Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Ergebnisse
4.2.3.3 High Five-IPSE kann über zwei Schritte aufgereinigt werden
High Five-IPSE wurde nach derselben Reinigungsstrategie aufgereinigt wie HEK-IPSE. Als erster
Reinigungsschritt wurde der Überstand über eine IMAC aufgereinigt. Hierfür konnte nur der
Überstand aus der Expression von High Five-IPSE mit V5-His-Tag eingesetzt werden, da High Five-
IPSE ohne den Histidin-Tag nicht an die Ni 2+ -Ionen binden kann. Für die IMAC wurde der
Kulturüberstand gegen PBS dialysiert, da nach Herstellerangaben in dem serumfreien Insektenzell-
Medium nicht näher bestimmte Komponenten enthalten sind, die ein Auswaschen der Ni 2+ -Ionen von
der Säulenmatrix bewirken würden.
In Abbildung 4.22 sind die Fraktionen der Aufreinigung in der silbergefärbten SDS-PAGE und im
Westernblot zu sehen. Der Westernblot, der mit dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper inkubiert
worden ist, zeigt die Lage der High Five-IPSE-Banden an. In den ersten beiden Elutionsfraktionen
sind drei eng beieinander liegende Banden bei ca. 40 kD zu sehen sowie auch zwischen 18 und 23 kD.
Diese Banden sind auch im silbergefärbten Gel zu sehen, jedoch sind zusätzlich noch
Kontaminationen ersichtlich. Das bedeutet, dass das Material weiter aufgereinigt werden muss.
Zur weiteren Aufreinigung wurden die High Five-IPSE enthaltenden Fraktionen vereinigt und über
eine anti-IPSE-Säule affinitätschromatographisch aufgetrennt. Die Chromatogramme der
Aufreinigung sowie die Fraktionen in der silbergefärbten SDS-PAGE sind in Abbildung 4.23
dargestellt. Die beiden Hauptkontaminationsbanden aus der IMAC binden nicht an die Säulenmatrix
und verbleiben im Effluent. In den Elutionsfraktionen sind nur die High Five-IPSE-Banden zu
erkennen. Lediglich eine sehr schwache Bande bei ca. 50 kD verunreinigt noch die High Five-IPSE-
Lösung. Wie auch bei HEK-IPSE reichen diese zwei Reinigungsstufen aus, um reines IPSE-Material
zu erhalten.
Auch der Überstand aus der High Five-IPSE-Expression ohne V5-His-Tag wurde über die
Affinitätschromatographie aufgereinigt. Da hier jedoch durch den fehlenden His-Tag keine
Vorreinigung durchgeführt werden konnte, waren die Elutionsfraktionen nach diesem
Reinigungsschritt noch deutlich verunreinigt. Aus diesem Grund wurde für weitere Expressionen
lediglich High Five-IPSE mit V5-His-Tag verwendet.
Die Expressionsrate der Insektenzellen ist jedoch deutlich geringer als die der HEK-Zellen. Nach
Aufreinigung von zwei Litern Kulturüberstand nach der optimalen Expressionszeit konnten 100 µg
High Five-IPSE gewonnen werden.
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