Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

Ergebnisse Abbildung 4.32: Doppelimmunodiffusionsassays nach Ouchterlony zur Untersuchung der Quervernetzung von IPSE mit Immunglobulinen. Von den beiden Reaktionspartnern ist der erstgenannte auf der linke Seite des Gels in der Mitte platziert und der letztgenannte in den Löchern außen herum in 2er-Verdünnungsstufen von unverdünnt bis 1: 32 (im Uhrzeigersinn). Auf der rechten Seite wurde das Experiment reziprok durchgeführt. Bei dem anti-IPSE-Antikörper handelt es sich um ein polyklonales Kaninchenserum gegen IPSE. Dieses wurde in dem mit * gekennzeichneten Experiment zuvor über eine Protein-G-Säule aufgereinigt und deshalb in einer anderen Konzentration eingesetzt als in Experiment 9). 100
Diskussion 5 Diskussion Das von den Eiern des Pärchenegels Schistosoma mansoni sekretierte Protein IPSE bewirkt eine IL-4- Freisetzung aus humanen Basophilen und stellt somit einen wichtigen potenziellen Immunmodulator in Richtung der Th2-Induktion dar. IPSE ist ein Immunglobulin-bindender Faktor und die Aktivierung der Basophilen ist IgE-abhängig. Zur weiteren Aufklärung des Wirkungsmechanismus auf zellulärer Ebene und für strukturelle Untersuchungen wird IPSE in rekombinanter Form benötigt, da natürliches IPSE nur in sehr geringer Menge im SmEA vorliegt. In dieser Arbeit wurden daher verschiedene Expressionssysteme untersucht, mit dem Ziel eine größtmögliche Menge an funktionell aktivem und löslichem IPSE zu erhalten. Als Expressionssysteme wurden E. coli mit unterschiedlichen Expressionsvektoren, humane 293 HEK-Zellen und Insektenzellen gewählt. 5.1 Expression von IPSE in E. coli 5.1.1 Proteingewinnung über in vitro-Rückfaltung Bakterielle Expressionssyteme haben den generellen Vorteil, dass schnell große Mengen an rekombinantem Protein unter relativ einfachen und kostengünstigen Laborbedingungen gewonnen werden können. Dies wird unter anderem in der pharmazeutischen Biotechnologie ausgenutzt und so seit 1982 große Mengen an rekombinantem Insulin hergestellt (Folkers et al. 2005). Auch IPSE wurde nach Aufklärung der DNA-Sequenz im Vorfeld dieser Arbeit in den Expressionsvektor pPROEX-Htb kloniert und in E. coli-Zellen des Stammes DH5α überexprimiert. Bei dieser Expression wird E. coli-IPSE jedoch nicht in löslicher Form exprimiert, sondern in so genannten inclusion bodies in der Zelle abgelegt. Inclusion bodies sind unlösliche Proteinaggregate, die nicht korrekt gefaltet und somit biologisch inaktiv sind. Diese bilden sich bei hohen intrazellulären Konzentrationen von falsch gefalteten Proteinen oder Faltungsintermediaten (Sørensen und Mortensen 2005). Über in vitro Rückfaltungsstrategien können aus solchen Proteinaggregaten dennoch biologisch aktive Proteine gewonnen werden (Chaudhuri 1994). Die Rückfaltung von Proteinen ist ein zweistufiger Prozess, bei dem zunächst die inclusion bodies unter starken denaturierenden Bedingungen gelöst und anschließend in einem physiologischen Puffer zurückgefaltet werden. Die Rückfaltung von gelöstem Protein zu gefaltetem Protein verläuft über einen Übergangszustand, der sich durch partielle Faltungsstrukturen mit einem geringen Anteil von Sekundärstruktur auszeichnet. Der kritische Schritt bei der Rückfaltung ist die Entstehung von nativem, gefaltetem Protein aus diesem Übergangszustand, denn auch hier können sich statt nativem Protein erneut Aggregate bilden. Wichtig dabei ist, dass die Konzentration an denaturiertem Protein möglichst gering gehalten wird. 101
Seite 1 und 2:
Aus dem Forschungszentrum Borstel L
Seite 3 und 4:
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichn
Seite 5 und 6:
Inhaltsverzeichnis 3.6 Reinigung vo
Seite 7 und 8:
Inhaltsverzeichnis 5 Diskussion ...
