinigung erfolgt, indem die Plasmid-
DNA unter Niedrigsalzbedingungen bei niedrigem pH-Wert an ein Anionenaustauscherharz gebunden
wird. Dabei werden Verunreinigungen, wie z.B. Proteine, bei mittleren Salzkonzentrationen entfernt.
Unter Hochsalzbedingungen wird die Plasmid-DNA eluiert und durch eine Isopropanolfällung
entsalzt. Nach einer weiteren Ethanolfällung wird die reine DNA in 200 µl aqua dest. aufgenommen.
31

Methoden
3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese
Mit der Agarose-Gelelektrophorese können DNA-Moleküle ihrer Größe nach aufgetrennt werden und
im Bereich von 500 bis 8000 bp dargestellt werden. Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer DNA-
Moleküle ist dabei umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Bei
ringförmiger DNA können auch coiled und supercoiled-Strukturen auftreten, die aufgrund ihrer
höheren Kompaktheit im Gel schneller laufen und so ein apparent kleineres Molekulargewicht
aufweisen als linearisierte DNA. Agarose-Gelelektrophoresen finden Anwendung bei der
Größenbestimmung von DNA-Fragmenten nach einem Restriktionsverdau, bei der Isolierung von
DNA-Fragmenten und bei der Überprüfung einer PCR oder Gelelution.
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in 1 %igen (w/v) Agarosegelen. Die Agarose wird durch
Kochen in TAE-Puffer gelöst, nach kurzem Abkühlen wird 0,1 % (v/v) Ethidiumbromid zugesetzt und
die Lösung in einen Gelschlitten mit dem entsprechenden Kamm gegossen. Nach dem Erstarren der
Agarose wird das Gel in eine mit TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Die Proben
werden mit 1/10 Volumen Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Als Größenstandard
werden 2,5 µl des MassRuler (100 bis 10.000 bp, Firma MBI Fermentas) mit aufgetragen. Die
Elektrophorese wird anschließend bei 0,5 V/cm 2 durchgeführt, bis der Farbmarker die gewünschte
Laufstrecke zurückgelegt hat. Die im Agarosegel aufgetrennten DNA-Banden können unter UV-Licht
sichtbar gemacht und mit einer Polaroid-Kamera dokumentiert werden.
10x Probenpuffer
60 % (v/v) Glycerin
100 mM EDTA
Spatelspitze Bromphenolblau
Spatelspitze Xylenxyanol
ad 10 ml mit aqua dest.
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die spektralphotometrische
Absorptionsmessung bei 260 nm. Dabei entspricht ein Extinktionswert von 1,0 ungefähr 50 µg
doppelsträngiger DNA in 1 ml Lösung. Wird gleichzeitig die Absorption bei 280 nm - dem
Absorptionsmaximum von Proteinen - gemessen, kann aus dem Verhältnis von 260 nm zu 280 nm die
Reinheit der DNA-Probe bestimmt werden. Bei reiner DNA liegt dieser Quotient bei 1,8 bis 2,0.
32

Methoden
3.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR)
Neben der schlichten Amplifikation von DNA-Fragmenten dient die Methode z. B. der Einführung
von Restriktionsschnittstellen oder anderen Modifikationen (z. B. Mutation in der DNA). Zur
Vervielfältigung der DNA benötigt man neben spezifischen Oligonukleotiden (Primern), welche
homolog zu Sequenzen der Matrizen-DNA sind und diese am 5´-Ende und 3´-Ende flankieren, die
spezifische hitzestabile DNA-abhängige DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-DNA-
Polymerase). Über die zyklische Wiederholung von Denaturierung, Primeranlagerung (Annealing)
und Primerverlängerung (Elongation) können Vervielfältigungsraten von ca. 10 6 erreicht werden.
Für eine PCR wurde der folgende PCR-Ansatz und PCR-Programm verwendet.
PCR-Ansatz
70 µl steriles aqua dest.
10 µl 10x Polymerasepuffer
5 µl sense-Primer (20 µM)
5 µl anti-sense Primer (20 µM)
8 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, d GTP, dTTP, jeweils 10 µM)
1 µl template DNA (aus DNA-Minipräparation)
0,5 µl Taq-Polymerase
100 µl Öl
PCR-Programm
Denaturierung bei 95 °C für 30 sec
Annealing bei 48 °C für 30 sec
Elongation bei 72 °C für 1 min
30 Zyklen
3.1.7 Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Ansätzen
PCR-Ansätze enthalten neben den Amplifikaten noch die zugesetzten Nukleotide, Primer und
Enzyme. Um diese für folgende Anwendungen zu entfernen werden die PCR-Ansätze über eine Silica-
Matrix gereinigt. Dafür wurde das „QIAquick PCR Purification Kit“ (Firma Qiagen) eingesetzt.
Während die PCR-Produkte unter Hochsalzbedingungen an die Silica-Matrix binden, können alle
unerwünschten Kontaminanten ausgewaschen werden. Die gebundene DNA wird mit 30 µl aqua dest.
eluiert.
33

Methoden
3.1.8 Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor
Restriktionsenzyme können DNA effektiver schneiden, wenn sie nicht am Ende eines DNA-Stranges
schneiden müssen, wie dies bei PCR-Produkten der Fall ist. Aus diesem Grund wird die
Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor angewendet. Dabei wird das PCR-Produkt, das
am 3´-Ende ein Desoxyadenosin besitzt, in einen linearisierten Vektor mit 5´-Desoxythymidin-
Überhang ligiert. Die Ligation des PCR-Produktes in den eigentlichen Vektor kann so erheblich
gesteigert werden. Als TA-Klonierungsvektor wurde das pGEM-T Easy Kit der Firma Promega nach
Herstellerangaben verwendet. Für die Ligation wird die DNA-Konzentration des PCR-Produktes
ermittelt und der folgende Ligationsansatz erstellt. Die Ligation erfolgt über Nacht bei 14 °C.
Ligationsansatz
5 µl 2x Rapid Ligation Buffer
1 µl pGEM ® -T Easy Vektor (entspricht 50 ng)
x µl PCR-Produkt (20 ng)
1 µl T4 DNA Ligase
ad 20 µl mit sterilem aqua dest.
3.1.9 Fällung von DNA
Für die Transformation von Bakterien darf nur reine, salzfreie DNA eingesetzt werden. Deshalb wird
nach einer Ligation eine Fällung der DNA vorgenommen. Der Ligationsansatz wird mit 100 µl
sterilem aqua dest., 1 µl Glycogen und 250 µl absolutem, eiskalten Ethanol versetzt und 2 h bei -70 °C
inkubiert. Anschließend wird der Ansatz bei 4 °C für 15 Minuten bei 18.000 x g zentrifugiert. Das
Pellet wird 10 Minuten bei 37 °C getrocknet und in 5 µl sterilem aqua dest. aufgenommen.
3.1.10 DNA-Sequenzierung
Die Überprüfung der DNA-Sequenz wurde bei der Firma MWG Biotech nach der Didesoxy-
Kettenabbruchmethode nach Sanger (1977) durchgeführt. Für die Sequenzierung wird pro Reaktion
1 µg gereinigte Plasmid-DNA in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und in der speedvac
(SPD12P, Firma Thermo Savant) bis zur vollständigen Trockenheit eingeengt. Nach der Verifizierung
der Sequenz werden die Klone zur weiteren Klonierung eingesetzt.
34

Methoden
3.1.11 Restriktion von DNA
Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische palindrome DNA-Sequenzen von meist 4 bis 8 bp
und führen in doppelsträngige DNA Strangbrüche ein, wobei überhängende 3’- bzw. 5’-Enden (sticky
ends) oder glatte Enden (blunt ends) entstehen können. Die DNA-Restriktion wird zur Analyse,
Klonierung und Fragmentisolierung angewendet. Die Restriktion wird nach Herstellerangaben mit den
mitgelieferten Puffern bei 37 °C für 2 h im Doppelrestriktionsansatz durchgeführt. Da SfiI eine von
anderen Restriktionsenzymen abweichende optimale Reaktionstemperatur von 50 °C aufweist, werden
die Restriktionen hier nacheinander durchgeführt. Pro µg DNA werden ungefähr 2 bis 4 U Enzym
eingesetzt. Der Erfolg der Restriktion wird anschließend in der Agarosegelelektrophorese überprüft.
3.1.12 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Gelelution
Zur Isolierung der DNA aus Agarosegelen, werden die Banden mit einem Skalpell ausgeschnitten und
gewogen. Die Extraktion erfolgt mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit“ (Firma Qiagen) in einem
Eppendorf-Reaktionsgefäß. Die Agarose wird mit 3 Volumenteilen des im Kit enthaltenen Puffers QG
versetzt und bei 50 °C inkubiert bis sich die Agarose aufgelöst hat. In der anschließenden
säulenbasierten Reinigung wird die DNA an eine Silicamembran gebunden und von kontaminierenden
Salzen, Proteinen und Nukleotiden befreit. Die Elution erfolgt in 30 µl sterilem aqua dest.
3.1.13 Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten
Die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit Hilfe der Ligase wird als Ligation bezeichnet. Bei der
Standardligation wird durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten
3’-Hydroxyl- und 5’-Phosphatgruppen linearisierter Vektor mit isolierten DNA-Fragmenten
verknüpft, die zuvor durch Restriktionsspaltung und Agarosegelelektrophorese mit anschließender
Gelelution gewonnen wurden. Für die Ligation wird ungefähr ein Vektor-Insert-Verhältnis von 1:3
eingesetzt. Die Quantifizierung erfolgt dabei grob über Abschätzung der Bandenintensität nach der
Agarosegelelektrophorese. Der Ligationsansatz (siehe unten) wird in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß
pipettiert und über Nacht bei 14 °C in einem Wasserbad inkubiert.
Ligationsansatz
x µl Vektor
y µl Insert
2 µl 10x Ligationspuffer
0,5 µl Ligase
ad 20 µl aqua dest. (steril)
35

Methoden
3.1.14 Klonierung der verwendeten Plasmid-Vektoren
Mit den oben aufgeführten Methoden wurde die Sequenz von IPSE in die folgenden Vektoren
kloniert.
pET26-IPSE
IPSE wurde über BamHI und HindIII in den Vektor kloniert. Der Vektor dient der periplasmatischen
Expression von rekombinantem Protein in E. coli.
pBM1.1-IPSE
Der Vektor wurde von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie,
Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt. Rekombinante Proteine werden in E. coli in das
Periplasma transportiert. IPSE wurde über HindIII und EcoRI in den Vektor kloniert.
pMalC-IPSE und pMalP-IPSE
Bei den Vektoren pMalC und pMalP der Firma New Engand Biolabs werden rekombinante Proteine in
E. coli als Maltosebindeprotein-Fusionsproteine exprimiert und bei dem pMalP-Vektor zusätzlich in
das Periplasma transportiert. IPSE wurde über BamHI und HindIII in beide Vektor kloniert.
pMSII-IPSE
Der Vektor pMSII dient der Expression von rekombinantem Protein in 293 HEK-Zellen. IPSE wurde
über SfiI und CelII in den Vektor kloniert.
pIB/V5-His-IPSE
Der Insektenzellexpressionsvektor pIB/V5-His stammt von der Firma Invitrogen und wurde von Dr. P.
Ziegelmüller (Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg) zur Verfügung
gestellt. Die IPSE-Sequenz wurde über HindIII und XhoI in den Vektor kloniert. Dabei wurde ein
Vektor mit dem V5-His-Tag konstruiert und ein Vektor bei dem dieses Tag fehlt.
Des Weiteren wurden für die bakterielle zytoplasmatische Expression der Vektor pPROEX Htb-IPSE
und der Vektor pET32-IPSE eingesetzt. Diese Vektoren wurden von Dr. G. Schramm (LG Zelluläre
Allergologie, Forschungszentrum Borstel) kloniert und zur Verfügung gestellt.
36

Methoden
3.2 Expression von IPSE in E. coli
3.2.1 Expression von rekombinantem IPSE in E. coli im kleinen Maßstab (20 ml)
Für die Expression wird eine Übernachtkultur angelegt und am nächsten Tag als Inokulum in einer
1:50-Verdünnung in 20 ml Medium eingesetzt. Die Bakterien werden auf einem Schüttler bei 225 rpm
und 37 °C für ca. 3 bis 4 h inkubiert bis eine OD 600 von 0,8 erreicht ist. Die Expression wird soweit
nicht anders angegeben durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die Bakterienzellen werden dabei
weiter unter den oben angegebenen Bedingungen für 18 h inkubiert. Zur Überprüfung der Zeitkinetik
der Expression in der SDS-PAGE wird nach 0 h, 2 h, 4 h und 18 h 1 ml der Expression abgenommen,
bei 18.000 x g pelletiert und in 100 µl 1x reduzierendem Probenpuffer aufgenommen. Nach
Beendigung der Expression werden die Zellen pelletiert (3.000 x g, 10 min) und in 1 ml PBS
aufgenommen. Durch Zusatz von 100 µl BugBuster werden die Zellen chemisch über Detergentien
aufgeschlossen. Die lösliche Proteinfraktion wird durch Zentrifugation (12.000 x g, 15 min) von den
unlöslichen Bestandteilen abgetrennt. Das Pellet wird wieder in 1 ml PBS aufgenommen und
zusammen mit dem Überstand ebenfalls mit der Zeitkinetik in der SDS-PAGE unter reduzierenden
Bedingungen untersucht.
3.2.2 Expression von rekombinantem IPSE in E. coli im großen Maßstab (2000 ml)
Für die Expression im großen Maßstab (2000 ml) wurden die Bedingungen der kleinen Expression
(20 ml) übernommen und die eingesetzten Mengen proportional vergrößert. Die Expression erfolgt
auf einem Schüttler bei 225 rpm in zwei 2 L-Schikanenerlenmyerkolben zur besseren Belüftung der
Kultur. Der anschließende Zellaufschluss erfolgt nicht chemisch sondern physikalisch über eine 30 ml
French Press-Druckzelle. Die abzentrifugierten Zellen werden in 30 ml Puffer (Säulenpuffer für MBP-
IPSE, Lysispuffer für Origami-IPSE; für genaue Pufferzusammensetzung siehe 3.3.1.1 bzw. 3.3.2)
aufgenommen und mit 8 µl Benzonase versetzt, um alle Nukleinsäuren zu verdauen. Die Zellen
werden 3 Mal bei einem Druck von 1000 bar durch die Druckzellen gepresst und in einem
eisgekühlten Behälter aufgefangen. Anschließend wird die Bakteriensuspension abzentrifugiert
(12.000 x g, 30 min), um die lösliche Proteinlösung von unlöslichen Zellfragmenten zu trennen. Der
Überstand wird dekantiert und zur weiteren Proteinreinigung eingesetzt. Expressionen im großen
Maßstab wurden mit Origami(DE3)-Zellen und dem Vektor pET32-IPSE sowie JM109-Zellen und
dem Vektor pMalC-IPSE durchgeführt.
37

Methoden
3.3 Reinigung von rekombinantem IPSE aus E. coli
3.3.1 Reinigung von MBP-IPSE
3.3.1.1 Reinigung von MBP-IPSE über Amylose-Affinitätschromatographie
Das Maltosebindeprotein besitzt eine hohe Affinität zu Amylose. Diese Affinität wird bei der
Aufreinigung ausgenutzt. Die Amylose ist dabei an ein Harz gekoppelt und bindet das MBP-
Fusionsprotein während kontaminierende Proteine von der Säule gewaschen werden können. Die
Elution des gebundenen Proteins erfolgt durch freie Maltose im Säulenpuffer.
Das Amyloseharz wird in eine 15 ml Leersäule gefüllt und mit dem zehnfachen Säulenvolumen mit
Säulenpuffer äquilibriert. Der Überstand des Bakterienaufschlusses wird 1:2 mit Säulenpuffer
verdünnt und auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgetragen.
Kontaminierende Proteine werden mit 5 Säulenvolumen von der Säule entfernt und das gebundene
Protein anschließend mit 30 ml Elutionspuffer eluiert. Dabei werden Fraktionen à 3 ml gesammelt.
Die erhaltenen Fraktionen werden in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht.
Die MBP-IPSE enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und die Proteinkonzentration über
spektralphotometrische Bestimmung ermittelt.
Säulenpuffer (pH 7,4)
Elutionspuffer
20 mM Tris-HCl Säulenpuffer mit 10 mM Maltose
200 mM NaCl
1 mM EDTA
3.3.1.2 Reinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration
Die gereinigten MBP-IPSE-Fraktionen wurden über eine Gelfiltration weiter aufgereinigt. Bei der
Gelfiltration (auch Größenauschlusschromatographie genannt) werden die Proteine ihrer Größe nach
aufgetrennt. Die poröse Säulenmatrix besteht aus quervernetzter Agarose mit Dextran. Kleinere
Moleküle können in die Poren hineindiffundieren und haben somit ein größeres Volumen zu
durchlaufen als größere Moleküle, die nur die Zwischenräume durchwandern können. Größere
Moleküle eluieren daher eher von der Säule als kleinere Moleküle.
Die Gelfiltration wurde von Dr. U. Mamat (LG Medizinische und biochemische Mikrobiologie,
Forschungszentrum Borstel) mit einer Superdex 200-Säule (HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade,
Firma Amersham Biosciences) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
38

Methoden
Probe:
1 ml MBP-IPSE (11,7 mg/ml)
Laufpuffer: 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 8,0)
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min
Fraktionsgröße: 2 ml
3.3.2 Reinigung von IPSE aus E. coli Origami-Zellen
IPSE wird in Origami-Zellen als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert. Aus diesem Grund lässt es
sich über immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit Ni-NTA aufreinigen.
7 ml äquilibrierte Ni-NTA-Matrix werden mit dem Überstand aus dem Bakterienaufschluss vermischt
und 1 h auf einem Rollenmischer inkubiert. Die Mischung wird in eine 15 ml Leersäule gefüllt und
das Effluent gesammelt. Nicht gebundene Proteine werden mit 2 x 30 ml Waschpuffer entfernt und die
gebundenen Proteine mit 3 x 10 ml Elutionspuffer eluiert. Die einzelnen Fraktionen werden in der
SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht.
Lysispuffer (pH 8,0)
50 mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl
10 mM Imidazol
Waschpuffer (pH 8,0)
entspricht Lysispuffer mit 20 mM Imidazol
Elutionspuffer (pH 8,0)
entspricht Lysispuffer mit 250 mM Imidazol
39

Methoden
3.4 293 HEK-Zellen
3.4.1 Kultur und Lagerung von 293 HEK-Zellen
Bei der Zelllinie 293 HEK handelt es sich um adhärent wachsende embryonale Nierenzellen (human
embryonic kidney cells). Sie werden bei 37 °C und 6 % CO 2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre
im Brutschrank in HEK-Medium kultiviert und alle 3 bis 4 Tage im Verhältnis 1:5 geteilt. Dabei
lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen mit der Pipette von dem Kulturflaschenboden lösen.
293 HEK-Zellen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert werden. Dafür werden die
Zellen als Monolayer angezogen bis sie zu 80-90 % konfluent sind. Abgespülte Zellen werden bei
600 x g für 10 min abzentrifugiert und mit einer Dichte von 3 x 10 6 Zellen/ml in Einfriermedium
resuspendiert. Je 1 ml der Zellsuspension wird in Gefriergefäßen mit 1 °C pro Minute langsam auf
-80 °C abgekühlt und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt. Eingefrorene Zellen können
wieder in Kultur genommen werden, indem sie bei 37 °C schnell aufgetaut, in Medium resuspendiert
und in eine 75 cm 2 -Kulturflasche ausgesät werden.
HEK-Medium
Einfriermedium für 293 HEK-Zellkultur
500 ml RPMI 1640 Medium 10 % (v/v) RPMI 1640
2 mM Glutamin 80 % (v/v) FBS
100 U/ml Penicillin 10 % (v/v) DMSO
100 µg/ml Streptomycin
10 % (v/v) FBS
Die Zusätze werden über einen 0,2 µm Spitzenfilter (Filtropour, Firma Sarstedt) in das Medium
filtriert.
3.4.2 Transfektion von 293 HEK-Zellen
Die Transfektion der 293 HEK-Zellen mit dem klonierten Expressionsvektor pMSII-IPSE wurde mit
dem kationischen Lipotransfektionsreagenz TransFast durchgeführt. Dafür werden in einer 24-Loch-
Platte pro Loch 5 x 10 4 Zellen ausgesät und in 1 ml HEK-Medium über Nacht inkubiert. Am nächsten
Tag weisen die Zellen normalerweise eine Konfluenz von 80 % auf. 0,5 µg der gereinigten Vektor-
DNA werden mit 200 µl HEK-Medium ohne FBS-Zusatz und 1,5 µl TransFast-Reagenz gemischt und
10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Von den ausgesäten Zellen wird das Medium abgezogen und
durch die Transfektionsmischung ersetzt. Nach einer Stunde Inkubation im Brutschrank wird jeder
Probe 1 ml HEK-Medium mit FCS zugefügt. Nach drei Tagen wird der Kulturüberstand abgenommen
und über eine Proteinaufreinigung im kleinen Maßstab (siehe 3.6.1) auf Anwesenheit des
rekombinanten Proteins untersucht. Zur Selektion von stabil transfizierten Zellen werden die Zellen
40

Methoden
mit HEK-Medium mit 100 µg/ml Zeocin versetzt. Stabil transfizierte 293 HEK-Zellen werden
kontinuierlich bei 100 µg/ml Zeocin gehalten und wie unter 3.4.1 beschrieben alle 3 bis 4 Tage im
Verhältnis 1:5 geteilt.
3.4.3 Expression von rekombinantem IPSE in 293 HEK-Zellen
Da der Vektor pMSII-IPSE einen Igκ-Leader am N-Terminus besitzt, wird das rekombinante Protein
fortlaufend von den Zellen ins Medium sekretiert. Zur Bestimmung des optimalen Zeitpunktes zum
Ernten des Kulturüberstandes mit einer möglichst hohen HEK-IPSE-Konzentration wurde eine
Expressionszeitkinetik durchgeführt.
Um die optimale Expressionsdauer mit einer möglichst hohen IPSE-Konzentration zu ermitteln, wurde
einer Kultur mehrmals im Laufe von 14 Tagen eine 100 µl-Probe entnommen. Die erhaltenen Proben
wurden zur Ermittlung einer Zeitkinetik im Basophilenstimulationsassay (siehe 3.9.2) eingesetzt. Die
Menge der IL-4-Freisetzung ist dabei ein Maß für die in der Probe enthaltene IPSE-Konzentration.
41

Methoden
3.5 Insektenzellen
3.5.1 Kultur und Lagerung von Insektenzellen
Zur Expression von rekombinantem Protein in Insektenzellen wurde die Zelllinie High Five TM der
Firma Invitrogen verwendet. Diese Zellen können sowohl adhärent als auch in Suspensionskultur
kultiviert werden. In dieser Arbeit wurden nur adhärent wachsende Insektenzellen eingesetzt.
Die Zellen werden in Insektenzellmedium im Brutschrank bei 27 °C gehalten und alle 3 bis 4 Tage im
Verhältnis 1:5 geteilt. Zur Langzeitkonservierung können die Zellen in DMSO-haltigem
Einfriermedium in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Dafür werden die Zellen als Monolayer
angezogen bis sie 80-90 % Konfluenz erreicht haben. Aus dem Kulturüberstand wird das
Einfriermedium angesetzt. Die Zellen werden für 10 min bei 600 x g abzentrifugiert und in
Einfriermedium resuspendiert, so dass eine Zelldichte von 3 x 10 6 Zellen/ml erreicht wird. Die
Zellsuspension wird zu je 1 ml in Gefriergefäße aliquotiert und langsam mit einer
Temperaturabsenkung von 1 °C pro Minute auf -80 °C eingefroren. Anschließend können die Zellen
in flüssigen Stickstoff überführt werden. Eingefrorene Zellen können wieder in Kultur genommen
werden, indem sie bei 27 °C aufgetaut, in Insektenzellmedium resuspendiert und in eine
75 cm 2 -Kulturflasche ausgesät werden. Sobald die Zellen adhärent sind, erfolgt ein Mediumwechsel,
um toxisches DMSO zu entfernen.
Insektenzellmedium
Einfriermedium für Insektenzellkultur
1000 ml Express-Five ® SFM 42,5 % (v/v) Insektenzellmedium
10 µg/ml Gentamicin 42,5 % (v/v) Kulturüberstand
18 mM Glutamin 10 % (v/v) DMSO
5 % (v/v) FCS
Die Zusätze werden über einen 0,2 µm Spitzenfilter (Filtropour, Firma Sarstedt) in das Medium
filtriert.
3.5.2 Transfektion von Insektenzellen
Zur Transfektion der Insektenzellen mit den gereinigten Vektoren pIB-V5-His-IPSE bzw. pIB-IPSE
wurde das kationische Lipotransfektionsreagenz Cellfectin eingesetzt. Für die Transfektion werden
nur Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit einer Viabilität von mehr als 95 % verwendet.
Von diesen Zellen werden 0,8 x 10 6 Zellen in einer 6-Lochplatte mit 2 ml Insektenzellmedium
ausgesät. Für die Transfektionsmischung werden 1 ml Insektenzellmedium mit 10 µg gereinigter
Vektor-DNA und 6 µl Cellfectin vermischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Sobald die
Zellen adhärent sind, wird das Medium abgenommen und langsam die Transfektionsmischung
42

Methoden
zugegeben. Für 4 h werden die Zellen im Brutschrank unter gelegentlichen Bewegungen inkubiert.
Mit zusätzlichen 2 ml Insektenzellmedium wird der Transfektionsansatz für 48 h bei 27 °C kultiviert.
Zur Selektion wird den Zellen 80 µg/ml Blasticidin zugesetzt. Der Kulturüberstand wird im
Basophilenstimulationsansatz auf Anwesenheit von rekombinantem High Five-IPSE überprüft. Sobald
die Kultur aus stabil transfizierten Zellen besteht, wird die Blasticidinkonzentration auf 10 µg/ml
abgesenkt.
3.5.3 Expression von rekombinantem IPSE in Insektenzellen
Über den OpIE2-Promotor des transfizierten pIB/V5-His-Vektors wird das in den Vektor klonierte
Protein kontinuierlich exprimiert. Des Weiteren besitzt der transfizierte Vektor neben der IPSE-
Sequenz auch die IPSE-Signalsequenz mit Hilfe derer das exprimierte Protein in das umgebende
Medium sekretiert werden kann.
Um die optimale Expressionsdauer zu ermitteln, wurde eine Expressionskinetik durchgeführt wie
unter 3.4.3 beschrieben. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse, wurden die Überstände der
Insektenzellkultur nach 8 bis 9 Tagen abgenommen und weiter aufgereinigt. Durch bestimmte
Komponenten in dem serumfreien Medium, die von dem Hersteller nicht genauer spezifiziert werden,
müssen die Überstände vor der IMAC dialysiert werden, da sonst Ni 2+ -Ionen von der Matrix
gewaschen werden.
43

