Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchung zum Einfluss von ...

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung zum Einfluss von Apoprotein A5 auf
Glukose- und Fettsäurestoffwechsel im genetisch
manipulierten Mausmodell
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae –
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Maina Wehner
Hamburg
Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: 1. PD Dr. Martin Merkel
Asklepios Klinik St. Georg
2. Prof. Dr. Hassan Naim
Institut für Physiologische Chemie
1. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Naim
2. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 25. Mai 2011

INHALT
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................. 6
TABELLENVERZEICHNIS .................................................................................................. 7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................................................ 8
ZIEL DER ARBEIT.................................................................................................................1
1 EINLEITUNG ..................................................................................................... 2
1.1 Lipide .................................................................................................................... 2
1.1.1 Triglyzeride als Reservestoffe .............................................................................. 2
1.1.2 Fettsäuren.............................................................................................................. 2
1.1.2.1 Nomenklatur ......................................................................................................... 2
1.1.2.2 Fettsäuresynthese .................................................................................................. 5
1.1.2.3 Funktion der Fettsäuren ........................................................................................ 8
1.1.2.4 Omega-3 und Omega-6 Fettsäuren in der Nahrung.............................................. 8
1.1.2.5 Klinische Bedeutung der PUFAs .......................................................................... 9
1.2 Lipoproteine........................................................................................................ 10
1.3 Apolipoproteine .................................................................................................. 12
1.3.1 Stoffwechsel der Lipoproteine............................................................................ 14
1.3.1.1 Das exogene Lipidtransportsystem ..................................................................... 14
1.3.1.2 Das endogene Lipidtransportsystem ................................................................... 14
1.3.1.3 Das reverse Cholesterintransportsystem ............................................................. 15
1.3.2 Apolipoprotein A5 .............................................................................................. 16
1.3.3 Adipositas und Diabetes ..................................................................................... 20
1.3.4 Insulinresistenz ................................................................................................... 20
1.3.5 Ursachen der Insulinresistenz ............................................................................. 21
2 MATERIAL UND METHODEN .................................................................... 22
2.1 Material ............................................................................................................... 22
2.1.1 Material PCR....................................................................................................... 22
2.1.2 Material Lipoproteinprofil .................................................................................. 23
2.1.3 Tierexperimentelle Materialien........................................................................... 24
2.1.4 Material Fettsäureextraktion ............................................................................... 24
2.2 Methoden ............................................................................................................ 26
2.2.1 Tierexperimentelle Methoden............................................................................. 26
2.2.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen...................................................................... 26
2.2.1.2 Verwendete Mauslinien ...................................................................................... 26
2.2.1.3 Studiendesign...................................................................................................... 27
2.2.1.4 Nahrungsbestandteile.......................................................................................... 28
2.2.1.5 Oraler Glukosetoleranztest (OGTT) ................................................................... 29
2.2.1.6 Organentnahme ................................................................................................... 29
2.2.1.7 Genotypisierung der Mäuse ................................................................................ 30
2.2.2 Lipoproteinprofil................................................................................................. 34
2.2.3 Cholesterin- und Triglyzeridbestimmung ........................................................... 34
2.2.3.1 Prinzip ................................................................................................................. 34

2.2.3.2 Durchführung...................................................................................................... 35
2.2.4 Fettsäureanalytik ................................................................................................. 35
2.2.4.1 Prinzip der Gewebehomogenisation und Fettsäureextraktion ............................ 35
2.2.4.2 Durchführung...................................................................................................... 36
2.2.4.3 Prinzip der Lipidderivatisierung ......................................................................... 36
2.2.4.4 Durchführung...................................................................................................... 37
2.2.4.5 Prinzip der Gaschromatographie......................................................................... 37
2.2.5 Statistik ............................................................................................................... 39
3 ERGEBNISSE ................................................................................................... 40
3.1 Ergebnisse der Futtermittelanalyse ..................................................................... 41
3.1.1 Standardfutter...................................................................................................... 41
3.1.2 HFD..................................................................................................................... 41
3.2 Ergebnisse Standardfutter ................................................................................... 42
3.2.1 Lipoproteinprofile der Mäuse auf Standardfutter ............................................... 42
3.2.2 Ergebnisse der Fettsäureanalyse auf Standardfutter ........................................... 43
3.2.2.1 Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe auf Standardfutter................................. 43
3.2.2.2 Ergebnisse im Plasma der Mäuse auf Standardfutter.......................................... 43
3.2.2.2.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma.......................................... 44
3.2.2.2.2 Omega-6-Fettsäuren im Plasma.......................................................................... 45
3.2.2.2.3 Omega-3-Fettsäuren im Plasma.......................................................................... 46
3.2.2.3 Ergebnisse in der Leber der Mäuse auf Standardfutter....................................... 47
3.2.2.3.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der Leber....................................... 47
3.2.2.3.2 Omega-6-Fettsäuren in der Leber ....................................................................... 47
3.2.2.3.3 Omega-3-Fettsäuren in der Leber ....................................................................... 48
3.2.2.4 Ergebnisse im Muskel der Mäuse auf Standardfutter ......................................... 49
3.2.2.4.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Muskel ......................................... 49
3.2.2.4.2 Omega-6-Fettsäuren im Muskel.......................................................................... 50
3.2.2.4.3 Omega-3-Fettsäuren im Muskel.......................................................................... 50
3.2.2.5 Ergebnisse im Fettgewebe der Mäuse auf Standardfutter................................... 52
3.2.2.5.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Fettgewebe................................... 52
3.2.2.5.2 Omega-6-Fettsäuren im Fettgewebe ................................................................... 53
3.2.2.5.3 Omega-3-Fettsäuren im Fettgewebe ................................................................... 54
3.3 Ergebnisse Hochfettdiät ...................................................................................... 56
3.3.1 Gewichtsverlauf während der HFD .................................................................... 56
3.3.2 Lipoproteinprofile der Mäuse auf Hochfettdiät .................................................. 57
3.3.3 Blutglukose- und Insulinplasmaspiegel der Mäuse auf HFD ............................. 59
3.3.4 Organgewichte der Tiere auf HFD...................................................................... 62
3.3.5 Ergebnisse der Fettsäureanalyse auf Hochfettdiät .............................................. 63
3.3.5.1 Vergleich Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe .............................................. 63
3.3.5.2 Ergebnisse im Plasma der Mäuse auf HFD ........................................................ 64
3.3.5.2.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma.......................................... 64
3.3.5.2.2 Omega-6-Fettsäuren im Plasma.......................................................................... 65
3.3.5.2.3 Omega-3-Fettsäuren im Plasma.......................................................................... 65
3.3.5.3 Ergebnisse in der Leber der Mäuse auf HFD...................................................... 66
3.3.5.3.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der Leber....................................... 66
3.3.5.3.2 Omega-6-Fettsäuren in der Leber ....................................................................... 67

3.3.5.3.3 Omega-3-Fettsäuren in der Leber ....................................................................... 67
3.3.5.4 Ergebnisse im Muskel der Mäuse auf HFD........................................................ 68
3.3.5.4.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Muskel ......................................... 68
3.3.5.4.2 Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren im Muskel ................................................. 69
3.3.6 Ergebnisse im Fettgewebe der Mäuse auf HFD.................................................. 69
3.3.6.1.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Fettgewebe................................... 69
3.3.6.1.2 Omega-6-Fettsäuren im Fettgewebe ................................................................... 71
3.3.6.1.3 Omega-3-Fettsäuren im Fettgewebe ................................................................... 72
3.3.6.1.4 Gesättigte und einfach ungesättigten Fettsäuren in Plasma und Leber............... 74
4 DISKUSSION.................................................................................................... 77
4.1 Ergebnisse der Studie auf Standardfutter............................................................ 77
4.1.1 Gesamtfettsäuregehalt im Plasma und in den Organen ...................................... 77
4.1.2 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe ........................................................... 78
4.1.3 Omega-6-Fettsäuren............................................................................................ 79
4.1.4 Omega-3-Fettsäuren............................................................................................ 80
4.2 Ergebnisse der Studie auf Hochfettdiät............................................................... 80
4.2.1 Gewichtsverlauf .................................................................................................. 80
4.2.2 Lipide .................................................................................................................. 81
4.2.3 Insulinresistenz ................................................................................................... 81
4.2.4 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe ........................................................... 82
4.2.5 Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren.................................................................... 83
4.3 Methodendiskussion............................................................................................ 85
5 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................. 86
6 SUMMARY ....................................................................................................... 88
7 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................... 90
8 DANKSAGUNG.............................................................................................. 106

ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Alpha-Linolensäure....................................................................................................... 3
Abb. 2: Synthese gesättigter und einfach ungesättigter Fettsäuren............................................ 6
Abb. 3: Omega-3-Stoffwechselweg ........................................................................................... 7
Abb. 4: Omega-6-Stoffwechselweg ........................................................................................... 7
Abb. 5: ApoA5Tg PCR ............................................................................................................ 33
Abb. 6: Anlage zur Gasflüssigkeitschromatographie (aus RICHTER 2003)........................... 38
Abb. 7: Gaschromatogramm (aus RICHTER 2003) ............................................................... 39
Abb. 8: Gesamtfettsäuren Plasma SF (Standardfutter) ............................................................ 44
Abb. 9: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma SF (Standardfutter)......................................... 44
Abb. 10: Omega-6-Vergleich Plasma SF (Standardfutter) ...................................................... 45
Abb. 11: Omega-3-Vergleich Plasma SF (Standardfutter) ...................................................... 46
Abb. 12: Delta-9-Desaturase-Vergleich Leber SF (Standardfutter)......................................... 47
Abb. 13: Omega-6-Vergleich Leber SF (Standardfutter)......................................................... 47
Abb. 14: Omega-3-Vergleich Leber SF (Standardfutter)......................................................... 48
Abb. 15: Delta-9-Desaturase Vergleich Muskel SF (Standardfutter) ...................................... 49
Abb. 16: Omega-6-Vergleich Muskel SF (Standardfutter)...................................................... 50
Abb. 17: Omega-3-Vergleich Muskel SF (Standardfutter)...................................................... 50
Abb. 18: Delta-9-Desaturase Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter).................................... 52
Abb. 19: Delta-9-Desaturase Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)................................... 52
Abb. 20: Omega-6-Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter) ................................................... 53
Abb. 21: Omega-6-Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)................................................... 53
Abb. 22: Omega-3-Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter) ................................................... 54
Abb. 23: Omega-3-Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)................................................... 54
Abb. 24: Gewichtsverlauf HFD ............................................................................................... 56
Abb. 25: Blutglukosekonzentration OGTT.............................................................................. 60
Abb. 26: Relative Veränderung Blutglukosekonzentration OGTT.......................................... 60
Abb. 27: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma HFD.............................................................. 64
Abb. 28: Omega-6-Vergleich Plasma HFD ............................................................................. 65
Abb. 29: Omega-3-Vergleich Plasma HFD ............................................................................. 65
Abb. 30: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma HFD.............................................................. 66
Abb. 31: Omega-6-Vergleich Leber HFD................................................................................ 67
Abb. 32: Omega-3-Vergleich Leber HFD................................................................................ 67
Abb. 33: Delta-9-Desaturase-Vergleich Muskel HFD............................................................. 68
Abb. 34: Delta-9-Desaturase-Vergleich EpiWAT HFD .......................................................... 69
Abb. 35: Delta-9-Desaturase-Vergleich SubWAT HFD.......................................................... 70
Abb. 36: Omega-6-Vergleich EpiWAT HFD .......................................................................... 71
Abb. 37: Omega-6-Vergleich SubWAT HFD.......................................................................... 71
Abb. 38: Omega-6-Vergleich BAT HFD................................................................................. 71
Abb. 39: Gesättigte Fettsäuren Plasma HFD ........................................................................... 74
Abb. 40: Gesättigte Fettsäuren Leber HFD.............................................................................. 74
Abb. 41: einfach ungesättigte Fettsäuren Plasma HFD............................................................ 75
Abb. 42: einfach ungesättigte Fettsäuren Leber HFD.............................................................. 75

TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Auswahl gesättigter, einfach und mehrfach ungesättigter Fettsäuren....................... 4
Tabelle 2: Charakteristika der Lipoproteinklassen (nach SCHWANDT u. PARHOFER 2006).
............................................................................................................................. 11
Tabelle 3: Charakteristika der wichtigsten Apolipoproteine.................................................... 13
Tabelle 4: Cholesterin- und Triglyzeridwerte im Plasma ........................................................ 42
Tabelle 5: Gesamtfettgehalt Plasma gegenüber Gewebe ......................................................... 43
Tabelle 6: Cholesterin- und Triglyzeridwerte in Woche 9 bzw. 10 der HFD.......................... 57
Tabelle 7: Cholesterin- und Triglyzeridwerte in Woche 12 bzw. 14 der HFD........................ 58
Tabelle 8: Blutglukosekonzentrationen Mäuse HFD............................................................... 59
Tabelle 9: Insulinplasmakonzentrationen und HOMA- Indices .............................................. 61
Tabelle 10: Organgewichte der Mäuse auf HFD ..................................................................... 62
Tabelle 11: Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe HFD ........................................................ 63
Tabelle 12: Omega-3-Fettsäuren EpiWAT HFD ..................................................................... 72
Tabelle 13: Omega-3-Fettsäuren SubWAT HFD..................................................................... 72
Tabelle 14: Omega-3-Fettsäuren BAT HFD............................................................................ 72

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
+/+ ApoA5-Wildtyp
+/d ApoA5 heterozygot knockout
d/d ApoA5 homozygot knockout
+/T ApoA5 transgen
Apo Apolipoprotein
BAT Brown Adipose Tissue
BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
BMI Body Mass Index
bp Basenpaare
C° Celsius
CETP Cholesterintransferprotein
CM Chylomikronen
CoA CoEnzymA
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EpiWAT epididymal white adipose tissue
FAS Fatty Acid Synthase
H20 Wasser
HDL High Density Lipoprotein
HDS Heptadekansäure
HFD Hochfettdiät
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase

IDL Intermediate Density Lipoprotein
IL-6 Interleukin-6
kbp Kilobasenpaare
KO Knockout
LCAT Lecithin-Cholesterin-Acetyltransferase
LDL Low Density Lipoprotein
LPL Lipoproteinlipase
LRP Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein
LXR Leber-X-Rezeptor
ME Metabolisierbare Energie
MTP Mitochondriales Transferprotein
MUFA Monounsaturated Fatty Acids
MW Mittelwert
n.s. nicht signifikant
n-3 omega-3
n-6 omega-6
NaCl Natriumchlorid
NaCO3 Natriumcarbonat
PBS Phosphat Buffered Saline
PCR Polymerasekettenreaktion
PPAR-alpha, Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor alpha
PPAR-α
PUFA Polyunsaturated Fatty Acids
RORalpha Retinoid-Related Orphan Receptor alpha
rpm revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute

SCD Stearoyl-Coenzyme A Desaturase
SD Standardabweichung
SF Standardfutter
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SREBP-1c Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1c
SubWAT Subkutaneous White Adipose Tissue
TBE Tris-Borat-EDTA
Tg transgen
TNF-alpha Tumornekrosefaktor alpha
UKE Universitätskrankenhaus Eppendorf
VLDL Very Low Density Lipoptotein

ZIEL DER ARBEIT
1
Ziel der Arbeit
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in der industrialisierten Welt.
Eine Erhöhung der Triglyzeride im Plasma (Hypertriglyzeridämie) spielt bei der Genese der
Atherosklerose neben den klassischen Risikofaktoren Alter, Familienanamnese, erhöhtes
LDL-Cholesterin, erniedrigtes HDL-Cholesterin, Rauchen, hoher Blutdruck und Diabetes
mellitus eine wichtige Rolle. Die Hypertriglyzeridämie tritt häufig als Komponente des
Metabolischen Syndroms (Met Syn) auf. Das Met Syn ist definiert als erhöhter Bauchumfang,
Insulinresistenz, Fettstoffwechselstörungen und arterieller Hypertonus (vgl. Definition der
IDF 2005, http://www.idf.org/metabolic_syndrome).
Mit Insulinresistenz sind außerdem Veränderungen im Fettsäuremetabolismus assoziiert.
Bisherige Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Fettsäurekomposition in den
Geweben eine Rolle in der Entwicklung des metabolischen Syndroms spielen könnte.
Das im Jahre 2001 entdeckte Apolipoprotein A5 (ApoA5) konnte sowohl in Mausmodellen
als auch beim Menschen als wichtiger Regulator für die Triglyzeridkonzentration identifiziert
werden. Der Verlust des ApoA5-Gens führt zu einer vierfachen Erhöhung des
Triglyzeridspiegels, während im transgenen Tiermodell durch den zusätzlichen Einbau des
humanen ApoA5-Gens in das Mausgenom die Triglyzeridwerte reduziert sind.
Triglyzeridreiche Lipoproteine werden primär in den Kapillaren des Fettgewebes und des
Muskels hydrolysiert. Die dort synthetisierte endothelständige Lipoproteinlipase (LPL)
übernimmt die Hydrolyse der Partikel und führt so zur Freisetzung von Fettsäuren. In
Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von PD Dr. Martin Merkel am UKE konnte bereits gezeigt
werden, dass ApoA5 die LPL aktiviert.
In der vorliegenden Arbeit sollen zunächst die Fettsäureverteilungsmuster im Plasma und in
den Geweben von ApoA5-defizienten und ApoA5-transgenen Tieren im Vergleich zu
Wildtyptieren analysiert werden. Im zweiten Teil soll untersucht werden, ob eine Hochfettdiät
(HFD) Einfluss auf die Fettsäureverteilungsmuster der Mäuse mit den verschiedenen
genetischen Hintergründen hat. Außerdem soll geklärt werden, ob die bei ApoA5-defizienten
Mäusen erhöhten Triglyzeridkonzentrationen im Plasma eine periphere Insulinresistenz
verursachen können.

