Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

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4.1 Expression von IPSE in E. coli
Nach Isolierung und Klonierung der cDNA von IPSE in den Expressionsvektor pPROEX-Htb konnte
das Protein bereits erfolgreich in E. coli DH5α als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert werden (im
Folgenden E. coli-IPSE genannt). Dabei wird IPSE jedoch unlöslich in Form von inclusion bodies im
Zytoplasma abgelegt. Die inclusion bodies werden unter denaturierenden Bedingungen in Lösung
gebracht. Nach Aufreinigung über IMAC kann ein Teil des exprimierten Proteins durch chemische
Rückfaltung in eine lösliche und aktive Form überführt werden. Das heißt, das so gewonnene
rekombinante IPSE bindet an Immunglobuline und induziert die IL-4-Freisetzung aus basophilen
Granulozyten wie das natürliche IPSE. Jedoch ist es sehr schlecht löslich und lässt sich nur bis zu
einer Konzentration von 0,15 mg/ml konzentrieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit
zunächst versucht, durch Modifizierung der Expressionsvektoren und -bedingungen IPSE in löslicher
Form in E. coli-Zellen zu exprimieren, um eine Rückfaltung zu umgehen.
4.1.1 Klonierung der Sequenz von IPSE in unterschiedliche Expressionsvektoren
4.1.1.1 pET26-IPSE
Bei dem Vektor pET26(+) handelt es sich um einen kommerziellen Expressionsvektor der Firma
Novagen. Als wichtigste Eigenschaft verfügt der Vektor über eine pelB-Leadersequenz, worüber die
exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum transportiert werden. Das dort herrschende
Milieu ist nicht so reduzierend wie das Zytoplasma und begünstigt somit die Bildung von
Disulfidbrücken und die Faltung von Proteinen. Wie alle Vektoren der pET-Reihe zeichnet sich dieser
Vektor durch einen niedrigen basalen Expressionshintergrund aus. Dies kommt dadurch zustande, dass
das zu exprimierende Gen hinter einen T7-Promotor kloniert wird. Die DNA-Sequenz für die
T7-RNA-Polymerase liegt in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) genomisch vor und ist hinter einen mit
IPTG induzierbaren lac-Promotor geschaltet. Das bedeutet, dass im nicht-induzierten Zustand keine
RNA-Polymerase zum Ablesen des gewünschten Gens vorliegt und so das Protein auch nicht
exprimiert werden kann.
Der Vektor verfügt über einen C-terminalen His 6 -Tag zur Aufreinigung des rekombinanten Proteins.
Die IPSE-Sequenz wurde zunächst wie auch bei allen folgenden Klonierungen in der PCR amplifiziert
und in einen TA-Klonierungsvektor zwischenkloniert. Anschließend wurde das Insert aus dem
Klonierungsvektor über BamHI und HindIII ausgeschnitten und in den Vektor pET26(+) ligiert. Der
Erfolg der Klonierung wurde über Restriktion überprüft und ist in Abbildung 4.1 dargestellt.
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