Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Methoden
3 Methoden
3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeiten
3.1.1 Kultur und Lagerung von E. coli
Kurzzeitkultur
Für eine Kurzzeitkultur werden E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten (eventuell mit Antibiotikazusatz)
ausgestrichen und über Nacht im Brutraum bei 37 °C inkubiert. Danach lassen sich die Platten
4 Wochen bei 4 °C lagern, bevor sie erneut ausgestrichen werden müssen.
Übernachtkultur
Für eine Übernachtkultur werden 5 ml LB-Medium (eventuell mit Antibiotikumszusatz) mit einer
Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Brutraum unter Schütteln (225 rpm)
inkubiert.
Langzeitkultur
E. coli-Zellen können bei -80 °C über lange Zeit eingefroren werden. Dafür werden 850 µl einer
Übernachtkultur mit 150 µl sterilem Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
anschließend in -80 °C überführt. Durch leichtes Antauen können die so gelagerten Zellen wieder
ausgestrichen werden.
3.1.2 Transformation von E. coli-Zellen
Die am häufigsten angewendeten Methoden zum Einbringen von DNA in Bakterienzellen sind die
Hitzeschocktransformation und Elektroporation. In der vorliegenden Arbeit wurde die Elektroporation
verwendet, da hier die Transformationseffizienz mit 10 9 bis 10 10 Transformanten pro µg DNA
ungefähr um den Faktor 10 3 höher liegt gegenüber der Hitzeschocktransformation (Sambrook et al.
1989). Bei der Elektroporation wird durch einen Elektroschock die Zytoplasmamembran kurzfristig
permeabilisiert, so dass DNA aus der Umgebung aufgenommen werden kann.
3.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen
Da bei der Elektroporation hohe Stromspannungen eingesetzt werden, müssen die Bakterienzellen in
ein salzfreies Medium überführt werden. Dafür werden 350 ml LB-Medium (ggf. mit Antibiotikum)
mit einer 1:50-Verdünnung einer frischen E. coli-Übernachtkultur angeimpft, bei 37 °C auf einem
Schüttler bis zu einer OD 600 von 1,0 inkubiert und anschließend auf Eis für 20 Minuten abgekühlt. Alle
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