1 EINLEITUNG
1.1 Lipide
2
Einleitung
Lipide ist der Oberbegriff für eine strukturell sehr heterogene Gruppe von Stoffen mit
ähnlichen Lösungsmitteleigenschaften. Allen Lipiden gemeinsam ist die schlechte Löslichkeit
in Wasser. In unpolaren, organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Aceton oder Chloroform
sind sie hingegen sehr gut lösbar. Die Stoffgruppe der Lipide gliedert sich in Triglyzeride,
Fettsäuren und deren Derivate, Steroide und deren Derivate, Wachse und Terpene, Phosphound
Sphingolipide.
1.1.1 Triglyzeride als Reservestoffe
Triglyzeride sind Speicherlipide in den Zellen. Für viele Organismen stellen sie die
Hauptenergiequelle dar. Aufgrund ihrer hohen Energiedichte - die Verbrennungswärme
beträgt 40kJ/g im Vergleich zu 17-18 kJ/g bei Kohlenhydraten und Proteinen (LÖFFLER et
al. 2003, S. 637) - eignen sich Triglyzeride als langfristige Energiespeicher. Sie entstehen
durch Esterifizierung aus Fettsäuren und Glyzerin. Neben ihrer Rolle im Stoffwechsel dienen
Triglyzeridspeicher überdies als mechanische Polster und thermische Isolatoren. Um die
Fettreserven zu mobilisieren, können die in den Triglyzeriden gebundenen Fettsäuren durch
Hydrolysereaktionen mittels hormonabhängiger Lipasen freigesetzt werden.
1.1.2 Fettsäuren
1.1.2.1 Nomenklatur
Fettsäuren sind Monocarbonsäuren, die aus einer Kohlenwasserstoffkette und einer
endständigen Carboxylgruppe bestehen. Die natürlich vorkommenden Fettsäuren haben durch
die Synthese aus Einheiten, die jeweils zwei Kohlenstoffatome umfassen, stets eine gerade
Anzahl von Kohlenstoffatomen. Eine Klassifikation der Fettsäuren kann anhand ihrer
Kettenlänge, Anzahl, Position und Konfiguration der Doppelbindungen vorgenommen
werden. In Anbetracht der Kettenlänge erfolgt eine Unterteilung in kurzkettige (bis zu 4 C-

3
Einleitung
Atome), mittelkettige (6-10 C-Atome) und langkettige Fettsäuren (über 10 C-Atome)
(BIESALSKI 2004, S. 74).
Der Grad der Wasserstoffsättigung der Kohlenstoffkette klassifiziert sie als gesättigte, einfach
(Monounsaturated Fatty Acid, MUFA) oder mehrfach ungesättigte Fettsäure (Polyunsaturated
Fatty Acids, PUFA). Durch das Vorkommen von Doppelbindungen ergibt sich die
Möglichkeit zweier Isomere einer Fettsäure, der cis- und der trans- Konfiguration.
Die Kurzschreibweise der Fettsäuren benennt zunächst die Anzahl der C-Atome, nach einem
Doppelpunkt folgt dann die Anzahl der Doppelbindungen. Die Position der Doppelbindung
wird vom Methylende ausgehend bestimmt und mit ω-n gekennzeichnet.
Bei der α-Linolensäure ergibt sich also folgende Schreibweise: 18:3 (ω-3). Dies bedeutet, dass
diese Fettsäure aus 18 C- Atomen mit 3 Doppelbindungen besteht, wobei die Zählung am
Methylende beginnt und somit die erste Doppelbindung zwischen C3 und C4 liegt. Abbildung
1 zeigt die Strukturformel von α-Linolensäure.
Abb. 1: Alpha-Linolensäure
Die Tabelle 1 gibt einen Überblick über eine Auswahl gesättigter, einfach ungesättigter und
mehrfach ungesättigter Fettsäuren.

Chemische
Kurzformel
Wissenschaftliche Bezeichnung Deutscher Trivialname
Gesättigte Fettsäuren
8:0 Oktansäure Caprylsäure
10:0 Dekansäure Caprinsäure
12:0 Dodecansäure Laurylsäure
14:0 Tetradecansäure Myristinsäure
15:0 Pentadecansäure Pentadekansäure
16:0 Hexadecansäure Palmitylsäure
18:0 Octadecansäure Stearinsäure
20:0 Eicosansäure Arachinsäure
22:0 Docosansäure Behensäure
24:0 Tetracosansäure Lignocerinsäure
Delta-9-Desaturase Familie
14:1ω5 9-Tetradecensäure Myristölsäure
16:1ω7 9-Hexadecensäure Palmitölsäure
18:1ω7 11-Octadecensäure Vaccinsäure
18:1ω9 9-Octadensäure Ölsäure
20:1ω9 11-Eicosensäure
20:3ω9 5,8,11-Eicosatriensäure
22:1ω9 13-Docosensäure Erucasäure
24:1ω9 15-Tetracosansäure Nervonsäure
Omega 3 Familie
18:3ω3 9,12,15-Octadecatriensäure α-Linolensäure
18:4ω3 6,9,12,15- Octadecatetraensäure Stearidonsäure
20:3ω3 11,14,17-Eicosatriensäure
20:4ω3 8,11,14,17-Eicosatetraensäure
20:5ω3 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure Eicosapentaensäure
22:5ω3 7,10,13,16,19-Docosapentaensäure Docosapentaensäure
22:6ω3 4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure Docosahexaensäure
24:6ω3 15-Tetracosansäure
Omega 6 Familie
18:2ω6 9,12,15-Octadecatriensäure Linolsäure
18:3ω6 6,9,12-Octadecatriensäure γ-Linolensäure
20:2ω6 11,14-Eicosadiensäure
20:3ω6 11,14,17-Eicosatriensäure Dihomo-γ-Linolensäure
20:4ω6 5,8,11,14-Eicosatetraensäure Arachidonsäure
22:2ω6 13,16-Docosadiensäure
22:4ω6 7,10,13,16-Docosatetraensäure
22:5ω6 4,7,10,13,16-Docosapentaensäure
Tabelle 1: Auswahl gesättigter, einfach und mehrfach ungesättigter Fettsäuren
4
Einleitung

1.1.2.2 Fettsäuresynthese
5
Einleitung
Die Synthese von Fettsäuren kann als zweistufiger Prozess betrachtet werden. Der erste
Schritt beinhaltet die Bildung des Hauptvorläufers Malonyl-CoA aus Acetyl-Coenzym A
(Acetyl CoA) durch das Enzym Acetyl CoA Carboxylase. Im zweiten Schritt wird die
Fettsäurekette mit Hilfe des cytosolischen Fettsäuresynthetasekomplexes (FAS) jeweils um
zwei Kohlenwasserstoffmoleküle erweitert (BERG et al. 2003). Palmitinsäure bildet mit 16
C-Atomen das Endprodukt der Fettsäuresynthese durch die FAS. Es dient als Substrat für
weitere Kettenverlängerung oder kann durch das Einfügen von Doppelbindungen in
ungesättigte Fettsäuren überführt werden.
Die Kettenverlängerung von mehr als 16 Kohlenstoffatome umfassenden Elementen wird
durch die Elongasen vermittelt. Das Einfügen von Doppelbindungen wird von Desaturasen
bewerkstelligt.
Der Organismus benötigt neben gesättigten Fettsäuren auch MUFAs und PUFAs. In Zellen
der Säugetiere können jedoch durch das Enzym Delta-9-Desaturase nur einfach ungesättigte
Fettsäuren synthetisiert werden (BLOOMFIELD 1960). Der Einbau weiterer
Doppelbindungen zwischen C-10 und dem Methylende ist beim Säugetier aufgrund fehlender
Enzymausstattung nicht möglich. Somit müssen die Vorläufer für die mehrfach ungesättigten
Fettsäuren wie Omega-6 und Omega-3 mit der Nahrung zugefügt werden. Man bezeichnet die
Vorläufer Linol- und Alpha-Linolensäure deshalb als essentielle Fettsäuren.
Die Synthese der Fettsäuren der Omega-6 und Omega-3-Reihe aus Linol- bzw. Alpha-
Linolensäure wird im Organismus durch die membranständigen Enzyme Delta-5- und Delta-
6- Desaturase ermöglicht (NAKAMURA 2004).
In den Abbildungen 2 und 3 wird die Synthese der MUFAs und PUFAs durch Desaturierung
und Elongation dargestellt. Linolsäure und Alpha-Linolensäure konkurrieren dabei um
dasselbe Enzymsystem. Die Omega-3-Fettsäure Alpha-Linolensäure hat die höchste Affinität
zum Enzym Delta-6-Desaturase, d.h. sie hemmt kompetitiv die Desaturierung von Linolsäure
zu Arachidonsäure. Ist Alpha-Linolensäure in hoher Konzentration vorhanden, wird die
Katalyse von Linolsäure zu anderen Fettsäuren der Omega-6-Reihe wie Arachidonsäure
unterdrückt. Wenn jedoch Linolsäure im Überschuss vorhanden ist, wird die Bildung von
Eicosapentaensäure (EPA) und Docosapentaensäure (DHA) aus Alpha-Linolensäure
vermindert.

Laurylsäure C 12:0
Myristinsäure C 14:0
Palmitinsäure C 16:0
Stearinsäure C 18:0
Arachinsäure C 20:0
Behensäure C 22:0
Lignoceronsäure C 24:0
↓ = Elongase
↓ = FAS
↓ = Delta 9- Desaturase
Gesättigte und einfach ungesättigte Fettsäuren
Abb. 2: Synthese gesättigter und einfach ungesättigter Fettsäuren
6
Myristölsäure C 14:1
Palmitölsäure C 16:1
Ölsäure C 18:1
Eicosaensäure C 20:1
Erucasäure C 22:1
Nervonsäure C 24:1
Einleitung

α-Linolensäure C 18:3
Stearidonsäure C 18:4
Eicosapentaesäure C 20:5
↓ = Elongase
↓ = Delta-6-Desaturase
↓ = Delta- 5−Desaturase
↓ = β−Oxidation
Abb. 3: Omega-3-Stoffwechselweg
Linolsäure C 18:2
..↓ = Elongase
..↓ = Delta-6-Desaturase
..↓ = Delta- 5−Desaturase
..↓ = β−Oxidation
Abb. 4: Omega-6-Stoffwechselweg
Omega-3-Stoffwechselweg
Docosapentaesäure
C 22:5
Omega-6-Stoffwechselweg
7
Eicosatriesäure C 20:3
Eicosatetraensäure C 20:4
Eicosadiensäure C 20:2
γ -Linolensäure C 18:3 Dihomo-γ-Linolensäure
C 20:3
Arachidonsäure C 20:4
Einleitung
Tetracosapentaensäure
C 24:5
Docosahexaensäure
C 22:6

8
Einleitung
Aus Linolsäure entsteht durch Elongation und Desaturierung die Omega-6-Fettsäure
Arachidonsäure, der Vorläufer für die Synthese von Eicosanoiden. Elongation und
Desaturierung von Alpha-Linolensäure resultiert in der Bildung von Eicosapentaensäure, dem
Vorläufer für eine weitere Reihe von Eicosanoiden. Die Gruppe der Eicosanoide umfasst
Prostaglandine, Prostazykline, Thromboxane und Leukotriene.
1.1.2.3 Funktion der Fettsäuren
Fettsäuren sind integrale Bestandteile von Zellmembranen und beeinflussen deren
Permeabilität und Stabilität. Veresterte Fettsäuren in Triglyzeriden bilden den
Hauptenergiespeicher des Körpers. Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren im Serum, Plasma
und in Phospholipiden von Zellmembranen sind die Vorläufer der Eicosanoide, die als
intrazelluläre Signalmoleküle und Gewebshormone viele Zellfunktionen regulieren.
1.1.2.4 Omega-3 und Omega-6 Fettsäuren in der Nahrung
Omega-6-Fettsäuren wie die Arachidonsäure kommen hauptsächlich in tierischen Fetten vor.
Linolsäure ist reichlich in Getreidesamen und Pflanzenölen wie Sonnenblumen, Mais, Soja
und Safflor vorhanden (OLLIS et al. 1999). Gamma-Linolensäure findet sich in höheren
Konzentrationen in den Samen von Borretsch, Nachtkerze und schwarzer Johannisbeere. Die
langkettigen Omega-3-Fettsäuren Eicosapentaen- und Docosapentaensäure sind in höheren
Konzentrationen in Lammfleisch, Seefisch, Flachs und Leinsamen nachweisbar. Auch in
Algen, Phytoplankton, Seevögeln und Meeressäugern wie Robben und Walen können hohe
Gehalte an langkettigen Omega-3-Fettsäuren gemessen werden. Besonders reich an
ungesättigten Fettsäuren sind Fischöle mit bis zu 75%, wobei EPA und DHA als wichtigste
Vertreter der Omega-3-Familie vor allem in Ölen von Meeresfischen wie Sardinen, Heringen,
Makrelen und Lachsen vorkommen. Der erhöhte Gehalt an DHA und EPA im Vergleich zum
mageren Süßwasserfisch ist durch die Hauptnahrungsquelle der Seefische, dem
Phytoplankton, erklärbar.
Lein-, Raps-, Soja -, Schwarzkümmel - und Walnussöl beinhalten höhere Konzentration an
Alpha-Linolensäure. Das Öl der asiatischen Nutzpflanze Perilla enthält bis zu 64% Alpha-
Linolensäure und jeweils bis zu 20% Ölsäure und Linolsäure. Den höchsten Gehalt an Alpha-

