Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Methoden
3.7.4 Färbung von Polyacrylamidgelen
3.7.4.1 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988)
Die empfindlichste Nachweismethode von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen ist die Silberfärbung, die
nach der Methode von Heukeshoven und Dernick eine Nachweisgrenze von 50 bis 100 pg pro Bande
aufweisen kann. Diese Empfindlichkeit wird jedoch nur selten erreicht, da nicht jedes Protein
gleichermaßen mit dieser Methode angefärbt werden kann. Bei der Silberfärbung bilden Ag + -Ionen
mit Glutamat-, Aspartat- und Cysteinresten Komplexe. Alkalisches Formaldehyd reduziert das Ag + der
Komplexe zu metallischem Silber, das sichtbar ist.
Die Proteine im Gel werden zunächst 15 Minuten in Fixierlösung fixiert und dann für eine Stunde in
thiosulfathaltige Inkubationslösung überführt. Das Gel wird 4 Mal für 5 min in aqua dest. gewaschen
und dann eine halbe Stunde in Silberlösung inkubiert. Nach kurzem Waschen des Gels in aqua dest.
werden die Banden durch Entwicklerlösung bis zur gewünschten Intensität angefärbt. Die Reaktion
wird durch Inkubation in Stopplösung beendet. Zur Konservierung wird das Gel für eine Stunde in
Glycerinlösung überführt und anschließend zwischen zwei Lagen eingeweichter Einmachhaut auf
einer Glasscheibe getrocknet.
Fixierlösung
30 % (v/v) Ethanol
10 % (v/v) Eisessig
Inkubationslösung
30 % (v/v) Ethanol
500 mM Natriumacetat
0,5 % (v/v) Glutardialdehyd
0,3 % (w/v) Natriumthiosulfat
Glutardialdehyd und Natriumthiosulfat werden erst direkt vor Gebrauch zugefügt.
Silberlösung
0,1 % (w/v) Silbernitrat
0,05 % (v/v) Formaldehyd
Die Lösung wird direkt vor Gebrauch frisch angesetzt.
Entwickler
230 mM Natriumcarbonat
0,05 % (v/v) Formaldehyd
Das Formaldehyd wird erst direkt vor Gebrauch zugesetzt.
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