Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...

Ergebnisse
Unter reduzierenden Bedingungen bindet das Lektin an alle drei Banden des glycosylierten Proteins,
die auch in der SDS-PAGE zu sehen sind (vgl. Abbildung 4.15), wohingegen der spezifische
Antikörper nur die beiden unteren Banden erkennt. Beim deglycosyliertem HEK-IPSE erkennt das
Lektin nur noch zwei Banden der ursprünglich drei Banden. Die oberste Glycoform ist folglich
vollständig deglycosyliert worden. Der spezifische Antikörper gegen IPSE erkennt nur noch eine
Bande. Da dieser Antikörper gegen E. coli-IPSE gerichtet ist, welches nicht glycosyliert ist, ist es
möglich, dass die Bindung des Antikörpers durch die Glycosylierung sterisch behindert ist.
4.2.2.5 Kristallisation von HEK-IPSE
Aufgrund der guten Löslichkeit von HEK-IPSE war es mit diesem rekombinanten Material möglich,
zwei Kristallisations-Screening-Experimente durchzuführen. In einem ersten Kristallisationsexperimient
wurde HEK-IPSE in einer Konzentration von 13 mg/ml und einem Volumen von 2 µl
eingesetzt. Über ein Screening-Kit (JBScreen, Firma Jena Biosciences) wurden 240 verschiedenen
Konditionen im „sitzenden-Tropfen-Verfahren“ über Dampfdiffusion ausgetestet. Die einzelnen
Konditionen wurden im Mikroskop in Abständen auf Kristallisationsbildung hin untersucht. Jedoch
hat keine der Konditionen innerhalb von 5 Monaten zu einem Kristall geführt. In 74 Fällen konnte
eine Phasentrennung beobachtet werden. Phasentrennungen sind in der Kristallisation häufig
Vorstufen von Kristallen. Sie stellen Proteintropfen mit einer sehr hohen Proteinkonzentration dar, aus
denen sich potenziell Kristalle bilden können. In 119 Konditionen konnten lediglich Präzipitate von
ausgefallenem Protein beobachtet werden und in 36 Konditionen ist die Lösung klar geblieben. Bei
11 Konditionen konnte keine Beurteilung durchgeführt werden, da sich ein Niederschlag auf der
Abdeckung gebildet hatte, so dass die Sicht durch das Mikroskop getrübt war.
Ein zweites Kristallisationsexperiment wurde mit HEK-IPSE in der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage
des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Hamburg von
Dr. J. Müller-Dieckmann durchgeführt. In der Hochdurchsatzanlage wird über einen Roboter das
Protein mit den jeweiligen Kristallisationskonditionen vermischt. Durch den Roboter ist es möglich
mit sehr kleinen Volumina zu arbeiten. So wurden für jeden Ansatz 200 nl HEK-IPSE mit einer
Konzentration von 22 mg/ml eingesetzt. Es wurden 816 verschiedene Konditionen ausgetestet. Die
Ansätze werden automatisch in regelmäßigen Abständen fotografiert. In Abbildung 4.19 sind
exemplarisch sechs Fotos aus diesem Ansatz gezeigt.
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