9
Einleitung
Linolensäure hat man in der alten Kulturpflanze Portulak, einem spinatähnlichen Gewächs,
nachgewiesen (BIESALSKI 2004, S. 76).
Gemäß Ernährungsempfehlungen sollte ein maximaler Fettanteil von 30% an der täglichen
Energiezufuhr nicht überschritten werden. Der Anteil an ungesättigten Fettsäuren soll ca.
20%, die der gesättigten nicht mehr als 10% betragen (LÖFFLER et al. 2006, S. 648). Gemäß
SIMOPOULOS (2002) ist dabei ein Verhältnis von ω-6- zu ω-3-Fettsäuren von annähernd 1
anzustreben.
1.1.2.5 Klinische Bedeutung der PUFAs
Verschiedene Studien haben gezeigt, dass mehrfach ungesättigte Fettsäuren eine
entscheidende Rolle in der Entwicklung von Krankheitsbildern wie z.B. Bluthochdruck,
koronarer Herzkrankheit, Atherosklerose, Diabetes mellitus, Metabolischem Syndrom,
Psoriasis, atopischer Dermatitis, entzündlicher Darmerkrankung und Krebs spielen (LA
GUARDIA 2005, CARPENTIER et al. 2006, CALDER 2008, SERINI et al. 2009).
Da PUFAs die Vorläufer für sowohl pro- als auch antiinflammatorische Moleküle bilden, hat
die Balance zwischen diesen antagonistischen Komponenten einen Einfluss auf den Ausgang
von Krankheitsprozessen (RUSSO 2009). Arachidonsäure und Eicosapentaensäure sind die
Vorläufer der Eicosanoide, zu denen Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene zählen.
Aus der Arachidonsäure werden Prostaglandine der 2-er Reihe, Thromboxan A2 und
Leukotriene der 4-er Reihe gebildet. Sie wirken proinflammatorisch, vasokonstriktorisch,
immunsuppressiv und fördern die Aggregation der Blutplättchen. Eicosapentaensäure stellt
den Vorläufer für Prostaglandine der 3er-Reihe, Thromboxan A3 und Leukotriene der 5er-
Reihe dar, welche gegensätzliche Wirkungen zu den aus Arachidonsäure gebildeten
Eicosanoiden aufweisen.
Aus PUFAs werden jedoch nicht nur Vorläufer für oben genannte Eicosanoide metabolisiert,
sondern auch Lipoxine, Resolvine und Protektin D1. Diese Lipidmediatoren haben cardio-,
neuro- und zytoprotektive Eigenschaften und sind insbesondere auch bei der Auflösung von
Entzündungsreaktionen beteiligt (SCHWAB et al. 2007).
Darüber hinaus üben PUFAs einen direkt regulatorischen Effekt auf Genexpression und
Enzymakitvität aus (CLARKE 2004). Im Zusammenspiel mit nukleären Rezeptoren und
Transkriptionsfaktoren beeinflussen PUFAs die Regulation mehrerer Schlüsselgene des

10
Einleitung
Lipidmetabolismus (SAMPATH u. NTAMBI 2005). So unterdrücken PUFAs z. B. die
Expression von lipogenen Genen (YOSHIKAWA et al. 2002) und aktivieren Gene der
Fettsäureoxidation über PPAR-α (JUMP et al. 2005), wodurch die Insulinsensitivität erhöht
wird. Auch die nachgewiesene Erhöhung der Adiponektinproduktion durch
Eicosapentaensäure trägt zu einer verbesserten Insulinsensitivität bei (ITOH et al. 2007).
Außerdem sind PUFAs potente Inhibitoren der HMG-Co-A-Reduktase, des Schlüsselenzyms
im Cholesterolstoffwechsel (EL-SOHEMY u. ARCHER 1999). Somit eignen sich PUFAs zur
Therapie der Hyperlipidämie.
In Zellmembranen von Neuronen stellen Omega-3-Fettsäuren wichtige Komponenten dar. Sie
sind nicht nur für die Entwicklung des Gehirns von großer Bedeutung, sondern auch für die
kognitiven Fähigkeiten des erwachsenen und alternden Gehirns (DAS 2003).
In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass Omega-3-Fettsäuren einen antiproliferativen
Effekt auf Tumorzellen haben und daher in der Prävention und Therapie von
Krebs eingesetzt werden können (PAUWELS u. KAIREMO, 2008)
1.2 Lipoproteine
Lipoproteine sind lösliche Komplexe aus Proteinen und Lipiden, die dem Transport von
Lipiden im Kreislauf dienen. Aufgrund ihrer Größe und stark hydrophoben Eigenschaften
können Triglyzeride nicht wie freie Fettsäuren an Albumin gebunden im Plasma transportiert
werden. Daher sind sie mit Cholesterin, Phospholipiden und Apolipoproteinen zu
transportfähigen Partikeln, den Lipoproteinen, assoziiert.
Der Kern dieser Partikel enthält neutrale Lipide (Triglyzeride, Cholesterinester und
lipidlösliche Vitamine), während die Außenschicht aus amphiphatischen Phospholipiden,
freiem Cholesterin und Apolipoproteinen besteht. Die Bestandteile der Hülle ermöglichen
somit den Lipidtransport im hydrophilen Medium Blut.
In der Zirkulation stellen die Lipoproteine ein höchst dynamisches System dar: Durch
Austausch von Lipid- und Proteinkomponenten verändern sie sich in ihrer Größe, Form und
Dichte.

11
Einleitung
Trotz ihrer ständigen Konformations- und Kompositionsänderungen lassen sich die
Lipoproteine anhand ihrer Dichte, Größe, Lipidzusammensetzung, Lipid-Protein-Verhältnis
und dem Gehalt an Apolipoproteinen in 5 Hauptklassen unterteilen (GOFMAN et al. 1954):
Chylomikronen (CM), Very Low Density Lipoproteins (VLDL), Intermediate Density
Lipoproteins (IDL), Low Density Lipoproteins (LDL) und High Density Lipoproteins (HDL).
Die Größe der Lipoproteine ist umgekehrt proportional zur Dichte. Mit abnehmendem
Triglyzeridgehalt erhöht sich die Dichte, während die Größe abnimmt. CM enthalten nur 1-
2% Protein, wohingegen bei HDL bis zu 50% des Gewichts aufs Protein entfallen.
Eigenschaften CM VLDL IDL LDL HDL
Dichte (g/ml) - 0,93 0,93 – 1,006 1,006 – 1,019 1,019 – 1,063 1,063 – 1,21
Durchmesser
(nm)
75 – 1200 30 – 80 25 – 35 18 – 25 5 – 12
Cholesterol (%) 2 13 34 41 15 - 20
Triglyzeride (%) 90 54 20 4 1 - 5
Phospholipide
(%)
5 16 20 21 23 - 34
Protein (%) 2% 10% 17% 23% 35-50%
Hauptfunktion
Apolipoproteine
Transport
exogener
Lipide
A4, A5, B48,
C2, C3, E
Transport
endogener
Lipide
A5, B100, C2,
C3, E
Transport
endogener
Lipide
Cholesteroltransport
B100, C3, E B100
Reverser
Cholesterol-
transport
A1, A2, A4, A5,
E
Tabelle 2: Charakteristika der Lipoproteinklassen (nach SCHWANDT u. PARHOFER 2006)
Die Hauptfunktionen der Lipoproteine werden durch die enthaltenen Apolipoproteine und die
Lipidkomponenten charakterisiert. Besonders die z. T. dynamisch wechselnden
Apolipoproteine bestimmen durch ihre Interaktion mit zellulären Rezeptoren das
metabolische Schicksal der Lipoproteine. (MAHLEY et al. 1984).
CM werden im Darm synthetisiert und sorgen für den Transport von Nahrungsfetten zu den
peripheren Geweben. VLDL entstehen in der Leber und gewährleisten den Abtransport von
endogenen Triglyzeriden und hepatisch synthetisiertem Cholesterin. Durch die intravasale
Hydrolyse der Triglyzeride in den CM und VLDL-Partikeln entstehen kleinere Lipoproteine,
die reich an Cholesterin und ApoE sind. Man bezeichnet sie als CM- und VLDL-Remnants.

12
Einleitung
Teile der VLDL-Remnants werden über Zwischenstufen intermediärer Dichte (IDL) in LDL
überführt.
LDL bilden schließlich das Endprodukt der fortschreitenden Lipolyse der VLDL. Sie
übernehmen die Beförderung von Cholesterin zu peripheren Geweben und der Leber. HDL
werden hauptsächlich in der Leber und zu geringeren Anteilen auch im Darm gebildet
(BRUNHAM et al. 2006). Die Funktion der HDL besteht im Abtransport von überschüssigem
Cholesterin aus den Zellen zur Leber und in steroidhormonproduzierende Organe.
1.3 Apolipoproteine
Apolipoproteine sind die Proteinkomponente der Lipoproteine. Sie vermitteln die Löslichkeit
der Lipoproteinpartikel im Blut und sorgen für deren Stabilität. Viele Apolipoproteine haben
darüber hinaus weitere Funktionen. Sie fungieren als Rezeptorliganden und steuern so die
Aufnahme der Lipide in die Zielzellen und wirken zusätzlich über die Beeinflussung von
Enzymaktivitäten auf den Lipoproteinstoffwechsel. Grundsätzlich lassen sich die
Apolipoproteine in zwei Hauptklassen einteilen: Die nicht-austauschbaren und die
austauschbaren Apolipoproteine. Apo B100 und Apo B48, die Hauptproteinbestandteile der
CM, VLDL, IDL und LDL, sind nicht-austauschbare Apolipoproteine, die am
Endoplasmatischen Reticulum der Leber (Apo B100) oder des Darms (Apo B48) gebildet
werden und stets an dasselbe Lipoprotein gebunden bleiben. Demgegenüber haben die
austauschbaren Apolipoproteine eine geringere molekulare Masse und können zwischen den
Lipoproteinen ausgetauscht werden.
Während die Genstrukturen und Aminosäuresequenzen der austauschbaren Apolipoproteine
einander sehr ähnlich sind (LI et al. 1986), unterscheidet sich das Apo B Gen davon deutlich.
Die wichtigsten Apolipoproteine und deren Charakteristika sind in der unten stehenden
Tabelle aufgeführt.

Apolipoprotein Assoziierte Lipoproteine Funktionen im Stoffwechsel
ApoA1 HDL, CM Strukturprotein von HDL, LCAT-Aktivator
ApoA2 HDL, CM unbekannt
ApoA4 HDL, CM
ApoA5 HDL, VLDL, CM
ApoB48 CM
ApoB100 VLDL, IDL, LDL
13
Einleitung
ermöglicht wahrscheinlich den Transfer von
Apolipoproteinen zwischen HDL und CM
Senkung des Triglyzeridspiegels durch
Aktivierung der LPL
Produktion und Sekretion von CM aus dem
Dünndarm, LPR-Ligand
Strukturprotein der VLDL, IDL und LDL,
Produktion und Sekretion von VLDL aus der
Leber, LDL-Rezeptor-Ligand
ApoC1 CM, VLDL, IDL, HDL
Inhibitor der hepatischen Aufnahme von CM und
VLDL Remnants
ApoC2 CM, VLDL, IDL, HDL Aktivator der LPL
ApoC3 CM, VLDL, IDL, HDL
ApoE CM, VLDL, IDL, HDL
Inhibiton der LPL und der Aufnahme von CM und
VLDL Remnants in die Leber
Ligand für den LDL- Rezeptor, LRP und
Proteoglykane
Tabelle 3: Charakteristika der wichtigsten Apolipoproteine
LCAT=Lecithin-Cholesterin-Acetyl-Transferase, LRP=LDL-Receptor-related Protein,
LPL=Lipoproteinlipase (nach CHAHIL et al. 2006)

1.3.1 Stoffwechsel der Lipoproteine
Der Metabolismus der Lipoproteine lässt sich in 3 wesentliche Systeme untergliedern:
1. Das exogene Lipidtransportsystem
Es dient dem Transport von Nahrungslipiden.
2. Das endogene Lipidtransportsystem
Es dient dem Transport von Lipoproteinen hepatischen Ursprungs.
3. Das reverse Cholesterintransportsystem
Es übernimmt den Transport von Cholesterin aus der Peripherie zur Leber.
Im Folgenden werden diese drei Systeme näher charakterisiert.
1.3.1.1 Das exogene Lipidtransportsystem
14
Einleitung
Triglyzeride aus der Nahrung werden zunächst durch die pankreatische Lipase gespalten und
als freie Fettsäuren, Monoacylglyzeride und freies Glyzerol in die Darmzellen aufgenommen.
In der Zelle erfolgt sogleich die Resynthese zu Triglyzeriden, die zusammen mit Cholesterin,
Phospholipiden und Apolipoproteinen (hauptsächlich Apo B48) zusammengepackt und als
CM an die Lymphe abgegeben werden. Über den Ductus thoracicus gelangen sie in die
Blutbahn. Dort erfolgt ein Austausch von Apoliporoteinen und Phospholipiden mit HDL. In
den kapillären Endstromgebieten des Fett- und Muskelgewebes werden die in den CM
enthaltenen Triglyzeride durch die Lipoproteinlipase (LPL) hydrolysiert (MAHLEY u.
HUSSAIN 1991). Als Endprodukte dieses Weges entstehen CM- Remnants, die weniger als
80% ihres ursprünglichen Triglyzeridgehalts aufweisen und letztlich von hepatischen
Rezeptoren der LDL- Rezeptor- Familie aufgenommen werden (BEISIEGEL et al. 1989;
KOWAL et al. 1989).
1.3.1.2 Das endogene Lipidtransportsystem
Endogen synthetisierte Triglyzeride aus der Leber dienen dem Organismus im Hungerzustand
als Energiequelle. Diese werden in VLDL verpackt zu den peripheren Organen transportiert.
Die Produktion der VLDL wird unter anderem durch den Gehalt freier Fettsäuren im Plasma
und durch Insulin beeinflusst. Die Aggregation der VLDL erfolgt über die Bindung von

15
Einleitung
Triglyzeriden und Cholesterinestern an ApoB100. Dieser Schritt wird durch das MTP
(mikrosomales Triglyzerid-Transferprotein) katalysiert (HUSSAIN et al. 2003). Nach der
Sekretion ins Plasma nehmen VLDL ApoE und ApoC sowie Cholesterolester von den HDL
auf. Während die VLDL zirkulieren, erzeugt die Hydrolyse ihrer Triglyzeridkomponenten
durch die LPL ein Kontinuum an kleineren und dichteren Partikeln, die VLDL-Remnants.
Einige dieser VLDL Remnants werden durch die Leber aufgenommen. Die meisten jedoch
(ca. 50-70%) werden über IDL weiter zu LDL modifiziert. Im Inneren setzen sich die LDL
fast ausschließlich aus Cholesterolestern zusammen und tragen als einziges Apolipoprotein
ApoB100 an ihrer Oberfläche. Die Aufgabe der LDL ist die Versorgung der Zellen mit
Cholesterin. Die meisten LDL werden durch Interaktion mit dem LDL-Rezeptor in die Leber
und in extrahepatische Gewebe aufgenommen. Ein Teil jedoch wird LDL-Rezeptorunabhängig
metabolisiert. Dieser Weg, auch als Scavenger-Pathway bezeichnet, verläuft
mittels der unspezifischen Aufnahme durch Scavenger Rezeptoren an Makrophagen.und
anderen Zellen des retikuloendothelialen Systems.
1.3.1.3 Das reverse Cholesterintransportsystem
Der reverse Cholesterintransport beschreibt die Bewegung von Cholesterin aus den
peripheren Geweben durch das extrazelluläre Kompartiment zum Ort seines Katabolismus,
der Leber. HDL spielen dabei als Vermittler dieses Transports eine wichtige Rolle (LEWIS
2005). HDL werden als sog. naszierende HDL, die hauptsächlich das Apolipoprotein A1 an
ihrer Oberfläche tragen, von der Leber gebildet. Diese, auch prä-β-HDL genannten Partikel,
adsorbieren an den Membranen peripherer Zellen freies Cholesterin. Auch das zelluläre
Transmembranprotein ATP-binding cassette transporter ABCA1 scheint bei dem Transfer
von Cholesterin auf die HDL eine bedeutende Rolle zu spielen (ORAM 2003).
Mit Hilfe des Enzyms Lecithin Cholesterin Acetyltransferase (LCAT) wird das
aufgenommene Cholesterin verestert. Ein Teil der so entstandenen Cholesterinester in den
HDL wird durch das Cholesterinestertransferprotein (CETP) auf ApoB enthaltene
Lipoproteine (v.a. VLDL und LDL) übertragen oder über den Scavenger-Rezeptor SR-B1 an
Leberzellen abgegeben (TRIGATTI et al. 2003).