Methoden
3.6 Reinigung von rekombinantem IPSE aus eurkaryotischen Zellen
3.6.1 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)
Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie ist eine säulenchromatographische
Reinigungsmethode bei der an Agarose gebundene N-Nitrilo-tri-essigsäure (NTA) zweiwertige Ionen
wie z.B. Ni 2+ über vier Bindungsstellen chelatiert. Diese zweiwertigen Ionen haben eine hohe Affinität
zu Histidin, welches als His 6 -Tag an den rekombinant exprimierten Proteinen vorliegt. Während die
His-getaggten Proteine an die Ni-NTA-Agarose binden, können kontaminierende Proteine durch
Waschen entfernt werden. Die Elution erfolgt durch Zugabe von hohen Konzentrationen des
Histidinanalogons Imidazol, welches das gebundene Protein kompetitiv verdrängt.
Das Protokoll zur Proteinpräparation basiert auf den Herstellerangaben der Ni-NTA-Matrix. Dabei
werden 1 l abzentrifugierter Kulturüberstand mit 333 ml 4x Inkubationspuffer und 2 ml in
Inkubationspuffer äquilibrierter Ni-NTA versetzt und zur Bindung der Proteine an die Matrix für
mindestens 90 min auf dem Rollenmischer inkubiert. Die Mischung wird über Gravitationskraft in
eine Chromatographiesäule gefüllt und das Effluent gesammelt. Schwach an die Ni-NTA gebundene
Proteine werden durch Waschen mit 3 mal 15 ml 1x Inkubationspuffer entfernt. Die Elution erfolgt
mit Elutionspuffer (250 mM Imidazol) in 13 Fraktionen à 1,5 ml.
4x Inkubationspuffer
Elutionspuffer
200 mM NaH 2 PO 4 50 mM NaH 2 PO 4
1,2 M NaCl 300 mM NaCl
50 mM Imidazol 250 mM Imidazol
pH-Einstellung mit 10 M NaOH auf 8,0 pH-Einstellung mit 1 M NaOH auf 8,0
3.6.2 Immunoaffinitätschromatographie
Bei der Immunoaffinitätschromatographie werden Antikörper gegen das zu reinigende Antigen
kovalent an eine Säulenmatrix gekoppelt. Das Antigen wird auf der Säule zurückgehalten, während
kontaminierende Proteine im Effluent zu finden sind. Die Elution des gebundenen Antigens kann
durch Absenkung des pH-Wertes oder durch Erhöhung der Salzkonzentration geschehen.
3.6.2.1 Herstellung einer anti-IPSE-Säule
Die Kopplung der gereinigten monoklonalen anti-IPSE Antikörper an eine 5 ml NHS-aktivierte
HiTrap Sepharose-Säule (Firma Amersham Biosciences) wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
44

Methoden
Anschließend wird die Säule mit 20 ml PBS mit Azid (0,01 % w/v) zur Konservierung gespült und bei
4 °C gelagert. Die Kopplungseffizienz wurde nach Herstellerangaben über spektralphotometrische
Absorptionsmessung bei 280 nm nach Auftrennung des Effluents über eine PD-10 Säule (Firma
Amersham Biosciences) bestimmt und lag bei 94 %.
Kopplungspuffer (pH 4,0) Puffer A (pH 8,3) PufferB (pH 4,0)
200 mM NaHCO 3 500 mM Ethanolamin 100 mM Na-Acetat
500 mM NaCl 500 mM NaCl 500 mM NaCl
3.6.2.2 Proteinreinigung von IPSE über eine anti-IPSE-Säule
Zur weiteren Aufreinigung werden die Elutionsfraktionen aus der IMAC immunoaffinitätschromatographisch
aufgetrennt. Eine 5 ml anti-IPSE-Säule wird dafür an eine ÄktaPurifier Anlage
(Firma Amersham Biosciences) angeschlossen. Während des gesamten Laufs wird über einen
UV-Monitor das Proteinprofil bei 280 nm aufgezeichnet. Die vereinigten Elutionsfraktionen werden
gegen PBS-Puffer (pH 7,4) dialysiert und filtriert (0,2 µm Filtropour Spitzenfilter, Firma Sarstedt).
Über einen 50 ml Superloop wird die Probe bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf eine 5 ml
anti-IPSE-Säule aufgetragen. Dabei werden Fraktionen à 15 ml gesammelt. Anschließend wird die
Säule mit 2 Säulenvolumen PBS gewaschen. Die Elution erfolgt durch Absenkung des pH-Wertes auf
pH 2,7 mit 100 mM Glycin-HCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Es werden Fraktionen à
1 ml gesammelt, die anschließend sofort mit 50 µl 1 M Tris-HCl pH 9,0 neutralisiert werden.
Peakfraktionen werden gegen PBS-Puffer dialysiert und in Centricon Plus-20 Filtern (Firma
Millipore) konzentriert. Die Proteinkonzentration wird wie unter 3.7.1.2 beschrieben ermittelt.
3.6.3 Reinigung von HEK-IPSE über Gelfiltration
Die Gelfiltration wird häufig als letzter Reinigungsschritt eingesetzt, um letzte Kontaminationen zu
entfernen. Dabei werden die Proteine ihrer Größe nach aufgetrennt, wobei wie schon unter 3.3.1.2
erwähnt, größere Moleküle eher eluieren als kleinere Moleküle. Die Gelfiltration von HEK-IPSE
wurde eingesetzt, um letzte Reste des Monomers bzw. Kontaminationen, die sich in der
silbergefärbten SDS-PAGE eventuell nicht darstellen lassen, zu entfernen.
Die Gelfiltration wurde mit einer Superdex 75-Säule (Superdex 75 10/300 GL von Amersham
Biosciences) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Probe:
50 µl HEK-IPSE 1,8 mg/ml (entspricht 90 µg)
Laufpuffer: PBS pH 7,4
Fließgeschwindigkeit: 0,05 ml/min
Fraktionsgröße: 500 µl
45

Methoden
3.7 Allgemeine proteinchemische Methoden
3.7.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
3.7.1.1 Bestimmung der Proteinkonzentration über spektralphotometrische Absorptionsmessung
Proteinkonzentrationen können über spektralphotometrische Absorptionsmessung bei 280 nm ermittelt
werden. Das Absorptionsmaximum von Proteinen bei 280 nm ergibt sich durch die aromatischen
Aminosäuren Tryptophan (Trp) und Tyrosin (Tyr), sowie zu einem geringen Teil den Disulfidbrücken.
Der spezifische Extinktionskoeffizient (ε S ) für HEK-IPSE wurde über das Programm ProtParam [2]
ermittelt und liegt bei 1,27. Nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz lässt sich über den spezifischen
Extinktionskoeffizienten und die Absorption die Proteinkonzentration einer Lösung bestimmen.
A 280 nm = ε S x c x d → c = A 280 nm x ε S
-1
ε S = molarer Extinktionskoeffizient [l x mol -1 x cm -1 ],
c = Konzentration [g x l -1 ],
d = Schichtdicke der Küvette [cm] = 1 cm
Zur Messung werden 80 µl der Probe in eine Kunststoff-Einmalküvette (UVette, Firma Eppendorf),
die für Messungen im UV-Bereich geeignet ist, gefüllt und im Photometer (BioPhotometer, Firma
Eppendorf) bei 280 nm vermessen. Als Leerwert dient das Lösungsmittel der Probe ohne Protein.
3.7.1.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode (Smith et al. 1985)
Die Proteinquantifizierung mit Hilfe der BCA-Methode beruht darauf, dass Kupferionen im
alkalischen Milieu durch Proteine reduziert werden (Cu 2+ → Cu + ). Das einwertige Kupfer bildet
anschließend mit 2,2´-Bichinoninsäure (BCA) einen violetten Chelatkomplex, der bei 570 nm nahezu
linear zur Proteinkonzentration im Bereich von 20 bis 2000 µg/ml absorbiert.
Die BCA-Methode wurde mit dem „BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Firma Pierce) nach
Herstellerangaben durchgeführt. Für Proteinkonzentrationen unter 200 µg/ml wurde der sensitivere
„Micro BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Nachweisgrenze: 0,5 µg/ml) verwendet.
46

Methoden
3.7.2 Dialyse von Proteinlösungen
Die Dialyse dient zur Umpufferung von Lösungen und zum Entfernen von niedermolekularen
Bestandteilen aus einer Lösung. Dabei diffundieren kleine Moleküle durch eine semipermeable
Membran längs eines Konzentrationsgradienten, bis sich zwischen beiden Seiten der Membran ein
Gleichgewicht eingestellt hat.
Die Dialysemembranen werden vor Gebrauch 20 min in aqua dest. gewaschen. Die Wahl der
Dialysemembran ist abhängig von dem Molekulargewicht des zu dialysierenden Proteins. Für die
Dialyse von IPSE-haltigen Lösungung werden Dialysemembranen mit einem MWCO von höchstens
10.000 kD eingesetzt. Die Probe wird in den Dialyseschlauch gefüllt, der Dialyseschlauch wird
verschlossen und in das 100-1000fache Volumen Dialyselösung gegeben. Die Dialyse findet über 24 h
bei 4 °C unter Rühren statt, wobei die Dialyselösung nach 2 und nach 4 Stunden ausgetauscht wird.
3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970)
Die SDS-PAGE dient dazu, Proteine aus einem Gemisch nach ihrem Molekulargewicht aufzutrennen
sowie die Reinheit einer Probe bzw. das Molekulargewicht der Proteine zu bestimmen. Das anionische
Detergenz SDS im Probenpuffer lagert sich im theoretischen Verhältnis von 1,4 : 1 an die Proteine
(Guttman, 1996). Hierdurch verleiht es jedem Protein-SDS-Komplex eine negative Nettoladung, die
proportional zum Molekulargewicht des Proteins ist und unterbindet gleichzeitig alle nicht-kovalenten
Bindungen. Wird dem Probenpuffer β-Mercaptoethanol zugesetzt, bewirkt dies zusätzlich eine
Reduktion der Disulfidbrücken. Unter diesen Bedingungen sind die Proteine vollständig denaturiert
und ihre Beweglichkeit im Gel ist proportional zum dekadischen Logarithmus ihrer Masse.
Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese wird ein System aus zwei Gelen, einem Trenngel und
einem Sammelgel, verwendet. Das großporige Sammelgel dient der Fokussierung der Proteine, damit
sie als scharf abgegrenzte Banden durch das Trenngel laufen. Die Fokussierung wird dadurch erreicht,
dass das Sammelgel einen sauren pH-Wert aufweist, bei dem das im Laufpuffer enthaltene Zwitterion
Glycin nur zu einem geringen Teil als Anion vorliegt. Wird ein elektrisches Feld angelegt, baut sich
durch den Mangel an Anionen ein starkes lokales elektrisches Feld zwischen den sich schnell
bewegenden Chloridionen und den langsameren Glycinationen auf, in dem die Proteine beschleunigt
werden. Beim Übergang in das alkalischere Trenngel wird der Mangel an Anionen aufgehoben und es
herrscht ein gleichmäßiges elektrisches Feld, in dem die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine nur
von ihrem Molekulargewicht abhängt.
Die Proben werden zu gleichen Teilen mit 2x Probenpuffer (reduzierend oder nicht-reduzierend)
versetzt, für 3 Minuten bei 95 °C gekocht (gilt nur für reduzierenden Probenpuffer) und auf das Gel
aufgetragen. Die Zusammensetzung für das Sammelgel und Trenngel ist in Tabelle 3.1 aufgeführt. Zur
Abschätzung des Molekulargewichtes wird zusätzlich ein Molekulargewichtsmarker aufgetragen (Low
Molecular Weight Marker, Firma Biorad). Die Auftrennung der Proteine erfolgt in einer
47

Methoden
Elektrophoresekammer der Firma Phase bei zunächst bei 50 V bis die Lauffront das Trenngel erreicht
hat, dann wird die Spannung auf 100 bis 120 V erhöht. Die Elektrophorese wird beendet, wenn die
Lauffront das Gelende erreicht hat.
4x Sammelgelpuffer (pH 6,8) 4x Trenngelpuffer (pH 8,8)
0,5 M Tris-HCl 1,5 M Tris-HCl
2x Probenpuffer (pH 6,8; nicht-reduzierend) Elektrodenpuffer
0,12 M Tris-HCl 50 mM Tris-HCl
20 % (v/v) Glycerin 384 mM Glycin
4 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS
0,01 % (w/v) Bromphenolblau
2x Probenpuffer (pH 6,8; reduzierend)
Für den reduzierenden Probenpuffer wird dem nicht-reduzierendem Probenpuffer 1 % (w/v) DTT
zugesetzt.
Tabelle 3.1: Zusammensetzung von Sammelgel und Trenngel für die SDS-PAGE
Sammelgel
Trenngel
T = 4 % T = 7,5 % T = 12 % T = 15 %
Aqua dest. 2,9 ml 8 ml 5,5 ml 3,9 ml
Acrylamid 850 µl 4 ml 6,5 ml 8,1 ml
4x Sammelgelpuffer 1,3 ml -
4x Trenngelpuffer - 4 ml
Pyronin G 16 µl -
SDS (10 % (w/v) 51 µl 163 µl
TEMED 5 µl 16 µl
APS (10 % (w/v) 30 µl 100 µl
48

Methoden
3.7.4 Färbung von Polyacrylamidgelen
3.7.4.1 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988)
Die empfindlichste Nachweismethode von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen ist die Silberfärbung, die
nach der Methode von Heukeshoven und Dernick eine Nachweisgrenze von 50 bis 100 pg pro Bande
aufweisen kann. Diese Empfindlichkeit wird jedoch nur selten erreicht, da nicht jedes Protein
gleichermaßen mit dieser Methode angefärbt werden kann. Bei der Silberfärbung bilden Ag + -Ionen
mit Glutamat-, Aspartat- und Cysteinresten Komplexe. Alkalisches Formaldehyd reduziert das Ag + der
Komplexe zu metallischem Silber, das sichtbar ist.
Die Proteine im Gel werden zunächst 15 Minuten in Fixierlösung fixiert und dann für eine Stunde in
thiosulfathaltige Inkubationslösung überführt. Das Gel wird 4 Mal für 5 min in aqua dest. gewaschen
und dann eine halbe Stunde in Silberlösung inkubiert. Nach kurzem Waschen des Gels in aqua dest.
werden die Banden durch Entwicklerlösung bis zur gewünschten Intensität angefärbt. Die Reaktion
wird durch Inkubation in Stopplösung beendet. Zur Konservierung wird das Gel für eine Stunde in
Glycerinlösung überführt und anschließend zwischen zwei Lagen eingeweichter Einmachhaut auf
einer Glasscheibe getrocknet.
Fixierlösung
30 % (v/v) Ethanol
10 % (v/v) Eisessig
Inkubationslösung
30 % (v/v) Ethanol
500 mM Natriumacetat
0,5 % (v/v) Glutardialdehyd
0,3 % (w/v) Natriumthiosulfat
Glutardialdehyd und Natriumthiosulfat werden erst direkt vor Gebrauch zugefügt.
Silberlösung
0,1 % (w/v) Silbernitrat
0,05 % (v/v) Formaldehyd
Die Lösung wird direkt vor Gebrauch frisch angesetzt.
Entwickler
230 mM Natriumcarbonat
0,05 % (v/v) Formaldehyd
Das Formaldehyd wird erst direkt vor Gebrauch zugesetzt.
49

Methoden
Stopplösung
50 mM EDTA
Glycerinlösung
1,5 % (v/v) Glycerin
3.7.4.2 Coomassie-Färbung nach Neuhoff et al. (1988)
Der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie bildet mit den fixierten Proteinen im Gel einen stabilen
Protein-Farbstoff-Komplex. Die Coomassie-Färbung ist weniger sensitiv als die Silberfärbung. Wie
auch bei der Silberfärbung ist die Sensitivität abhängig vom Protein und kann bei 200 bis 400 ng pro
Bande liegen.
Zur Färbung werden die Gele direkt in Coomassie-Färbelösung für mindestens 2 h inkubiert und
anschließend in Entfärbelösung überführt. Die Entfärbelösung wird so oft erneuert, bis nur noch eine
möglichst geringe Hintergrundfärbung zu sehen ist. Nach Inkubation für 1 h in Glycerinlösung können
die Gele zwischen zwei Lagen eingeweichter Einmachhaut konserviert werden. Die Entfärbelösung
wird über Aktivkohle regeneriert.
Coomassie-Färbelösung
Coomassie-Entfärbelösung
0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 18 % (v/v) Isopropanol
40 % (v/v) Ethanol 9 % (v/v) Eisessig
10 % (v/v) Eisessig
Glycerinlösung
2 % (v/v) Glycerin
7 % (v/v) Eisessig
3.7.5 Westernblot
Beim Westernblot werden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert und anschließend über spezifische Antikörper sichtbar gemacht.
Der Transfer erfolgte in der vorliegenden Arbeit mittels Elektroblotting nach dem Semi-Dry-Blotting-
Prinzip von Khyse-Andersen (1984). Dabei werden die Proteine aus der Polyacrylamidmatrix über das
senkrecht zum Gel angelegte elektrische Feld eluiert und in derselben Anordnung von der Membran
adsorbiert.
50

Methoden
Für den luftblasenfreien Aufbau des Blots werden auf die Anode zwei Filterpapiere gelegt, die mit
Anodenpuffer I getränkt sind, dann ein Filterpapier, das mit Anodenpuffer II getränkt ist und
schließlich die Nitrocellulosemembran (Protran ® , Firma Schleicher & Schüll) und das Gel, die beide in
Anodenpuffer II äquilibriert worden sind. Abschließend folgen drei in Kathodenpuffer getränkte
Filterpapiere und die Kathode. Der Aufbau wird mit einem 2 kg-Gewicht beschwert und der
Blotvorgang erfolgt für 30 min bei 0,8 mA/cm 2 . Nach erfolgtem Blotting wird das Gel entfernt und die
Membran trockengefönt. Zur Blockierung freier Bindungsstellen wird die Membran für mindestens
1 h in TBST auf einem Schüttler inkubiert und wieder getrocknet.
Anodenpuffer I (pH 10,0) Kathodenpuffer (pH 9,4)
300 mM Tris-HCl 25 mM Tris-HCl
20 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Methanol
20 mM 6-Aminohexansäure
Anodenpuffer II (pH 10,4)
25 mM Tris-HCl
20 % (v/v) Methanol
3.7.5.1 Proteinnachweis im Westernblot über India Ink-Färbung (Hancock und Tsang, 1983)
Proteine, zum Beispiel Markerproteine, können auf Westernblotmembranen unspezifisch über eine
India Ink-Färbung mit einer Nachweisgrenze von 80 bis 200 ng/Bande angefärbt werden (Hancock
und Tsang, 1983). Dafür wird die India Ink-Lösung 1:1000 in TBST verdünnt und die Membran darin
1 h inkubiert. Überschüssige Farbpartikel werden durch mehrmaliges Waschen mit TBST entfernt und
die Membran getrocknet.
3.7.5.2 Spezifischer Proteinnachweis und Antikörperbindung im Westernblot
Als Detektionssystem für den Westernblot wurde das Alkalische Phosphatase-System verwendet. Die
Alkalische Phosphatase (AP) spaltet von einem Substrat-Chromogengemisch einen Phosphatrest ab,
wobei ein Farbstoff freigesetzt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde 5-Bromo-4-chloro-3-
indolylphosphat (BCIP) als Substrat eingesetzt, welches durch Dephosphorylierung und Oxidation in
einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Als Oxidationsmittel dient Nitroblautetrazoliumchlorid
(NBT), welches nach der Reaktion ebenfalls einen blauen Farbstoff ergibt und somit farbverstärkend
wirkt. Die Alkalische Phosphatase ist entweder an Sekundärantikörper gekoppelt oder liegt als an
Streptavidin gebundenes Fusionsprotein vor (Streptavidin-Alkalische Phosphatase = SavAP).
Der blockierte Blot wird in 3 mm breite Streifen geschnitten und in einer Kanalschale mit dem
Primärantikörper über Nacht inkubiert. Der Primärantikörper wird durch dreimaliges Waschen mit
51

Methoden
TBST für jeweils 10 min entfernt und die Blots werden für 2 h mit dem AP-konjugierten
Sekundärantikörper behandelt. Nach einem erneuten Waschzyklus, wird die Membran in TBS pH 9,5
äquilibriert und die Bindung der Antikörper durch Reaktion der Alkalischen Phosphatase mit
zugesetztem NBT/BCIP visualisiert. Die Reaktion wird durch Waschen mit aqua dest. gestoppt.
Sämtliche Inkubationsschritte finden in einem Inkubationsvolumen von 1 ml bei Raumtemperatur auf
einem Schüttler statt und alle Verdünnungen werden mit TBST hergestellt.
BCIP-Stammlösung
5 mg/ml BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat)
gelöst in TBS-Puffer pH 9,5
NBT-Stammlösung
33 mg/ml NBT (Nitroblautetrazoliumchlorid)
gelöst in TBS-Puffer pH 9,5
Chromogenlösung für Alkalische Phosphatase
1 ml BCIP-Stammlösung wird mit 30 ml NBT-Stammlösung vereinigt und auf 37 °C angewärmt.
3.7.6 Biotinylierung von Proteinen
Biotin kann über N-Hydroxysuccinimid (NHS) unter milden alkalischen Bedingungen an
Amingruppen von Proteinen gekoppelt werden. Biotin besitzt eine sehr hohe natürliche Affinität zu
Streptavidin mit einer Dissoziationskonstante von K D = 10 -15 M. Mit an Streptavidin (Sav) gekoppelter
Alkalischen Phosphatase (AP) können biotinylierte Proteine im Westernblot nachgewiesen werden. In
der vorliegenden Arbeit wurde biotinyliertes HEK-IPSE ebenfalls dazu verwendet die Bindung von
IPSE an Basophile in FACS-Analysen zu untersuchen. Als Nachweissystem diente dabei an
Phycoerythrin (PE) gekoppeltes Streptavidin (SavPE).
Für die Biotinylierung werden 22 mg (+)-Biotin-N-hydroxysuccinimidester in DMSO gelöst und das
zu biotinylierende Protein im Verhältnis 3 Teile Protein zu 1 Teil Biotinlösung damit vermischt. Nach
4 h Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Rollenmischer wird das nicht gebundene Biotin durch
Dialyse entfernt.
52

Methoden
3.8 Methoden zur Untersuchung von IPSE
3.8.1 Doppelimmunodiffusionsassay nach Ouchterlony
Die zweidimensionale Immunodiffusion nach Ouchterlony, auch Agar-Gel-Doppeldiffusion genannt,
dient der Identitätsuntersuchung und semiquantitativen Bestimmung von Antigenen. Dabei werden
zwei Proteinlösungen in vorgestanzte Löcher in ein Agarosegel eingebracht, so dass die Proteine frei
in dem Gel diffundieren können. Sofern beide Reaktionspartner bivalent füreinander sind und in
äquimolarer Menge vorliegen, bilden sich Präzipitate, die durch Färbemethoden, wie zum Beispiel der
Coomassie-Färbung, sichtbar gemacht werden können.
Die Agarose wird in Barbitalpuffer unter Kochen gelöst und 5 ml davon auf 7,5 cm x 2,5 cm große
GelBond ® -Folie (Firma Biozym) pipettiert. Nach dem Abkühlen werden mit einer Stanze Löcher in
die Agarosegele gestanzt. Von den Reaktionspartnern werden Verdünnungsreihen angelegt und wie in
Abbildung 3.1 angegeben in die Löcher pipettiert. In einer wasserdampfgesättigten Metallschale
werden die Gele für 48 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die Gele zunächst gepresst und freie
Proteine durch Waschen entfernt (2 x für 30 min mit Kochsalzlösung, 2 x für 10 min mit aqua dest.).
Nach erneutem Pressen und Trocknen werden die Gele zur Färbung für 10 min in Coomassie-Lösung
überführt und anschließend mehrmals mit Entfärberlösung entfärbt, wobei zunächst ein Mal
Entfärbelösung I verwendet wird und bis zur vollständigen Entfärbung des Hintergrundes
Entfärbelösung II eingesetzt wird. Durch Trocknen werden die Gele konserviert.
Abbildung 3.1: Schematischer Aufbau eines Doppelimmunodiffusionsassays nach Ouchterlony. In das
Agarosegel werden Vertiefungen in der dargestellten Anordnung gestanzt. Lösung A (z. B. Antigen) wird in die
Mitte platziert, Verdünnungsstufen der Lösung B (z. B. Antikörper) werden in die umgebenden Löcher gegeben.
Beide Lösungen können im Gel diffundieren. Sofern beide Reaktionspartner bivalent füreinander sind, ergibt
sich an der Stelle an der beide in der gleichen Konzentration vorliegen ein Präzipitat, dass über Färbemethoden
visualisiert werden kann. Auf der rechten Seite des Gels, wird der Versuch in umgekehrter Anordnung
durchgeführt.
53

Methoden
Barbitalpuffer
2,5 mM 5,5-Diethylbarbitursäure-Natriumsalz
0,7 mM 5,5-Diethylbarbitursäure (bei 95 °C im Wasserbad lösen)
0,015 % (w/v) Merthiolat
keine pH-Einstellung, pH-Wert sollte bei 8,3 liegen
Coomassie-Färbelösung
0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250
40 % (v/v) Ethanol
10 % (v/v) Eisessig
Entfärbelösung I
15 % (v/v) Ethanol
5 % (v/v) Eisessig
Entfärbelösung II
18 % (v/v) Isopropanol
9 % (v/v) Eisessig
3.8.2 Deglycosylierung von Proteinen
PNGase F, eine Amidase aus Flavobacterium meningosepticum, spaltet N-glycosidische Bindungen
zwischen dem Asparagin des Glycoproteins und der Kohlenhydratseitenkette. Endo H spaltet dagegen
zwischen den beiden ß-(1→4) gebundenen N-Acetylglucosaminresten, so dass nach der Spaltung an
dem Protein ein N-Acetylglucosaminrest verbleibt.
Für die Deglycosylierung werden 12 µg Protein in einem Volumen von 20 µl mit 5 U des jeweiligen
Enzyms versetzt und 24 h bei 37 °C inkubiert. Da das Enzym Endo H bei pH 7,4 nicht aktiv ist, wird
der pH-Wert bei dieser Probe auf pH 5,5 abgesenkt. Der Erfolg der Deglycosylierung wird in der
SDS-PAGE und im Westernblot untersucht.
3.8.3 Massenspektrometrische Untersuchung mit MALDI-TOF-MS
Die MALDI-TOF-MS (Matrix-assistierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie)
dient der Molekulargewichtsbestimmung von Biomolekülen. In diesem Fall wurde die
Methode zur Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE eingesetzt. Proteine lassen sich unter
54