Seite 9 und 10:
Abkürzungsverzeichnis LB Luria-Bro
Seite 11 und 12:
Zusammenfassung Reinheit aufreinige
Seite 13 und 14:
Einleitung Bei dem Pärchenegel Sch
Seite 15 und 16:
Einleitung des Zytokins noch nicht
Seite 17 und 18:
Einleitung antigenspezifischer und
Seite 19 und 20:
Einleitung Die Eier sind auch das S
Seite 21 und 22:
Einleitung 1.7 Ziel dieser Arbeit T
Seite 23 und 24:
Materialien Produkt Fötales Rinder
Seite 25 und 26:
Materialien 2.2 Häufig verwendete
Seite 27 und 28:
Materialien 2.3 Antibiotika Folgend
Seite 29 und 30:
Materialien • pIB anti XhoI 5´AT
Seite 31 und 32:
Materialien 2.7 Zelllinien 2.7.1 Ba
Seite 33 und 34:
Methoden folgenden Zentrifugationss
Seite 35 und 36:
Methoden 3.1.6 Polymerase-Ketten-Re
Seite 37 und 38:
Methoden 3.1.11 Restriktion von DNA
Seite 39 und 40:
Methoden 3.2 Expression von IPSE in
Seite 41 und 42:
Methoden Probe: 1 ml MBP-IPSE (11,7
Seite 43 und 44:
Methoden mit HEK-Medium mit 100 µg
Seite 45 und 46:
Methoden zugegeben. Für 4 h werden
Seite 47 und 48:
Methoden Anschließend wird die Sä
Seite 49 und 50:
Methoden 3.7.2 Dialyse von Proteinl
Seite 51 und 52: Methoden 3.7.4 Färbung von Polyacr
Seite 53 und 54: Methoden Für den luftblasenfreien
Seite 55 und 56: Methoden 3.8 Methoden zur Untersuch
Seite 57 und 58: Methoden normalen Umständen nicht
Seite 59 und 60: Methoden 3.9 Methoden zur Untersuch
Seite 61 und 62: Methoden Medium zur Stimulation der
Seite 63 und 64: Methoden 3.9.6.2 Nachweis von CD203
Seite 65 und 66: Ergebnisse A) B) Abbildung 4.1: Klo
Seite 67 und 68: Ergebnisse A) B) Abbildung 4.3: Klo
Seite 69 und 70: Ergebnisse Abbildung 4.5: Einfluss
Seite 71 und 72: Ergebnisse Abbildung 4.7: Aufreinig
Seite 73 und 74: Ergebnisse Des Weiteren wurde IPSE
Seite 75 und 76: Ergebnisse 4.2 Expression von IPSE
Seite 77 und 78: Ergebnisse 4.2.1.3 HEK-IPSE kann ü
Seite 79 und 80: Ergebnisse A) B) C) Abbildung 4.14:
Seite 81 und 82: Ergebnisse 4.2.2 Strukturelle Unter
Seite 83 und 84: Ergebnisse Bedingungen durchgeführ
Seite 85 und 86: Ergebnisse A) B) Abbildung 4.18: De
Seite 87 und 88: Ergebnisse Abbildung 4.19: Kristall
Seite 89 und 90: Ergebnisse 4.2.3.2 Das Expressionso
Seite 91 und 92: Ergebnisse A) B) Abbildung 4.22: Fr
Seite 93 und 94: Ergebnisse 4.2.3.4 High Five-IPSE i
Seite 95 und 96: Ergebnisse 4.3.2 Die IL-4-Freisetzu
Seite 97 und 98: Ergebnisse Die Basophilen wurden ü
Seite 99 und 100: Ergebnisse 4.3.5 HEK-IPSE und High
Seite 101: Ergebnisse 4.3.6 HEK-IPSE führt ni
Seite 105 und 106: Diskussion 5.1.2 Strategien zur Gew
Seite 107 und 108: Diskussion wurde, dass der Proteina
Seite 109 und 110: Diskussion diesem Grund wurde der T
Seite 111 und 112: Diskussion Teil der kontaminierende
Seite 113 und 114: Diskussion und die zweifach protoni
Seite 115 und 116: Diskussion auch noch schwach eine h
Seite 117 und 118: Diskussion Expressionsraten auszeic
Seite 119 und 120: Diskussion Erkenntnissen inaktiv is
Seite 121 und 122: Diskussion 5.5 Vergleich der Expres
Seite 123 und 124: Literatur 6 Literatur 6.1 Literatur
Seite 125 und 126: Literatur Coombs RRA und Gell PGH (
Seite 127 und 128: Literatur Hancock K und Tsang VC (1
Seite 129 und 130: Literatur Maizels RM und Yazdanbakh
Seite 131 und 132: Literatur Randall LL, Topping TB un
Seite 133 und 134: Literatur Taylor AL, Haze-Filderman
Seite 135 und 136: Veröffentlichungen 7 Veröffentlic
Seite 137 und 138: Danksagung Bei allen Mitgliedern de
Alle anzeigen

Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?