1.3.2 Apolipoprotein A5
16
Einleitung
Das Apolipoprotein A5 (ApoA5) wurde 2001 von zwei Arbeitsgruppen gleichzeitig entdeckt.
PENNACCHIO et al. (2001) identifizierten durch vergleichende Sequenzanalysen zwischen
Maus und Mensch ein neues Mitglied des ApoA1/C3/A4 Genclusters, das ApoA5 Gen,
während VAN DER VLIET et al. (2001) bei ihren Experimenten ein mit der frühen Phase der
Leberregeneration assoziiertes Protein aufspürten. Das ApoA5-Gen auf dem menschlichen
Chromosom 11q23 besteht aus 4 Exons und codiert ein Protein von 366 Aminosäuren mit
einem 19 Aminosäuren umfassenden Signalpeptid (ALBORN 2006). Das murine Genprodukt
ist ein 368 Aminosäuren langes Protein, welches eine 71-prozentige Ähnlichkeit zum
humanen ApoA5 aufweist. Die Produktionsstätte des ApoA5 wurde von WEINBERG et al.
(2003) in der Leber lokalisiert. Von der Leber wird es ans Plasma abgegeben und liegt dort
hauptsächlich an HDL und triglyzeridreiche Lipoproteine gebunden vor. Im Vergleich zu
anderen Lipoproteinen sind die im Plasma vorhandenen Konzentrationen von ApoA5 um ein
Vielfaches geringer. Die im humanen Plasma gemessenen Werte reichen von 0,1 bis 0,4µg/ml
(O`BRIEN et al. 2005).
Die ApoA5-Genexpression wird durch Transkriptionsfaktoren, die bekanntermaßen den
Triglyzeridstoffwechsel beeinflussen, reguliert. Ein Einfluss wurde u.a. nachgewiesen für
PPARα, RORα, LXR and SREBP-1c (PRIEUR et al. 2003; GENOUX et al. 2005; JAKEL et
al. 2004). Aber auch Insulin und Interleukine scheinen bei der Regulation der ApoA5-
Genexpression eine Rolle zu spielen (NOWAK 2005)
Um die Funktion dieses neuen Apolipoproteins zu entschlüsseln, wurden verschiedene
Mausmodelle entwickelt. Diese enthüllten den triglyzeridsenkenden Effekt des ApoA5.
Transgene ApoA5 Mäuse, die zusätzlich zu dem murinen das humane ApoA5-Gen tragen,
zeigten einen um zwei Drittel erniedrigten Plasmatriglyzeridspiegel. Hingegen wiesen
ApoA5-Knockout-Mäuse, bei denen das murine ApoA5-Gen deletiert ist, einen vierfach
höheren Plasmatriglyzeridspiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe auf (PENNACCHIO u.
RUBIN 2003). In einem Mausmodel mit adenoviral überexprimiertem ApoA5 konnte die
triglyzeridsenkende Rolle des ApoA5 bestätigt werden (VAN DER VLIET et al. 2002).

17
Einleitung
Die im Mausmodell beobachteten Veränderungen bezüglich der Triglyzeridlevel ließen eine
negative Korrelation von Plasma-ApoA5 und Triglyzeriden vermuten. Tatsächlich sind
jedoch neben wenigen Hinweisen auf eine negative Korrelation zunehmend
Studienergebnisse publiziert worden, die auf eine positive Korrelation von Plasma-ApoA5
und Triglyzeriden hindeuten (ZHAO et al. 2007; DALLINGA-THIE et al. 2006;
HENNEMANN et al. 2007; PALMEN et al. 2008; PRUNETA-DELOCHE et al. 2005;
KAHRI et al. 2007; TALMUD et al. 2006).
Eine positive Korrelation zwischen Plasma-ApoA5- und Triglyzeridkonzentrationen konnten
sowohl NELBACH et al. (2008) als auch VAESSEN et al. (2009) in ihren Untersuchungen
nachweisen.
Die dem triglyzeridsenkenden Effekt zugrunde liegenden Mechanismen wurden weiter
untersucht. Zunächst wurde einer möglichen Interaktion von ApoC3 und ApoA5
nachgegangen. Da ApoC3 und ApoA5 entgegengesetzte Effekte auf den Triglyzeridspiegel
haben, vermutete man einen Einfluss von ApoA5 auf ApoC3. Durch Experimente mit
Mäusen, die für die beiden Apolipoproteine defizient bzw. transgen waren, konnte diese
These jedoch widerlegt werden (BAROUKH et al. 2004).
Für die ApoA5 vermittelte Senkung des Triglyzeridspiegels können zwei mögliche
Mechanismen vermutet werden: Eine reduzierte Produktion oder ein beschleunigter Abbau
von Triglyzeriden. Aufgrund der physikochemischen Eigenschaften von ApoA5 nahmen
WEINBERG et al.(2003), BECKSTEAD et al. (2003) und OLOFSSON et al. (2005) einen
hemmenden Einfluss auf die VLDL-Synthese an. Die Ergebnisse aus in-vivo-Studien belegen
eine Interaktion von ApoA5 mit LPL, so dass diese aktiviert wird und eine intravasale
Hydrolyse der Triglyzeride stattfindet (SCHAAP et al. 2004; FRUCHART-NAJIB et al.
2004; MERKEL et al. 2005; LOOKENE et al. 2005). ApoA5 kann die LPL aber nur dann
optimal aktivieren, wenn LPL an Heparansulfat- Proteoglykane an der Gefäßwand gebunden
ist (MERKEL u. HEEREN 2005).
ApoA5-transgene Mäuse zeichnen sich dementsprechend durch einen beschleunigten VLDL-
Katabolismus sowie einen niedrigeren postprandialen Triglyzeridanstieg aus (MERKEL et al.
2005). In ApoA5-defizienten Mäusen hingegen ist die Hydrolyse der triglyzeridreichen

18
Einleitung
Lipoproteine verlangsamt, und die Remnants stellen schlechtere Rezeptor-Liganden dar
(GROSSKOPF et al. 2005).
Hohe Konzentrationen von ApoA5 an Leberzellmembranen lassen eine
Partikelaufnahmefunktion dieses Proteins vermuten. Im Einklang mit dieser Auffassung
stehen die Entdeckungen von SHU et al. (2007), die eine Assoziation von ApoA5 mit
zellulären Lipidtropfen feststellten. Ergebnisse von NILSSON et al. (2007 und 2008)
beweisen eine Interaktion von ApoA5 mit verschiedenen Lipoproteinrezeptoren.
Ob der beschleunigte VLDL-Abbau nur durch die erhöhte LPL-Aktivität verursacht wird oder
ob ApoA5 möglicherweise auch die Aufnahme von Lipoproteinen in die Leber fördert, bleibt
zu klären.
ApoA5- Polymorphismen
Für das ApoA1/C3/A4 Gencluster sind bereits mehrere Defekte im Lipidmetabolismus
beschrieben worden (GROENENDIJK et al. 2001). Nach Entdeckung von A5 als neues
Mitglied dieses Clusters konnten bis dato 36 Punktmutationen (Single Nucleotide
Polymorphisms; SNPs) im ApoA5- Gen gefunden werden. Darauf basierend wurden
verschiedene Haplotypen, Kombinationen von Punktmutationen, des ApoA5- Gens definiert
(PENNACCHIO et al. 2002; TALMUD et al. 2002; OLIVIER et al. 2004). Eine Vielzahl von
genetischen Studien weisen auf eine deutlichen Zusammenhang zwischen Polymorphismen
des ApoA5- Gens und Plasmalipiden hin (AOUIZERAT et al. 2003; BAUM et al. 2003;
EICHENBAUM-VOLINE et al. 2004; HUBACEK et al. 2004; KAO et al. 2003).
So führt z. B. das kombinierte Vorliegen von ApoA5*2- und ApoA5*3- Haplotyp zu einem
nahezu verdoppelten Plasmatriglyzeridspiegel im Vergleich zum normalen Genotyp
(PENNACCHIO et al. 2002).
Da ApoA5 folglich eine wichtige Rolle im Triglyzeridmetabolismus spielt, der wiederum eng
mit der Entstehung von Atherosklerose verbunden ist, wurde auch dieser Zusammenhang
untersucht. Ein erhöhtes Risiko, an Herzinfarkt zu erkranken, konnte in einigen Studien für
bestimmte ApoA5-Varianten nachgewiesen werden (ELOSUA et al. 2006; HSU et al. 2006;
LAI et al. 2004; SZALAI et al. 2004; TALMUD et al. 2004; TANG et al. 2006). Andere

19
Einleitung
Studien konnten diesen Zusammenhang jedoch nicht bestätigen (DALLONGEVILLE et al.
2006; VAESSEN et al. 2006).
Der Einfluss von PPARalpha auf die ApoA5- Genexpression lässt ein eine Mitwirkung von
ApoA5 an der triglyzeridsenkenden Funktion von Fibraten vermuten. In einer Studie
untersuchten LAI et al. (2007) die Wirkung von Fibraten bei Probanden mit verschiedenen
ApoA5-Varianten. Dabei zeigte sich interessanterweise, dass Träger von bestimmten
Mutationen im ApoA5-Gen deutlich besser auf die Fibrattherapie ansprachen als andere.
Auch CARDONA et al. (2009) konnten in ihrer Studie bestätigen, dass Träger des
-1131T→C APOA5 SNP mehr von einer Fibrattherapie profitierten als die Wildtypträger. Für
diese Beobachtungen wird jedoch ein von der fenofibratinduzierten ApoA5-Expression
unabhängiger triglyzeridsenkender Mechanismus angenommen.
Viele Gene, die mit dem Lipidmetabolismus assoziiert sind, weisen deutliche Gen-Diät-
Interaktionen auf (CORELLA u. ORDOVAS 2005). Beweise für ApoA5-Diät-Interaktionen
sind durch mehrere Studien erbracht worden (ELOSUA et al. 2006; LAI et al. 2006; KIM et
al. 2006; CORELLA et al. 2007). In der Framingham- Studie von CORELLA et al. (2007)
wurden das Zusammenspiel von ApoA5-Mutationen einer Hochfettdiät und dem Body-Maß-
Index untersucht. Bei den Trägern einer bestimmten ApoA5-Variante (-1131T→C SNP)
konnte sich im Vergleich zu den Nicht-Trägern dieser ApoA5-Variante kein erhöhter Anstieg
des BMI während einer Hochfettdiät nachweisen lassen. Ähnliche Ergebnisse zeigen
Untersuchungen von ABERLE et al. (2005). Übergewichtige, hyperlipidämische Träger des -
1131T→C SNP profitierten in dieser Studie stärker von einer dreimonatigen Fettrestriktion
als die Kontrollpersonen.

1.3.3 Adipositas und Diabetes
20
Einleitung
Weltweit ist bekanntermaßen die Anzahl der an Adipositas leidenden Menschen in den letzten
Jahrzehnten dramatisch gestiegen, was vor allem der Verfügbarkeit von hochkalorischer
Nahrung und mangelnder Bewegung zugeschrieben werden kann. Neben den exogenen
Faktoren trägt auch eine genetische Prädisposition zur Krankheitsentstehung bei. In den
meisten Fällen scheint der Hintergrund polygenetischer Natur zu sein (SNYDER 2003).
Adipositas geht einher mit einem erhöhten Risiko für eine Reihe von Erkrankungen. Hier sind
vor allem Diabetes mellitus Typ 2, Hypertonie, koronare Herzkrankheiten und Dyslipidämie
zu nennen (KOPELMAN 2000). Aber auch Erkrankungen des respiratorischen Systems und
des Bewegungsapparates können aus einer Adipositas resultieren. Von besonderer Bedeutung
ist daher die Erforschung der Entstehungsmechanismen von Adipositas. Durch die
Entschlüsselung von Risikofaktoren könnten sich Möglichkeiten zur Prävention entwickeln
lassen.
1.3.4 Insulinresistenz
Insulinresistenz beschreibt einen Zustand verminderter Ansprechbarkeit der Zelle auf das
Hormon Insulin. Dieser Zustand hat eine reduzierte Glukoseaufnahme in die Zellen v.a. der
Skelettmuskulatur, der Leber und dem Fettgewebe zur Folge. Daraus resultiert ein
Stoffwechselzustand mit hohen Insulinkonzentrationen bei normaler oder erhöhter
Blutglukosekonzentration. Um das verminderte Ansprechen der Zielorgane zu kompensieren,
wird vom Pankreas vermehrt Insulin ausgeschüttet. Eine dauerhaft hohe Insulinausschüttung
kann der Körper jedoch nicht aufrechterhalten. Dies führt zusammen mit einer progredienten
Betazelldysfunktion unweigerlich zur Verschlechterung der Glukose-Homöostase und zu
Hyperglykämie. Diese verschlechtert weiter die Insulinsensitivität sowie die Insulinsekretion der
Betazellen des Pankreas (Glukotoxizität). Letztendlich bilden diese Veränderungen die
Grundlage für die Entstehung eines Diabetes mellitus Typ 2.

1.3.5 Ursachen der Insulinresistenz
21
Einleitung
Die typischerweise mit der Adipositas einhergehenden erhöhten Fettsäurekonzentrationen im
Plasma spielen eine entscheidende Rolle in der Entstehung der Insulinresistenz. In klinischen
Studien konnte durch eine künstliche Erhöhung freier Fettsäuren im Plasma mittels
Lipidinfusionen eine Insulinresistenz ausgelöst werden (THIÉBAUD 1982, FERRANNINI et
al. 1983, RODEN et al. 1996). Erhöhte freie Fettsäurespiegel verringern die
Glukoseaufnahme in die Zellen der Skelettmuskulatur (RANDLE et al. 1963), erhöhen die
hepatische Glukosefreisetzung (MOLLER u. KAUFMANN 2005) und beeinträchtigen die
Funktion der Betazellen des Pankreas (UNGER 1995).
Eine Vergrößerung von viszeralen Fettdepots zieht außerdem Veränderungen in der Sekretion
von Adipozytokinen nach sich. Die erhöhte Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen
wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Interleukin 6 (IL-6) stört die Weiterleitung des
Insulinsignals auf Rezeptorebene. Während die insulinresistenzinduzierende Rolle des TNF-α
belegt ist (UYSAL et al. 1997), existieren für IL-6 widersprüchliche Ergebnisse (MOONEY
2007; PEDERSEN u. FEBBRAIO 2007).
Adiponektin hat Insulin-sensitivierende Eigenschaften im Muskel und in der Leber
(YAMAUCHI et al. 2001). Es besteht jedoch eine negative Korellation von
Adiponektinspiegeln im Plasma mit Adipositas (TSCHRITTER et al. 2003). Eine verminderte
Sekretion von Adiponektin hat eine reduzierte insulinvermittelte Glukoseverwertung des
Muskels sowie einen Wegfall der hemmenden Wirkung von Insulin auf die hepatische
Glukoneogenese zur Folge. Dies resultiert in einer Hyperglykämie.
Die zu Beginn der Insulinresistenz bestehende Hyperinsulinämie führt zu einer Vergrößerung
der Fettgewebsmasse. Durch eine höhere lipolytische Aktivität der Adipozyten und des
gleichzeitig verminderten antilipolytischen Effekts von Insulin werden mehr Fettsäuren
freigesetzt, wodurch oben genannte Mechanismen verstärkt werden.
Im Weiteren verschlechtern Gluko- und Lipotoxizität die Insulinsekretion und führen letztlich
zur Ausbildung eines Typ-2-Diabetes.