Methoden
normalen Umständen nicht in die Gasphase überführen und sind somit nicht für die
Massenspektroskopie verwendbar. Bei der MALDI-TOF-MS wird dieses Problem gelöst, indem die
Proben in Kristalle einer Matrix, häufig eine niedermolekulare organische Säure, eingelagert werden.
Werden diese Analyt-Matrix-Kristalle mit einem Laser beschossen, wird die Probe mit Hilfe der
Matrix ionisiert und zusammen mit ihr in die Gasphase überführt. Die Ionen werden dann in einem
elektrischen Feld beschleunigt und ihre Flugzeit am Detektor bestimmt. Durch Eichung des
Instrumentes mit Molekülen bekannter Masse werden aus den Flugzeiten der Analyt-Ionen die
Massen-Ladungsverhältnisse m/z ermittelt.
Die Arbeiten wurden von PD Dr. B. Lindner (LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel)
durchgeführt.
3.8.4 Kristallisation
Voraussetzung für die Strukturaufklärung von Proteinen über Röntgenbeugungsmuster ist das
Vorhandensein eines Proteinkristalls. Bei der Proteinkristallisation wird einer konzentrierten
Proteinlösung langsam Wasser entzogen. Unter bestimmten Bedingungen lagern sich die Moleküle bei
dieser Konzentrierung in einer gleichmäßigen Anordnung an, so dass ein Kristall wachsen kann.
Welche Bedingungen zu dieser Kristallisation führen, kann nicht vorhergesagt werden und ist
proteinabhängig. Die zwei am häufigsten verwendeten Kristallisationsverfahren sind das Batch-
Verfahren und die Dampfdiffusionsmethode.
In dieser Arbeit wurde die Dampfdiffusionsmethode verwendet, da hier im Gegensatz zum Batch-
Verfahren in einem Experiment ein weiter Konzentrationsbereich untersucht werden kann. Man
unterscheidet die Dampfdiffusionsmethode im „hängenden Tropfen“ und im „sitzenden Tropfen“
(beide sind in Abbildung 3.2 dargestellt), wobei beide Arten der Durchführung auf demselben Prinzip
beruhen. Ein Tropfen mit einem Gemisch aus wässriger Proteinlösung und Fällungsmittel wird hierbei
in den Kopfraum einer Mikrotiterplatte platziert. Die eigentliche Vertiefung wird mit einer deutlich
größeren Menge Fällungsmittel gefüllt und dicht verschlossen. Im Kopfraum entsteht so eine
gesättigte Fällungsmittel-Atmosphäre, wodurch das Wasser langsam aus dem proteinhaltigen Tropfen
diffundiert. Durch diese Diffusion steigt die Fällungsmittel- und Proteinkonzentration im sitzenden
oder hängenden Tropfen während des Versuchs kontinuierlich an.
Um möglichst viele Konditionen untersuchen zu können, wurde das JBScreen Crystallization Kit der
Firma Jena Biosciences verwendet. In dem Kit sind 240 Ampullen mit unterschiedlichen
Pufferbedingungen und Fällungsmittelkonzentrationen enthalten (genaue Zusammensetzung siehe
Herstellerangaben), die nach Literaturrecherche schon häufig zur erfolgreichen Kristallisation geführt
haben. Der Inhalt einer Ampulle (700 µl) wird in die große Vertiefung einer 24-Loch-Cloverplate
(Firma Jena Biosciences) gefüllt. 2 µl der Proteinlösung (HEK-IPSE 13 mg/ml in 100 mM MES-
Puffer pH 6,5) und 2 µl der jeweiligen Kondition werden vorsichtig in die kleine Vertiefung der Platte
55

Methoden
pipettiert, so dass sich die beiden Tropfen gerade eben vereinigen können. Abschließend wird die
Platte gut verschlossen und waagerecht in einem klimatisiertem Raum bei 25 °C gelagert. Der
Krisallisationsprozess wird in Abständen unter dem Mikroskop beobachtet und dokumentiert.
Ein zweites Kristallisationsexperiment wurde mit HEK-IPSE in der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage
des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Hamburg von
Dr. J. Müller-Dieckmann durchgeführt.
Abbildung 3.2: Prinzipielle Durchführungsarten der Dampfdiffusionsmethode zur Proteinkristallisation:
„hängender Tropfen“ und „sitzender Tropfen“. Ein Gemisch aus Protein und Fällungsmittel wird in den
Kopfraum einer Mikrotiterplatte gegeben. Beim „hängenden Tropfen“ wird das Gemisch an der Abdeckung
angebracht, beim „sitzenden Tropfen“ auf einem Vorsprung in der Vertiefung. Ein großer Überschuss an
Fällungsmittel wird in die große Vertiefung pipettiert und die Platte luftdicht verschlossen, so dass sich eine
Fällungsmittel gesättigte Atmosphäre im Kopfraum einstellt.
56

Methoden
3.9 Methoden zur Untersuchung der Wirkung von IPSE auf basophile
Granulozyten
3.9.1 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten
Die Aufreinigung der humanen basophilen Granulozyten (Basophilen) erfolgte nach einem
dreistufigen Verfahren nach der Methode von Haisch et al. (1999). Das Verfahren besteht aus einer
Dichtegradienten-Zentrifugation, einer Gegenstrom-Elutriation und einer negativen Selektion mit
immunomagnetischen Beads. Die Basophilen wurden aus Frischblut von freiwilligen, gesunden
Spendern gewonnen. Eine Zustimmung Ethikkommission der Medizinischen Falkultät der Universität
zu Lübeck lag vor (Aktenzeichen 03-319). Direkt bei der Abnahme wurde das Blut mit 10 % (v/v)
einer 100 mM EDTA-Lösung (pH 7,4) als Antikoagulanz vermischt.
3.9.1.1 Ficoll/Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation
Eine 100:6 Ficoll-Percoll-Mischung (Dichte = 1080 g/l) wird mit dem frischen Blut-EDTA-Gemisch
überschichtet und 30 min bei 4 °C und 600 x g zentrifugiert. Die leukozytenreiche Interphase wird
abgenommen, mit kalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in HBSS-Puffer
aufgenommen.
HBSS-Puffer (pH 7,4)
10x HBSS-Lösung (Firma PAA) 1:10 mit aqua dest. verdünnt
4,2 mM NaHCO 3
0,25 % (w/v) BSA
3.9.1.2 Gegenstrom-Elutriation
Bei der Gegenstrom-Elutriation ist eine Zentrifuge an eine Peristaltikpumpe angeschlossen und ein
Zellgemisch wird bei konstanter niedriger Fließgeschwindigkeit in die Zentrifuge eingespeist. Die
Fließrichtung der Zellen und die Zentrifugalkraft sind einander entgegengesetzt, so dass die Zellen
entsprechend ihrer Kompaktheit bzw. Größe sortiert werden. Durch stufenweise Erhöhung der
Fließgeschwindigkeit können die Zellen nacheinander eluiert werden.
Die Anlage wird mit HBSS-Puffer gespült und das Zellgemisch aus der Dichtegradienten-
Zentrifugation wird bei 3500 U/min und 30 ml/min in das System eingespeist. 200 ml des
Durchflusses bei dieser Fließgeschwindigkeit werden verworfen. Danach wird die
Fließgeschwindigkeit auf 33 ml/min erhöht und weitere 300 ml werden verworfen. Frühere
Untersuchungen haben ergeben, dass Basophile bei einer Fließgeschwindigkeit von 36 bis 45 ml/min
57

Methoden
eluieren. Aus diesem Grund werden 200 ml bei 42 ml/min gesammelt, über Zentrifugation eingeengt
und die Zellzahl und Basophilenreinheit bestimmt.
3.9.1.3 Bestimmung von Zellzahl und Basophilenreinheit
Durch Anfärbung der Zellen mit Trypanblau werden in der Neugebauer-Kammer Zellzahl und
Zellviabilität ermittelt. Zur Bestimmung der Reinheit werden Zytospin-Präparate mit
150.000 Zellen/Objektträger (500 U/min; 1 min) angefertigt und 3 min mit May-Grünwald-Lösung
gefärbt. Im Lichtmikrokop können basophile Granulozyten von kontaminierenden Zellen differenziert
und die Basophilenreinheit bestimmt werden.
3.9.1.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads
Zur weiteren Aufreinigung der Fraktion aus der Gegenstrom-Elutriation wurde das MACS Basophil
Isolation Kit (Firma Miltenyi) nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Die Zellen werden dabei mit
einem Gemisch aus monoklonalen, Hapten-gekoppelten Antikörpern gegen Epitope von
verunreinigenden Zellen versetzt und inkubiert. Durch Inkubation mit einem Zweitantikörper, der
gegen das Hapten gerichtet ist und an den magnetische Beads gekoppelt sind, werden die Nicht-
Basophilen markiert. Das Zellgemisch wird über eine Säule mit magnetisierter Matrix gegeben, die die
markierten Zellen im Magnetfeld festhält, während die unmarkierten Basophilen im Effluent zu finden
sind. Das Effluent wird über Zentrifugation eingeengt, in 500 µl HBSS-Puffer aufgenommen und
erneut die Zellzahl und Basophilenreinheit (siehe 3.9.1.3) bestimmt.
3.9.2 Stimulation der Basophilen zur IL-4-Freisetzung
Zur Stimulation werden die aufgereinigten Basophilen in einer Endkonzentration von
25.000 Basophilen/ml in Medium in sterilen Rundbodenplatten (Firma Nunc) bei 37 °C und 6 % CO 2 -
Gehalt in einem befeuchteten Brutschrank über Nacht inkubiert. Da bekannt ist, dass Stimulation mit
IL-3, einem Wachstums- und Differenzierungsfaktor von Basophilen, die IgE-vermittelte IL-4-
Freisetzung der Zellen potenziert (Brunner et al. 1993), wird zu allen Stimulationsansätzen IL-3 in
einer Konzentration von 2,5 ng/ml zugesetzt.
Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der zu untersuchenden Substanz in Verdünnungsreihen in
100 µl Endvolumen angefertigt. Als Kontrollen wurden bei jedem Ansatz folgende Stimulatien
mitgeführt:
IL-3 (Negativkontrolle)
2,5 ng/ml
Ionomycin (IgE unabhängige Kontrolle) 2 µM
anti-IgE (Positivkontrolle)
50 ng/ml
58

Methoden
Medium zur Stimulation der Basophilen
Protectomed basal Iscoves Medium (IMDM 1x) versetzt mit
50 µg/ml Transferrin
5 µg/ml Insulin
100 U/ml Penicillin G
100 µg/ml Streptomycin-Sulfat
3.9.3 Stripping und Resensibilisierung von Basophilen
Um das an die Fcε-Rezeptoren der Basophilen gebundene IgE zu entfernen, wurde in dieser Arbeit ein
IgE-Stripping in Anlehnung an die Methode von Pruzansky et al. (1983) durchgeführt. Dafür werden
die aufgereinigten Basophilen (0,5 x 10 6 Zellen) mit 200 µl Lactatpuffer versetzt und auf Eis inkubiert,
wobei nach jeweils 1 min die Zellen kräftig gemischt werden. Nach 3 min Inkubation werden die
Proben auf 4 ml mit HBSS-Puffer aufgefüllt und die Zellen rasch abzentrifugiert (600 x g, 4 °C,
5 min), um eine erneute Bindung des IgE an die Rezeptoren zu verhindern. Der Überstand wird
verworfen, die Zellen in 400 µl Stimulationsmedium resuspendiert und auf zwei Eppendorf-
Reaktionsgefäße aufgeteilt. Für die Resensibilisierung wird den Zellen in einem der Eppendorf-
Reaktionsgefäße aufgereinigtes polyklonales IgE (10 µg/ml) zugesetzt. Die anderen Zellen werden
gestrippt belassen. Als weitere Option werden 0,25 x 10 6 Basophile, die bis zu diesem Zeitpunkt auf
Eis gehalten werden, ebenfalls in 200 µl Stimulationsmedium verdünnt und von diesem Zeitpunkt an
parallel behandelt. Um einen ausreichenden Gasaustausch zu gewährleisten, werden die Deckel der
Eppendorf-Reaktionsgefäße durchstochen und die Proben für 60 min im Brutschrank bei 37 °C und
6 % CO 2 inkubiert.
Lactat-Puffer (pH 3,9)
10 mM Milchsäure
5 mM KCl
140 mM NaCl
3.9.4 IL-4-ELISA
Die IL-4-Konzentration im Überstand der Basophilen wurde mit Hilfe des Sandwich-ELISAs IL-4
Elipair der Firma Diaclone bestimmt. Leichte Abweichungen vom Herstellerprotokoll wurden zur
optimalen Ausnutzung des Kits etabliert. Zur Beschichtung der 96-Loch Maxisorp-Platte (Firma
Nunc) wird der im Kit enthaltene anti-human-IL-4-Antikörper 1:1000 in TBS verdünnt und die Platte
damit über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend werden verbleibende Bindungsstellen für 2 h mit
5 % (w/v) BSA blockiert und die Platte getrocknet. Die Platte wird mit den Proben aus der
59

Methoden
Basophilenstimulation bzw. mit dem in Medium verdünnten Standard beschickt und 90 min inkubiert.
Anschließend wird die Platte nacheinander mit folgenden Reagenzien inkubiert: 60 min biotinylierter
Detektionsantikörper (1:100 verdünnt), 60 min Streptavidin-HRP (Horseradish peroxidase, 1:8000
verdünnt), 2 h TMB (Tetramethylbenzidin, Substrat der HRP). Alle Inkubationen werden auf einem
Schüttler in einer feuchten Metallkammer durchgeführt. Nach jeder Inkubation wird die Platte sieben
Mal mit TBST gewaschen. Zum Abschluss wird die Enzymreaktion mit 1 M H 2 SO 4 abgestoppt und
die Absorption bei 450 nm im ELISA Reader gemessen.
3.9.5 Anfertigung von Zytospinpräparaten
Die Degranulation der Basophilen nach Stimulation mit IPSE oder anderen Stimulantien kann über
Anfertigung von Zytospinpräparaten der Zellen mit anschließender May-Grünwald-Färbung
visualisiert werden.
Für die Zytospins werden 0,3 x 10 6 Basophile in 200 µl Medium mit den unterschiedlichen Stimuli
versetzt und über Nacht in Eppendorf-Reationsgefäßen bei 37 °C und 6 % CO 2 -Gehalt in einem
befeuchteten Brutschrank inkubiert. 100 µl der Basophilenlösung werden in einer Zytospinzentrifuge
bei 500 U/min für 1 min zentrifugiert, mit May-Grünwald-Lösung 10 min gefärbt und mit 100facher
Vergrößerung fotografiert.
3.9.6 Durchflusszytometrie (FACS)
Die fluoreszensaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Die Zellen werden mit
Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern, die gegen das zu untersuchende Oberflächenmolekül
gerichtet sind, inkubiert und anschließend in einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische
Fokussierung an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet.
Die FACS-Analyse wurde zum Nachweis von CD203c auf der Oberfläche der Basophilen und der
Bindung von IPSE an Basophile eingesetzt. Als Positivkontrolle diente in beiden Fällen anti-IgE.
3.9.6.1 Nachweis der Bindung von IPSE an Basophile
Für den Nachweis der Bindung von IPSE an native und gestippte Basophile werden native und
gestrippte Basophile, wie unter 3.9.1 beschrieben, präpariert. 0,1 x 10 6 dieser Basophilen werden pro
Kondition eingesetzt und mit unterschiedlichen Konzentrationen an biotinyliertem HEK-IPSE bzw.
biotinyliertem IgE für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden mit 1 ml Waschpuffer
gewaschen, pelletiert (800 x g, 5 min) und zur Färbung mit PE-gekoppeltem Streptavidin für 15 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zufügen von 300 µl Waschpuffer werden die Zellen im
Durchflusszytometer (FACScalibur, Firma BD Biosciences) vermessen.
60

Methoden
3.9.6.2 Nachweis von CD203c auf der Oberfläche von Basophilen
Für den Nachweis von CD203c werden pro Kondition 0,15 x 10 6 Basophile eingesetzt. Ein Teil dieser
Basophilen wird für 20 min bei Raumtemperatur in 1 ml Fixierungspuffer fixiert, die andere Hälfte in
Waschpuffer inkubiert. Anschließend werden die Zellen pelletiert (800 x g, 5 min) und
100 µl HEK-IPSE bzw. anti-IgE für 30 min bei 37 °C zugefügt. Den fixierten Zellen wird 1 ml
Waschpuffer zugesetzt, den unfixierten Zellen wird 1 ml Fixierungspuffer zugesetzt, um einen
Einfluss der Fixierung auf die Bindung des Antikörpers auszuschließen. Abschließend werden die
Zellen für 20 min bei Raumtemperatur mit PE-gekoppeltem anti-CD203c-Antikörper (1:20 verdünnt)
inkubiert, mit 600 µl Färbepuffer versetzt und im Durchflusszytometer (FACScalibur, Firma BD
Biosciences) vermessen.
Waschpuffer
0,5 % (w/v) BSA
Fixierungspuffer
0,5 % (w/v) BSA
2 % (v/v) Formaldehyd
Färbepuffer
1 % (w/v) BSA
1 % (w/v) Natriumazid
61

Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Expression von IPSE in E. coli
Nach Isolierung und Klonierung der cDNA von IPSE in den Expressionsvektor pPROEX-Htb konnte
das Protein bereits erfolgreich in E. coli DH5α als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert werden (im
Folgenden E. coli-IPSE genannt). Dabei wird IPSE jedoch unlöslich in Form von inclusion bodies im
Zytoplasma abgelegt. Die inclusion bodies werden unter denaturierenden Bedingungen in Lösung
gebracht. Nach Aufreinigung über IMAC kann ein Teil des exprimierten Proteins durch chemische
Rückfaltung in eine lösliche und aktive Form überführt werden. Das heißt, das so gewonnene
rekombinante IPSE bindet an Immunglobuline und induziert die IL-4-Freisetzung aus basophilen
Granulozyten wie das natürliche IPSE. Jedoch ist es sehr schlecht löslich und lässt sich nur bis zu
einer Konzentration von 0,15 mg/ml konzentrieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit
zunächst versucht, durch Modifizierung der Expressionsvektoren und -bedingungen IPSE in löslicher
Form in E. coli-Zellen zu exprimieren, um eine Rückfaltung zu umgehen.
4.1.1 Klonierung der Sequenz von IPSE in unterschiedliche Expressionsvektoren
4.1.1.1 pET26-IPSE
Bei dem Vektor pET26(+) handelt es sich um einen kommerziellen Expressionsvektor der Firma
Novagen. Als wichtigste Eigenschaft verfügt der Vektor über eine pelB-Leadersequenz, worüber die
exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum transportiert werden. Das dort herrschende
Milieu ist nicht so reduzierend wie das Zytoplasma und begünstigt somit die Bildung von
Disulfidbrücken und die Faltung von Proteinen. Wie alle Vektoren der pET-Reihe zeichnet sich dieser
Vektor durch einen niedrigen basalen Expressionshintergrund aus. Dies kommt dadurch zustande, dass
das zu exprimierende Gen hinter einen T7-Promotor kloniert wird. Die DNA-Sequenz für die
T7-RNA-Polymerase liegt in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) genomisch vor und ist hinter einen mit
IPTG induzierbaren lac-Promotor geschaltet. Das bedeutet, dass im nicht-induzierten Zustand keine
RNA-Polymerase zum Ablesen des gewünschten Gens vorliegt und so das Protein auch nicht
exprimiert werden kann.
Der Vektor verfügt über einen C-terminalen His 6 -Tag zur Aufreinigung des rekombinanten Proteins.
Die IPSE-Sequenz wurde zunächst wie auch bei allen folgenden Klonierungen in der PCR amplifiziert
und in einen TA-Klonierungsvektor zwischenkloniert. Anschließend wurde das Insert aus dem
Klonierungsvektor über BamHI und HindIII ausgeschnitten und in den Vektor pET26(+) ligiert. Der
Erfolg der Klonierung wurde über Restriktion überprüft und ist in Abbildung 4.1 dargestellt.
62

Ergebnisse
A) B)
Abbildung 4.1: Klonierung von pET26-IPSE. A) Vektorkarte von pET26-IPSE. KanR: Kanamycinresistenzgen, lacI:
Lactoserepressorgen, MCS: Multi cloning site, pelB-SP: pelB-Signalpeptid für die Translokation in das Periplasma. B)
Restriktion von pET26-IPSE mit BamHI und HindIII. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.
4.1.1.2 pBM1.1-IPSE
Das Plasmid pBM1.1 leitet sich von dem kommerziellen Expressionsvektor pET27b der Firma
Novagen ab und ist von Matthey et al. (1999) modifiziert worden. Es wurde freundlicherweise von
Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel) zur
Verfügung gestellt. Wie auch bei dem pET26(+)-Vektor handelt es sich bei dem pBM1.1-Vektor um
einen periplasmatischen Vektor, bei dem die exprimierten Proteine über das pelB-Signalpeptid in den
periplasmatischen Raum transloziert werden. Im Unterschied zum pET26(+)-Vektor befindet sich der
His 10 -Tag bei diesem Vektor am N-Terminus.
Dieses Plasmid wurde eingesetzt um rekombinantes lösliches Phl p 1, ein Allergen aus dem
Lieschgras Phleum pratense, zu exprimieren. Aus diesem Grund lag der Vektor als pBM1.1-Phlp1
vor. Die Sequenz des Phl p 1 wurde über die Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI entfernt. Die
IPSE-Sequenz wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen aus dem TA-Klonierungsvektor
geschnitten und mit dem gereinigten pBM1.1 ligiert. Der Erfolg der Klonierung wurde über
Restriktion verifiziert und ist in Abbildung 4.2 dargestellt.
63

Ergebnisse
A) B)
Abbildung 4.2: Klonierung von pBM1.1-IPSE. A) Vektorkarte von pBM1.1-IPSE. KanR: Kanamycinresistenzgen, lacI:
Lactoserepressorgen, MCS: Multi cloning site, pelB-SP: pelB-Signalpeptid für die Translokation in das Periplasma. B)
Restriktion von pBM1.1-IPSE mit HindIII und EcoRI. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.
4.1.1.3 pMalC-IPSE und pMalP-IPSE
Bei den Vektoren pMalC und pMalP der Firma New England Biolabs wird die DNA-Sequenz des zu
exprimierenden Proteins hinter das malE-Gen von E. coli kloniert, welches für das
Maltosebindeprotein (MBP) kodiert. Bei der Expression wird das gewünschte Protein als MBP-
Fusionsprotein exprimiert. Während bei der Expression des Vektors pMalP das Fusionsprotein über
das malE-Signalpeptid in den periplasmatischen Raum transportiert, besitzt der Vektor pMalC in
dieser Sequenz eine Mutation, so dass das Fusionsprotein im Zytoplasma verbleibt. Durch eine
Faktor Xa-Schnittstelle kann nach der Reinigung bei beiden Vektoren der MBP-Anteil des
Fusionsproteins wieder abgespalten werden.
Die IPSE-Sequenz wurde aus dem TA-Klonierungsvektor über BamHI und HindIII ausgeschnitten
und sowohl in den zytoplasmatischen pMalC-Vektor als auch in den periplasmatischen pMalP-Vektor
eingefügt. Der Erfolg der Ligation wurde über Restriktion überprüft und ist für den Vektor
pMalP-IPSE in Abbildung 4.3 dargestellt.
64

Ergebnisse
A) B)
Abbildung 4.3: Klonierung von pMalP-IPSE. A) Vektorkarte von pMalP-IPSE. AmpR: Ampicillinresistenzgen, lacI:
Lactoserepressorgen, malE: Gen für das Maltosebindeprotein, malE-SP: Signalpeptid des Maltosebindeproteins für die
Translokation ins Periplasma, MCS: Multi cloning site, B) Restriktion von pMalP-IPSE mit BamHI und HindIII. Der
Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.
4.1.2 Optimierung der Expression von IPSE in E. coli durch Variation der
Expressionsparameter
4.1.2.1 Periplasmatische Expression von IPSE
Zur Optimierung der IPSE-Expression in E. coli wurde zunächst der periplasmatische Vektor pET26-
IPSE in BL21(DE3)-Zellen eingesetzt, um die Möglichkeit der Disulfidbrückenbildung zu
gewährleisten. Bei der Expression ist in der Coomassie-gefärbten SDS-PAGE jedoch keine
Expressionsbande erkennbar, lediglich im Westernblot kann mit dem monoklonalen anti-IPSE-
Antikörper eine sehr schwache Expression nachgewiesen werden (nicht dargestellt). Aufgrund der
sehr geringen Expressionsrate wurden mit diesem Vektor keine weiteren Versuche durchgeführt.
4.1.2.2 Einfluss der Temperatur auf die IPSE-Expression
Das Expressionsprotokoll für E. coli-IPSE sieht eine Expressionstemperatur von 37 °C vor. Durch
Variation der Expressionstemperatur wurde der Einfluss dieses Parameters auf die Faltung und damit
auf die Löslichkeit des exprimierten Proteins untersucht. Für diese Untersuchung wurden zum einen
DH5α-Zellen mit dem zytoplasmatischen Vektor pPROEX-Htb-IPSE (wie zur Expression von E. coli-
IPSE) und zum anderen BL21(DE3)-Zellen mit einem weiteren periplasmatischen Vektor - dem
pBM1.1-IPSE-Vektor - eingesetzt. Wie in Abbildung 4.4 zu sehen ist, nimmt bei der
65

Ergebnisse
zytoplasmatischen Expression die Menge an exprimiertem Protein mit sinkender Temperatur ab und es
sind keine signifikanten Mengen an löslichem IPSE im Überstand des Zellaufschlusses nachweisbar.
Im Gegensatz zum pET26-IPSE-Vektor zeigt der periplasmatische pBM1.1-IPSE-Vektor gute
Expressionsraten. Die Expressionsrate bei 20 °C liegt leicht über der bei 37 °C und es ist auch hier
kein lösliches IPSE im Überstand nachweisbar.
Abbildung 4.4: Einfluss von unterschiedlichen Expressionstemperaturen auf die Expression von IPSE. 20 ml LB-
Medium wurden mit DH5α/pPROEX-Htb-IPSE (zytoplasmatische Expression) bzw. BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE
(periplasmatische Expression) angeimpft und die Expression durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die Expression
wurde über 18 h bei unterschiedlichen Expressionstemperaturen (20 °C bis 37 °C) durchgeführt. Die lösliche und unlösliche
Fraktion des Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel, 10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen des Blots wurden über einen monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf
Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper; P: Pellet des Zellaufschlusses; SN:
Überstand des Zellaufschlusses.
4.1.2.3 Einfluss von Salzstress auf die IPSE-Expression
Der periplasmatische Vektor pBM1.1 wurde erfolgreich von Barth et al. (2000) zur Expression von
rekombinanten Immuntoxinen eingesetzt. Dabei wurde die Expression unter Salzstress
(4 % (w/v) NaCl und 0,5 M Sorbitol) in TB-Medium mit Zusatz von kompatiblen Soluten
(10 mM Glycinbetain) durchgeführt. Auch rekombinantes Phl p 1, ein Allergen des Lieschgrases
Phleum pratense, konnte über diese Methode löslich exprimiert werden (Dr. D. Wicklein,
LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel, persönliche Mitteilung).
Phl p 1 besitzt genau wie IPSE ebenfalls eine ungerade Anzahl an Disulfidbrücken. Dies stellt generell
ein Problem bei der Expression in E. coli dar, weil bakterielle Zellen keine Disulfidbrücken knüpfen
können. Für die Expression von IPSE wurden diese Salzstress-Expressionsbedingungen übernommen.
Wie Abbildung 4.5 zeigt, wird IPSE auch unter Salzstressbedingungen nicht in löslicher Form
exprimiert. Hinzu kommt, dass IPSE bei diesen Bedingungen als Doppelbande exprimiert wird.
66

Ergebnisse
Abbildung 4.5: Einfluss von unterschiedlichen Expressionsmedien auf die Expression von IPSE. 20 ml LB-Medium
bzw. TB-Medium wurden mit BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE angeimpft. Vor der Expressionsinduktion mit 1,5 mM IPTG wurde
dem TB-Medium erst 500 mM Sorbitol und 40 mM Glycin-Betain zugefügt und nach 30 min Inkubation 4 % (w/v) NaCl und
0,5 mM ZnCl 2 zugesetzt. Die Expression wurde über 18 h bei unterschiedlichen Expressionstemperaturen (20 °C und 37 °C)
durchgeführt. Die lösliche und unlösliche Fraktion des Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel,
10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen des Blots wurden über einen monoklonalen
anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper;
P: Pellet des Zellaufschlusses; SN: Überstand des Zellaufschlusses.
4.1.2.4 Einfluss der IPTG-Konzentration auf die IPSE-Expression
Als weiterer Parameter wurde die IPTG-Konzentration zur Induktion der Expression variiert. Die
normalerweise eingesetzte Konzentration liegt bei 300 µM IPTG. Bei der Untersuchung wurden
IPTG-Konzentrationen zwischen 100 pM und 100 µM eingesetzt. Die Expression wurde mit dem
pBM1.1-IPSE Vektor in BL21(DE3)-Zellen in LB-Medium bei 25 °C durchgeführt. Wie in
Abbildung 4.6 zu sehen ist, kann die Expression auch durch eine IPTG-Konzentration, die um den
Faktor 10 6 niedriger ist, als die ursprünglich eingesetzte, induziert werden. Die Expressionsrate ist
jedoch geringer. Auffällig ist auch, dass bei IPTG-Konzentrationen zwischen 100 pM und 1 µM IPSE
als Doppelbande exprimiert wird. Bei 100 µM IPTG sind zwar auch zwei Banden sichtbar, jedoch ist
die obere wesentlich stärker ausgeprägt. In der Coomassie-gefärbten SDS-PAGE ist auch im
Überstand des Zellaufschlusses eine Doppelbande im gleichen Molekulargewichtsbereich sichtbar
(nicht dargestellt), die im Westernblot jedoch nicht als IPSE zu identifizieren ist.
67

