Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Diskussion
Lösung ist klar geblieben; des Weiteren wurden eine Reihe von präkristallinen Formen in Konditionen
mit 2-Methyl-2,4-pentadiol (MPD) als Fällungsmittel gefunden. Da PEG auch selbst zu
Phasentrennungen führen kann (Dr. J. Müller-Dieckmann, EMBL Hamburg, persönliche Mitteilung),
ist in diesen Konditionen unklar, ob die präkristallinen Formen tatsächlich auf das Protein
zurückzuführen sind. E. coli-IPSE, das bei pH 4,0 zurückgefaltet worden und sehr gut löslich ist,
wurde in einem parallel angesetzten Kristallisationsexperiment mit den gleichen Konditionen versetzt
(durchgeführt von A. Gronow, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel). Hier zeigten
sich in lediglich vier Konditionen Phasentrennungen, während in den übrigen das Protein aus der
Lösung präzipitiert ist. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass E. coli-IPSE sobald es in Lösungen mit
neutralem pH-Wert gebracht wird, sehr schlecht löslich ist und für die Kristallisation nur bedingt
geeignet ist.
In einem zweiten Kristallisationsexperiment werden zurzeit 816 weitere Konditionen im
Hochdurchsatzverfahren untersucht (durchgeführt von Dr. J. Müller-Dieckmann am EMBL,
Hamburg). Die Ergebnisse hierfür stehen noch aus. Als Tendenz lässt sich jedoch wieder feststellen,
dass E. coli-IPSE sehr leicht aus den Lösungen präzipitiert und somit nicht mehr für die Kristallisation
einsetzbar ist.
5.3.1 Expression von IPSE in High Five-Zellen
5.3.1.1 Expression
Neben den CHO-Zellen und 293 HEK-Zellen zählen Insektenzellen mit zu den wichtigsten
eukaryotischen Expressionssystemen. Ursprünglich wurden die Insektenzellen mit rekombinanten
Baculoviren, die die DNA für das gewünschte Protein tragen, infiziert und somit auch transfiziert. Der
Nachteil dieser virus-basierten Expressionssysteme ist, dass die Insektenzellen durch die Infektion
lysieren. Somit ist keine kontinuierliche Expression des rekombinanten Proteins möglich (Garon
1999). Durch die Lyse werden verstärkt Proteasen freigesetzt, die das exprimierte Protein degradieren
können. Des Weiteren sind während der Lyse einige intrazelluläre Stoffwechselwege inhibiert, z. B.
die Sekretion, so dass die Ausbeute des rekombinanten Proteins herabgesetzt und die
posttranslationalen Modifikationen unvollständig sein können. Dennoch können über diese Prozedur
abhängig von dem jeweiligen Protein Ausbeuten von mehreren Milligramm pro Liter Kulturansatz
erzielt werden (Taylor et al. 2006, Cody et al. 2005). Die virusfreie Transfektion umgeht diese
Nachteile und den hohen Arbeitsaufwand der Virusamplifikation. Daher wurden in der vorliegenden
Arbeit High Five-Zellen mit den Vektoren pIB/V5-His-IPSE (High Five-IPSE mit V5-His-Tag) und
pIB-IPSE (High Five-IPSE ohne V5-His-Tag) über das Lipotransfektionsmittel Cellfectin transfiziert.
High Five-Zellen sind eine Zellline von Eizellen von Trichoplusia ni, die sich gegenüber den
üblicherweise verwendeten Sf9- und Sf21-Zelllinien von Spodoptera frugiperda durch höhere
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