2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
2.1.1 Material PCR
Geräte Hersteller
Hybridisierungsofen
Wasserbad
Amersham LIFE SCIENCE
PCR-Cycler Biometra TS Thermocycler
Vortexer, Type Reax 2000 Heidolph
Waage BP 410S Sartorius
Zentrifuge 1-15 K Sigma
Tischzentrifuge Fisherbrand
Elektrophoresekammer Biorad
Pipetten Eppendorf Research
Verbrauchsmaterialien
0,5 ml Eppendorftubes Sarstedt
Pipettenspitzen Sarstedt
PCR-Strips Biozym
Chemikalien
Seakem LE Agarose Lonza
Borsäure Merck
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Trizma®) Sigma
Aqua ad injectabilia Braun
PCR Reaction Buffer (10x) with 10mM MgCl2 Roche
6x Loading Dye Solution Fermentas
DMSO Sigma
22
Material und Methoden

Ethidiumbromid Sigma
DirectPCR® Lysis Reagent (Tail) Viagen
Enzyme, Nukleotide Hersteller
Proteinase K (20mg/ml) Invitrogen
TaqPolymerase Roche
PCR Grade Nucleotide Mix Roche
Gene Ruler DNA Ladders, Mix Fermentas
23
Material und Methoden
Puffer: Zusammensetzung
5x TBE-Puffer: 54g Tris
27,5g Borsäure
20ml 0,5M EDTA pH 8,0 => mit H20 auf
1000ml
2.1.2 Material Lipoproteinprofil
Geräte und Verbrauchsmaterialien Hersteller
Mikrotiterplattenlesegerät Biotrak II Amersham Biosciences
Hamiltonspritze Kloehn Co., Inc.
Mikrotiterplatten Nunc
Ultrazentrifuge L7-55 mit Rotor LP42TI Beckman
Zentrifugationsröhrchen Beckman
Chemikalien
Cholesterol, Triglyzeride,
Standardlösung für Assays
Roche

2.1.3 Tierexperimentelle Materialien
Chemikalien, Pharmaka Hersteller
Heparin-Natrium-25000 Ratiopharm
PBS Dulbecco’s GIBCO
Ketamin Gräub AG
Xylazin Bayer
Glukose
flüssiger Stickstoff
Sigma
Instrumente, Verbrauchsmaterialien Hersteller
Operationsbesteck Aesculap
Kanülen Braun
Spritzen (20ml und 1ml) BD Discardit
Serumröhrchen Sarstedt
2.1.4 Material Fettsäureextraktion
Geräte Hersteller
Gaschromatograph, Series II 5890 Hewlett Packard
Auto-Sampler 7673A Hewlett Packard
24
Material und Methoden
Einstellungen des Gaschromatographen
Injektor 260°C, Injektionsvolumen 1µl; Split/Splitless, 90sec. Purge off
Säule:DB-225, Länge 30m, i.D. 0,25mm, Filmdicke 0,25µm, (Agilent)
Flammenionisationsdetektor: 300°C, Helium make up Gas, 30ml/min
Trägergas: Helium, 37m/s bei 70°C, konstanter Fluss
Die Einstellungen des Gaschromatographen werden in allen Versuchen beibehalten.
Ultra Thurrax Janke & Kunkel
Inkubator Unitron HT Infors
Trockenschrank Memmert

Vortexer Reax 2000 Heidolph
Waage LA 120S Sartorius
Zentrifuge 6 K 15 Sigma
Rotor Nr. 13127; 306g; 299/01 Sigma
Pipetten Gilson, Eppendorf, Labsystems
25
Material und Methoden
Verbrauchsmaterialien Hersteller
Flasche R1, braun-6,2-BF mm CS-Chromatographie Service GmbH
Mikroeinsatz, G301s, 6mm
Bördelkappe, R11-1.0/HP
Reagenzgläser mit hitzebeständigem
Kunststoffschraubdeckel und Teflondichtung Schott
Pipettenspitzen Sarstedt, Gilson
Chemikalien Hersteller
Acetylchlorid Fluka
BHT (2,6-di-tert-butyl-p-cresol) Fluka
Ethanol 96% Walter CMP GmbH & Co. KG
Heptadecansäure Fluka
Hexan Roth
Methanol Roth
Natriumcarbonat Merck
Toluol Merck
Angesetzte Lösungen Zusammensetzung
BHT-Lösung 0,1M BHT in Toluol
Heptadecansäurestandard 50mg HDS auf
(Reaktionslösung) 1000ml Methanol:Toluol (4:1)
Methanol-Toluol 4:1 (V:V)
Natriumcarbonatlösung 6% 30g NaCO3 auf 500ml deion. H2O

2.2 Methoden
2.2.1 Tierexperimentelle Methoden
2.2.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen
26
Material und Methoden
Die Mäuse wurden in spezifisch pathogenfreien Räumen der Versuchstierhaltung des UKE
unter standardisierten Bedingungen gehalten. Das Lichtprogramm war auf einen 12 Stunden
Hell-/Dunkelrhythmus eingestellt. Die Tiere erhielten Wasser und Futter ad libitum. Um
durch die Hereinnahme von Tieren aus anderen Institutionen die Einschleppung von
Seuchenerregern zu verhindern, wurden die Tiere zunächst einem Embryotransfer unterzogen.
Alle Tierversuche wurden von der Behörde für Umwelt und Gesundheit genehmigt bzw. bei
dieser angezeigt. Es bestanden Genehmigungen nach §7 TierSchG (14/05 und 51/02) und §6
TierSchG (UKE-VTH-Aktenzeichen A65, A66). Organentnahmen hatten das interne
Registrierzeichen Org 163 und Org 288 der Universität Hamburg.
2.2.1.2 Verwendete Mauslinien
Für diese Studie wurden ApoA5-transgene (ApoA5 Tg, +/T), ApoA5-knockout (ApoA5 Ko,
d/d) und Wildtypmäuse (+/+) verwendet. Die Tiere wurden vom Genome Sciences
Department, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, USA bezogen. Durch die
Integration eines das humane ApoA5 codierenden Genfragments in das Mausgenom wurden
die ApoA5-transgenen Mäuse erzeugt. Dieses 26 kbp große Xho I Genfragment wird, ebenso
wie das endogene Maus ApoA5-Gen, ausschließlich in der Leber exprimiert. Um einen
möglichst homogenen genetischen Hintergrund zu erhalten, lagen alle Mauslinien um mehr
als 5 Generationen auf den FVB-Hintergrund gekreuzt vor.
ApoA5 transgene Mäuse haben im Vergleich zum Wildtyp einen um ein Drittel erniedrigten
Plasmatriglyzeridspiegel.
ApoA5-knockout-Tiere wurden durch Entfernen der drei ApoA5-codierenden Exons
erschaffen. Die Plasmatriglyzeridlevel dieser Mäuse sind um das Vierfache erhöht verglichen
mit dem Wildtyp. (PENNACCHIO et al. 2001).

2.2.1.3 Studiendesign
27
Material und Methoden
Der erste Teil der Studie wurde mit drei verschiedenen Tiergruppen begonnen. Die Gruppen
umfassten je 5 Tiere. Die erste Gruppe entsprach bezüglich des ApoA5-Genlocus dem
Wildtyp (+/+), die zweite war heterozygot transgen (+/T). Die dritte Gruppe bildeten die
homozygoten Knockout-Tiere (d/d, KO).
Diese Mäuse erhielten nach dem Absetzen in der 4. Lebenswoche für 12 Wochen
Standardfutter (SF). Nach Ablauf der 12 Wochen wurden die Tiere getötet und Blut und
Organe entnommen.
Im zweiten Teil der Studie wurden 4 Tiergruppen mit den unten dargestellten genetischen
Varianten ab der 4. Lebenswoche für 12 Wochen mit einer hochfetthaltigen Nahrung (HFD)
gefüttert. Folgende Tiergruppen mit jeweils 10 Tieren wurden gebildet:
1. ApoA5 Wildtyp (+/+)
2. ApoA5 transgen (+/T)
3. ApoA5 heterozygot Knockout (+/d)
4. ApoA5 homozygot Knockout (d/d)
Jeweils 6 Tiere pro Gruppe wurden in Woche 11 (+/+ und +/T) bzw. Woche 13 (+/d und d/d)
einem oralen Glukosetoleranztest (OGTT) unterzogen. Nach 12 (+/+ und +/T) bzw. 14 (+/d
und d/d) Wochen wurden schließlich von je 6 Tieren pro Gruppe Organe und Blut
entnommen.

2.2.1.4 Nahrungsbestandteile
28
Material und Methoden
Als Standardfutter (SF) wurde V1536-000 ssniff® R/M-H Extrudat, als fettreiche Nahrung
(HFD) BIO-SERV DIET # F3282 verwendet. Beide Futtermittel wurden von der Firma ssniff
aus Soest bezogen.
Zusammensetzung des Standardfutters
Herstellerangaben:
Rohnährstoffe [%]
Trockensubstanz 89,5
Rohprotein 19,3
Rohfett 3,4
Rohfaser 5,0
Rohasche 6,5
N-freie Extraktstoffe 55,3
Stärke 37,5
Zucker 4,7
Zusammensetzung der HFD
Herstellerangaben:
Rohnährstoffe [%]
Rohprotein 20
Rohfett 35,5
Rohfaser 0,1
Rohasche 3,7
Kohlenhydrate 32,7
Feuchtigkeit

2.2.1.5 Oraler Glukosetoleranztest (OGTT)
29
Material und Methoden
Ein Glukosetoleranztest wird eingesetzt, um zu bestimmen, wie schnell Glukose nach einer
Applikation aus der Blutbahn verschwindet.
Vor der Glukoseapplikation wurden die Mäuse für 5 Stunden gefastet. Danach wurde den
Mäusen ein ca. 2mm langes Schwanzstück abgeschnitten und wurden vorsichtig 2
Blutstropfen herausgedrückt, von denen der erste Tropfen verworfen wurde. Mit dem zweiten
Tropfen wurde der basale Blutzuckerwert bestimmt. Für die Messungen wurde ein Accu
Check® Aviva Blutzuckermessgerät verwendet. Nachdem bei allen Mäusen der 0-Wert
bestimmt worden war, wurde mit dem Test begonnen. Zum Zweck der oralen Applikation der
Glukoselösung wurde die Maus mit einer Hand im Nacken und am Schwanz fixiert und der
Kopf überstreckt. Eine leicht gebogene Knopfkanüle wurde vorsichtig über den Zungenwulst
in den Rachen und, nach Abschlucken durch das Tier, bis in die Speiseröhre vorgeschoben.
Die Glukoselösung mit einer Konzentration von 0,5 mg/µl wurde gewichtsadaptiert
verabreicht (1,5 mg pro g Körpergewicht). Die nachfolgenden Blutzuckermessungen
erfolgten zu den Zeitpunkten 15, 30, 60 und 120 Minuten ebenfalls durch vorsichtiges
Herausmassieren eines Bluttropfen aus dem Schwanz auf den Glukosemessstreifen. Zu dem
Zeitpunkt 0 Minuten wurde zusätzlich zu den Blutzuckermessungen ein Serumröhrchen mit
Blut gefüllt, um daraus Insulin bestimmen zu können.
Aus den basalen Glukose- und Insulinwerten lässt sich der sog. HOMA-Index (Homeostasis
Model Assessment) errechnen. Es handelt sich dabei um ein mathematisches Modell, welches
über das Produkt der Nüchternplasmaglukose und der Nüchterninsulinkonzentration eine
Berechnung der Insulinresistenz erlaubt. Ein niedriger Wert steht für eine hohe
Insulinsensitivität, hohe Werte für eine Insulinresistenz.
2.2.1.6 Organentnahme
Die für fünf Stunden gefasteten Mäuse wurden mittels einer intraperitonealen
Ketamin/Xylazin- Injektion betäubt. Bei Erreichen der nötigen Narkosetiefe wurde die Bauchund
Brusthöhle durch einen großzügigen von der Linea alba ausgehenden Schnitt geöffnet.
Zwei Entlastungsschnitte der lateralen Bauchwand in Höhe des Rippenbogens
gewährleisteten eine gute Übersicht über die Organe. Blut wurde über die Punktion des

30
Material und Methoden
rechten Ventrikels gewonnen. Nach Einschneiden des rechten Vorhofes wurde durch den
linken Ventrikel das Gefäßsystem mit PBS/Heparin (10 U Heparin/ml) perfundiert.
Anschließend wurden Leber, Muskel, epididymales, subkutanes und braunes Fettgewebe
entnommen, gewogen und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung
bei –80°C gelagert.
2.2.1.7 Genotypisierung der Mäuse
Zur Genotypisierung der Tiere wurde aus Schwanzbiopsien DNA isoliert und mit Hilfe einer
standardisierten Polymerasekettenreaktion (PCR) auf das Vorkommen bestimmter, die Mäuse
charakterisierender Basenpaarenfragmente untersucht.
1. DNA-Isolation aus Mausschwanzbiopsien
Vier Wochen alten Mäusen wurde ein ca. 0,5 cm großes Schwanzspitzenstück entfernt und in
0,75 ml fassende Eppendorfgefäße überführt. Auf die Schwanzstücke gab man 200 µl
DirectPCR® Lysis Reagent- Tail und fügte 10 µl Proteinase K hinzu. Anschließend wurden
die Eppendorfgefäße in einem rotierenden Hybridisierungsofen bei 55°C für ca. 4 Std. bis zur
kompletten Lyse des Gewebes belassen. Darauf folgte eine 45-minütige Inkubation in 85°C
heißen Wasser auf einem schwimmenden Gitter. Bis zur weiteren Verwendung wurde die
DNA bei 4°C gelagert oder für längere Zeit bei minus 20°C eingefroren.
2. PCR
Für die ApoA5Tg PCR sowie für die ApoA5Ko-PCR wurden zunächst die unten stehenden
Primersequenzen generiert:
ApoA5Tg: 5’-GCYTCTGGGACTACTTCAGC-3’ (n=20 nt)
5’-CTTTCAGGKTCCTGGAGAAGG-3’ (n=21 nt)
ApoA5Ko: 5’-TCTAGGCGCCATAGGTCTGTAAC-3’ (n=23 nt)
5’-CCGGTGGATGTGGAATGTG-3’ (n=19 nt)
5’-GCTAGCCTGTATCTGCAGCTCTC-3’ (n=23 nt)

31
Material und Methoden
Für die PCR wurde eine Reaktionslösung erstellt, die pro zu bestimmender DNA-Probe
folgende Bestandteile enthielt:
2,5 µl 10*Puffer
1,0 µl DMSO
18,5 µl Aqua ad injectabilia
0,5 µl dNTP´s
0,5 µl je Primer
0,5 µl Taq-Polymerase
Pro Ansatz wurden 24µl der Reaktionslösung und 1µl des DNA- Isolats in ein Reaktionsgefäß
eines PCR-Strips pipettiert, welcher dann im PCR-Cycler folgendem Protokoll unterworfen
wurde:
1. ApoA5Tg-PCR
Initiale Denaturierung: 95°C 3 Min.
Denaturierung: 95°C 25 Sek.
Annealing: 55°C 40 Sek. 35 Zyklen
Elongation: 72°C 20 Sek.
Finale Elongation: 72°C 1 Min.
2. Apo A5Ko-PCR
Initiale Denaturierung: 95°C 3 Min.
Denaturierung: 95°C 25 Sek.
Annealing: 54°C 40 Sek. 35 Zyklen
Elongation: 72°C 15 Sek.
Finale Elongation: 72°C 1 Min.
Durch Verwendung der spezifischen Primer entstand bei einem ApoA5 Wildtyp-Allel ein
Fragment mit 526 bp und für das transgene Allel ein 614 bp umfassendes Fragment. Die