Ergebnisse
Abbildung 4.6: Einfluss von unterschiedlichen IPTG-Konzentrationen auf die Expression von IPSE. 20 ml LB-
Medium wurden mit BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE angeimpft und die Expression durch Zugabe von unterschiedlichen IPTG-
Konzentrationen (100 pM bis 100 µM) induziert. Die Expression wurde über 18 h bei 25 °C durchgeführt. Die lösliche und
unlösliche Fraktion des Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel, 10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen des Blots wurden über einen monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf
Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper; P: Pellet des Zellaufschlusses;
SN: Überstand des Zellaufschlusses.
4.1.3 Optimierung der Expression von IPSE in E. coli durch Expression als
Fusionsprotein
4.1.3.1 Expression von IPSE als MBP-Fusionsprotein
Die Sequenz von IPSE wurde erfolgreich in den Vektor pMalC kloniert, so dass IPSE als MBP-
Fusionsprotein exprimiert wird. MBP ist ein E. coli-eigenes Protein, welches in löslicher Form
exprimiert wird. Wird ein solches Protein um einen Fremdproteinanteil, der ansonsten unlöslich ist,
erweitert, so kann das resultierende Fusionsprotein als Ganzes löslich sein. MBP dient daher zum
einen als Löslichkeitsvermittler, zum anderen wird der MBP-Anteil zur einfachen Aufreinigung über
eine Amylose-Affinitätschromatographie genutzt. Durch eine Faktor Xa-Schnittstelle kann nach der
Reinigung der MBP-Anteil des Fusionsproteins wieder abgespalten werden.
Die Expression mit dem pMalC-IPSE-Vektor wurde in E. coli-Zellen des Stammes JM109 in LB-
Medium (mit Zusatz von 0,2 % (w/v) Glucose) bei 20 °C durchgeführt. IPSE wird mit diesem Vektor
tatsächlich in löslicher Form als MBP-Fusionsprotein (im Folgenden MBP-IPSE genannt) mit einer
guten Expressionsrate exprimiert. Vor der Aufreinigung ist in dem Überstand des Zellaufschlusses
neben vielen weiteren E. coli-Proteinen eine deutliche Expressionsbande von MBP-IPSE bei 50 kD zu
sehen (Abbildung 4.7). Das Molekulargewicht setzt sich zusammen aus der Größe von MBP (42,4 kD)
und dem IPSE-Monomer (13,2 kD). Während MBP-IPSE an die Säule bindet, werden die E. coli-
Proteine über das Effluent und die Waschfraktionen entfernt. MBP-IPSE wird durch Elution mit
maltosehaltigem Laufpuffer von der Säule gelöst. In den Elutionsfraktionen ist jedoch neben MBP-
IPSE ein geringer Anteil an kontaminierenden Proteinen enthalten. Die Ausbeute aus einem Liter
Expressionsansatz liegt bei ungefähr 20 mg MBP-IPSE.
68

Ergebnisse
Abbildung 4.7: Aufreinigung von MBP-IPSE über Amyloseaffinitätschromatographie. Ein Liter LB-Medium wurde mit
JM109/pMalC-IPSE angeimpft und die Expression durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die Expression wurde für 6 h
bei 20 °C durchgeführt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen über French Press aufgeschlossen. Der lösliche Überstand des
Zellaufschlusses wurde über IMAC aufgereinigt. Die Fraktionen der Aufreinigung wurden in der SDS-PAGE unter
reduzierenden Bedingungen (12 % Trenngel, 10 µl Probe) aufgetrennt und das Gel über Coomassie gefärbt. W1-W2:
Waschfraktionen à 50 ml, E1-E8: Elutionsfraktionen à 3 ml.
Im Basophilenassay wurde MBP-IPSE auf IL-4-induzierende Aktivität im Vergleich zu E. coli-IPSE
untersucht (Abbildung 4.8). E. coli-IPSE führt zu einer IL-4-Freisetzung aus Basophilen mit einem
Maximum bei 4 ng E. coli-IPSE/ml. Die Kurve zeigt den charakteristischen glockenförmigen Verlauf,
wie er für IPSE typisch ist. MBP-IPSE führt in sehr hohen Konzentrationen zu einer sehr starken IL-4-
Freisetzung. Die Kurve zeigt keinen glockenförmigen Verlauf. Die IL-4-Freisetzung ist somit nicht
mit der von E. coli-IPSE zu vergleichen.
12 mg des auf diese Weise exprimierten IPSEs wurden über eine Gelfiltration mit einer Superdex-200-
Säule weiter aufgereinigt (Abbildung 4.9). Dabei erscheint jedoch fast die gesamte Proteinmenge im
Ausschlussvolumen der Säule mit einer Peakhöhe von 750 mAU. Das bedeutet, dass das MBP-IPSE in
Form von hochmolekularen Aggregaten vorliegt. Diese Aggregate haben sich gebildet, obwohl zur
Verminderung der Aggregatbildung dem Laufpuffer 1 mM DTT zugesetzt worden sind. Im trennbaren
Bereich der Säule sind lediglich vier Peaks mit einer Höhe zwischen 20 und 40 mAU zu finden. Falls
es sich bei diesen Peaks um MBP-IPSE handeln sollte, so ist die Ausbeute für weitere Arbeiten zu
gering.
69

Ergebnisse
Abbildung 4.8: Basophilenstimulationsassay mit natürlichem MBP-IPSE und E. coli-IPSE. Gereinigte Basophile
wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an MBP-IPSE und E. coli-IPSE versetzt und über Nacht inkubiert. Die IL-4-
Konzentration im Überstand wurde im ELISA bestimmt. IL-3: Negativkontrolle; anti-IgE: Positivkontrolle.
Abb. 4.9: Aufreinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration. 12 mg MBP-IPSE (in 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl,
1 mM DTT, pH 7,4) wurden in einer Konzentration von 12 mg/ml über eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200 16/60 prep
grade, Firma Amersham biosciences) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min aufgetrennt.
70

Ergebnisse
Des Weiteren wurde IPSE auch in den Vektor pMalP kloniert. Dieser Vektor verfügt über das malE-
Signalpeptid. Dadurch wird das MBP-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum transportiert. Die
Expression mit diesem Vektor war sehr gering, so dass von weiteren Untersuchungen abgesehen
wurde, da auch hier eine spätere Aggregatbildung nicht ausgeschlossen werden konnte.
4.1.3.2 Expression von IPSE als Thioredoxin-Fusionsprotein
Weiterhin wurde IPSE in den pET32-Vektor der Firma Invitrogen kloniert und anschließend als
Thioredoxin-Fusionsprotein in Origami(DE3) -Zellen exprimiert (im Folgenden TRX-IPSE genannt).
Die Origami(DE3) -Zellen verfügen über eine Mutation sowohl in der Thioredoxinreduktase und als
auch der Glutathionreduktase. Aus diesem Grund ist es in diesen Zellen möglich, dass auch im
Zytoplasma der Zellen Disulfidbrücken gebildet werden können. Über eine Enterokinase-Schnittstelle
kann der TRX-Fusionsproteinanteil von dem zu exprimierenden Protein entfernt werden.
Für die Expression lag der Vektor bereits mit integrierter IPSE-Sequenz in der Arbeitsgruppe vor. Die
Expression wurde mit Origami(DE3) -Zellen in LB-Medium bei 30 °C durchgeführt und durch
Zugabe von 5 µM IPTG induziert. Diese geringe IPTG-Konzentration zeigte in Vorarbeiten einen
höheren Anteil an löslichem Protein. In Abbildung 4.10 sieht man bereits nach zwei Stunden
Expression eine Expressionsbande bei 32 kD. Dieses Molekulargewicht setzt sich zusammen aus dem
IPSE-Anteil von 13,2 kD und dem TRX-Anteil von 12 kD. Den verbleibenden Rest von ca. 7 kD
machen der His-Tag und S-Tag sowie die Enterokinase- und Thrombin-Schnittstelle aus. Der
überwiegende Teil des exprimierten IPSEs ist unlöslich und ist nach dem Zellaufschluss im Pellet zu
finden. Jedoch zeigt sich im löslichen Überstand des Zellaufschlusses eine Bande auf der Höhe der
Expressionsbande. Dieser lösliche Anteil wurde über eine IMAC aufgereinigt, da TRX-IPSE über
einen C-terminalen His 6 -Tag verfügt. Tatsächlich ist der ersten Elutionsfraktion eine prominente
Bande auf der Höhe des TRX-IPSE zu sehen, die nur noch mit wenigen weiteren Proteinen
kontaminiert ist. Das bedeutet, dass auch bei TRX-IPSE wie bei MBP-IPSE der Fusionsproteinanteil
zu einem löslichen Gesamtprotein führt.
Zur Abspaltung des TRX-Anteils mit Hilfe der Enterokinase müssen für das Enzym die optimalen
Reaktionsbedingungen herrschen. Die Enterokinase hat ihre höchste Aktivität bei einem pH-Wert von
7,0 bis 8,0 (Fonseca und Light 1983). Die Elutionsfraktion mit TRX-IPSE wurde daher gegen
50 mM Tris-Puffer (pH 7,5) dialysiert. Jedoch fällt bei der Dialyse das gesamte Protein irreversibel
aus der Lösung aus. TRX-IPSE lässt sich somit löslich exprimieren, der Fusionsproteinanteil kann
allerdings nicht abgespalten werden.
71

Ergebnisse
Abbildung 4.10: TRX-IPSE: Expressionskinetik und Aufreinigung über IMAC. Zwei Liter LB-Medium wurden mit
Origami(DE3)/pET32-IPSE angeimpft und die Expression durch Zugabe von 5 µM IPTG induziert. Die Expression wurde
für 18 h bei 30 °C durchgeführt. Danach wurden die Zellen über French Press aufgeschlossen und der lösliche Überstand des
Zellaufschlusses über IMAC aufgereinigt. Die Fraktionen der Expression und der Aufreinigung wurden in der SDS-PAGE
unter reduzierenden Bedingungen (12 % Trenngel, 10 µl Probe) aufgetrennt und das Gel über Coomassie gefärbt. W1-W2:
Waschfraktionen der IMAC à 30 ml; E1-E3: Elutionsfraktionen der IMAC à 10 ml.
72

Ergebnisse
4.2 Expression von IPSE in eukaryotischen Zellen
4.2.1 Expression und Reinigung von IPSE aus 293 HEK-Zellen (HEK-IPSE)
4.2.1.1 IPSE wird von 293 HEK-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert
Für die Expression von IPSE in 293 HEK-Zellen wurde zunächst der Expressionsvektor pMSII mit der
IPSE-Sequenz kloniert. Dieser Vektor wurde von Dr. Stöcker konstruiert und leitet sich von dem
kommerziellen Vektor pSecTag2 ab (Stöcker et al. 2003). Die über PCR amplifizierte IPSE-Sequenz
wurde zunächst in einen TA-Klonierungsvektor zwischenkloniert und aus diesem über die
Restriktionsenzyme SfiI und CelII ausgeschnitten. Der Vektor wurde ebenfalls mit den Enzymen
restringiert und mit dem Insert ligiert. E. coli-Zellen wurden mit dem Ligationsansatz transformiert.
Der Erfolg der Ligation und Transformation wurde über Restriktion überprüft und konnte bestätigt
werden (Abbildung 4.11). Zur Selektion in E. coli verfügt der Vektor über eine Ampicillin-Resistenz.
Aus den positiv transformierten Zellen wurde der Vektor aufgereinigt und für die Transfektion von
293 HEK-Zellen eingesetzt. Für die Expression in diesem Zellsystem ist dem exprimierten Protein
eine murine Signalsequenz für die Igκ-Kette vorgeschaltet, so dass das Protein unter Abspaltung der
Signalsequenz in das umgebende Medium sekretiert werden und aus diesem über einen C-terminalen
His 6 -Tag aufgereinigt werden kann. Gegenüber dem pSecTag2-Vektor enthält der pMSII-Vektor
zusätzlich eine interne ribosomale Eintrittssequenz (IRES) in Kombination mit dem Reportergen für
das verstärkt grünfluoreszierende Protein (EGFP). Über diese Fluoreszenz kann die
Transfektionseffizienz beurteilt werden, allerdings war diese nach erfolgter Transfektion mit dem
kationischen Lipotransfektionsreagenz Transfast nur sehr schwach ausgeprägt.
A) B)
Abbildung 4.11: Klonierung von pMSII-IPSE. A) Vektorkarte von pMSII-IPSE. AmpR: Ampicillinresistenzgen, EGFP:
enhanced green fluorescent protein, Igκ-SP: Igκ-Signalpeptid füf die Sekretion, MCS: Multi cloning site, ZeoR:
Zeocinresistenzgen. B) Restriktion von pMSII-IPSE mit SfiI und CelII. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel
aufgetrennt.
73

Ergebnisse
Drei Tage nach der erfolgreichen Transfektion der 293 HEK-Zellen mit dem pMSII-IPSE-Vektor
wurde der Kulturüberstand über IMAC aufgereinigt und auf Anwesenheit von exprimiertem IPSE (im
folgenden HEK-IPSE genannt) über einen Westernblot überprüft. Da dies bestätigt werden konnte,
wurden die Zellen mit Zeocin selektioniert, um eine stabil transfizierte Zelllinie zu etablieren.
4.2.1.2 Das Expressionsoptimum für HEK-IPSE liegt bei 10 bis 11 Tagen
Über den Cytomegalovirus-Promotor (CMV) exprimieren die 293 HEK-Zellen IPSE konstitutiv. Mit
Hilfe einer Expressionskinetik sollte herausgefunden werden, nach wie vielen Tagen Expression nach
der Teilung der Zellen die höchste IPSE-Konzentration im Medium erreicht werden kann. So wurden
der Kultur im Expressionszeitraum zwischen 0 und 13 Tagen in Abständen Proben entnommen.
Gereinigte Basophile wurden mit diesen Proben stimuliert und die IL-4-Freisetzung als relatives Maß
für die IPSE-Aktiviät untersucht. Der Basophilenassay bietet sich für diese Untersuchung an, da er so
sensitiv ist, dass eine Aufreinigung der Proben umgangen werden kann.
In Abbildung 4.12 ist die Expressionskinetik für HEK-IPSE dargestellt, dabei ist die Menge an
freigesetztem IL-4 ein Maß für den relativen HEK-IPSE-Gehalt in dem Expressionsmedium.
Demzufolge wird in den ersten 5 Tagen nur wenig HEK-IPSE synthetisiert. Diese Phase ist vor allem
durch Zellwachstum gekennzeichnet. Ab dem 5. bis 6. Tag erreichen die Zellen das Stadium der
Konfluenz und der HEK-IPSE-Gehalt im Kulturüberstand steigt stark an, bis er ab dem 12. Tag auf
einem Niveau stagniert. Ab diesem Zeitpunkt fangen die Zellen an zu sterben und die Produktivität
nimmt folglich ab. Das bedeutet, dass nach 10 bis 11 Tagen die höchste Zellviabilität mit dem
gleichzeitig höchsten HEK-IPSE-Gehalt zu erwarten ist. Aus diesem Grund wurden die Zellen für
weitere Expressionen alle 10 bis 11 Tage im Verhältnis 1:5 geteilt und aus dem Überstand das Protein
aufgereinigt.
1200
IL-4 [pg / 10 6 Basophile]
1000
800
600
400
200
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Expressionsdauer [Tage]
Abbildung 4.12: Expressionskinetik der HEK-IPSE-Kultur. Von einer HEK-IPSE-Kultur wurden im Zeitraum von
14 Tagen Proben abgenommen und im Basophilenassay auf den relativen IPSE-Gehalt untersucht. Die Basophilen wurden
mit 0,01 µl Probe stimuliert und die IL-4-Konzentration im ELISA bestimmt.
74

Ergebnisse
4.2.1.3 HEK-IPSE kann über zwei Schritte aus dem Expressionsmedium aufgereinigt werden
HEK-IPSE wird mit einem C-terminalen His 6 -Tag exprimiert. Die hohe Affinität von Histidin zu
zweiwertigen Kationen wie Ni 2+ oder Zn 2+ wird in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie
(IMAC) ausgenutzt, indem nur His-getaggte Proteine an die Agarosematrix binden.
Diese werden durch Kompetition mit dem Histidinanalogon Imidazol eluiert.
In Abbildung 4.13 sind die Fraktionen aus einer charakteristischen IMAC mit HEK-IPSE-
Kulturüberstand in der silbergefärbten SDS-PAGE und im Westernblot dargestellt. Der Westernblot,
der mit einem monoklonalem anti-IPSE-Antikörper inkubiert worden ist, zeigt die Lage der HEK-
IPSE-Banden in den einzelnen Fraktionen an. Demzufolge lassen sich in den Elutionsfraktionen vier
Banden im Bereich von 40 bis 50 kD und drei Banden im Bereich von 20 bis 30 kD identifizieren. Der
Kulturüberstand weist nur eine sehr schwache Bande auf, da das HEK-IPSE in dieser Fraktion sehr
verdünnt vorliegt. Die silbergefärbte SDS-PAGE gibt Auskunft über den Kontaminationsgrad der
Fraktionen. Der Kulturüberstand weist eine Hauptproteinbande bei 67 kD auf. Da im Kulturmedium
10 % FBS enthalten sind, repräsentiert diese Bande das im FBS hauptsächlich enthaltene Albumin.
Diese Bande ist jedoch mit annähernd gleicher Intensität auch im Effluent und in geringerem Maße in
den Waschfraktionen zu finden. Das bedeutet, dass die größte Kontamination über diesen
Reinigungsschritt entfernt werden konnte. Tatsächlich sind in den Elutionsfraktionen hauptsächlich
die über den Westernblot identifizierten HEK-IPSE-Banden zu finden. Lediglich im höhermolekularen
Bereich sind noch kontaminierende Proteine zu sehen. Aus diesem Grund ist ein weiterer
Aufreinigungsschritt notwendig, um eine reine HEK-IPSE-Proteinfraktion zu erhalten. Die HEK-IPSE
enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und dialysiert, um das enthaltene Imidazol zu entfernen.
Anschließend wurde diese Probe affinitätschromatographisch weiter aufgereinigt. Dazu wurden
monoklonale anti-IPSE-Antikörper an eine Sepharosesäule mit NHS-aktivierten Gruppen gekoppelt.
Die an die Säule gekoppelten monoklonalen anti-IPSE-Antikörper binden das HEK-IPSE spezifisch
aus der Proteinlösung. Gebundenes HEK-IPSE wurde über Absenkung des pH-Wertes von der Säule
eluiert. In Abbildung 4.14 sind die Chromatogramme des Probenauftrags und der Elution dargestellt,
sowie die silbergefärbte SDS-PAGE der einzelnen Fraktionen. Das Effluent weist eine Absorption bei
280 nm von 25 mAU auf. Wie in der silbergefärbten SDS-PAGE zu sehen ist, handelt es sich bei den
nicht gebundenen Proteinen allerdings nicht um HEK-IPSE, sondern nur um kontaminierende
Proteine. HEK-IPSE ist ausschließlich in den Elutionsfraktionen A4-A11 zu finden mit einer
maximalen Peakhöhe von 1700 mAU. Die Elutionsfraktionen wurden vereinigt, gegen PBS-Puffer
dialysiert und eingeengt. Wie in Abbildung 4.14 zu sehen ist, resultiert dies in reinem HEK-IPSE.
75

Ergebnisse
A)
B)
Abbildung 4.13: Fraktionen der IMAC-Aufreinigung von HEK-IPSE in der silbergefärbten SDS-PAGE (A) und im
Westernblot (B). Zwei Liter HEK-IPSE-Kulturüberstand nach 10 Tagen Expression wurden über IMAC aufgereinigt und
die einzelnen Fraktionen in der SDS-PAGE untersucht (15 % Trenngel, nicht-reduzierende Bedingungen, 2,5 µl Probe).
SN: Kulturüberstand; W1-W3: Waschfraktionen à 15 ml; E1-E10: Elutionsfraktionen à 1,5 ml.
76

Ergebnisse
A) B)
C)
Abbildung 4.14: Reinigung von HEK-IPSE mittels Affinitätschromatographie über eine anti-IPSE-Säule.
A) Chromatogramm des Probenauftrags auf eine anti-IPSE-Säule bei 280 nm. B) Chromatogramm der Elution von HEK-
IPSE von der anti-IPSE-Säule durch Absenkung des pH-Wertes. Absorption bei 280 nm in mAU, Leitfähigkeit
in mS/cm. C) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe, von Fraktion
A6 und A7 nur 2,5 µl Probe) mit Fraktionen der Aufreinigung von HEK-IPSE über eine anti-IPSE-Säule.
77

Ergebnisse
4.2.1.4 Bilanzierung der Aufreinigung von HEK-IPSE
Das Kulturmedium, in dem HEK-IPSE exprimiert wird, enthält FBS. Aus diesem Grund nimmt HEK-
IPSE nur einen sehr geringen Proteinanteil in dem Kulturüberstand ein und muss von den übrigen
Proteinen getrennt werden. In Tabelle 4.1 ist eine exemplarische Bilanzierung der
Proteinkonzentration von einer HEK-IPSE-Aufreinigung aus 6,8 Litern Kulturüberstand angegeben.
Eine Berechnung des spezifischen IPSE-Anteils in den jeweiligen Reinigungsschritten ist nicht
möglich, da ein Nachweissystem für diese Berechnung fehlt.
Der Kulturüberstand hat eine Proteinkonzentration von 2,4 mg/ml. Bei einem Gesamtvolumen von
6,8 Litern entspricht dies 16,3 g. Die Konzentration von HEK-IPSE ist dabei so gering, dass HEK-
IPSE selbst im Westernblot nicht nachweisbar ist. Im Durchfluss und in den Waschfraktionen der
IMAC sind 16,2 g Gesamtprotein enthalten. Das bedeutet, dass bei diesem Schritt über 99 % der
kontaminierenden Proteine entfernt werden, während HEK-IPSE an die Säulenmatrix bindet. In dem
Eluat der IMAC sind 1,9 mg. Diese 1,9 mg bestehen hauptsächlich aus HEK-IPSE, jedoch ist noch ein
geringer Anteil an kontaminierenden Proteinen vorhanden (siehe Abbildung 4.13 A), die in der
Affinitätschromatographie entfernt werden. Nach dem finalen Reinigungsschritt enthält das Eluat
1,65 mg HEK-IPSE und 0,25 mg an kontaminierenden Proteinen werden von der HEK-IPSE-Lösung
entfernt, indem sie nicht an die Säule binden. Demzufolge werden in einem Liter Kulturüberstand
0,24 mg HEK-IPSE exprimiert. In verschiedenen Aufreinigungschargen wurden Ausbeuten zwischen
0,2 und 0,5 mg/l Kulturüberstand gewonnen je nach Alter der Kultur.
Tabelle 4.1: Bilanzierung der HEK-IPSE-Aufreinigung. n.n. = nicht nachweisbar
Reinigungsschritt
Fraktion Volumen
[ml]
Proteinkonz.
[µg/ml]
Gesamtproteingehalt
[mg]
HEK-IPSE-
Anteil
Kulturüberstand 6800 2400 16300 n.n.
IMAC Effluent 8100 2000 16200 n.n.
Waschfraktion 90 160 14,4 n.n.
Eluat 43 44 1,9 ~ 70-80 %
Affinitätschromtographie
Effluent 42 6 0,25 n.n.
Eluat 7 235 1,65 ~ 100
%
78

Ergebnisse
4.2.2 Strukturelle Untersuchungen von HEK-IPSE
4.2.2.1 HEK-IPSE ist ein Dimer
Natürliches IPSE aus Schistosoma mansoni wird als Homodimer von den Eiern des Wurmes sekretiert
und auch rekombinantes E. coli-IPSE, das aus inclusion bodies gereinigt und chemisch zurückgefaltet
wurde, bildet bei pH 8,5 größtenteils Dimere. Zur Untersuchung, ob HEK-IPSE ebenfalls dimerisiert
vorliegt, wurde gereinigtes HEK-IPSE in der SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden
Bedingungen aufgetrennt (Abbildung 4.15). Unter nicht-reduzierenden Bedingungen
werden vier Banden im Bereich von 40 bis 50 kD angefärbt, die auch schon bei der Aufreinigung im
Westernblot als HEK-IPSE-Banden identifiziert wurden. Durch Reduktion werden aus den vier
Banden drei Banden im Bereich von 20 bis 30 kD, die auch im nicht-reduzierenden Gel schwach zu
sehen sind. Das bedeutet, dass HEK-IPSE vorwiegend als Dimer synthetisiert wird und nur ein sehr
geringer Teil als Monomer vorliegt.
Abbildung 4.15: Silbergefärbte SDS-PAGE zur Untersuchung der Dimerbildung von HEK-IPSE. Gereinigtes HEK-
IPSE wurde in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2 µg HEK-IPSE) unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen
aufgetrennt.
4.2.2.2 Auftrennung von gereinigtem HEK-IPSE in der Gelfiltration
Um die vier Dimerbanden von den drei Monomerbanden weiter voneinander abzutrennen, wurde eine
Gelfiltration durchgeführt. Über eine Kalibrierung der Säule kann die Gelfiltration zusätzlich zur
Molekulargewichtsbestimmung dienen. Für die Kalibrierung der Säule wurde eine Mischung aus
Kalibrierungsproteinen (Albumin 67 kD, Ovalbumin 43 kD, Chymotrypsinogen 25 kD und
79

Ergebnisse
A)
Kav
B)
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1
Ribonuklease
y = -0.3117Ln(x) + 4.7104
R 2 = 0.9953
Chymotrypsinogen
Ovalbumin
Albumin
10000 100000
log Molekulargewicht
C)
D)
Abbildung 4.16: Auftrennung und Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über Gelfiltration. A) Elutionsprofil
der Kalibrierungsproteine nach Auftrennung über eine Superdex-75-Säule. B) logarithmische Darstellung des
Verteilungsquotientens K av der jeweiligen Kalibrierungsproteine in Abhängigkeit vom Molekulargewicht zur Ermittlung der
Kalibrierungsgeraden. C) Elutionsprofil von 90 µg HEK-IPSE nach Auftrennung über eine Superdex-75-Säule. Das
Elutionspeakmaximum liegt bei 10,303 ml. Die Pfeile zeigen die Fraktionen an, die in der SDS-PAGE (D) eingesetzt worden
sind. D) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe) der Fraktionen aus
der Auftrennung von HEK-IPSE über Gelfiltration.
Ribonuklease 13,7 kD) aufgetragen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,02 ml/min auf die Säule
aufgetragen (Abbildung 4.16 A). Aus dem so genannten Verteilungsquotienten K av von
Elutionsvolumen des jeweiligen Proteins (V e ) und dem Ausschlussvolumen der Säule (V 0 = 7,7 ml),
lässt sich in Abhängigkeit des Molekulargewichtes eine Kalibriergerade mit entsprechender
Geradengleichung ermitteln (Abbildung 4.16 B). Für jeden weiteren Lauf, der unter denselben
80

Ergebnisse
Bedingungen durchgeführt worden ist, lässt sich so für jeden Peak das dazugehörige
Molekulargewicht ermitteln.
HEK-IPSE zeigt nach der Gelfiltration einen Peak von 50 mAU bei einem Elutionsvolumen von
10,303 ml (Abbildung 4.16 C). Dies entspricht nach der Geradengleichung einem Molekulargewicht
von 48,5 kD. Dies passt zu dem über die SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht von 40 bis 50 kD.
Des Weiteren weist der Peak drei Schultern auf. In der silbergefärbten SDS-PAGE konnte gezeigt
werden, dass es sich bei diesen Schultern um eine partielle Auftrennung der einzelnen vier Banden
handelt (Abbildung 4.16 D). In Fraktion B3 und B5 sind nur die oberen beiden Banden zu sehen,
wohingegen Fraktion B7 im Wesentlichen nur die unteren beiden Banden aufweist. Die einzelnen
Banden können somit über eine Superdex-75-Säule nicht zufrieden stellend aufgetrennt werden. Eine
Auftrennung in einem so engen Molekulargewichtsbereich ist bei dieser Säule allerdings auch nicht zu
erwarten, möglicherweise könnte über eine Reversed Phase-Chromatographie eine bessere
Auftrennung erzielt werden.
4.2.2.3 Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über MALDI-TOF-MS
Für die Molekulargewichtsbestimmung liefert die SDS-PAGE ein nur scheinbares Molekulargewicht.
Gerade Glycoproteine zeigen in der SDS-PAGE häufig ein verändertes Laufverhalten, so dass ihre
genaue Masse nur schwer zu bestimmen ist. Aus diesem Grund wurde HEK-IPSE
massenspektroskopisch im MALDI-TOF-MS untersucht (Arbeiten sind von PD Dr. B. Lindner,
LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel, durchgeführt worden). Die Probe wird dabei in eine leicht
zu kristallisierende Matrix eingebracht und die daraus resultierenden Kristalle werden anschließend
mit einem Laser beschossen. Über dieses Verfahren können Proteine in die Gasphase überführt
werden und in einem elektrischen Feld beschleunigt werden. Ein Detektor misst die Flugzeit des
Proteins und kann darüber das Masse-Ladungsverhältnis bestimmen.
Das MALDI-TOF-Massenspektrum von HEK-IPSE ist in Abbildung 4.17 dargestellt. Es zeigt zwei
Dreifach-Peaks im Bereich von 17300 und 19400 D bzw. von 34400 bis 38400 D. Da somit der
größere Dreifachpeak in etwa die doppelte Masse des kleineren besitzt, handelt es sich bei dem
kleineren wahrscheinlich um die doppeltprotonierte Form des HEK-IPSE-Dimers. Festzustellen ist,
dass das Molekulargewicht für das Dimer mit 34 bis 39 kD stark von dem apparenten
Molekulargewichten aus der SDS-PAGE abweicht. Da es sich bei der Massenspektroskopie aber um
eine wesentlich genauere Methode zur Ermittlung des Molekulargewichtes handelt, werden im
Weiteren diese Resultate verwendet.
81

Ergebnisse
Abbildung 4.17: MALDI-TOF Massenspektrum von HEK-IPSE. Gereinigtes HEK-IPSE (10 µmol) wurde im
MALDI-TOF massenspektroskopisch untersucht.
4.2.2.4 HEK-IPSE ist glycosyliert
IPSE besitzt zwei potentielle N-Glycosylierungsstellen. Daher lag die Vermutung nahe, dass die vier
verschiedenen HEK-IPSE-Banden in der SDS-PAGE auf unterschiedliche Glycoformen
zurückzuführen sind. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde HEK-IPSE mit PNGase F und
Endo H deglycosyliert.
Wie in Abbildung 4.18 (A) zu sehen ist, können die vier HEK-IPSE-Banden durch PNGase F-
Behandlung auf zwei Banden reduziert werden. Das bedeutet, dass die vier Banden tatsächlich
unterschiedliche Glycoformen repräsentieren. Da aber noch zwei Banden und nicht nur eine
homogene Bande vorhanden sind, ist das Protein nicht vollständig deglycosyliert. PNGase F spaltet
spezifisch N-glycosidisch gebundene Zucker direkt am Asparagin des Proteinrückgrats. Unter
Umständen ist mindestens die obere der beiden Banden noch O-glycosyliert und konnte durch diese
Behandlung nicht deglycosyliert werden. Die Endo H-Behandlung hatte keinen Einfluss auf die
Bandenstruktur.
82

Ergebnisse
A) B)
Abbildung 4.18: Deglycosylierung von HEK-IPSE mit PNGase F bzw. Endo H. A) HEK-IPSE wurde mit 5 U PNGase F
bzw. Endo H deglycosyliert 24 h bei 37 °C deglycosyliert. Als Negativkontrolle dient eine Inkubation mit aqua dest. statt
Enzym. Die Proben wurden anschließend in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2,5 µg HEK-IPSE) aufgetrennt. Der Pfeil
deutet die Position der PNGase F an. B) Die Proben aus der Deglycosylierung mit PNGase F wurden unter
nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen in der SDS-PAGE aufgetrennt (15 % Trenngel) und auf
Nitrocellulosemembran geblottet. Die Streifen wurden entweder mit dem Lektin PSA oder dem monoklonalen anti-IPSE-
Antikörper (anti-IPSE) inkubiert. C = Negativkontrolle für den Sekundärantikörper.
Zur genaueren Untersuchung der Glycosylierung von HEK-IPSE wurden die Proben nach
Deglycosylierung mit PNGase F in der SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden wie auch nichtreduzierenden
Bedingungen aufgetragen und anschließend auf Nitrocellulosemembran geblottet.
Einzelne Streifen dieses Blots wurden mit biotinyliertem Lektin PSA (Pisum sativum Agglutinin) bzw.
mit monoklonalem anti-IPSE-Antikörper inkubiert (Abbildung 4.18 B). Das Lektin PSA bindet
spezifisch an terminale α-D-Mannose-Reste und in geringerem Maße an α-D-Glucose-Reste und an
die fucosylierte Kernregion von bi- und triantennären N-Glycanen.
Unter nicht-reduzierenden Bedingungen sieht man bei dem glycosylierten Dimer, dass die untere der
vier mit dem anti-IPSE-Antikörper gefärbten Banden bei dem mit PSA inkubiertem Streifen nur sehr
schwach ist. Diese Glycoform wird vom Lektin nur sehr schwach gebunden. Nach der
Deglycosylierung ist diese Bande in beiden Fällen stärker ausgeprägt. Die beiden oberen Banden, die
hier fehlen, scheinen in diese Glycoform umgewandelt zu werden.
83

Ergebnisse
Unter reduzierenden Bedingungen bindet das Lektin an alle drei Banden des glycosylierten Proteins,
die auch in der SDS-PAGE zu sehen sind (vgl. Abbildung 4.15), wohingegen der spezifische
Antikörper nur die beiden unteren Banden erkennt. Beim deglycosyliertem HEK-IPSE erkennt das
Lektin nur noch zwei Banden der ursprünglich drei Banden. Die oberste Glycoform ist folglich
vollständig deglycosyliert worden. Der spezifische Antikörper gegen IPSE erkennt nur noch eine
Bande. Da dieser Antikörper gegen E. coli-IPSE gerichtet ist, welches nicht glycosyliert ist, ist es
möglich, dass die Bindung des Antikörpers durch die Glycosylierung sterisch behindert ist.
4.2.2.5 Kristallisation von HEK-IPSE
Aufgrund der guten Löslichkeit von HEK-IPSE war es mit diesem rekombinanten Material möglich,
zwei Kristallisations-Screening-Experimente durchzuführen. In einem ersten Kristallisationsexperimient
wurde HEK-IPSE in einer Konzentration von 13 mg/ml und einem Volumen von 2 µl
eingesetzt. Über ein Screening-Kit (JBScreen, Firma Jena Biosciences) wurden 240 verschiedenen
Konditionen im „sitzenden-Tropfen-Verfahren“ über Dampfdiffusion ausgetestet. Die einzelnen
Konditionen wurden im Mikroskop in Abständen auf Kristallisationsbildung hin untersucht. Jedoch
hat keine der Konditionen innerhalb von 5 Monaten zu einem Kristall geführt. In 74 Fällen konnte
eine Phasentrennung beobachtet werden. Phasentrennungen sind in der Kristallisation häufig
Vorstufen von Kristallen. Sie stellen Proteintropfen mit einer sehr hohen Proteinkonzentration dar, aus
denen sich potenziell Kristalle bilden können. In 119 Konditionen konnten lediglich Präzipitate von
ausgefallenem Protein beobachtet werden und in 36 Konditionen ist die Lösung klar geblieben. Bei
11 Konditionen konnte keine Beurteilung durchgeführt werden, da sich ein Niederschlag auf der
Abdeckung gebildet hatte, so dass die Sicht durch das Mikroskop getrübt war.
Ein zweites Kristallisationsexperiment wurde mit HEK-IPSE in der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage
des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Hamburg von
Dr. J. Müller-Dieckmann durchgeführt. In der Hochdurchsatzanlage wird über einen Roboter das
Protein mit den jeweiligen Kristallisationskonditionen vermischt. Durch den Roboter ist es möglich
mit sehr kleinen Volumina zu arbeiten. So wurden für jeden Ansatz 200 nl HEK-IPSE mit einer
Konzentration von 22 mg/ml eingesetzt. Es wurden 816 verschiedene Konditionen ausgetestet. Die
Ansätze werden automatisch in regelmäßigen Abständen fotografiert. In Abbildung 4.19 sind
exemplarisch sechs Fotos aus diesem Ansatz gezeigt.
84

Ergebnisse
Abbildung 4.19: Kristallisation von HEK-IPSE. 200 nl HEK-IPSE (22 mg/ml in 50 mM MES-Puffer, pH 6,5) wurden in
der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage mit 200 nl Präzipitans versetzt. Dargestellt sind sechs charakteristische Tropfen
nach drei Wochen Inkubation. 1) klarer Tropfen, 2) Proteinpräzipitat, 3) tropfenartige Phasentrennung, 4) Phasentrennung,
5) mikrokristalliner Niederschlag, 6) mikrokristalliner Niederschlag.
85

Ergebnisse
4.2.3 Expression und Reinigung von IPSE aus High Five-Zellen (High Five-IPSE)
4.2.3.1 IPSE wird von High Five-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert
Für die Expression von IPSE in Insektenzellen wurde die IPSE-Sequenz über PCR amplifiziert und
mit HindIII und XhoI in den Insektenzellexpressionsvektor pIB/V5-His der Firma Invitrogen kloniert.
Da dieser Vektor nicht über eine eigene Signalsequenz verfügt, wurde die IPSE-Sequenz mit dem
Schistosoma mansoni-spezifischen Signalpeptid in den Vektor kloniert, so dass das Protein zur
leichteren Aufreinigung in den Kulturüberstand sekretiert wird. Über die IPSE-spezifischen Primer
wurden zwei unterschiedliche Konstrukte hergestellt: Ein Vektor verfügte über den C-terminalen
V5-His 6 -Tag (pIB/V5-His-IPSE), bei dem anderen Vektor wurde IPSE durch Einfügen von
Stopp-Codons ohne weiteres Tag exprimiert (pIB-IPSE). Der Erfolg der Klonierung wurde über
Restriktion überprüft (Abbildung 4.20). Anschließend wurden High Five -Insektenzellen über das
Transfektionsreagenz Cellfectin mit den Vektoren transfiziert. Zusätzlich wurden die Insektenzellen
mit dem Vektor pIZT/V5-His transfiziert. Dieser Vektor dient als Transfektionskontrolle, da das
Zeocinresistenz-Protein als Fusionsprotein mit GFP exprimiert wird und transfizierte Zellen so grün
leuchten. Nach zwei Tagen konnte über einen Basophilenassay sekretiertes IPSE im Überstand
nachgewiesen werden. Die erfolgreich transfizierten Zellen wurden durch Zugabe von Blasticidin
selektioniert und eine stabile Zelllinie etabliert.
A) B)
Abbildung 4.20: Klonierung von pIB/V5-His-IPSE. A) Vektorkarte von pIB/V5-His-IPSE. AmpR:
Ampicillinresistenzgen, BlaR: Blasticidinresistenzgen, IPSE-SP: IPSE-spezifisches Signalpeptid, MCS: Multi cloning site.
B) Restriktion von pIB/V5-His-IPSE mit HindIII und XhoI. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel
aufgetrennt.
86

Ergebnisse
4.2.3.2 Das Expressionsoptimum für High Five-IPSE liegt bei 8 Tagen
Nach Etablierung von stabilen Zelllinien wurde für beide Konstrukte eine Expressionskinetik
durchgeführt, um den optimalen Zeitpunkt für die Abnahme des Kulturüberstandes zu ermitteln. Dafür
wurden wie auch bei HEK-IPSE im Zeitraum von 0 bis 13 Tagen beiden Kulturen Proben entnommen
und diese im Basophilenassay eingesetzt. Die Menge an freigesetztem IL-4 ist dabei ein Maß für den
IPSE-Gehalt im Kulturüberstand.
Wie in Abbildung 4.21 zu sehen ist, wird das Konstrukt High Five-IPSE ohne V5-His-Tag besser
exprimiert als High Five-IPSE mit V5-His-Tag. Die Expression steigt nach bereits 3 Tagen stark an
und fängt nach 6 Tagen an ein Plateau zu erreichen. Das Konstrukt mit V5-His-Tag exprimiert IPSE
zwar langsamer, erreicht aber in etwa dieselbe IPSE-Konzentration im Überstand dies jedoch erst nach
8 Tagen. Der Übergang in die Plateauphase ist auch bei High Five-IPSE mit dem Absterben der Zellen
korreliert. Ab dem 9. Tag sind in der Kultur vermehrt tote Zellen zu beobachten. Aus diesem Grund
wurden der Überstand von beiden Kulturen nach 7 bis 8 Tagen abgenommen und weiter aufgereinigt.
1400
1200
IL-4 [pg / 10 6 Basophile]
1000
800
600
400
High Five-IPSE ohne V5-His-Tag
200
High Five-IPSE mit V5-His-Tag
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Expressionsdauer [Tage]
Abbildung 4.21: Expressionskinetik der High Five-IPSE-Kultur. Von den beiden unterschiedlichen High Five-IPSE-
Kulturen (High Five-IPSE mit und ohne V5-His-Tag) wurden im Zeitraum von 13 Tagen Proben abgenommen und im
Basophilenassay auf den relativen IPSE-Gehalt untersucht. Die Basophilen wurden mit 1 µl Probe stimuliert und die
IL-4-Konzentration im ELISA bestimmt.
87

Ergebnisse
4.2.3.3 High Five-IPSE kann über zwei Schritte aufgereinigt werden
High Five-IPSE wurde nach derselben Reinigungsstrategie aufgereinigt wie HEK-IPSE. Als erster
Reinigungsschritt wurde der Überstand über eine IMAC aufgereinigt. Hierfür konnte nur der
Überstand aus der Expression von High Five-IPSE mit V5-His-Tag eingesetzt werden, da High Five-
IPSE ohne den Histidin-Tag nicht an die Ni 2+ -Ionen binden kann. Für die IMAC wurde der
Kulturüberstand gegen PBS dialysiert, da nach Herstellerangaben in dem serumfreien Insektenzell-
Medium nicht näher bestimmte Komponenten enthalten sind, die ein Auswaschen der Ni 2+ -Ionen von
der Säulenmatrix bewirken würden.
In Abbildung 4.22 sind die Fraktionen der Aufreinigung in der silbergefärbten SDS-PAGE und im
Westernblot zu sehen. Der Westernblot, der mit dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper inkubiert
worden ist, zeigt die Lage der High Five-IPSE-Banden an. In den ersten beiden Elutionsfraktionen
sind drei eng beieinander liegende Banden bei ca. 40 kD zu sehen sowie auch zwischen 18 und 23 kD.
Diese Banden sind auch im silbergefärbten Gel zu sehen, jedoch sind zusätzlich noch
Kontaminationen ersichtlich. Das bedeutet, dass das Material weiter aufgereinigt werden muss.
Zur weiteren Aufreinigung wurden die High Five-IPSE enthaltenden Fraktionen vereinigt und über
eine anti-IPSE-Säule affinitätschromatographisch aufgetrennt. Die Chromatogramme der
Aufreinigung sowie die Fraktionen in der silbergefärbten SDS-PAGE sind in Abbildung 4.23
dargestellt. Die beiden Hauptkontaminationsbanden aus der IMAC binden nicht an die Säulenmatrix
und verbleiben im Effluent. In den Elutionsfraktionen sind nur die High Five-IPSE-Banden zu
erkennen. Lediglich eine sehr schwache Bande bei ca. 50 kD verunreinigt noch die High Five-IPSE-
Lösung. Wie auch bei HEK-IPSE reichen diese zwei Reinigungsstufen aus, um reines IPSE-Material
zu erhalten.
Auch der Überstand aus der High Five-IPSE-Expression ohne V5-His-Tag wurde über die
Affinitätschromatographie aufgereinigt. Da hier jedoch durch den fehlenden His-Tag keine
Vorreinigung durchgeführt werden konnte, waren die Elutionsfraktionen nach diesem
Reinigungsschritt noch deutlich verunreinigt. Aus diesem Grund wurde für weitere Expressionen
lediglich High Five-IPSE mit V5-His-Tag verwendet.
Die Expressionsrate der Insektenzellen ist jedoch deutlich geringer als die der HEK-Zellen. Nach
Aufreinigung von zwei Litern Kulturüberstand nach der optimalen Expressionszeit konnten 100 µg
High Five-IPSE gewonnen werden.
88

Ergebnisse
A)
B)
Abbildung 4.22: Fraktionen der IMAC-Aufreinigung von High Five-IPSE in der silbergefärbten SDS-PAGE (A) und
im Westernblot (B). 500 ml High Five-IPSE-Kulturüberstand nach 7 Tagen Expression wurden dialysiert und über IMAC
aufgereinigt. Die einzelnen Fraktionen wurden in der SDS-PAGE untersucht (15 % Trenngel, nicht-reduzierende
Bedingungen, 10 µl Probe). SN: Kulturüberstand; W1-W2: Waschfraktionen à 15 ml; E1-E5: Elutionsfraktionen à 1,5 ml
89

Ergebnisse
A)
B)
C)
Abbildung 4.23: Reinigung von High Five-IPSE mittels Affinitätschromatographie über eine anti-IPSE-Säule.
A) Chromatogramm des Probenauftrags auf eine anti-IPSE-Säule bei 280 nm. B) Chromatogramm der Elution von High
Five-IPSE von der anti-IPSE-Säule durch Absenkung des pH-Wertes. Absorption bei 280 nm in mAU, Leitfähigkeit
in mS/cm. C) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe) mit
Fraktionen der Aufreinigung von High Five-IPSE über eine anti-IPSE-Säule.
90

Ergebnisse
4.2.3.4 High Five-IPSE ist ein Dimer
Ähnlich wie bei HEK-IPSE weist auch das High Five-IPSE drei Banden im höhermolekularen Bereich
und drei in einem niedermolekularen Bereich auf. In der SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden
Bedingungen konnte gezeigt werden, dass es sich bei diesen Banden um dimerisiertes
High Five-IPSE und um monomeres High Five-IPSE handelt (Abbildung 4.24). Unter reduzierenden
Bedingungen werden aus den Dimeren ebenfalls Monomere. In den High Five-Zellen wird IPSE zwar
größtenteils als Dimer exprimiert, der Anteil von monomerem IPSE ist jedoch höher als in den HEK-
Zellen.
Abbildung 4.24: Silbergefärbte SDS-PAGE zur Untersuchung der Dimerbildung von High Five-IPSE. Gereinigtes
High Five-IPSE wurde in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2 µg High Five-IPSE) unter nicht-reduzierenden und
reduzierenden Bedingungen aufgetrennt.
91

Ergebnisse
4.3 Funktionelle Untersuchungen von rekombinantem IPSE
Im Folgendem werden die Ergebnisse zu den funktionellen Untersuchungen von HEK-IPSE und High
Five-IPSE dargestellt. Da High Five-IPSE nur in sehr geringer Menge vorlag, konnten nicht alle
Experimente mit diesem Material durchgeführt werden.
4.3.1 HEK-IPSE und High Five-IPSE führen zur IL-4-Freisetzung aus Basophilen
Die vorausgehenden Versuche zeigen, dass HEK-IPSE und High Five-IPSE von dem monoklonalen
anti-IPSE-Antikörper erkannt werden und somit wahrscheinlich in korrekter Faltung vorliegen. Zur
Untersuchung ob dieses Material auch tatsächlich funktionell aktiv ist und somit zu einer IL-4-
Freisetzung aus humanen Basophilen führt, wurden alle IPSE-Präparationen im Basophilenstimulationsassay
eingesetzt. Gereinigte Basophile wurden dafür über Nacht mit verschiedenen
Konzentrationen an IPSE (natürliches IPSE (nIPSE), HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE)
inkubiert und die IL-4-Konzentration im ELISA bestimmt. Abbildung 4.25 zeigt für alle IPSE-Arten
den charakteristischen glockenförmigen Verlauf. Die Kurven von nIPSE, HEK-IPSE und E. coli-IPSE
verlaufen parallel und weisen ein Maximum von 20 ng IPSE/ml auf. High Five-IPSE zeigt maximale
Aktivität bei 100 ng IPSE/ml und weist somit eine geringere Aktivität auf. Jedoch führen alle IPSE-
Präparationen zu einer IL-4-Freisetzung und sind daher funktionell aktiv.
+ IL-3
Abbildung 4.25: Basophilenstimulationsassay mit nIPSE, HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE. Gereinigte
Basophile wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an nIPSE, HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE versetzt
und über Nacht inkubiert. Die IL-4-Konzentration im Überstand wurde im ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein
repräsentatives Ergebnis von drei Experimenten. IL-3: Negativkontrolle; anti-IgE: Positivkontrolle.
92

Ergebnisse
4.3.2 Die IL-4-Freisetzung der Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE ist
IgE-abhängig
Wird das FcεRI-gebundene IgE auf der Oberfläche von Basophilen quervernetzt, beispielsweise durch
anti-IgE oder B-Zell-Superantigene, so werden die Basophilen zur IL-4-Freisetzung aktiviert. Auch
für natives IPSE aus Schistosoma mansoni und rekombinantes E. coli-IPSE konnte die IgE-
Abhängigkeit der Aktivierung nachgewiesen werden (Schramm et al. 2003), auch wenn die
Aktivierung der Basophilen hier wahrscheinlich nicht auf einer Quervernetzung beruht (Blindow
2004).
Zur weiteren funktionellen Charakterisierung des HEK-IPSEs wurde untersucht, ob auch die durch
HEK-IPSE bewirkte Aktivierung der Basophilen IgE-abhängig ist. Dafür wurde ein Stripping-
Experiment durchgeführt, bei dem das rezeptorgebundene IgE durch Absenkung des pH-Wertes von
der Oberfläche der Basophilen entfernt worden ist. Anschließend wurden die Zellen mit IgE-haltigem
Patientenserum bzw. mit reinem polyklonalem IgE resensibilisiert. Die nativen, gestrippten und
resensibilisierten Basophilen wurden dann mit anti-IgE, SmEA, E. coli-IPSE und HEK-IPSE
stimuliert und die IL-4-Freisetzung gemessen.
Wie in Abbildung 4.26 zu sehen ist, führen alle Stimulantien bei den nativen Basophilen zu einer IL-4-
Freisetzung. Bei gestrippten Basophilen geht das Signal fast auf das Niveau der Negativkontrolle
zurück. Mit IgE resensibilisierte Basophile zeigen wieder eine erhöhte IL-4-Freisetzung, die teilweise
über das ursprüngliche Signal hinausgeht. Das bedeutet, dass auch die Aktivierung über HEK-IPSE
IgE-abhängig ist.
Abbildung 4.26: Basophilenassay mit nativen, gestrippten und resensibilisierten Basophilen. Native ( ), gestrippte ( )
und mit Patientenserum ( ) bzw. reinem IgE ( ) resensibilisierte Basophile wurden in Anwesenheit von IL-3 mit anti-IgE
(als Positivkontrolle), SmEA, E. coli-IPSE und HEK-IPSE über Nacht stimuliert und die IL-4-Freisetzung im ELISA
gemessen.
93

Ergebnisse
In FACS-Experimenten wurde die Bindung von HEK-IPSE an Basophile untersucht (Abbildung 4.27).
Werden die Basophilen mit biotinyliertem HEK-IPSE inkubiert (gefüllte Kurve) so zeigen sie eine
deutlich höhere mittlere Fluoreszenz gegenüber Basophilen, die nicht mit HEK-IPSE inkubiert worden
sind (graue offene Kurve), ersichtlich über eine Rechtsverschiebung der Kurve. Folglich binden die
Basophilen HEK-IPSE. Wird das rezeptorgebundene IgE von den Basophilen entfernt, so binden sie
deutlich weniger HEK-IPSE (schwarze offene Kurve). Dies unterstützt die Ergebnisse der
Strippingexperimente, dass die Aktivierung der Basophilen IgE-abhängig ist. Die Positivkontrolle mit
biotinyliertem anti-IgE zeigt dasselbe Ergebnis, nur dass die mittlere Fluoreszenz bei anti-IgE deutlich
höher ist.
Abbildung 4.27: Histogramme der FACS-Untersuchung zur Untersuchung der Bindung von HEK-IPSE oder anti-IgE
an native und gestrippte Basophile. Native und gestrippte Basophile wurden entweder mit biotinyliertem HEK-IPSE oder
mit biotinyliertem anti-IgE inkubiert. Der Nachweis im FACS erfolgte über Bindung von PE-gekoppeltem Streptavidin.
4.3.3 Basophile degranulieren nach Stimulation mit HEK-IPSE und High Five-IPSE
Neben der Freisetzung von IL-4 schütten Basophile auch noch weitere Mediatoren wie Histamin,
IL-13 und Leukotriene aus. Während IL-4 und IL-13 de novo synthetisiert werden, werden Histamin
und Leukotriene durch Degranulation freigesetzt. Die Granulierung bzw. die Degranulation kann
durch Anfärbung von Zytospinpräparaten nach Stimulation der Basophilen visualisiert werden.
94