32
Material und Methoden
Primer wurden so konzipiert, dass sowohl die humane als auch die murine Sequenz erkannt
wurde.
Als Produkte der ApoA5Ko-PCR entstand ein das Ko-Allel charakterisierendes Fragment von
412 bp und ein Fragment mit 579 bp, welches das Wildtyp-Allel darstellte.
Die Verwendung der oben genannten Primer ermöglichte die Differenzierung in homo- und
heterozygote Knockouttiere.
3. Gelelektrophorese
Um die DNA-Fragmente aufzutrennen, wurde die Gelelektrophorese verwendet. Hierbei wird
über ein Agarose-Gel eine Spannung angelegt. Die Auftrennung beruht darauf, dass die
negativ geladenen DNA-Moleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen Ladung und Größe
unterschiedlich schnell durch das Gel wandern. Da die Wanderungsgeschwindigkeit
umgekehrt proportional zur Molekülgröße ist, wandern kleinere Moleküle schneller durch das
Gel, wodurch eine Auftrennung nach der Größe der Moleküle möglich wird.
Um das Ergebnis der PCR auf dem Gel zu visualisieren, wird dem Gel der
Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid zugegeben. Dieser interkaliert mit der DNA, so dass
diese unter ultraviolettem Licht sichtbar wird.
Zur Herstellung der Gele wurden 2g Agarose in 110ml eines 1x TBE-Puffers durch Erhitzen
gelöst. Nach Abkühlung des Gemisches auf ca. 60°C wurden 3ml Ethidiumbromid
hinzugegeben und wurde das Gel in einen Gelschlitten gegossen. Das fest gewordene Gel
wurde anschließend in eine mit TBE-Puffer gefüllte Gelkammer transferiert.
Zu den DNA- Proben wurde 4µl eines Ladepuffers hinzugegeben. Dieser enthält einen
Farbstoff (Bromphenolblau), anhand dessen sich die Laufweite der DNA im Gel abschätzen
lässt. Die Geltaschen wurden jeweils mit 20 µl DNA-Probe beladen. Um Später eine Aussage
über die Anzahl der Basenpaare, also die Länge eines DNA-Fragments, machen zu können,
wurde ein Standard-Marker auf das Gel aufgetragen. Er besteht aus einem Gemisch von DNA
Fragmenten mit bekannter Größe. Anschließend wurde das Gel für eine Stunde bei 100V
unter Spannung gesetzt und das Ergebnis abschließend unter UV-Licht mit einer digitalen
Kamera fotografiert.
Zur Durchführung der PCR wurden in der Etablierungsphase sowohl Produkte von Roche als
auch von Invitrogen verwendet. Ein Vergleich der unterschiedlichen Ansätze verdeutlichte,

33
Material und Methoden
warum im Folgenden mit dem Roche-PCR-Kit gearbeitet wurde. Wie aus der unten stehenden
Abbildung ersichtlich, wurden hiermit eindeutig klarere PCR-Resultate erzielt. Die Abbildung
zeigt von links nach rechts drei unterschiedliche Ansätze der ApoA5TgPCR sowohl mit dem
Roche als auch dem Invitrogen-Kit bei z.T. unterschiedlichen Annealingtemperaturen. Neben
den Kontrollen 979 (+/+) und 980 (+/T) sind jeweils die Proben Nr. 131 (+/+) und 132 (+/T)
aufgetragen.
1. Ansatz: 55 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen, Invitrogen-Kit
2. Ansatz: 55 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen, Roche-Kit
3. Ansatz: 60 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen, Invitrogen-Kit
Marker
H2O
Kontrolle 979
Kontrolle 980
Abb. 5: ApoA5Tg PCR
# 131
# 132
H2O
Kontrolle 979
Kontrolle 980
# 131
# 132
# 131
# 132
H2O
Kontrolle 979
Kontrolle 980

2.2.2 Lipoproteinprofil
34
Material und Methoden
Lipoproteine können mittels der sequentiellen Ultrazentrifugation aufgetrennt werden.
(HAVEL. et al. 1955). Durch Zugabe von spezifischen Dichtelösungen lassen sich die
Lipoproteine in der Ultrazentrifuge in 3 Fraktionen unterteilen. Bei einer Lösungsdichte von
d < 1,006 g/ml flotieren die VLDL, bei 1,063 die IDL und LDL und bei 1,21 g/ml die HDL.
In Ultrazentrifugationsröhrchen pipettierte man zunächst 60µl PBS, welches anschließend mit
60µl Plasma unterschichtet wurde. Nach der folgenden Ultrazentrifugation für 2,5 h bei
42 000 rpm und 4 C befanden sich in der oberen Phase die VLDL, während IDL, LDL und
HDL den Unterstand bildeten.
Die untere Phase wurde in ein neues Zentrifugationsröhrchen überführt und mit 60µl Kalium-
Bromid mit einer Dichte von 1,12 g/ml gemischt, um eine Dichte von 1,063 g/ml zu
erreichen. Anschließend erfolgte eine erneute Zentrifugation für 6h bei 42 000 rpm und 4 °C.
Die VLDL-führende obere Phase wurde zur weiteren Verwendung in ein Eppendorftube
überführt. Nach der zweiten Zentrifugation waren die HDL in den unteren, die LDL und IDL
in den oberen 60µl enthalten. Anschließend wurde die untere, dann die obere Phase
abgenommen und ebenfalls zur weiteren Verwendung in Eppendorftubes pipettiert und bis
zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
2.2.3 Cholesterin- und Triglyzeridbestimmung
2.2.3.1 Prinzip
Cholesterin und Triglyzeride im Plasma werden anhand eines enzymatischen Tests ermittelt.
Hierbei werden die im Plasma vorhandenen Cholesterinester zu Cholesterin und freien
Fettsäuren gespalten, die Triglyzeride in Glycerin und freie Fettsäuren zerlegt. An die erste
Reaktion schließen sich weitere an, die zur Entstehung eines Farbstoffes führen, dessen
Extinktion proportional zur vorhandenen Cholesterin- bzw. Trigylzeridkonzentration ist.

2.2.3.2 Durchführung
35
Material und Methoden
In eine Mikrotiterplatte wurde zunächst der jeweilige Standard der Reagenzien in einer
Verdünnungsreihe von 0,0; 0,5; 1,25; 2,5; 3,75; 7,5 und 15 mg/dl in einer Doppelbestimmung
vorgelegt. In den verbliebenen Feldern der Platte wurden die Plasmaproben mit PBS so weit
verdünnt, dass die zu erwartenden Cholesterin- bzw. Triglyzeridkonzentrationen innerhalb der
Standardreihe lagen. Anschließend wurden sowohl die Standardreihe als auch die Proben mit
200 µl Cholesterin- bzw. Triglyzeridreagenz überschichtet. Nach einer zehnminütigen
Inkubation bei 37°C wurde die Extinktion des entstandenen Farbstoffs bei einer Wellenlänge
von 540nm im Photometer gemessen. Mittels einer aus der Standardreihe erstellten Eichkurve
wurde ein Proportionalitätsfaktor bestimmt und dieser mit den Extinktionswerten der Proben
multipliziert, um die tatsächliche Cholesterin- bzw. Triglyzeridkonzentrationen zu ermitteln.
2.2.4 Fettsäureanalytik
2.2.4.1 Prinzip der Gewebehomogenisation und Fettsäureextraktion
Bevor die Lipide einer Probe analysiert werden können, ist ihre möglichst reine Isolation aus
dem vorliegenden Gewebe unumgänglich. Doch zunächst muss das zu analysierende Gewebe
mechanisch zerkleinert werden. Dies ist z.B. mit den rotierenden Klingen eines Ultra Turrax
des Herstellers Jahnke und Kunkel möglich.
Die Fettsäureextraktion wird nach der bekannten Methode von Folch (Folch et al. 1957)
durchgeführt. Lipide lösen sich aufgrund ihrer geringen Polarität in unpolaren
Lösungsmitteln. Um Lipide jedoch möglichst quantitativ extrahieren zu können, muss die
Spaltung von Lipid- Protein- Bindungen mit Hilfe eines Lösungsmittelgemisches aus apolaren
und polaren Lösungsmitteln erreicht werden.
Aus diesem Grund wird dem Gewebehomogenisat eine Methanol/Chloroform - Lösung im
Verhältnis 1:2 zugesetzt. Dabei dient Chloroform als Fettlöser, während Methanol die
Proteine denaturiert und somit die assoziierten Fettsäuren herauslöst. Nach Schüttelinkubation
und Zentrifugation erhält man am Boden des Reagenzglases ein Proteinpellet mit dem
darüberliegenden Folchextrakt, das die freien Fettsäuren enthält.

2.2.4.2 Durchführung
36
Material und Methoden
Zunächst wurden 100 mg schwere Gewebestücke abgewogen und in Reagenzgläser überführt.
Hierbei wurde auf Trockeneis gearbeitet, um einem Antauen des Gewebes vorzubeugen.
Anschließend wurde das Gewebe mit 250 µl einer 0,1M BHT Stammlösung versetzt, um eine
Autooxidation der Fettsäuren zu verhindern. Nun wurden noch 4 ml der
Methanol/Chloroform- Lösung dazugegeben. Anschließend wurden die Proben insgesamt
sechs Mal jeweils 10 Sekunden lang mit dem Ultra Turrax auf Eis homogenisiert. Um
sämtliche Gewebereste im Reagenzglas aufzufangen, wurde der Ultra-Turrax-Stab zwei Mal
mit 1 ml der Methanol/Chloroform- Lösung abgespült. Die verschlossenen Reagenzgläser
wurden bei 50°C und 90 rmp für 30 Minuten in den Schüttelinkubator gestellt. Nach der
anschließenden Zentrifugation für 15 Minuten bei 3500 rmp und 4°C waren die Proben für
den Derivatisierungschritt aufbereitet.
2.2.4.3 Prinzip der Lipidderivatisierung
Die Fettsäuren in den Lipidextrakten liegen in der Regel in gebundener Form vor, so dass sie
bei den Arbeitstemperaturen des Gaschromatographen nicht flüchtig sind. Es ist daher
notwendig, flüchtige Derivate zu erzeugen, die einer gaschromatographischen Trennung
zugänglich sind. Daher müssen die Fettsäuren aus den Lipiden in Fettsäuremethylester
umgewandelt werden. Der Methylierungsschritt der Fettsäuren entspricht formal einer
Verseifungsreaktion mit anschließender Veresterung. Der Zeitaufwand und der mögliche
Lipidverlust bei diesen Schritten (EDER 1995) hat die Etablierung einer Methode
vorangetrieben, bei der eine direkte Umesterung der Lipide mit einem Alkohol, eine sog.
Alkoholyse, stattfindet. (LEPAGE u. ROY 1986, GARCES u. MANCHA 1993;
SHIMASAKI et al.1977; SEGURA 1988)
Die Methylierung findet so unter Verwendung nur eines Reagens in ein und demselben Gefäß
statt. Diese Reaktion benötigt jedoch einen Katalysator. In diesem Fall wurde die
hitzeerfordernde Säurekatalyse mit Acetylchlorid angewandt.

2.2.4.4 Durchführung
37
Material und Methoden
Pro Probe wurde eine Zweifachbestimmung angesetzt. In mit Hexan gespülten
Reagenzgläsern wurden 100 µl des zuvor durch Homogenisierung und Zentrifugation
gewonnenen Überstandes pipettiert. Hinzu kamen 2 ml der Reaktionslösung
(Methanol/Toluol 4:1 mit 50µg/ml Heptadekansäure). Unter vorsichtigem Vortexen fügte man
diesem Gemisch 200 µl Acetylchlorid hinzu.
Die Reagenzgläser wurden gut verschlossen und für eine Stunde bei 100°C in den
Trockenschrank gestellt. Danach kühlten die Proben bei geöffneter Trockenschranktür ca. 20
min ab.
Anschließend wurde den Proben Toluol zugegeben: 3600 µl bei Fettgewebe, 600 µl bei
Muskelgewebe, 1600 µl bei Lebergewebe. Zur Neutralisation wurde der Ansatz mit 4 ml 6prozentiger
Natriumcarbonatlösung komplettiert. Die verschlossenen Reagenzgläser wurden
ca. 30 Sekunden geschüttelt und danach bei 2000 rmp und 10°C für 15 Minuten zentrifugiert.
Aus der oberen Phase wurden 1000 µl in ein Gaschromatographiefläschchen überführt und im
Gaschromatographen gemessen oder bis zur Messung bei -80°C eingefroren.
2.2.4.5 Prinzip der Gaschromatographie
Gaschromatographie ist ein Verfahren zur Trennung von Substanzgemischen, die gasförmig
vorliegen. Die zu trennenden Substanzen werden auf zwei Phasen verteilt: eine mobile und
eine stationären Phase. Als mobile Phasen dienen generell inerte Gase wie z.B. Helium. Die
stationäre Phase bildet in diesem Fall ein Polymer mit sehr polaren Cyanopropylgruppen und
wenig polaren Trimethylgruppen. Die Trennung des Substanzgemisches wird dadurch
erreicht, dass Substanzen, die vorzugsweise in der mobilen Phase verteilt sind, schneller
durchlaufen als solche, die eine höhere Affinität zur stationären Phase aufweisen.
Ein Gaschromatograph besteht in der Regel aus vier Einheiten:
1) Gaszufuhr
2) Injektoreinheit
3) Chromatographiesäule
4) Detektoreinheit

Abb. 6: Anlage zur Gasflüssigkeitschromatographie (aus RICHTER 2003)
38
Material und Methoden
Mit Hilfe der Vorrichtung zur Gaszufuhr werden dem System alle benötigten Gase zugeführt.
Die Probe wird mit einer Mikroliterspritze automatisch in die Einspritzkammer überführt, wo
sie aufgrund der dort herrschenden 260°C sofort verdampft. Das Trägergas transportiert die
nun gasförmige Probe in die Säuleneinheit. Die Säule umfasst die stationäre Phase, die direkt
auf die innere Oberfläche der Säule aufgebracht ist. Hier wird die notwendige Trennung des
Substanzgemisches erreicht. Die Wechselwirkung der Probe mit der stationären Phase, also
das Auftrennungsverhalten, ist temperaturabhängig. Daher ist die Säule in einen Ofen
eingebettet. Durch Veränderung der Säulentemperatur kann somit das Retentionsverhalten der
Substanzkomponenten variiert werden. Die Säulentemperatur wird meist in Form eines
ansteigenden Temperaturgradienten verändert. Das ermöglicht die Auftrennung von
Komponenten mit einer großen Spanne an Siedepunkten.
Die hohe Polarität der Säule ermöglicht nicht nur eine Auftrennung nach Kettenlänge (Anzahl
der C-Atome), sondern ebenfalls nach Anzahl der Doppelbindungen. Sogar Fettsäuren mit
gleicher Anzahl, aber unterschiedlicher Lokalisation der Doppelbindungen können getrennt
werden.
Am Ende der Kapillarsäule liegt der Flammenionisationsdetektor, der die einzelnen
Fettsäuren detektiert. Das Prinzip beruht auf der Messung der Leitfähigkeit einer
Knallgasflamme zwischen zwei Elektroden. Die zu analysierende Substanz wird mit dem
Trägergasstrom in die Knallgasflamme transportiert und dort thermisch ionisiert. Die bei der
Ionisation freiwerdenden Ionen erzeugen ein elektrisches Signal, welches registriert und

39
Material und Methoden
gespeichert wird. Die Stromstärke bzw. das Signal ist proportional zur Menge der Ionen und
somit auch zur Menge der verbrannten Substanz.
Die Detektoreinheit ist gekoppelt an ein Computerprogramm, welches das Ergebnis als eine
Serie von Peaks, ein Chromatogramm (Abb.6), darstellt.
Abb. 7: Gaschromatogramm (aus RICHTER 2003)
Jede Substanz erreicht den Detektor zu einer anderen Zeit und produziert ein Signal zu einem
charakteristischen Zeitpunkt, der sog. Retentionszeit (Zeit von der Injektion bis zum
Auftreten des Peaks). Die Fläche des Peaks ist der Menge der verbrannten Substanz
proportional. Zur Auswertung und Quantifizierung des Ergebnisses wird die Angabe der
definierten Menge eines zugegebenen internen Standards benötigt, anhand deren die Menge
der Substanzen errechnet werden kann.
2.2.5 Statistik
Um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen, wurde der
Student´s T-Test für unabhängige Stichproben durchgeführt.