Ergebnisse
Die Basophilen wurden über Nacht mit den verschiedenen Stimuli (SmEA, E. coli-IPSE, HEK-IPSE
und High Five-IPSE) in IL-3-haltigem Medium inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Zellen nur
in Medium bzw. in IL-3-haltigem Medium inkubiert.
Die Effekte der einzelnen Stimuli sind in Abbildung 4.28 zu sehen. Die in Medium inkubierten
Basophilen sind stark granuliert. Die Granula sind dabei gleichmäßig über die Zelle verteilt. Durch
Zusatz von IL-3 bei der Inkubation kommt es zu einer Polarisierung der Granula auf der einen Seite
der Zelle während der Kern die andere Hälfte einnimmt. SmEA, welches natürliches IPSE enthält,
bewirkt eine Degranulation der Basophilen. Es sind kaum mehr Granula sichtbar, stattdessen kann
man in einigen Basophilen Granulakavitäten erkennen. Das gleiche Bild zeigt sich auch bei den
rekombinant exprimierten IPSE-Präparationen. Sowohl E. coli-IPSE wie auch HEK-IPSE und
High Five-IPSE führen zu einer Degranulation der Basophilen. Auch wenn für HEK-IPSE und
High Five-IPSE keine Histaminbestimmung durchgeführt worden ist, so kann man durch die
Degranulation davon ausgehen, dass auch diese IPSE-Arten zu einer Histaminfreisetzung führen.
Abbildung 4.28: Degranulation humaner basophiler Granulozyten nach Stimulation mit IPSE aus verschiedenen
Expressionssystemen. Basophile wurden mit SmEA, E. coli-IPSE, HEK-IPSE und High Five-IPSE über Nacht bei 37 °C
stimuliert. Von den Zellen wurden Zytospinpräparate angefertigt, mit May-Grünwald-Lösung gefärbt und unter dem
Mikroskop bei 1000x Vergrößerung fotografiert. Als Negativkontrollen dienen Zellen, die nur in Medium bzw. in IL-3
haltigem Medium inkubiert worden sind.
95

Ergebnisse
4.3.4 Inkubation mit HEK-IPSE führt zu einer allgemeinen Aktivierung der
Basophilen
Bei der Aktivierung von Basophilen wird der Oberflächenmarker CD203c hochreguliert (Bühring et
al. 2004). In FACS-Experimenten wurde untersucht, ob dies auch für die Aktivierung der Basophilen
durch IPSE der Fall ist. Dafür wurde ein Teil der gereinigten Basophilen in 2 % Formaldehyd fixiert,
der andere Teil wurde nativ belassen. Beide Konditionen wurden mit HEK-IPSE für eine halbe Stunde
bei 37 °C inkubiert. Die Menge an CD203c wurde im FACS mit einem PE-gekoppelten anti-CD203c-
Antikörper auf der Oberfläche der Basophilen nachgewiesen. Wie in dem Histogramm in Abbildung
4.29 zu sehen ist, zeigen native Basophile sowohl mit HEK-IPSE als auch mit anti-IgE eine deutlich
höhere Fluoreszenz. Sie haben folglich mehr CD203c an ihrer Oberfläche als die fixierten Basophilen,
das während der Inkubationszeit von Basophilen auf der Oberfläche exprimiert worden ist. Das
bedeutet, dass Basophile nicht nur durch anti-IgE sondern auch durch HEK-IPSE aktiviert werden.
Abbildung 4.29: Histogramme der FACS-Experimente zur Untersuchung der Expression von CD203c auf fixierten
und nativen Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE und anti-IgE. Ein Teil der gereinigten Basophilen wurde mit
2 % Formaldehyd fixiert, der andere Teil wurde nativ belassen. Beide Konditionen wurden mit HEK-IPSE oder anti-IgE für
30 min bei 37 °C inkubiert und die Expression von CD203c auf der Oberfläche über einen PE-gekoppelten anti-CD203c-
Antikörper im FACS nachgewiesen. Offene Kurven: fixierte Basophile, gefüllte Kurven: native Basophile.
96

Ergebnisse
4.3.5 HEK-IPSE und High Five-IPSE binden Immunglobuline
Wie bereits erwähnt ist die Aktivierung der Basophilen durch IPSE IgE-abhängig. In Arbeiten von
Blindow (2004) konnte gezeigt werden, dass E. coli-IPSE jedoch nicht nur IgE sondern auch IgG, IgM
und IgA bindet. IPSE ist folglich ein Immunglobulin-bindender Faktor. Daher wurde untersucht ob
diese funktionelle Eigenschaft auch auf HEK-IPSE und High Five-IPSE zutrifft.
Als Positivkontrollen wurden aufgereinigtes natürliches IPSE und Schistosoma mansoni-Ei-Antigen
(SmEA), welches nIPSE enthält, in der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen
aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE, IgG, dem
Lektin Aleuria aurantia Agglutinin (welches spezifisch α1→6 oder α1→3 gebundene Fucose bindet)
und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper inkubiert. Die Bindung wurde über AP-gekoppelte
Sekundärantikörper nachgewiesen (Abbildung 4.30).
Der monoklonale anti-IPSE-Antikörper gibt die Lage der Banden von IPSE an. Natürliches IPSE zeigt
eine Doppelbande bei ca. 40 kD. Diese Banden sind auch bei Streifen, die mit IgE, IgG und dem
Lektin inkubiert worden sind, zu sehen. Natürliches IPSE bindet demzufolge nach die ausgetesteten
Immunglobuline und ist fucosyliert. Das SmEA enthält neben IPSE viele weitere Proteine. Der
Streifen, der mit dem Lektin inkubiert worden ist, zeigt zahlreiche Banden. Dies ist dadurch zu
erklären, dass über die Bindung des Lektins die fucosylierten Proteine des SmEAs angezeigt werden.
Der monoklonale anti-IPSE-Antikörper zeigt wieder die Doppelbande des natürlichen IPSE bei 40 kD.
Auch IgE und IgG binden an diese Doppelbande wenn auch nur sehr schwach. Da aus dem
Proteingemisch jedoch nur diese Doppelbande erkannt wird, handelt es sich um eine spezifische
Bindung und keinen Artefakt.
Abbildung 4.30: Bindung von natürlichem IPSE an Immunglobuline. Natürliches aufgereinigtes IPSE (5 µg/cm) und
SmEA (67 µg/cm) wurden in der SDS-PAGE (15 % Trenngel) unter nicht-redzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE (3 µg/ml von Diatec), IgG (3 µg/ml), dem APgekoppelten
Lektin AAA (0,1 µg/ml) und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (1:50) inkubiert. Die Bindung wurde
über AP-gekoppelte immungloblulin-spezifische Antikörper nachgewiesen. C: Kontrolle für den Sekundärantikörper.
97

Ergebnisse
Abbildung 4.31: Bindung von rekombinantem IPSE an Immunglobuline. E. coli-IPSE (0,5 µg/cm), HEK-IPSE
(3 µg/cm) und High Five IPSE (2,5 µg/cm) wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel für E. coli-IPSE und HEK-IPSE;
15 % Trenngel für High Five-IPSE) unter nicht-redzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran
geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE (3 µg/ml von Tago), IgG (3 µg/ml), dem AP-gekoppelten Lektin AAA
(0,1 µg/ml) und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (1:50) inkubiert. Die Bindung wurde über AP-gekoppelte
immungloblulin-spezifische Antikörper nachgewiesen. C: Kontrolle für den Sekundärantikörper.
Die rekombinant hergestellten IPSE-Proteine - E. coli-IPSE, HEK-IPSE und High Five-IPSE - wurden
in gleicher Weise wie das natürliche IPSE und das SmEA in der SDS-PAGE aufgetrennt und im
Streifentest untersucht (Abbildung 4.31). E. coli-IPSE zeigt mit dem monoklonalen anti-IPSE-
Antikörper eine Doppelbande bei 33 kD. Diese Bande bindet sowohl IgE als auch IgG, jedoch nicht
AAA. Da Bakterien Proteine nicht glycosylieren können, kann dieser Streifen auch nicht weiter
gefärbt sein.
Die vier von dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper identifizierten HEK-IPSE-Banden werden
ebenfalls sowohl von IgE als auch von IgG gebunden. Des Weiteren bindet auch das Lektin AAA an
alle vier Banden, was bedeutet, dass alle vier Banden fucosyliert sind.
Bei High Five-IPSE erkennt der monoklonale Antikörper die drei Banden des Dimers und auch zwei
Monomerbanden. Die drei Dimerbanden binden - wie auch alle anderen IPSE-Arten - IgE, IgG und
auch AAA.
98

Ergebnisse
4.3.6 HEK-IPSE führt nicht zu einer Quervernetzung von Immunglobulinen
Nach Metzger (1992) werden bei einer Allergie Basophile durch eine Quervernetzung des
rezeptorgebundenen allergenspezifischen IgEs über das Allergen aktiviert. Quervernetzungen können
über Bindung großer Komplexe im Äquivalenzbereich im Doppelimmunodiffusionsassay nach
Ouchterlony nachgewiesen werden. Für E. coli-IPSE sind diese Versuche jedoch immer negativ
ausgefallen. Das bedeutet, dass IPSE IgE und IgG zwar bindet, jedoch nicht quervernetzt
(Blindow 2004). E. coli-IPSE ist jedoch schlecht löslich und bildet im Ouchterlony im Auftragsloch
Präzipitate, so dass die tatsächlich ins Gel diffundierte Proteinmenge erheblich niedriger ist als die
aufgetragene. Möglicherweise können über dieses Material keine so hohen Proteinkonzentrationen im
Gel erreicht werden, die mit den Immunglobulinen Präzipitate bilden könnten.
Aus diesem Grund wurden die Versuche mit dem gut löslichen HEK-IPSE wiederholt. Die Ergebnisse
sind in Abbildung 4.32 dargestellt. Wie in der Kontrolle mit dem anti-IPSE-Antikörper zu sehen ist,
bildet HEK-IPSE keine Präzipitate direkt im Auftragsloch wie es bei E. coli-IPSE der Fall ist. Auch
die Präzipitatslinien sind bei diesem Material sehr viel deutlicher ausgeprägt. Das heißt, dass mehr
HEK-IPSE in das Gel diffundieren konnte.
Jedoch sind auch bei HEK-IPSE weder mit IgG noch mit IgE Präzipitatbanden zu erkennen. Die
Versuche sind über einen weiten Konzentrationsbereich durchgeführt worden. In Abbildung 4.32
dargestellt sind die Ergebnisse der Diffusion der Immunglobuline und HEK-IPSE in äquimolarer
Menge und in zehnfachem Immunglobulin-Überschuss. Werden HEK-IPSE und Immunglobulin in
äquimolarer Menge aufgetragen, so wird das Gel vollständig entfärbt. Es zeigen sich keine
Präzipitatlinien. Das bedeutet, dass es zu keiner Quervernetzung kommt. Wenn die Immunglobuline in
zehnfachem Überschuss zugegeben werden, zeigen sich um die Auftragslöcher des Immunglobulins
konzentrische Proteinfärbungen. Diese sind jedoch nicht auf eine Quervernetzung mit HEK-IPSE
zurückzuführen, da diese Präzipitate auch auftreten, wenn statt HEK-IPSE nur Puffer in die Löcher
aufgetragen wird. Diese unspezifische Anfärbung ist auf Aggregatbildung der Immunglobuline bei
hohen Proteinkonzentrationen zurückzuführen.
Somit ist selbst mit dem gut löslichen HEK-IPSE im Ouchterlony keine Quervernetzung zwischen
Immunglobulinen und IPSE nachweisbar.
99

Ergebnisse
Abbildung 4.32: Doppelimmunodiffusionsassays nach Ouchterlony zur Untersuchung der Quervernetzung von IPSE
mit Immunglobulinen. Von den beiden Reaktionspartnern ist der erstgenannte auf der linke Seite des Gels in der Mitte
platziert und der letztgenannte in den Löchern außen herum in 2er-Verdünnungsstufen von unverdünnt bis 1: 32
(im Uhrzeigersinn). Auf der rechten Seite wurde das Experiment reziprok durchgeführt. Bei dem anti-IPSE-Antikörper
handelt es sich um ein polyklonales Kaninchenserum gegen IPSE. Dieses wurde in dem mit * gekennzeichneten Experiment
zuvor über eine Protein-G-Säule aufgereinigt und deshalb in einer anderen Konzentration eingesetzt als in Experiment 9).
100

Diskussion
5 Diskussion
Das von den Eiern des Pärchenegels Schistosoma mansoni sekretierte Protein IPSE bewirkt eine IL-4-
Freisetzung aus humanen Basophilen und stellt somit einen wichtigen potenziellen Immunmodulator
in Richtung der Th2-Induktion dar. IPSE ist ein Immunglobulin-bindender Faktor und die Aktivierung
der Basophilen ist IgE-abhängig. Zur weiteren Aufklärung des Wirkungsmechanismus auf zellulärer
Ebene und für strukturelle Untersuchungen wird IPSE in rekombinanter Form benötigt, da natürliches
IPSE nur in sehr geringer Menge im SmEA vorliegt. In dieser Arbeit wurden daher verschiedene
Expressionssysteme untersucht, mit dem Ziel eine größtmögliche Menge an funktionell aktivem und
löslichem IPSE zu erhalten. Als Expressionssysteme wurden E. coli mit unterschiedlichen
Expressionsvektoren, humane 293 HEK-Zellen und Insektenzellen gewählt.
5.1 Expression von IPSE in E. coli
5.1.1 Proteingewinnung über in vitro-Rückfaltung
Bakterielle Expressionssyteme haben den generellen Vorteil, dass schnell große Mengen an
rekombinantem Protein unter relativ einfachen und kostengünstigen Laborbedingungen gewonnen
werden können. Dies wird unter anderem in der pharmazeutischen Biotechnologie ausgenutzt und so
seit 1982 große Mengen an rekombinantem Insulin hergestellt (Folkers et al. 2005).
Auch IPSE wurde nach Aufklärung der DNA-Sequenz im Vorfeld dieser Arbeit in den
Expressionsvektor pPROEX-Htb kloniert und in E. coli-Zellen des Stammes DH5α überexprimiert. Bei
dieser Expression wird E. coli-IPSE jedoch nicht in löslicher Form exprimiert, sondern in so
genannten inclusion bodies in der Zelle abgelegt. Inclusion bodies sind unlösliche Proteinaggregate,
die nicht korrekt gefaltet und somit biologisch inaktiv sind. Diese bilden sich bei hohen intrazellulären
Konzentrationen von falsch gefalteten Proteinen oder Faltungsintermediaten (Sørensen und Mortensen
2005). Über in vitro Rückfaltungsstrategien können aus solchen Proteinaggregaten dennoch biologisch
aktive Proteine gewonnen werden (Chaudhuri 1994). Die Rückfaltung von Proteinen ist ein
zweistufiger Prozess, bei dem zunächst die inclusion bodies unter starken denaturierenden
Bedingungen gelöst und anschließend in einem physiologischen Puffer zurückgefaltet werden. Die
Rückfaltung von gelöstem Protein zu gefaltetem Protein verläuft über einen Übergangszustand, der
sich durch partielle Faltungsstrukturen mit einem geringen Anteil von Sekundärstruktur auszeichnet.
Der kritische Schritt bei der Rückfaltung ist die Entstehung von nativem, gefaltetem Protein aus
diesem Übergangszustand, denn auch hier können sich statt nativem Protein erneut Aggregate bilden.
Wichtig dabei ist, dass die Konzentration an denaturiertem Protein möglichst gering gehalten wird.
101

Diskussion
Die Bedingungen, die zu nativem Protein führen, müssen für jedes Protein systematisch ausgetestet
werden. Bei E. coli-IPSE werden die inclusion bodies zunächst gewaschen und in 8 M Harnstoff
solubilisiert, um im denaturierten Zustand über IMAC aufgereinigt zu werden. Das gereinigte E. coli-
IPSE wird gegen einen Refoldingpuffer dialysiert. Dieser enthält ein Redoxsystem, das die
Disulfidbrückenbildung ermöglicht. Anschließend wird der Refoldingpuffer durch Dialyse gegen
einen PBS-Puffer pH 8,5 ersetzt (Schramm et al. 2003). Dieses E. coli-IPSE führt bei Basophilen zu
einer IL-4-Freisetzung, bindet Immunglobuline und wird von polyklonalem Antikörper gegen nIPSE
sowie monoklonalem Antikörper gegen E. coli-IPSE erkannt. Daher kann davon ausgegangen werden,
dass es sich bei diesem Protein um zumindest größtenteils korrekt gefaltetes IPSE handelt. In diesen
Präparationen überwiegt der Anteil an dimerisiertem IPSE, jedoch ist immer auch eine gewisse Menge
an monomerem IPSE enthalten, das sich nicht weiter abtrennen lässt. Ein weiterer Nachteil dieser
Präparationsart ist, dass sich das zurückgefaltete E. coli-IPSE nur bis zu einer Konzentration von
0,15 mg/ml konzentrieren lässt, da es andernfalls aus der Lösung präzipitiert.
Mit Hilfe einer anderen Rückfaltungsstrategie kann die Löslichkeit verbessert werden. Dabei wird
denaturiertes IPSE nicht gegen PBS-Puffer sondern gegen einen Acetat-Puffer bei pH 4,0
zurückgefaltet. Das auf diese Weise gewonnene E. coli-IPSE (pH 4,0) besteht überwiegend aus
monomerem IPSE mit einem geringen Anteil an IPSE-Dimer und lässt sich auf bis zu 8 mg/ml
einengen. Die bessere Löslichkeit lässt sich unter Umständen auf die höhere Nettoladung des Proteins
an der Oberfläche zurückführen, da der isoelektrische Punkt (pI) von His-getaggtem E. coli-IPSE bei
8,43 liegt. In der Nähe des pI weist das Protein keine Nettoladung auf und die Aggregation
hydrophober Bereiche ist begünstigt. Für Experimente bei physiologischem pH-Wert ist das bei
pH 4,0 zurückgefaltete Material nicht geeignet, da unbestimmte Mengen an Protein aus der Lösung
ausfallen können und somit keine klare Aussage über die tatsächlich eingesetzte Konzentration
getroffen werden.
Für eine Vielzahl von Fragestellungen sind die beiden über in vitro-Rückfaltung gewonnenen IPSE-
Proteine einsetzbar. So wurde beispielsweise die Immunglobulinbindung mit diesem Material näher
untersucht und über ein Epitopmapping potentielle Bindungsstellen auf dem IPSE-Molekül sowie auf
dem IgG-Molekül identifiziert (Blindow 2004). Dennoch ist für einige Untersuchungen wie z. B. der
Ultrazentrifugation zur Aufklärung der Bindungsstöchiometrie und der Kristallisation eine hohe
Proteinkonzentration bei physiologischem pH-Wert notwendig. Aus diesem Grund wurde versucht,
über verschiedene Strategien die Bildung von inclusion bodies zu umgehen und lösliches IPSE in
E. coli zu gewinnen.
102

Diskussion
5.1.2 Strategien zur Gewinnung von löslichem IPSE in E. coli
5.1.2.1 Variation der Expressionstemperatur
Eine sehr einfache Methode die Löslichkeit von exprimierten Proteinen in E. coli zu erhöhen ist die
Herabsetzung der Expressionstemperatur. Für eine Vielzahl von Proteinen wie z. B. humanes
Interferon α-2, β-Lactamase und bakterielle Luciferase konnte eine erhöhte Löslichkeit bei niedrigeren
Expressionstemperaturen nachgewiesen werden (Übersicht in Vasina und Baneyx 1997). Durch die
geringere Temperatur ist die Replikation, Transkription und Translation herabgesetzt. Auch die
Effektivität von den gewöhnlicherweise eingesetzten Promotoren ist erniedrigt. Dies resultiert in einer
geringeren Expressionsrate und einer geringeren zellulären Proteinkonzentration, welches die Faltung
von Proteinen begünstigt. Bei höheren Temperaturen ist die Aggregationsreaktion, die zu inclusion
bodies führt, verstärkt, da die Interaktion zwischen hydrophoben Bereichen stark temperaturabhängig
ist (Kiefhaber et al. 1991). Des Weiteren werden bei niedrigeren Temperaturen eine Vielzahl von
Chaperonen vermehrt exprimiert, die für die Stabilität und korrekte Faltung der exprimierten Proteine
verantwortlich sind (Ferrer et al. 2003). Bei der Expression von IPSE konnte allerdings durch
Herabsetzung der Expressionstemperatur kein positiver Effekt auf die Expression von löslichem
Protein nachgewiesen werden, weder bei der zytoplasmatischen noch bei der periplasmatischen
Expression. Das bedeutet, dass die Variation dieses Parameters einen zu geringen Einfluss auf die
Faltung von IPSE hat, da die Aggregationsreaktion zu schnell verläuft, als dass sich korrekt gefaltetes
Protein bilden könnte.
5.1.2.2 Periplasmatische Expression
Gleiches scheint auch für die periplasmatische Expression von IPSE zu gelten. Bei der
periplasmatischen Expression werden die Proteine im Zytoplasma synthetisiert und anschließend im
ungefalteten Zustand in das Periplasma transloziert (Pugsley 1993). Das Periplasma zeichnet sich
durch ein weniger reduzierendes Redoxpotenzial aus als das Zytoplasma und verfügt über eine
Vielzahl von Proteinen, die die Faltung katalysieren oder begünstigen. So ist es über die
Disulfidbrückenoxidasen bzw. -reduktasen DsbA und DsbB möglich Disulfidbrücken in einem Protein
zu bilden, was im Zytoplasma nicht möglich ist (Bardwell 1994) und Peptidyl-Prolyl-cis-trans-
Isomerasen (PPIs) katalysieren die Isomerisierung von Peptidbindungen. Chaperone scheinen bei der
Faltung von Proteinen im Periplasma keine Rolle zu spielen, da diese ATP-abhängig arbeiten, welches
im Periplasma nicht vorkommt. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene periplasmatische
Expressionsvektoren verwendet. Beide verfügen über das pelB-Signalpeptid, welches für die
Pektatlyase B codiert und die Translokation in den periplasmatischen Raum gewährleistet. Bei dem
pET26(+)-IPSE-Expressionsvektor zeigte sich keine sichtbare Expressionsleistung. Lediglich im
Westernblot konnten geringen Mengen von IPSE nachgewiesen werden. Der Grund für die geringe
103

Diskussion
Expression ist unklar, da durch eine erfolgte Sequenzierung ein Klonierungsfehler ausgeschlossen
werden konnte.
Die Expressionsleistung mit dem pBM1.1-IPSE-Expressionsvektor war dagegen gut (allerdings nur in
Form von inclusion bodies). Dieser Vektor unterscheidet sich vor allem von dem pET26(+)-Vektor
durch den N-terminalen His 10 -Tag. Trotz der guten Expressionsleistung unter jeglichen ausgetesteten
Expressionsbedingungen konnte allerdings auch hier nicht einmal im Westernblot im Überstand des
Zellaufschlusses IPSE in löslicher Form nachgewiesen werden. Es war in diesem Fall notwendig,
diese Westernblots mit dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper durchzuführen, da in der Coomassiegefärbten
SDS-PAGE eine Vielzahl von Banden zu sehen sind und so geringe Mengen von
exprimiertem IPSE überdeckt werden würden. Für die Translokation ins Periplasma muss das zu
translozierende Protein im ungefalteten Zustand vorliegen (Randall et al. 1990). Dies wird von einer
Reihe von Proteinen, die zum Translokationapparat gehören, und von der Signalsequenz selbst
gewährleistet (Park et al. 1988). Ob sich die inclusion bodies bereits bei der Translation im
Zytoplasma gebildet haben oder erst im Periplasma, konnte nicht geklärt werden.
Mit dem pBM-1.1-IPSE-Vektor wurde zusätzlich die Expression unter Salzstressbedingungen und
unter Einsatz von kompatiblen Soluten durchgeführt. Kompatible Solute wie z. B. Glycinbetain,
Sorbitol und Hydroxyectoin sind gut lösliche osmotisch wirksame Substanzen mit
proteinstabilisierender Wirkung, die von halophilen und halotoleranten Bakterien akkumuliert werden,
um in einer salzhaltigen Umgebung das Überleben zu ermöglichen (Galinski 1995). Der osmotische
Stress durch den hohen Salzgehalt bewirkt in den Zellen die Induktion von Hitzeschockproteinen und
Chaperonen, die bei der korrekten Faltung eine große Rolle spielen, sowie deren Löslichkeit und
Stabilität erhöhen. Neben den Chaperonen wird auch eine Vielzahl von weiteren Proteinen induziert,
die das Wachstum unter den gegebenen Umständen sichern und möglicherweise auch Einfluss auf die
exprimierten Proteine haben können. Des Weiteren wird ein direkter positiver Einfluss der
kompatiblen Solute auf die exprimierten Proteine diskutiert, da die kompatiblen Solute über das proP
und proU-Transportsystem in die Zelle aufgenommen werden können (Csonka et al. 1996). Die
Interaktionen sind jedoch bis dato unerforscht. Diese Methode wurde von Barth et al. (2000) zur
Expression von Immuntoxinen angewandt. Die Immuntoxine werden wie auch IPSE unter normalen
Expressionsbedingungen als inclusion bodies exprimiert. Durch Zusatz von kompatiblen Soluten unter
Salzstress konnten 1,1 mg lösliches Protein aus einer 200 ml-Kultur gewonnen werden. Auch für
Ferritin (van Wuytswinkel 1995) und DMAPP/AMP-Transferase (Blackwell und Horgan 1991)
konnte über diese Methode lösliches aktives rekombinantes Protein generiert werden. Auch wenn es
sich bei der Expression unter Salzstressbedingungen um einen viel versprechenden Ansatz handelt,
konnte für IPSE keine positive Wirkung auf die Expression von löslichem Protein nachgewiesen
werden. Jegliches exprimiertes IPSE war in der unlöslichen Fraktion des Zellaufschlusses zu finden.
Möglicherweise haben gerade die hohen Salzkonzentrationen bei dieser Expression einen
Aussalzungseffekt auf IPSE, da in der Zwischenzeit in mehreren experimentellen Ansätzen beobachtet
104

Diskussion
wurde, dass der Proteinanteil von IPSE sehr hydrophob ist (persönliche Mitteilung A. Mewes und Dr.
G. Schramm, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel).
5.1.2.3 Erniedrigung der Induktorkonzentration
Wie schon erwähnt, kann eine Erniedrigung der Proteinsyntheserate zur Erhöhung der
Proteinlöslichkeit in E. coli-Expressionssystemen führen. Dies lässt sich nicht nur durch Herabsetzung
der Expressionstemperatur erreichen (siehe 5.1.2.1), sondern auch durch Erniedrigung der
Induktorkonzentration [3]. Wie die meisten E. coli-Expressionssysteme verfügen alle in dieser Arbeit
verwendeten Vektoren über den IPTG-induzierbaren lac-Operator. Durch Zugabe des Lactose-
Analogs Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird die Expression gestartet. Die
Induktionskonzentrationen liegen im Bereich zwischen 0,05 bis 2 mM und typischerweise bei 0,1 bis
1 mM [4].
Mit dem periplasmatischen Vektor pBM1.1-IPSE in BL21(DE3)-Zellen sind IPTG-Konzentrationen
zwischen 100 pM und 100 µM ausgetestet worden. Dabei zeigt sich, dass sogar Spuren von IPTG zu
einer relativ hohen Expressionsrate führen. Die Induktion durch IPTG ist somit als ein „Alles-oder-
Nichts-Signal“ für die Zelle zu verstehen. Die Herabsetzung der IPTG-Konzentration ist insofern nicht
geeignet, um die Expressionsrate zu regulieren. Für die Regulation der Expression wurden von
Bhandari und Gowrishankar (1997) salzinduzierbare E. coli-Zellen (GJ1158) beschrieben, die den
salzinduzierbaren proU-Promotor besitzen. Bei diesen Zellen lässt sich die Expression tatsächlich über
die Induktorkonzentration (NaCl) regulieren und für eine Reihe von Proteinen konnte über diese
Methode lösliches Protein gewonnen werden (Donahue und Bebee 1999). Dies stellt somit einen
weiteren möglichen Ansatz zur Expression von E. coli-IPSE dar.
Interessanterweise zeigt sich auch hier, dass IPSE unter niedrigen IPTG-Konzentrationen als
Doppelbande exprimiert wird, wie es auch schon unter Salzstressbedingungen der Fall war. Da E. coli-
Zellen Proteine nicht glycosylieren können, kann die Doppelbande nicht auf unterschiedliche
Glycosylierungsvarianten zurückgeführt werden. Auch unterschiedliche Faltungsvarianten scheiden
als Grund für die Doppelbande aus, da die SDS-PAGE unter denaturierenden und reduzierenden
Bedingungen durchgeführt wurde. Demzufolge scheint bei dem pBM1.1-IPSE-Vektor IPSE unter
diesen Bedingungen, die für die Zelle möglicherweise eine Stresssituation darstellen, als vollständiges
Protein und in einer verkürzten Variante exprimiert zu werden. Ob dies primär durch Kettenabbruch
bei der Translation oder sekundär durch proteolytischen Abbau zustande kommt, ist nicht geklärt.
Über einen Westernblot mit einem anti-His-Tag-Antikörper könnte nachgewiesen werden, ob sich die
Verkürzung am N- oder C-Terminus befindet. Da es sich aber ohnehin um unlösliches IPSE handelt,
das nicht weiter verwendet werden konnte, wurde dieser Fragestellung nicht weiter nachgegangen.
105

Diskussion
5.1.2.4 Expression von IPSE als Fusionsprotein
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, dass es nicht möglich ist, IPSE nur durch Variation der
Expressionsbedingungen in löslicher Form zu exprimieren. Eine weitere Strategie, um lösliches
rekombinantes Protein in E. coli zu erhalten, ist die Expression als Fusionsprotein mit einem
Löslichkeitsvermittler. Als Löslichkeitsvermittler werden dabei häufig Affinitäts-Tags eingesetzt, die
zusätzlich die Aufreinigung und Detektion des exprimierten Fusionsproteins erleichtern. Dazu zählen
der GST-Tag (Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum, 26 kD, Smith 2000), der MBP-
Tag (Maltosebindeprotein aus E. coli, 40 kD, Sachdev und Chirgwin 2000), der TRX-Tag
(Thioredoxin aus E. coli, 12 kD, La Vallie et al. 2000) und der NusA-Tag (N utilization substance A,
54 kD, Harrison 2000). Für den GST-, MBP- und NusA-Tag konnte in einer vergleichenden
Untersuchung von 40 Proteinen im Bereich zwischen 9 und 100 kD eine deutliche Verbesserung in
Bezug auf die Löslichkeit erzielt werden, wohingegen der vergleichsweise kleine TRX-Tag kaum
Auswirkungen zeigte (Shih et al. 2002). In dieser Arbeit wurde für die Expression von IPSE der MBP-
Tag und der TRX-Tag verwendet.
In dem MBP-System konnte IPSE zytoplasmatisch in größeren Mengen löslich als MBP-IPSE
gewonnen werden. Über eine Amylose-Affinitätschromatographie konnte das exprimierte
Fusionsprotein gut aufgereinigt werden. Die restlichen kontaminierenden Proteine sollten dann über
eine Gelfiltration abgetrennt werden. Dabei zeigte sich jedoch, dass bei der erwarteten Größe für das
Monomer von 50 kD kein Protein eluierte, sondern jegliches aufgetragenes Protein im
Ausschlussvolumen der Superdex-200-Säule zu finden war. Diese Säule trennt Proteine im Bereich
von 10 bis 600 kD. Das bedeutet, dass sich bei der Aufarbeitung oder während der Gelfiltration
Aggregate von mehr als 600 kD gebildet haben müssen. Diese waren auch durch Einsatz von milden
reduzierenden Bedingungen (1 mM DTT) nicht zu verhindern. In der Bachelorarbeit von Jessen
(2003), in der Fragmente von IPSE als MBP-Fusionsproteine exprimiert wurden, zeigte sich ebenfalls
eine Aggregationstendenz bei der Gelfiltration. Des Weiteren konnte der MBP-Fusionsanteil nicht
über Faktor Xa abgespalten werden. Für weitere Untersuchungen von IPSE ist dies aber notwendig, da
der MBP-Anteil ca. 80 % des gesamten Proteins ausmacht und es bei Bindungsstudien zu artefiziellen
sterischen Behinderungen kommen könnte. Das bedeutet, dass trotz der hohen Ausbeuten an zunächst
löslichem Fusionsprotein, eine weitere Aufarbeitung von IPSE sehr schwierig ist.
Bei dem TRX-System dient der Thioredoxin-Anteil nicht nur als Löslichkeitsvermittler, sondern
katalysiert wahrscheinlich auch die Disulfidbrückenbildung (Prinz et al. 1997). Dies ist nur in
Origami-Zellen möglich, da in anderen Bakterienzellen das Zytoplasma ein reduzierendes Milieu
aufweist, welches die Bildung von Disulfidbrücken verhindert. Das reduzierende Milieu wird durch
zwei unabhängige Systeme aufrechterhalten: das Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System und das
Glutathion/Glutaredoxin-System (Stewart et al. 1998). Die Origami-Zellen besitzen in den Genen
trxB, das für die Thioredoxin-Reduktase codiert, und gor, das für die Glutathion Oxido-Reduktase
codiert, eine Mutation und haben dadurch ein verändertes zytoplasmatisches Redoxpotential. Aus
106

Diskussion
diesem Grund wurde der TRX-Tag auch für die Expression von IPSE ausgetestet, da die
Disulfidbrückenbildung für IPSE essentiell ist. Tatsächlich führt dies im Falle von IPSE auch zu
einem Teil löslichem Protein, welches sich über IMAC bis zu einem guten Reinheitsgrad aufreinigen
lässt. In dem Elutionspuffer der IMAC, welcher 250 mM Imidazol enthält, ist das eluierte Protein
stabil. Bei einer Umpufferung gegen einen Tris-Puffer (50 mM, pH 7,5) präzipitiert das gesamte
Protein jedoch irreversibel aus der Lösung. Diese Umpufferung ist aber nötig, um den TRX-Anteil
über die Enterokinase-Schnittstelle abzuspalten. Aus diesem Grund schienen weitere Experimente mit
diesem Material aussichtslos. In späteren Versuchen, z. B. bei der Kristallisation, zeigte sich, dass
IPSE - unabhängig von dem Expressionssystem - in Tris-haltigen Puffern nicht löslich ist. Durch den
Einsatz von 50 mM MES-Puffer (pH 7,5) könnte dieses Problem umgangen werden und der TRX-
Anteil abgespalten werden. Ob das restliche IPSE ohne den Fusionsproteinanteil weiterhin löslich ist,
ist fraglich, da häufig nach dem Abspalten des Affinitäts-Tags das gewünschte Protein zu großen
Teilen präzipitiert (Baneyx 1999). Dennoch stellt die Expression von TRX-IPSE unter den
untersuchten E. coli-Expressionssystemen den viel versprechensten Ansatz dar.
Für die Kristallisation eines Proteins kann ein großer Affinitäts-Tag sowohl von Nutzen als auch
hinderlich sein. Die 3D-Strukturen von MBP und TRX konnten bereits aufgeklärt werden (Spurlino et
al. 1991, Jeng et al. 1994). Durch Modifizierung der Kristallisationsbedingungen, die bereits zu einem
Kristall geführt haben, kann das Kristallisations-Screening vereinfacht werden. Für MBP konnte dies
jedoch nur für kleine Peptide von 5-42 Aminosäuren nachgewiesen werden (Bucher et al. 2002). Auf
der anderen Seite führen große Affinitäts-Tags, die mit dem gewünschten Protein fusioniert sind,
durch die flexible Linkerregion, über die sie miteinander verbunden sind, zu einer größeren
konformationellen Heterogenität, was die Kristallisation behindert. Dennoch ist es gelungen die ersten
Kristalle von fünf Proteinen mit MBP-Tag zu erlangen (Übersicht in Smyth et al. 2003). Bei allen
wurde die flexible Linkerregion auf drei bis fünf Aminosäuren - meist Alaninreste - verkürzt. Da
sowohl MBP-IPSE als auch TRX-IPSE eine längere Linkerregeion besitzen, sind sie in ihrer jetzigen
Form mit dem Fusionsanteil nicht für die Kristallisation einsetzbar und müssen zunächst gentechnisch
modifiziert werden.
107

Diskussion
5.2 Expression von IPSE in eukaryotischen Zellen
Eukaryotische Expressionssysteme wie Insektenzellen und humane Zelllinien zeichnen sich gegenüber
bakteriellen Expressionssystemen durch eine größtenteils korrekte Faltung des exprimierten Proteins
aus. Des Weiteren sind sie in der Lage posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Glycosylierungen,
Phosphorylierungen und Acetylierungen durchzuführen (Fernandez und Hoeffler 1999). Neben diesen
Vorteilen ist jedoch die Ausbeute an exprimiertem Protein deutlich geringer, das Zellwachstum
langsamer, die Kosten des Mediums und die Laboranforderungen höher. Da IPSE in E. coli-Zellen
nicht löslich exprimiert werden konnte, wurden zwei eukaryotische Expressionssysteme ausgetestet:
humane 293 HEK-Zellen und High Five-Insektenzellen.
5.2.1 Expression von IPSE in 293 HEK-Zellen
5.2.1.1 Expression
Das HEK-Zellsystem hat sich nach der ersten Beschreibung von Graham et al. (1977) zu einem weit
verbreiteten Expressionssystem entwickelt. Graham transformierte humane embryonale Nierenzellen
mit gescherter Adenovirus-DNA vom Typ 5 und erhielt eine Zelllinie, die sensitiv für Adenoviren
war. Neben der virusbasierten Transfektion sind diese Zellen auch über Elektroporation,
Lipotransfektion, Phosphatpräzipitation und Mikroinjektion transfizierbar. Der gereinigte pMSII-
IPSE-Vektor wurde über das kationische Lipotransfektionsreagenz Transfast in die Zellen eingebracht,
da dies die einfachste Transfektionsmethode mit einer hohen Effizienz darstellt. Der pMSII-Vektor hat
gegenüber seinem Ausgangsvektor pSecTag2 den Vorteil, dass sich die Transfektionseffizienz
theoretisch über grüne Fluoreszenz der Zellen ermitteln lässt, da der Vektor über eine bicistronische
mRNA gleichzeitig mit dem rekombinanten Protein eGFP produziert. Auch wenn die grüne
Fluoreszenz nur sehr schwach ausgeprägt war, kann von einer ausreichenden Transfektionsrate
ausgegangen werden, da nach Zugabe des Selektionsmittels Zeocin viele Zellen überlebten und nach
drei Tagen bereits erstmals HEK-IPSE im Kulturüberstand nachgewiesen werden konnte. Aus diesem
Kulturansatz konnte eine stabile Zelllinie etabliert werden, die kontinuierlich HEK-IPSE exprimiert
und in das Medium sekretiert.
5.2.1.2 Reinigung
Für die Aufreinigung des Kulturüberstandes konnte ein zweistufiges Reinigungsprotokoll - bestehend
aus einer IMAC und einer Affinitätschromatographie - etabliert werden. Dieses resultierte in
hochreinem rekombinantem Protein. Der erste Reinigungsschritt - die IMAC - entfernt den größten
108

Diskussion
Teil der kontaminierenden Proteine (im Wesentlichen FBS). Serumfreies Medium zeichnet sich durch
eine geringe Proteinkonzentration aus. Insofern wäre es vorteilhaft auf den teuren Zusatz von FBS zu
verzichten, der die Reinigung erschwert. Stöcker et al. (2003) beschreiben, dass der Kulturüberstand
einer serumfreien 293 HEK-Zellkultur fast nur rekombinantes Protein enthält, so dass dieser schon für
Bindungsstudien im FACS eingesetzt werden kann. In einem kommerziellen HEK-Zell-
Expressionsmedium (HEK 293 Express der Firma PAA) starben die transfizierten Zellen jedoch nach
langsamer Adaptation ab, sobald kein FBS mehr enthalten war. In einem weiteren Versuch wurden die
Zellen auf ein weiteres serumfreies Medium (Dulbecco´s modified Medium + HAM´s Medium zu
gleichen Teil unter Zusatz von Albumin, Insulin, Transferrin, Thiotyronin, Selen und Ethanolamin)
adaptiert. In diesem Fall überlebten die Zellen zwar, sofern dem Kulturüberstand bei der Aufreinigung
der Inkubationspuffer für die IMAC zugesetzt wird, bilden sich Präzipitate, die das Gelmaterial der
IMAC verstopfen und eine Aufreinigung somit erschweren. Aus diesen Gründen wurde FBS-haltiges
Medium für die Expression verwendet. In dem zweiten Reinigungsschritt - der
Affinitätschromatographie - können auch letzte Verunreinigungen abgetrennt werden. Wird die
Affinitätschromatographie als einzige Reinigungsprozedur durchgeführt, so verbleiben noch
kontaminierende Proteine im Eluat. Der Reinheitsgrad entspricht in etwa dem nach der IMAC. Das
zweistufige Reinigungsprotokoll ist somit für reines Material unumgänglich.
5.2.1.3 Ausbeute
Aus einem Liter Kulturüberstand wurden zwischen 0,2 und 0,5 mg HEK-IPSE isoliert. Die Ausbeute
aus einem Expressionssystem ist zwar immer abhängig von dem zu exprimierenden Protein, für
vergleichbare 293 HEK-Zell-Expressionssysteme sind jedoch ähnliche Expressionsraten ermittelt
worden: ~ 0,5 mg/l Kreatintransporter (West et al. 2005), 2 mg/l humanes Cathepsin E (Cappiello et
al. 2004), 0,5 mg/l bovine pregnancy associated glycoprotein (Patel et al. 2003) und 0,3 mg/l humaner
Faktor X (Rudolph et al. 1997). Für den in dieser Arbeit verwendeten pMSII-Vektor sind zwei
unterschiedliche Expressionen und Aufreinigungen von rekombinanten Immuntoxinen beschrieben
(Stöcker et al. 2003, Brüll 2004), jedoch ist lediglich die Expression von anti-CD30-Angiogenin
bilanziert. Hier wurden ähnliche Ausbeuten wie in dieser Arbeit erhalten (0,1 bis 0,5 mg/l).
Um dennoch die Ausbeute zu optimieren, wurden erste Versuche mit einem Minifermenter
(miniPERM der Firma Greiner Bio-One) unternommen (Kultivierung der Zellen durchgeführt von PD
Dr. J. van der Bosch, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel). Im miniPERM
Bioreaktor ist der Kulturraum durch eine Dialysemembran in einen Produktions- und einen
Versorgungsraum aufgeteilt. Zellen und hochmolekulare Produkte werden durch diese zurückgehalten,
Nährstoffe, physikalisch gelöste Gase und Metabolite können jedoch passieren. Hierdurch ist eine
starke Anreicherung von Zellen und Zellprodukten möglich. Es wurden zwei verschiedene Systeme
ausgetestet: eine Suspensionskultur und eine adhärent wachsende Kultur. Die Suspensionskultur zeigte
109

Diskussion
gegenüber der adhärenten Kultur geringere Wachstumsraten und somit auch geringere
Produktionsraten. In der adhärenten Kultur konnten während der optimalen Produktionsphase
innerhalb von zwei Tagen aus 40 ml Kulturüberstand bis zu 0,3 mg HEK-IPSE gereinigt werden.
Wenn dieses Ergebnis in Langzeitversuchen bestätigt werden kann, so würde dies einer deutlichen
Verbesserung im Arbeitsaufwand und Materialeinsatz entsprechen.
5.2.1.4 Dimerisierung
HEK-IPSE wird von den 293 HEK-Zellen als Dimer gebildet. Nur ein sehr geringer Teil liegt als
Monomer vor. Auch im natürlichen IPSE sind zwei IPSE-Monomere über eine Disulfidbrücke
zwischen dem C 39 und C 73 kovalent miteinander verbunden (Wuhrer et al., Paper eingereicht).
Experimente im Basophilen-Assay zeigen, dass sehr wahrscheinlich nur dimeres IPSE zu einer
Aktivierung der Basophilen führt, wohingegen monomeres IPSE keinen Einfluss besitzt (A. Gronow,
LG Zelluläre Allergologie, persönliche Mitteilung). Nach dem von Blindow (2004) entwickelten
Modell der Bindung von IPSE an Immunglobuline, kann nur dimerisiertes IPSE zu einer
Konformationsänderung des rezeptorgebundenen IgE´s an der Oberfläche der Basophilen führen und
diese darüber aktivieren. Die Bildung von dimerem IPSE ist aus diesem Grund für die Gewinnung von
funktionell aktivem Material essentiell.
5.2.1.5 Molekulargewicht
In der SDS-PAGE wurde für dimeres HEK-IPSE ein apparentes Molekulargewicht von 40 bis 50 kD
ermittelt. HEK-IPSE liegt dabei in vier unterschiedlichen Glycosyslierungsformen vor. Gerade
Glycoproteine zeigen in der SDS-PAGE häufig ein verändertes Laufverhalten, so dass ihre
Wanderungsgeschwindigkeit nicht mehr proportional zum dekadischen Logarithmus ihres
Molekulargewichts ist (Rehm 2002). Aus diesem Grund wurde das Molekulargewicht für HEK-IPSE
zusätzlich im MALDI-TOF Massenspektrum ermittelt (durchgeführt von PD Dr. B. Lindner,
LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel). Tatsächlich zeigt sich hier eine deutliche Abweichung zu
dem in der SDS-PAGE ermittelten Molekulargewicht. Dimeres HEK-IPSE hat demzufolge 34 bis
39 kD. Da die Peaks durch die Glycosylierung sehr breit sind, lässt sich das Molekulargewicht nicht
genauer bestimmen. Das aus der Aminosäuresequenz für monomeres HEK-IPSE abgeleitete
Molekulargewicht ist 16,679 kD. Die Differenz zwischen dem kalkulierten und gemessenen
Molekulargewicht beruht auf der Glycosylierung. Demzufolge nimmt der Glycoanteil 2 bis 14 % des
Molekulargewichtes ein. Neben dem Peak bei 34 bis 39 kD ist zusätzlich mit gleicher Intensität noch
ein Peak bei 17 bis 19 kD zu sehen, bei dem es sich um die doppelt protonierte Form des HEK-IPSE-
Dimers in der MALDI-TOF-MS handelt. Das Massenspektrum von natürlichem IPSE sieht sehr
ähnlich aus (Wuhrer et al., Paper eingereicht): Es zeigt ebenfalls zwei breite Peaks, welche die einfach
110

Diskussion
und die zweifach protonierte Form von nIPSE darstellen. Demzufolge hat natürliches IPSE ein
Molekulargewicht von 32 bis 38 kD mit einem Kohlenhydratanteil von ungefähr 25 %.
5.2.1.6 Glycosylierung
Die vier Banden, die das HEK-IPSE-Dimer in der SDS-PAGE zeigt, sind auf unterschiedliche
Glycosylierung zurückzuführen. Dies konnte in Experimenten mit der Endoglycosidase PNGase F, die
spezifisch am Asparagin von N-glycosidisch gebundenen Zuckern spaltet, gezeigt werden, da die
beiden höhermolekularen Banden durch diese Behandlung verschwanden. Da nach der
Deglycosylierung nicht nur eine Bande sondern zwei zu sehen sind, ist das Protein nicht vollständig
deglycosyliert. Dies kann zum einen daran liegen, dass HEK-IPSE neben N-glycosidisch gebundenen
Zuckern auch noch O-glycosidisch gebundene Zucker aufweist, welche von der PNGase F nicht
erkannt werden. Beim natürlichen IPSE können allerdings keine O-glycosidischen Zucker
nachgewiesen werden (Wuhrer et al., Paper eingereicht). Zum anderen können dies N-glycosidische
Zucker sein, die von der PNGase F durch unvollständigen Abbau nicht komplett entfernt wurden. Die
Deglycosylierungseffizienz der PNGase F kann nach Herstellerangaben durch Zugabe von SDS und
reduzierenden Agenzien gesteigert werden, da die Angriffsstellen für das Enzym freier zugänglich
sind. Dies führt jedoch zur Denaturierung und Inaktivierung des Proteins, daher wurde von diesen
Maßnahmen abgesehen.
Die Deglycosylierung mit dem Enzym Endo H hatte keinen Einfluss auf die Bandenstruktur. Die
Endo H spaltet die β(14)-Bindung zwischen den ersten beiden N-Acetylglucosaminresten
(Chitobiose) N-glycosidisch gebundener Zucker, wobei ein N-Acetylglucosaminrest am Protein
verbleibt. Die Spezifität der Endo H beschränkt sich auf Mannose-reiche Oligosaccharide, komplexe
Oligosaccharide können von dem Enzym nicht gespalten werden. Möglicherweise ist dies der Grund
für die fehlgeschlagene Deglycosylierung.
In Westernblots mit dem Lektin PSA (bindet spezifisch an terminale α-D-Mannosereste,
α-D-Glucosereste und fucosylierte Kernregion von bi- und triantennären N-Glycanen) und dem
monoklonalen anti-IPSE-Antikörper wurde die Glycosylierung des HEK-IPSE-Monomers und
-Dimers näher untersucht. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgendes Modell für die Glycosylierung
ableiten wie es in Abbildung 5.1 dargestellt ist. Betrachtet man nur das HEK-IPSE-Monomer, so ist
dieses an bis zu drei Stellen glycosyliert. Da die Aminosäuresequenz von IPSE nur zwei potentielle
N-Glycosylierungsstellen aufweist, müsste eine Glycosylierung O-glycosidisch gebunden sein. Da in
der SDS-PAGE keine Bande zu sehen ist, die zwar von dem monoklonalen Antikörper erkannt wird
aber nicht von dem Lektin, ist davon auszugehen, dass kein Monomer unglycosyliert vorliegt. Aus
diesen drei verschieden bezuckerten Monomeren (einfach, zweifach oder dreifach glycosyliert) lassen
sich theoretisch sechs verschiedene Dimere mit fünf unterschiedlichen Bezuckerungsgraden bilden.
Tatsächlich sind in der SDS-PAGE die üblichen vier Banden zu erkennen, das Lektin erkennt jedoch
111

Diskussion
Abbildung 5.1: Modell zur potentiellen Glycosylierung von HEK-IPSE
112

Diskussion
auch noch schwach eine höhermolekulare Form, so dass alle Bezuckerungsgrade auch nachweisbar
sind. Durch die unterschiedlichen Glycosylierungsformen sind auch die breiten Peaks im MALDI-
TOF-Massenspektrum zu erklären.
Natürliches IPSE ist ebenfalls glycosyliert. Die Glycostruktur wurde von Wuhrer et al. (Paper
eingereicht) über massenspektroskopische Methoden aufgeklärt. Demzufolge nach sind in 70 % der
Homodimere alle vier N-Glycosylierungsstellen besetzt und in den restlichen sind drei Stellen besetzt.
Wie auch HEK-IPSE ist natürliches IPSE ebenfalls gut löslich. Dies beruht wahrscheinlich auf dem
hydrophilen Charakter der Glycosylierungen. Dies erklärt auch die Tatsache, warum nicht
glycosyliertes E. coli-IPSE sehr schlecht löslich ist.
Für die Funktion von IPSE bezüglich der Basophilenaktivierung spielen Glycosylierungen keine
Rolle, da auch nicht glycosyliertes E. coli-IPSE zu einer IL-4-Freisetzung führt. Dennoch ist für
weitere Untersuchungen zu berücksichtigen, dass Glycosylierungen einen Einfluss z. B. auf andere
Immunzellen haben können. So wurde beschrieben, dass die Kohlenhydrate im SmEA, wie die Lacto-
N-fucopentaose III (LNFP III), für eine Th2-Induktion in vivo verantwortlich sein können (Okano et
al. 2001).
5.2.1.7 Kristallisation
Die Glycosylierung eines Proteins ist bei der Kristallisation eher hinderlich, da durch die
Glycostrukturen zusätzliche Heterogenität entsteht, die die Ordnung eines Kristalls stört. Dennoch ist
die Kristallisation von Glycoproteinen prinzipiell möglich (Huang et al. 2005). Daher und weil die
Behandlung mit PNGase F nur zu einer partiellen Deglycosylierung geführt hat, wurde zunächst
glycosyliertes HEK-IPSE eingesetzt. Für die Kristallisation ist der Punkt der Übersättigung
ausschlaggebend, bei dem sich Kristalle formen können. Diese Übersättigung wird beeinflusst von der
Proteinkonzentration, der Art und der Konzentration des Fällungsmittels, der Ionenstärke, der
Temperatur und dem pH-Wert. Die Proteinkonzentration sollte möglichst hoch sein, damit die
Übersättigung erreicht werden kann. Aus diesem Grund war die gute Löslichkeit von HEK-IPSE für
diese Art der Untersuchung vorteilhaft. HEK-IPSE wurde in einer Konzentration von 13 mg/ml und
22 mg/ml eingesetzt. Die weiteren Parameter wurden in den unterschiedlichen Konditionen variiert,
lediglich die Temperatur wurde konstant gehalten.
Ein Kristallisationsexperiment konnte im Laufe der Arbeit abgeschlossen werden, ohne dass ein
Kristall gewachsen ist. Aus den unterschiedlichen Konditionen lassen sich folgende Tendenzen
ablesen: Die meisten präkristallinen Formen in Form von Phasentrennungen konnten in Konditionen
mit Polyethylenglycol (PEG) 4000, PEG 8000 und PEG 10000 als Präzipitans gefunden werden;
HEK-IPSE präzipiert in fast allen Konditionen in denen Tris-HCl verwendet wird; mit
Ammoniumsulfat als Präzipitans sind sehr große Proteinpräzipitate beobachtet worden; in Salz- und
Alkohol-basierten Konditionen ist es größtenteils zu kleineren Präzipitaten gekommen oder die
113

Diskussion
Lösung ist klar geblieben; des Weiteren wurden eine Reihe von präkristallinen Formen in Konditionen
mit 2-Methyl-2,4-pentadiol (MPD) als Fällungsmittel gefunden. Da PEG auch selbst zu
Phasentrennungen führen kann (Dr. J. Müller-Dieckmann, EMBL Hamburg, persönliche Mitteilung),
ist in diesen Konditionen unklar, ob die präkristallinen Formen tatsächlich auf das Protein
zurückzuführen sind. E. coli-IPSE, das bei pH 4,0 zurückgefaltet worden und sehr gut löslich ist,
wurde in einem parallel angesetzten Kristallisationsexperiment mit den gleichen Konditionen versetzt
(durchgeführt von A. Gronow, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel). Hier zeigten
sich in lediglich vier Konditionen Phasentrennungen, während in den übrigen das Protein aus der
Lösung präzipitiert ist. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass E. coli-IPSE sobald es in Lösungen mit
neutralem pH-Wert gebracht wird, sehr schlecht löslich ist und für die Kristallisation nur bedingt
geeignet ist.
In einem zweiten Kristallisationsexperiment werden zurzeit 816 weitere Konditionen im
Hochdurchsatzverfahren untersucht (durchgeführt von Dr. J. Müller-Dieckmann am EMBL,
Hamburg). Die Ergebnisse hierfür stehen noch aus. Als Tendenz lässt sich jedoch wieder feststellen,
dass E. coli-IPSE sehr leicht aus den Lösungen präzipitiert und somit nicht mehr für die Kristallisation
einsetzbar ist.
5.3.1 Expression von IPSE in High Five-Zellen
5.3.1.1 Expression
Neben den CHO-Zellen und 293 HEK-Zellen zählen Insektenzellen mit zu den wichtigsten
eukaryotischen Expressionssystemen. Ursprünglich wurden die Insektenzellen mit rekombinanten
Baculoviren, die die DNA für das gewünschte Protein tragen, infiziert und somit auch transfiziert. Der
Nachteil dieser virus-basierten Expressionssysteme ist, dass die Insektenzellen durch die Infektion
lysieren. Somit ist keine kontinuierliche Expression des rekombinanten Proteins möglich (Garon
1999). Durch die Lyse werden verstärkt Proteasen freigesetzt, die das exprimierte Protein degradieren
können. Des Weiteren sind während der Lyse einige intrazelluläre Stoffwechselwege inhibiert, z. B.
die Sekretion, so dass die Ausbeute des rekombinanten Proteins herabgesetzt und die
posttranslationalen Modifikationen unvollständig sein können. Dennoch können über diese Prozedur
abhängig von dem jeweiligen Protein Ausbeuten von mehreren Milligramm pro Liter Kulturansatz
erzielt werden (Taylor et al. 2006, Cody et al. 2005). Die virusfreie Transfektion umgeht diese
Nachteile und den hohen Arbeitsaufwand der Virusamplifikation. Daher wurden in der vorliegenden
Arbeit High Five-Zellen mit den Vektoren pIB/V5-His-IPSE (High Five-IPSE mit V5-His-Tag) und
pIB-IPSE (High Five-IPSE ohne V5-His-Tag) über das Lipotransfektionsmittel Cellfectin transfiziert.
High Five-Zellen sind eine Zellline von Eizellen von Trichoplusia ni, die sich gegenüber den
üblicherweise verwendeten Sf9- und Sf21-Zelllinien von Spodoptera frugiperda durch höhere
114