3 ERGEBNISSE
40
Ergebnisse
Die Studie bestand aus 2 Teilen. Im ersten Teil wurden drei Tiergruppen gebildet, die mit
Standardfutter (SF) ernährt wurden. Es existierten folgende Gruppen à fünf Tiere:
1. ApoA5 Wildtyp (+/+)
2. ApoA5 Transgen (+/T)
3. ApoA5 Knockout (d/d)
Nach 12 Wochen Standardfutterdiät wurden die Tiere getötet. Aus Blut und Organgeweben
wurden ein Lipoproteinprofil und eine Fettsäureanalyse erstellt.
Der zweite Studienteil umfasste folgende vier Tiergruppen à 10 Tiere, die für 12 Wochen eine
Hochfettdiät (HFD) erhielten:
1. ApoA5 Wildtyp (+/+)
2. ApoA5 Transgen (+/T)
3. ApoA5 heterozygot Knockout (+/d)
4. ApoA5 homozygot Knockout (d/d)
Durch dieses Vorgehen konnte ApoA5 bei verscheidenen Gendosen (von Knockout – kein
Gen - über heterozygot – 1 Gen - und Wildtyp (2 Gene) bis hin zu Transgen (>3 Gene)
untersucht werden. Auch von diesen Tiergruppen wurden am Ende von je 6 Tieren pro
Gruppe Blut und Organe entnommen, um daraus ein Lipoproteinprofil sowie eine
Fettsäureanalyse anzufertigen. Von den entnommenen Organen wurde das Gewicht ermittelt.
Zusätzlich wurden Cholesterin- und Triglyzeridwerte einmal im Verlauf der HFD gemessen.
Außerdem wurden alle vier Gruppen einem oralen Glukosetoleranztest unterzogen und die
Insulinkonzentration im Plasma bestimmt.

3.1 Ergebnisse der Futtermittelanalyse
3.1.1 Standardfutter
Fettsäuren [%] vom Gesamtfettsäuregehalt
C 14:0 Myristinsäure 0,3
C 16:0 Palmitinsäure 17,1
C 16:1 Palmitölsäure 0,3
C 18:0 Stearinsäure 3,6
C 18:1 Ölsäure 16,2
C 18:1 Vaccinsäure 0,8
C 18:2 Linolsäure 53,6
C 18:3 Linolensäure 5,6
C 18:4 Stearidonsäure 0,3
C 20:3 Dihomogammalinolensäure 0,1
C 20:4 Arachidonsäure 0,1
C 20:4 ω3 Arachidonsäure 0,1
C 20:5 Eicosapentaensäure 0,1
3.1.2 HFD
Fettsäuren [%] vom Gesamtfettsäuregehalt
C 14:0 Myristinsäure 1,9 Prozentuale Zusammensetzung der HFD
C 16:0 Palmitinsäure 28,5
C 16:1 Palmitölsäure 1,8
C 18:0 Stearinsäure 18,3
C 18:1 Ölsäure 33,6
C 18:1 Vaccinsäure 2,0
C 18:2 Linolsäure 10,6
C 18:3 Linolensäure 0,9
C 18:4 Stearidonsäure 0,01
C 20:3 Dihomogammalinolensäure 0,1
C 20:4 Arachidonsäure 0,2
C 20:4 ω3 Arachidonsäure 0,02
C 20:5 Eicosapentaensäure 0,03
41
Ergebnisse
Prozentuale Zusammensetzung des Standardfutters
19%
17%
18%
11%
6%
2%
2%
4%
1%
1%
2%
29%
54%
34%

3.2 Ergebnisse Standardfutter
3.2.1 Lipoproteinprofile der Mäuse auf Standardfutter
42
Ergebnisse
Um Lipoproteinprofile von den verschiedenen Mausgruppen zu erstellen, wurden die
Plasmaproben mit Hilfe der sequentiellen Ultrazentrifugation getrennt und der Triglyzeridbzw.
Cholesteringehalt der einzelnen Fraktionen photometrisch bestimmt. Die Tabelle 4 gibt
einen Überblick über die gewonnenen Lipoproteinprofile der Mausgruppen auf
Standardfutter.
Mittelwert
±SD
T-Test
Tabelle 4: Cholesterin- und Triglyzeridwerte im Plasma
n.s. = nicht signifikant
Mausgruppe Cholesterin Triglyzeride
d/d 178 ± 24,9 697 ± 280
+/+ 155 ± 13 157 ± 117
+/T 179 ± 37,6 90 ± 11,2
d/d / +/+ 0,098 0,004
+/T / +/+ n.s. n.s.
d/d / +/T n.s. 0,004
Im Plasma der Mäuse auf dem Standardfutter ist der Triglyzeridgehalt der homozygoten
Knockout-Mäuse mit 697 mg/dl mehr als viermal so hoch wie der des Wildtyps mit 157
mg/dl. Eine Absenkung des Triglyzeridgehalts in der Transgen-Gruppe ist zwar gegeben,
jedoch erreicht dieser Unterschied zum Wildtyp nicht das Signifikanzniveau (p=0,301).

3.2.2 Ergebnisse der Fettsäureanalyse auf Standardfutter
43
Ergebnisse
In den folgenden Abbildungen sind die Ergebnisse der Fettsäureanalyse in den einzelnen
Organen und im Plasma der Mäuse auf dem Standardfutter dargestellt. Sofern sich die
Graphik nicht auf den Gesamtfettsäuregehalt bezieht, sind die Veränderungen in den Gruppen
immer im Vergleich zur Wildtyp-Gruppe, die gleich eins gesetzt wurde, abgebildet.
3.2.2.1 Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe auf Standardfutter
Mausgruppe
Plasma
[µg/mg]
EpiWAT
[µg/mg]
SubWAT
[µg/mg]
BAT
[µg/mg]
Leber
[µg/mg]
Muskel
[µg/mg]
d/d 5968 ± 2073 596 ± 161 513 ± 90 260 ± 63 26 ± 2 32 ± 12
+/+ 2934 ± 508 665 ± 62 561 ± 50 363 ± 91 32 ± 17 64 ± 25
+/T 2347 ± 309 714 ± 77 532 ± 125 355 ± 183 24 ± 12 65 ± 56
Tabelle 5: Gesamtfettgehalt Plasma gegenüber Gewebe
In Tabelle 5 sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen des Gehalts an
Gesamtfettsäuren im Plasma und in den verschiedenen Organen der drei Mausgruppen
dargestellt. Auffällig ist der signifikant höhere Gehalt an Fettsäuren im Plasma in den d/d-
Mäusen im Vergleich zum Wildtyp und der Transgengruppe (p=0,01), während in deren
Geweben vergleichsweise weniger Fettsäuren vorhanden sind. Der Fettsäuregehalt im Muskel
der homozygoten Knockout-Mäuse ist verglichen mit dem Wildtyp und der Transgengruppe
signifikant geringer (p=0,04). Das epididymale Fettgewebe verhält sich anders als das
subkutane Fettgewebe. Bei letzterem treten kaum Unterschiede zwischen den Gruppen
zutage, während beim epidiymalen Fettgewebe eine jedoch nicht signifikante Zunahme der
Gesamtfettsäuren von den Knockout-Mäusen bis hin zur Transgengruppe zu verzeichnen ist.
3.2.2.2 Ergebnisse im Plasma der Mäuse auf Standardfutter
Betrachtet man den Gesamtgehalt an Fettsäuren im Plasma der drei verschiedenen Gruppen
wie in Abbildung 8 dargestellt, so fallen die signifikant erhöhten Werte der KO-Gruppe auf
(p=0,013). Der triglyzeridsenkende Effekt des ApoA5-Transgens ist erkennbar, erreicht in
diesem Falle jedoch nicht Signifikanzniveau (p=0,084).

[µg/mg]
8000
6000
4000
2000
0
Gesamtfettgehalt im Plasma der Mäuse auf SF
Abb. 8: Gesamtfettsäuren Plasma SF (Standardfutter)
3.2.2.2.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma der Mäuse
auf SF
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 9: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma SF (Standardfutter)
* (p≤0,05)
44
d/d
+/+
+/T
*
*
Ergebnisse
Abbildung 9 zeigt die prozentualen Fettsäureanteile der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma.
Der Anteil an Myristinsäure ist in den KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp erhöht, jedoch
nicht signifikant (p=0,06). Und obwohl die Erhöhung der Werte der Wildtyp- im Vergleich
zur Transgen-Gruppe nicht signifikant ist (p=0,802), verdeutlicht sie den Trend.
Myristölsäure konnte nicht nachgewiesen werden. Bezüglich der Palmitinsäure stellt sich das
Verhältnis der drei Gruppen ähnlich wie bei der Myristinsäure dar.
Während Stearinsäure in der KO-Gruppe signifikant erniedrigt ist (p=0,02), steigt der
Ölsäureanteil in dieser Gruppe auf deutlich höhere Werte im Vergleich zum Wildtyp
(p=0,046). Betrachtet man jedoch die absolut gemessenen Werte für Stearinsäure (nicht
d/d
+/+
+/T

45
Ergebnisse
abgebildet), zeigt sich ein umgekehrtes Bild: Der Stearinsäureanteil ist hier in der KO-Gruppe
verglichen mit der Wildtyp- und Transgengruppe signifikant erhöht.
3.2.2.2.2 Omega-6-Fettsäuren im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf SF
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 10: Omega-6-Vergleich Plasma SF (Standardfutter)
* (p≤0,05)
Die obige Abbildung spiegelt das prozentuale Verteilungsmuster der Fettsäuren der Omega-6-
Desaturase-Reihe im Plasma wider. In der Transgen-Gruppe lässt sich gegenüber dem
Wildtyp ein signifikanter Anstieg (p=0,0377) der Dihomogammalinolensäure verzeichnen.
Auffallend ist außerdem die signifikante Verminderung (p=0,0092) des Arachidonsäureanteils
in der KO-Gruppe.
*
*
*
d/d
+/+
+/T

3.2.2.2.3 Omega-3-Fettsäuren im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
**
Vergleich der ω-3-Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf SF
*
46
*
**
Ergebnisse
Linolensäure Stearidonsäure w3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 11: Omega-3-Vergleich Plasma SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
In Abbildung 11 sind die prozentualen Anteile der Omega 3-Fettsäuren im Plasma dargestellt.
Es fallen einige signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ins Auge: Linolensäure und
Docosapentaensäure sind in der KO-Gruppe im Vergleich zum Wildtyp erhöht (p=0,0031 und
p=0,0009), während Omega-3-Arachidon- und Eicosapentaensäure in der Transgen-Gruppe
verglichen mit dem Wildtyp erhöht sind (p=0,03 und p=0,003).
d/d
+/+
+/T

3.2.2.3 Ergebnisse in der Leber der Mäuse auf Standardfutter
3.2.2.3.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta 9 Desaturase-Reihe in der Leber der
Mäuse auf SF
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 12: Delta-9-Desaturase-Vergleich Leber SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
47
*
**
d/d
+/+
+/T
Ergebnisse
In Abbildung 12 ist das Verteilungsmuster der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der
Leber dargestellt. Der Palmitöl- und Ölsäureanteil in der KO-Gruppe ist im Gegensatz zu den
anderen beiden Gruppen signifikant verringert (p=0,017 und p=0,002).
3.2.2.3.2 Omega-6-Fettsäuren in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf SF
*
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 13: Omega-6-Vergleich Leber SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
*
**
d/d
+/+
+/T

48
Ergebnisse
Die prozentualen Fettsäureanteile der Omega-6-Fettsäuren in der Leber sind in obiger
Darstellung abgebildet (Abb. 13). Während die Linolsäure in den KO-Mäusen signifikant
vermindert ist (p=0,02), zeigt sich bei der Dihomogammalinolen- und der Arachidonsäure ein
signifikanter Anstieg in der KO-Gruppe im Vergleich zum Wildtyp (p=0,02 und p=0,001).
3.2.2.3.3 Omega-3-Fettsäuren in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
*
Vergleich der ω-3-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf SF
Linolensäure Stearidonsäure w 3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 14: Omega-3-Vergleich Leber SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
Was das Verteilungsmuster der Omega-3-Fettsäuren in der Leber betrifft, ergeben sich
zwischen den 3 Gruppen kaum Unterschiede. Lediglich für Alpha-Linolensäure und
Docosahexaensäure lassen sich signifikante Unterschiede für die KO-Gruppe im Vergleich
zum Wildtyp nachweisen. Der erhöhte Wert für Docosapentaensäure in der KO-Gruppe liegt
knapp unter dem Signifikanzniveau (p=0,061). Es wird durch die obige Abbildung der
Eindruck erweckt, dass sich signifikante Unterschiede auch bei den übrigen Fettsäuren,
Omega-3-Arachidon- und Eicosapentaensäure, ergeben. Dies trifft jedoch nicht zu. Als
Ursache hierfür sind die Streuung der Messwerte und die prozentual geringen Mengen, in
denen diese Fettsäuren vorhanden sind, anzunehmen.
**
d/d
+/+
+/T

3.2.2.4 Ergebnisse im Muskel der Mäuse auf Standardfutter
3.2.2.4.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Muskel
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Muskel der
Mäuse auf SF
*
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 15: Delta-9-Desaturase Vergleich Muskel SF (Standardfutter)
* (p≤0,05)
49
*
*
*
d/d
+/+
+/T
Ergebnisse
Diese Abbildung zeigt die Unterschiede der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im
Muskel zwischen den drei Gruppen. Analog zu den Ergebnissen in der Leber sieht man auch
im Muskel eine signifikante Verringerung des Palmitöl- und Ölsäureanteils in der KO-Gruppe
im Vergleich zur Wildtyp (p=0,018 und p=0,006), während Palmitin- und Stearinsäure
signifikant erhöht sind (p=0,013 und p=0,006).

3.2.2.4.2 Omega-6-Fettsäuren im Muskel
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im Muskel der Mäuse auf SF
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 16: Omega-6-Vergleich Muskel SF (Standardfutter)
* (p≤0,05)
50
*
*
d/d
+/+
+/T
Ergebnisse
Im Muskel verhält es sich bezüglich der Omega-6-Fettsäuren ähnlich wie in der Leber.
Dihomogammalinolen- und Arachidonsäure sind in der KO-Gruppe im Vergleich zum
Wildtyp signifikant erhöht (P=0,022 und p=0,011) (Abb. 16).
3.2.2.4.3 Omega-3-Fettsäuren im Muskel
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der ω-3-Fettsäuren im Muskel der Mäuse auf SF
**
Linolensäure Stearidonsäure w3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 17: Omega-3-Vergleich Muskel SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
In Abbildung 17 ist das Verteilungsmuster der Omega-3-Fettsäuren im Muskel dargestellt.
Bei nahezu allen Fettsäuren zeigt sich eine Erhöhung in der KO-Gruppe, die jedoch nur bei
Stearidon-, Docosapenta- und Docosahexaensäure signifikant ist. Lediglich Linolensäure ist
*
**
d/d
+/+
+/T

51
Ergebnisse
in dieser Gruppe nicht signifikant vermindert (p=0,183). Die Werte für Omega-3-
Arachidonsäure und Eicosapentaensäure sind nicht aussagekräftig, da diese Fettsäuren in zu
geringen Konzentrationen vorlagen und in einigen Proben gar nicht nachgewiesen werden
konnten.