Diskussion
Expressionsraten auszeichnet. Die Transfektionrate wurde über einen parallelen Transfektionsansatz
mit dem pIZT/V5-His-Plasmid ermittelt, bei dem transfizierte Zellen durch die Expression von GFP
unter dem Fluoreszenzmikroskop grün leuchten. Demzufolge konnte zwar eine gute
Transfektionseffizienz erreicht werden, dennoch war nach vier Tagen im Kulturüberstand und in den
Zellen über einen Westernblot kein IPSE nachweisbar. In dem sensitiveren Basophilenassay konnte
jedoch bereits nach zwei Tagen in den Kulturüberständen eine IL-4-induzierende Aktivität
nachgewiesen werden, die auf Anwesenheit von IPSE in den Kulturüberständen zurückzuführen ist.
Die transfizierten Zellen wurden über Zugabe von Blasticidin selektioniert und stabile Zelllinien
etabliert.
5.3.1.2 Aufreinigung
Es wurden zwei unterschiedliche IPSE-Konstrukte exprimiert: High Five-IPSE mit V5-His-Tag und
High Five-IPSE ohne V5-His-Tag. Das Konstrukt ohne den Fusionsanteil zeigte eine leicht bessere
Expressionsrate. Da es ohne den His-Tag nicht für die IMAC einsetzbar ist, wurde es nur über einen
Reinigungsschritt aufgereinigt. Dies führte wie auch bei HEK-IPSE zu einem nicht befriedigenden
Ergebnis. Aus diesem Grund wurde lediglich High Five-IPSE mit V5-His-Tag weiter kultiviert. Dies
führt über das für HEK-IPSE etablierte Aufreinigungsprotokoll zu reinem Material. Lediglich im
Bereich von 60 kD ist noch eine weitere schwache Bande identifizierbar. Im Gegensatz zu HEK-IPSE
werden die High Five-Zellen in einem serumfreien Medium kultiviert. Das bedeutet, dass der
Fremdproteinanteil in diesem Medium deutlich geringer ist und der spezifische Proteinanteil somit vor
der Reinigung deutlich höher ist. Der Nachteil dieses Mediums liegt darin, dass in dem Medium
Komponenten enthalten sind, die zu einer Auswaschung der Ni 2+ -Ionen von der Agarosematrix führen
würden. Diese müssen vor der Aufreinigung durch Dialyse entfernt werden. Dieser zusätzliche Schritt
macht ein upscaling der Kultur sehr aufwändig.
5.3.1.3 Ausbeute
Die Ausbeute aus dem High Five-Zellsystem liegt mit ca. 50 µg pro Liter Kulturüberstand deutlich
unter der des 293 HEK-Zellexpressionssystems. In den 293 HEK-Zellen konnte vier bis zehn Mal
mehr rekombinantes Protein gewonnen werden. Auch verglichen mit den Literaturdaten, in den
Ausbeuten von mehreren Milligramm aus einem Liter Kulturüberstand erzielt worden sind (z. B.
1-5 mg humanes IL-6, Garon 1999; 9 mg humanes GM2-Aktivatorprotein, Wendeler et al. 2003) ist
die Ausbeute sehr gering. Dies könnte unter Umständen daran liegen, dass anstelle eines Insektenspezifischen
das IPSE-eigene Signalpeptid für die Sekretion des Proteins in den Kulturüberstand
verwendet worden ist. Signalpeptide weisen zwar keine konservierte Konsensussequenz auf, zeichnen
sich aber durch ähnliche Eigenschaften aus (13 bis 36 Aminosäuren Länge, eine positive Aminosäure
115

Diskussion
am N-Terminus, hydrophober Kern) und sind größtenteils selbst zwischen Bakterien und humanen
Zellen übertragbar (Baker et al. 1996). Dass selbst ein wurmspezifisches Signalpeptid von
Insektenzellen erkannt wird, zeigt sich dadurch, dass IPSE in den Kulturüberstand sekretiert wurde
und nur geringe Mengen im Zelllysat nachzuweisen waren (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise ist
die Effizienz der Expression aber durch das zellfremde Signalpeptid herabgesetzt. Dies könnte durch
die Verwendung eines Sekretionsvektor mit einem Insekten-Signalpeptid umgangen werden, z. B.
durch den Einsatz des häufig verwendeten Honigbienen-Melittin-Sekretionssignals.
5.3.1.4 Struktur
High Five-IPSE wird von den Insektenzellen in etwa gleichen Teilen als Dimer und als Monomer
exprimiert. Wie bereits erwähnt ist wahrscheinlich nur das Dimer funktionell aktiv. Um reines
funktionelles Protein zu gewinnen, müsste bei diesem IPSE-Molekül nach der Reinigung noch das
Dimer von dem Monomer abgetrennt werden. Dies stellt einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt dar
und würde die Ausbeute weiter verringern. Das Dimer zeigt in der SDS-PAGE ein apparentes
Molekulargewicht von ca. 35 kD und weist drei unterschiedliche Glycosylierungsbanden auf.
Verglichen mit HEK-IPSE scheint der Glycoanteil bei High Five-IPSE geringer zu sein. Aufgrund der
geringen Ausbeute konnte jedoch weder das genaue Molekulargewicht über MALDI-TOF-MS
ermittelt noch die Glycostruktur genauer untersucht werden.
5.4 Funktionelle Charakterisierung
Für die weitere Verwendung des in 293 HEK-Zellen und High Five-Zellen exprimierten IPSE, ist es
von entscheidender Bedeutung, ob dieses Material auch die gleiche Aktivität zeigt, wie natürliches
IPSE und das E. coli-IPSE. Erste Hinweise, dass sowohl HEK-IPSE als auch High Five-IPSE zu einer
IL-4-Freisetzung aus humanen Basophilen führen, konnten über die Expressionskinetiken des
jeweiligen Materials gewonnen werden. Da dieses Material nicht rein vorlag, konnten keine
Rückschlüsse auf den Konzentrationsbereich geschlossen werden, in dem HEK-IPSE bzw. High Five-
IPSE aktiv sind. In vergleichenden Untersuchungen von aufgereinigtem Material zeigte sich jedoch,
dass die Kurven von HEK-IPSE und natürlichem IPSE parallel verlaufen und somit die gleiche IL-4-
Freisetzungskapazität besitzen. Auch die Kurve von E. coli-IPSE weist einen ähnlichen Verlauf auf.
Lediglich High Five-IPSE zeigte in allen Experimenten eine nach rechts verschobene Kurve. Das
bedeutet, dass die Aktivität in etwa um den Faktor fünf niedriger als die der übrigen IPSE-Proteine ist.
Dieser Aktivitätsunterschied könnte zum Teil darauf zurückzuführen sein, dass High Five-IPSE
ungefähr zu gleichen Teilen aus Monomer und Dimer besteht. Da der Monomeranteil nach bisherigen
116

Diskussion
Erkenntnissen inaktiv ist, ist ein Teil des eingesetzten Materials somit nicht aktiv. Dennoch erklärt
dies nicht den relativ großen Aktivitätsunterschied. Unter Umständen weist das High Five-IPSE in
einigen Bereichen nicht die richtige Faltung auf oder durch die Glycosylierung ist die Bindungsstelle
für Immunglobuline sterisch nicht zugänglich.
In Zytospinpräparaten konnte gezeigt werden, dass es durch Stimulation mit HEK-IPSE, High Five-
IPSE und E. coli-IPSE nicht nur zur IL-4-Freisetzung kommt, sondern die Basophilen dabei in
gleicher Weise degranulieren wie nach Stimulation mit SmEA, das natürliches IPSE enthält. Die
Degranulation und damit die Histamin-Freisetzung ist ein Vorgang der normalerweise nach 30 bis
45 Minuten abgeschlossen ist (Kagey-Sobotka et al. 1981). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte
bereits nach 45 Minuten eine Degranulation in den stimulierten Ansätzen beobachtet werden. Da die
Granula sich in frisch präparierten Basophilen häufig nur schlecht anfärben lassen, wurden auch
längere Stimulationszeiten eingesetzt, um den Unterschied zwischen granulierten und degranulierten
Zellen deutlicher hervorzuheben.
Auch die IgE-Abhängigkeit der Basophilenaktivierung durch IPSE konnte für HEK-IPSE in
Strippingexperimenten bestätigt werden. Dabei konnte erstmals über FACS-Experimente mit
gestrippten und nativen Basophilen gezeigt werden, dass IPSE tatsächlich an die Oberfläche der
Basophilen bindet. Die Bindung des biotinylierten HEK-IPSEs bzw. des biotinylierten anti-IgEs
wurde über PE-konjugiertes Streptavidin nachgewiesen. Anhand der Fluoreszenz ist der Unterschied
der Bindung von HEK-IPSE zwischen gestrippten und nativen Basophilen zwar nicht so ausgeprägt
wie bei der Positivkontrolle mit anti-IgE. Dies kann jedoch entweder auf ein unterschiedliches
Ausmaß an Biotinylierung oder auf unterschiedliche Affinitäten von HEK-IPSE und anti-IgE
zurückzuführen sein.
Ebenfalls in FACS-Experimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl durch anti-IgE wie auch HEK-
IPSE der Aktivierungsmarker CD203c für Basophile hochreguliert wird. CD203c ist die
Ektonukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 3 (E-NPP 3), die in Basophilen sowohl
intrazellulär wie auch an der Oberfläche lokalisiert ist (Bühring et al. 2003). Bei Aktivierung der
Basophilen durch Quervernetzung des membranständigen IgEs durch anti-IgE oder Allergene wird die
Menge an membranständigem CD203c von den Zellen hochreguliert (Hauswirth et al. 2002). Die
Hochregulierung korreliert dabei mit der Mediatorfreisetzung. Verglichen mit CD63, einem weiteren
häufig eingesetzten Aktivierungsmarker für Basophile, zeichnet sich CD203c durch eine deutlich
höhere Sensitivität aus (Boumiza et al. 2003). Mit HEK-IPSE wurde die Hochregulierung von
CD203c erstmals für IPSE nachgewiesen. Es ist aber davon auszugehen, dass auch natürliches IPSE
und die weiteren rekombinanten IPSEs die gleiche Eigenschaft zeigen, da auf den Basophilen alle
IPSE-Proteine zu einer Mediatorfreisetzung führen. Um ausschließen zu können, dass die Fixierung
der Basophilen Einfluss auf die Bindung des PE-konjugierten anti-CD203c-Antikörpers hat, wurde ein
Teil der nativen Basophilen, die mit HEK-IPSE inkubiert worden sind, anschließend fixiert und im
117

Diskussion
FACS vermessen. Diese Kurve verläuft parallel zu der Kurve der nativen Basophilen. Das bedeutet,
die Fixierung hat keinen Einfluss auf die Bindung des Antikörpers.
Neben der IL-4-induzierenden Aktivität zeichnet sich IPSE dadurch aus, dass es ein Immunglobulinbindender
Faktor ist. Zwar verläuft die Aktivierung der Basophilen über Bindung an IgE, dennoch
bindet IPSE auch an IgG, IgM und IgA (Blindow 2004). Diese Eigenschaft konnte auch für HEK-
IPSE und High Five-IPSE im Westernblot in Bezug auf IgE und IgG nachgewiesen werden. Im
Westernblot scheint IgE eine höhere Affinität zu HEK-IPSE zu haben und IgG eine höhere Affinität
zu High Five-IPSE. Da jedoch unterschiedliche Nachweissysteme verwendet werden mussten, kann
über Bindungsaffinitäten keine Aussage gemacht werden.
Bei der Untersuchung der Funktionalität von HEK-IPSE und High Five-IPSE konnten keine
gravierenden Unterschiede zu natürlichem IPSE und E. coli-IPSE festgestellt werden, da es in gleicher
Weise Basophile aktiviert, so dass diese degranulieren und IL-4 freisetzen, lediglich High Five-IPSE
zeigt eine schwächere IL-4-Freisetzungskapazität. Des Weiteren binden beide rekombinanten
eukaryotischen IPSE-Präparationen an Immunglobuline.
Der Mechanismus der Basophilenaktivierung durch IPSE ist noch nicht geklärt. Nach dem bisherigen
Kenntnisstand scheint IPSE die Basophilen jedoch anders als anti-IgE und Allergene nicht über eine
Quervernetzung des FcεRI-gebundenen IgEs zu aktivieren, sondern vielmehr über Bindung von
wahrscheinlich zwei IPSE-Molekülen an ein IgE-Molekül. Durch eine Konformationsänderung könnte
so ein Signal in das Innere der Zelle geleitet werden (Blindow 2004). Ein wichtiger Bestandteil für die
Hypothese, dass es sich nicht um eine Quervernetzung handelt, waren neben BIACORE-Daten
Ergebnisse aus Doppelimmunodiffusions-Assays. Bei diesem Assay liegen im Gegensatz zu
Sandwich-Blot-Experimenten beide Reaktionspartner in gelöster Form vor und können frei im
Agarosegel diffundieren. Da E. coli-IPSE schlecht löslich ist, ist eine erhebliche Menge an IPSE im
Auftragsloch präzipitiert. Aus diesem Grund konnte keine Aussage über die tatsächlich im Gel
diffundierende Menge gemacht werden. Dieses Experiment wurde daher mit dem gut löslichen HEK-
IPSE nachvollzogen. Tatsächlich zeigen sich keine Präzipitate im Auftragsloch. Aber obwohl ein sehr
weiter Konzentrationsbereich sowohl von HEK-IPSE als auch von IgE bzw. IgG ausgetestet worden
ist, konnten keine Präzipitatlinien beobachtet werden, die auf eine Quervernetzung hätten schließen
lassen. Wird IgE bzw. IgG in sehr hohen Konzentrationen eingesetzt, so zeigen sich zwar
wolkenartige Präzipitate, diese sind aber nur auf Präzipitate des Immunglobulins selbst
zurückzuführen, da diese Präzipitate auch zu sehen sind, wenn statt HEK-IPSE nur Puffer aufgetragen
wird.
Das bedeutet, dass auch mit HEK-IPSE keine Quervernetzung der Immunglobuline nachgewiesen
werden kann. Dies untermauert die Hypothese, dass die Aktivierung der Basophilen durch IPSE auf
einen neuartigen Mechanismus zurückzuführen ist, der ohne Quervernetzung der IgE-Moleküle
funktioniert.
118

Diskussion
5.5 Vergleich der Expressionssysteme
Ziel dieser Arbeit war es, ein Expressionssystem zu finden, in dem IPSE rekombinant in ausreichender
Menge exprimiert wird, um die Struktur von IPSE aufzuklären und den Mechanismus der Wirkung
von IPSE auf Basophile weiter untersuchen zu können. Über E. coli-IPSE konnten schon viele
wichtige Erkenntnisse über das Bindungsverhalten gewonnen werden (Blindow 2004), doch viele
Untersuchungen, wie zum Beispiel Ultrazentrifugation und titrative Mikrokalorimetrie zur Aufklärung
der Stöchiometrie, scheiterten an der geringen Konzentration des Materials. Gerade für die
Strukturaufklärung über Kristallisation wäre E. coli theoretisch ein geeignetes Expressionssystem, da
durch die fehlende Glycosylierung sehr homogenes Material gewonnen werden kann. Dennoch wird
IPSE in E. coli unter jeglichen ausgetesteten Expressionsbedingungen in inclusion bodies in der Zelle
abgelegt. Wilkinson und Harrison (1991) haben einen Algorithmus für die Vorhersage der Löslichkeit
eines Proteins bei der Überexpression in E. coli entwickelt. In diesen Algorithmus gehen die
Nettoladung, der Anteil an turn-bildenden Aminosäuren, der Anteil an Cysteinen und Prolinen, die
Hydrophobizität und die Gesamtanzahl der Aminosäuren ein, wobei die ersten beiden Parameter den
größten Einfluss auf die inclusion body-Bildung haben. IPSE bildet nach diesem Algorithmus bei der
Überexpression mit einer Wahrscheinlichkeit von 83 % inclusion bodies [5]. Dies unterstützt den
Befund, dass E. coli kein geeignetes Expressionssystem für die Expression von IPSE ist. Der einzige
vielversprechende Ansatz ist die Expression von TRX-IPSE, wenn sich in zukünftigen
Untersuchungen herausstellen sollte, dass TRX-IPSE in MES-Puffer nicht präzipitiert und sich der
TRX-Anteil über die Enterokinase entfernen ließe.
In den Insektenzellen konnte IPSE hingegen löslich und in aktiver Form gewonnen werden. Dieses
System hat jedoch mehrere Nachteile. Zum einen ist die Ausbeute sehr gering und der Anteil an nicht
dimerisiertem IPSE ist relativ groß. Zum anderen ist das Medium zur Kultivierung sehr teuer und ein
upscaling der Kultur ist dadurch erschwert, dass der Kulturüberstand vor der Aufreinigung dialysiert
werden muss.
Die 293 HEK-Zellen exprimieren dagegen IPSE mit einer guten Ausbeute, die möglicherweise noch
gesteigert werden kann. Die Handhabung der Zellen ist einfach und das Medium ist kostengünstiger
als das für High Five-Zellen. Wie auch High Five-IPSE kann HEK-IPSE über ein zweistufiges
Reinigungsprotokoll aufgereinigt werden. Da HEK-IPSE fast ausschließlich in dimerisierter Form
exprimiert wird, entfällt hier ein weiterer Reinigungsschritt, der das inaktive Monomer von dem
aktiven Dimer trennt. HEK-IPSE zeigt die gleiche Funktionalität wie natürliches IPSE, d. h. es bindet
Immunglobuline und aktiviert Basophile zur IL-4-Freisetzung. Aus diesem Grund ist es geeignet
natürliches IPSE in weiteren Untersuchungen zu ersetzen. HEK-IPSE kann in ausreichender Menge
gewonnen werden, so dass es möglich ist auch in vivo-Studien damit zu betreiben. Zurzeit wird die
Wirkung von HEK-IPSE in vivo in zwei unterschiedlichen Mausmodellen untersucht. In dem einen
119

Diskussion
Modell wird die Th2-Induktion in so genannten 4get/KN2 IL-4 Doppelreporter-Mäusen untersucht.
Bei diesen Mäusen hat das eine Allel von IL-4 bicistronisch IRES-GFP und exprimiert intaktes IL-4,
das andere Allel besitzt eine Insertion von humanem CD2, das statt IL-4 exprimiert wird. Mit diesem
System kann sowohl die Transkription wie auch die Translation von IL-4 nach Stimulation mit IPSE
untersucht werden (Mohrs et al. 2005). Das zweite Mausmodell ist ein Modell zur Untersuchung von
Multipler Sklerose. Die murine Form der Multiplen Sklerose ist die Experimentelle Autoimmun-
Encephalomyelitis (EAE). Multiple Sklerose und auch EAE sind durch eine starke Th1-Induktion
geprägt. In diesem Modell wird untersucht, ob IPSE als Th2-Induktor die Krankheit abschwächen
kann. Bei allen in vivo-Untersuchungen muss jedoch bedacht werden, dass auch Kohlenhydrate einen
Einfluss auf das Ergebnis haben können und sich die Glycosylierung von HEK-IPSE von der des
natürlichen IPSEs unterscheidet.
Für die Kristallisation wäre es zwar wünschenswert, wenn die Zellen HEK-IPSE nicht glycosylieren
würden, damit das Ausgangsmaterial homogener ist. Dennoch ließen sich aufgrund der guten
Löslichkeit bereits Kristallisationsexperimente ansetzen.
Zur weiteren Untersuchung der Stöchiometrie von IPSE und Immunglobulin wird HEK-IPSE derzeit
in Ultrazentrifugationsexperimenten eingesetzt (durchgeführt von Dr. R. Beavil, King´s College,
London). Auch hierfür werden hohe Konzentrationen an IPSE benötigt, so dass diese Untersuchungen
mit E. coli-IPSE bislang nicht möglich waren.
120

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glycans.
131

Literatur
van Wuytswinkel O, Savino G und Briat JF (1995). Purification and characterization of
recombinant pea-seed ferritins expressed in Escherichia coli: influence of N-terminus
deletions on protein solubility and core formation in vitro. Biochem J. 305 ( Pt 1): 253-261
Yanisch-Perron C, Vieira J und Messing J (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host
strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene. 33(1):103-119
6.2 Zitierte Internetseiten
[1] Ärzte Zeitung Online
http://www.aerzte-zeitung.de/docs/2005/06/22/113a0502.asp?cat=/medizin/allergien
(Stand 19.2.2006)
[2] Expasy - ProtParam
http://www.expasy.org/tools/protparam.html
(Stand 19.2.2006)
[3] EMBL Heidelberg - Improving protein solubility
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/protein_unit/draft_frames/flowchart/exp_e_coli/
Ecoli_solubility.html
(Stand 19.2.06)
[4] EMBL Heidelberg - Expression in E. coli
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/protein_unit/draft_frames/flowchart/exp_e_coli/
Expression_Ecoli.html
(Stand 19.2.06)
[5] University of Oklahoma - Recombinant Protein Solubiliy Prediction
http://www.biotech.ou.edu/
(Stand 19.2.06)
132

Veröffentlichungen
7 Veröffentlichungen
1. Poster und Abstract auf der Tagung „Molecular and cellular biology of helminth parasites“,
Hydra (Griechenland); 6.-11. September 2005:
Manske M, Schramm G, Gronow A, Wicklein D, van der Bosch J, Lindner B, Mamat U, Blindow
S, Kennedy MW, Doenhoff MJ und Haas H (2005). Expression of recombinant glycosylated
IPSE (IL-4-inducing principle of Schistosoma mansoni eggs) in 293 HEK cells.
2. Vortrag und Abstract auf der Tagung „18. Mainzer Allergie Workshop“, Mainz; 10.-11. März
2006:
Wodrich M, Schramm G, Blindow S, Gronow A, Sutton BJ, Weimar T, Gibbs BJ, van der Bosch J,
Wicklein D, Stöcker M und Haas H (2006). Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden
Schistosomen-Ei-Proteins IPSE zur Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der
Basophilenaktivierung.
3. Veröffentlichung:
Wicklein D, Stöcker M, Klockenbring T, Huhn M, Wodrich M, Haas H, Becker WM, Barth S,
Petersen A (Paper eingereicht). In contrast to specific B cells, human basophils are uneffected by
the toxic activity of an allergen-toxin due to lack of internalization of IgE-bound allergen. Clin
Exp Allergy.
133

Danksagung
8 Danksagung
Bei Herrn Prof. Dr. O. Holst möchte ich mich herzlich für die Bereitschaft bedanken, die
Schirmherrschaft für diese Arbeit zu übernehmen.
Herrn PD Dr. H. Haas danke ich für die Betreuung, die interessante Themenstellung, die
Ermöglichung der Teilnahme an Kongressen und die Diskussionsbereitschaft.
Ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. G. Schramm für die hervorragende Betreuung, die Einweisung in
die molekularbiologischen Techniken, die Korrektur dieser Arbeit und die freundliche Atmosphäre,
die sie verbreitet.
Herrn A. Gronow danke ich für die die Hilfe und Unterstützung bei den vielen kleinen Dingen im
Laboralltag und bei der Einführung in die Basophilenaufreinigung.
Herrn Dr. D. Wicklein und Frau M. Böttger danke ich sehr für die Hilfe und das bereitgestellte
Material bei der Bakterien- und 293 HEK-Zellkultur und für die freundliche Atmosphäre. Zusätzlich
möchte ich mich auch bei allen anderen Mitarbeitern der LG Klinische und Molekulare Allergologie
bedanken für die vielen kleinen Hilfestellungen.
Bei Herrn PD Dr. J. van der Bosch bedanke ich mich für die Einführung in die FACS-Analyse und die
Optimierung der 293 HEK-Zellkultivierung sowie den vielen guten Ratschlägen.
Herrn PD Dr. B. Lindner danke ich für die Durchführung der MALDI-TOF-MS-Experimente.
Herrn Dr. P. Zimmermann danke ich für die schnelle und unkomplizierte Hilfestellung bei der
Insektenzellkultur sowie der Bereitstellung der Insektenzellen und Vektoren.
Herrn Dr. J. Müller-Dieckmann danke ich sehr für den engagierten Einsatz bei der Kristallisation in
der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage und seine kompetenten Ratschläge.
Bei allen Mitarbeitern der LG Zelluläre Allergologie, sowie allen Auszubildenden, Bachelorstudenten
und Gastwisschenschaftlern, die mich während meiner Doktorarbeit begleitet haben, möchte ich mich
für die Fröhlichkeit bedanken, die sie im Labor verbreitet haben.
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Danksagung
Bei allen Mitgliedern des Graduiertenkollegs 288 möchte ich mich für den Erfahrungsaustausch und
die vielen netten Stunden bedanken, die wir zusammen hatten, bedanken. Ganz besonderer Dank gilt
Frau Dr. C. Blume, die mich mein ganzes Studium über mit guten Ratschlägen und Hilfe begleitet hat.
Bei allen Blutspendern möchte ich mich für ihre unkomplizierte Spontaneität und natürlich für ihr Blut
bedanken.
Ganz großer Dank gilt meiner Familie für die stete Unterstützung während des gesamten Studiums
und der Anfertigung dieser Arbeit.
Mein ganz besonderer Dank gilt Alex, der in allen Lebenslagen für mich da war, und so zu einem
großen Teil zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
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Lebenslauf
9 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Maren Wodrich, geb. Manske
Geburtsdatum: 14. November 1977
Geburtsort:
Hamburg
Nationalität: deutsch
Familienstand: verheiratet
Schulausbildung
1984-1988 Grundschule Lehmkuhlenweg, Hamburg
1988-1997 Gymnasium Willhöden, Hamburg
Schulabschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
10/1997-12/2002 Studium der Biologie an der Universität Hamburg
Prüfungsfächer: Angewandte Botanik, Biochemie, Mikrobiologie
02/2002-12/2002 Diplomarbeit am Institut für Angewandte Botanik unter der Leitung
von Prof. Dr. R. Lieberei zu dem Thema:
„Charakterisierung der Polyphenoloxidase aus den Blättern von
Theobroma cacao“
Promotion
03/2003-heute
Promotion am Forschungszentrum Borstel in der Laborgruppe
Zelluläre Allergologie unter der Leitung von Dr. H. Haas im Rahmen
des Graduiertenkollegs 288
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