3.2.2.5 Ergebnisse im Fettgewebe der Mäuse auf Standardfutter
3.2.2.5.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Fettgewebe
Relative Fettsäurekonz.
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im EpiWAT der Mäuse
auf SF
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 18: Delta-9-Desaturase Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
52
*
**
d/d
+/+
+/T
Ergebnisse
Die Abbildungen 18 und 19 stellen die prozentualen Fettsäureanteile der Delta-9-Desaturase-
Reihe im epididymalen und subkutanen Fettgewebe dar.
Es wird ersichtlich, dass der Palmitöl- und der Ölsäureanteil im epididymalen Fettgewebe der
KO-Mäuse in einer signifikant geringeren Konzentration vorhanden ist (p=0,022 und
p=0,003). Im subkutanen Fettgewebe trifft dies lediglich für die Ölsäure zu (p=0,001).
Relative Fettsäurekonz.
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im SubWAT der Mäuse
auf SF
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 19: Delta-9-Desaturase Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)
** (p≤0,005)
**
d/d
+/+
+/T

3.2.2.5.2 Omega-6-Fettsäuren im Fettgewebe
Relative Fettsäurekonz.
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
**
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im EpiWAT der Mäuse auf SF
*
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 20: Omega-6-Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
Relative Fettsäurekonz.
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im SubWAT der Mäuse auf SF
**
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 21: Omega-6-Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)
** (p≤0,005)
53
**
**
d/d
+/+
+/T
d/d
+/+
+/T
Ergebnisse
Wie aus den obigen Abbildungen (Abb. 20 und 21) ersichtlich, stellt sich das
Verteilungsmuster der Omega-6-Fettsäuren im epididymalen und subkutanen Fettgewebe
ähnlich dar. Der Linolsäureanteil ist in beiden Geweben in der KO-Gruppe signifikant am
höchsten (p

3.2.2.5.3 Omega-3-Fettsäuren im Fettgewebe
Relative Fettsäurekonz.
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-3-Fettsäuren im EpiWAT der Mäuse auf SF
54
*
Ergebnisse
Linolensäure Stearidonsäure w 3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 22: Omega-3-Vergleich EpiWAT SF (Standardfutter)
* (p≤0,05)
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
**
Vergleich der ω-3-Fettsäuren im SubWAT der Mäuse auf SF
Linolensäure Stearidonsäure w 3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 23: Omega-3-Vergleich SubWAT SF (Standardfutter)
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
Bezüglich der Omega-3-Fettsäuren weisen epididymales und subkutanes Fett
Gemeinsamkeiten aber auch Unterschiede auf. Die Linolensäure ist in beiden Geweben in der
KO-Gruppe erhöht. Im epididymalen Fettgewebe bleibt der Unterschied zur Wildtypgruppe
aber unter Signifikanzniveau (p=0,097). Während der Anteil an Eicosapentaensäure im
subkutanen Fettgewebe bei der KO-Gruppe signifikant höher ist (p=0,027), lässt sich dies für
das epididymale Fettgewebe nicht bestätigen. Der Anteil an Docosahexaensäure im
*
d/d
+/+
+/T
d/d
+/+
+/T

55
Ergebnisse
epididymalen Fettgewebe der KO-Mäuse ist signifikant höher als in der Wildtypgruppe
(p=0,017).
Im braunen Fettgewebe (nicht dargestellt) ergeben sich weder für die Fettsäuren der Delta-9-
Desaturase-Reihe noch für die Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren unterschiedliche
Verteilungsmuster zwischen den Gruppen.

3.3 Ergebnisse Hochfettdiät
3.3.1 Gewichtsverlauf während der HFD
56
Ergebnisse
Die Abbildung 24 zeigt den Gewichtsverlauf der vier verschiedenen Mausgruppen während
der HFD. Die homo- und heterozygoten Knockout-Tiere wurden im Alter von 4 Wochen auf
die HFD umgestellt und mit dieser bis zur 17. Lebenswoche gefüttert. Die Wildtyp- und
Transgentiere bekamen die HFD von der 5. bis zur 15. Lebenswoche. Während die Gruppe
der Wildtyptiere über den gesamten Zeitraum konstant am meisten Gewicht zulegen, bleiben
die homozygoten Knockout-Tiere im Verlaufe der Zeit deutlich hinter den Wildtyptieren
zurück. Dieser Unterschied in der Gewichtsentwicklung bleibt über den gesamten Zeitraum
signifikant.
Gewicht [g]
50,0
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
Gewichtsverlauf während der HFD
4 6 8 10 12 14 16 18
Alter [Wochen]
Abb. 24: Gewichtsverlauf HFD
d/d = homozygot knockout, +/d = heterozygot knockout, +/+ = Wildtyp, +/T = transgen
* (p

3.3.2 Lipoproteinprofile der Mäuse auf Hochfettdiät
57
Ergebnisse
Nach 9 (+/T und +/+) bzw. 10 Wochen (+/d und +/d) HFD zeigen sich Unterschiede zwischen
den vier Mausgruppen sowohl beim Cholesterin als auch bei den Triglyzeriden. (Tabelle 6).
Signifikant höhere Cholesterinwerte im Vergleich zum Wildtyp ergeben sich im Plasma und
in der VLDL- und LDL-Fraktion der homo- bzw. heterozygoten Knockout-Tiere. Auch die
transgenen Tiere weisen zum Teil höhere Cholesterinkonzentrationen in diesen Fraktionen
auf. Für die Triglyzeride sind höhere Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp bei den
homo- und heterozygoten Knockout-Tieren im Plasma und in der VLDL-Fraktion
nachzuweisen.
In der HDL-Fraktion zeigt sich ein umgekehrtes Bild: Hier sind die Triglyzeride bei den
homozygoten Knockout-Tieren signifikant erniedrigt im Vergleich zum Wildtyp. In der
Transgen–Gruppe ist eine leichte, jedoch signifikante Absenkung der Triglyzeride im Plasma
und in der VLDL-Fraktion zu sehen.
Mittelwert ± SD
T-Test
Maus-
Gruppe
Cholesterin [mg/dl] Triglyzeride [mg/dl]
Plasma VLDL LDL HDL Plasma VLDL LDL HDL
d/d 221 ± 46,3 40 ± 12,2 119 ± 31,4 113 ± 29,3 159 ± 75 138 ± 56,5 23 ± 10,4 4 ± 1,9
+/d 181 ± 39,4 38 ± 7,5 98 ± 18,2 117 ± 12,7 142 ± 56,2 118 ± 45,9 24 ± 2,12 13 ± 5,59
+/+ 169 ± 21,4 15 ± 2,64 37 ± 10,38 109 ± 8,57 80 ± 11,3 47 ± 9,25 27 ± 2,17 13 ± 2,68
+/T 139 ± 21,5 14 ± 4,53 27 ± 6,07 99 ± 10,67 66± 9,55 32± 8,94 24 ± 4,62 13 ± 3,27
d/d / +/d n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. p < 0,001
+/+ / +/T 0,006 n.s. 0,037 0,04 0,01 0,004 n.s. n.s.
+/d / +/+ n.s. p < 0,001 p < 0,001 n.s. 0,003 p < 0,001 0,026 n.s.
d/d / ++ 0,005 p < 0,001 p < 0,001 n.s. 0,003 p < 0,001 0,251 p < 0,001
Tabelle 6: Cholesterin- und Triglyzeridwerte in Woche 9 bzw. 10 der HFD
n.s. = nicht signifikant
Am Ende der Hochfettdiät sind deutlich geringere Unterschiede zwischen den Gruppen zu
verzeichnen (Tabelle 7). Für Plasmacholesterin und VLDL-Cholesterin lässt sich eine
kontinuierliche Abnahme der Konzentration von d/d bis +/T feststellen. In der
Transgengruppe zeigt sich eine Absenkung des Cholesterins in der LDL- Fraktion.
Bezüglich der Triglyzeride ergibt sich nur noch für die homozygote Knockout-Gruppe im
Vergleich zur Wildtyp-Gruppe eine Erhöhung der Konzentration im Plasma und in der

58
Ergebnisse
VLDL-Fraktion. Die transgenen Tiere weisen signifikant erniedrigte Triglyzeridwerte im
Vergleich zum Wildtyp in der VLDL-Fraktion auf. Auffallend ist jedoch auch hier - analog
zum VLDL-Cholesterin - die kontinuierliche Abnahme von VLDL in den Triglyzeriden über
die Genotypen hinweg.
Deutliche Unterschiede zeigen sich in der HDL-Fraktion bei den Triglyzeriden. Während die
Triglyzeridkonzentrationen bei den homo- und heterozygoten Knockout-Tieren signifikant
erhöht sind, zeigt sich in der Transgen-Gruppe eine signifikante Absenkung im Vergleich
zum Wildtyp.
Mittelwert ± SD
T-Test
Maus-
Gruppe
Cholesterin [mg/dl] Triglyzeride [mg/dl]
Plasma VLDL LDL HDL Plasma VLDL LDL HDL
d/d 172 ± 42,9 14,6 ± 4,26 41 ± 16,3 116 ± 28,2 68,6 ± 20,6 42,2 ± 14,3 14,5 ± 3,53 16 ± 3,28
+/d 150 ± 13 12 ± 2,54 31,6 ± 3,53 111 ± 7,84 42,6 ± 9,69 25,3 ± 7,96 13,4 ± 2,39 20,2 ± 6,19
+/+ 124 ± 9,75 11,3 ± 3,67 34,7 ± 12,9 107 ±8,1 46 ± 8,62 24,8 ± 7,48 14,5 ± 2,84 10,1 ± 2,36
+/T 103 ±14,2 8,97 ± 1,42 21 ± 2,77 99,2 ± 11,5 38 ± 7,85 15,1 ± 4,08 11,9 ± 2,18 6,39 ± 1,64
d/d /+/d n.s. n.s. n.s. n.s. 0,03 0,05 n.s. n.s.
+/+ / +/T 0,013 n.s. 0,047 n.s. n.s. 0,031 n.s. 0,015
+/d /+/+ 0,004 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. 0,005
d/d /++ 0,023 n.s. n.s. n.s. 0,032 0,028 n.s. 0,007
Tabelle 7: Cholesterin- und Triglyzeridwerte in Woche 12 bzw. 14 der HFD

3.3.3 Blutglukose- und Insulinplasmaspiegel der Mäuse auf HFD
59
Ergebnisse
Um den Einfluss des ApoA5-Genlocus auf den Glukosestoffwechsel während einer HFD zu
untersuchen, wurde bei den Mäusen in Woche 11 (+/T und +/+) bzw. Woche 13 (+/d und d/d)
Blut gewonnen und die Glukosekonzentration mit einem Accu-Check®-Aviva-
Blutzuckermessgerät bestimmt. Bei den dabei gewonnenen Werten in Tabelle 8 ergeben sich
signifikante Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Transgen-Gruppe sowie zwischen
dem Wildtyp und den hetero- bzw. homozygot Knockout-Tieren. Während die Wildtyptiere
die höchste Glukosekonzentration im Blut aufweisen, ergeben sich absteigende
Konzentrationen für die Gruppe der transgenen, hetero- und homozygoten Knockout-Tiere.
Mittelwert ± SD
T-Test
Blutglukosekonzentration [mg/dl]
Mausgruppe
Woche 9
OGTT Woche 11 bzw. Woche 13
bzw. 10 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min
d/d 129 ± 21 125 ± 24 200 ± 57 210 ± 60 218 ± 78 134 ± 45
+/d 139 ± 33 134 ± 24 179 ± 48 269 ± 60 278 ± 66 205 ± 70
+/+ 194 ± 33 171 ± 21 270 ± 74 360 ± 89 424 ± 91 353 ± 68
+/T 166 ± 21 167 ± 32 295 ± 83 320 ± 43 372 ± 76 303 ± 69
d/d /+/d n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
+/+ / +/T 0,039 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
+/d /+/+ 0,002 0,016 0,029 n.s. 0,099 0,004
d/d /++ p

BZ [mg/dl]
450
400
350
300
250
200
150
100
50
Verlauf der Blutglukosekonzentration während des OGTT
0
0 15 30 60 120
t [min]
Abb. 25: Blutglukosekonzentration OGTT
d/d = homozygot knockout, +/d = heterozygot knockout, +/+ = Wildtyp, +/T = transgen,
BZ = Blutzucker, * (p

61
Ergebnisse
Ausgangswerts, wohingegen sich die Blutglukosekonzentration in der Wildtyp-Gruppe mehr
als verdoppelt und auch nach 120 Minuten noch auf einem sehr hohen Niveau bleibt.
Mittelwert ± SD
T-Test
Mausgruppe
Insulin [ng/ml]
(O min. OGTT)
HOMA
d/d 0,40 ± 0,27 55,21 ± 47,65
+/d 0,66 ± 0,26 91,39 ± 44,45
+/+ 0,87 ± 0,20 147,1 ± 31,18
+/T 0,92 ± 0,43 164,2 ± 98,00
d/d /+/d n.s. n.s.
+/+ / +/T n.s. n.s.
+/d /+/+ n.s. 0,031
d/d /++ 0,007 0,003
Tabelle 9: Insulinplasmakonzentrationen und HOMA- Indices
n.s. = nicht signifikant
Um Aussagen bezüglich einer Insulinresistenz treffen zu können, wurde im Plasma der Tiere
zum Zeitpunkt 0 Minuten Insulin bestimmt. Tabelle 9 enthält die Insulin- und HOMA-Indizes
der vier verschiedenen Gruppen zum Zeitpunkt 0. Eine signifikante Erniedrigung der
Insulinplasmaspiegel ist in der Homozygot-Knockout-Gruppe im Vergleich zum Wildtyp zu
verzeichnen. Die Auswertung der HOMA-Indizes lässt eine Aussage bezüglich der
Insulinsensitivität zu. Die deutlich geringeren Werte bei den homo- und heterozygoten
Knockout-Tieren im Vergleich zum Wildtyp lassen auf bessere Insulinsensitivität dieser
Gruppen verglichen mit dem Wildtyp schließen. Insgesamt lässt sich ein Gen-Dosis-Effekt
feststellen, da die HOMA-Indizes von den homozgot Knockout- bis zu den transgenen Tieren
zunehmen.

3.3.4 Organgewichte der Tiere auf HFD
Mittelwert
T-Test
Maus-
Gruppe
KG der
Mäuse [g]
62
Organgewichte [g]
Ergebnisse
Leber EpiWAT SubWAT BAT
d/d 36,9 1,42 ± 0,37 1,47 ± 0,42 1,29 ± 0,76 0,21 ± 0,09
+/d 43,0 1,45 ± 0,33 1,87 ± 0,45 1,91 ± 0,46 0,23 ± 0,03
+/+ 44,3 2,35 ± 0,12 1,27 ± 0,77 1,87 ± 0,35 0,23 ± 0,06
+/T 41,0 2,08 ± 0,33 1,20 ± 0,38 1,98 ± 0,62 0,27 ±0,10
d/d /+d - n.s. n.s. n.s. n.s.
+/+/ +/T - n.s. n.s. n.s. n.s.
+/d /+/+ - p

3.3.5 Ergebnisse der Fettsäureanalyse auf Hochfettdiät
63
Ergebnisse
Die folgenden Abbildungen illustrieren das Ergebnis der Fettsäureanalyse der Mäuse auf der
Hochfettdiät (HFD). Sofern nicht auf den Gesamtfettsäuregehalt Bezug genommen wird, sind
die Fettsäuregehalte der Mäusegruppen immer im Verhältnis zum Wildtyp dargestellt.
3.3.5.1 Vergleich Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe
Mausgruppe
Plasma
[µg/mg]
epiWAT
[µg/mg]
subWAT
[µg/mg]
BAT
[µg/mg]
Leber
[µg/mg]
Muskel
[µg/mg]
d/d 1864 ± 445 847 ± 62 773,64± 67 543 ± 112 84 ± 52 61 ± 31
+/d 1383 ± 191 827 ± 96 883 ± 185 602 ± 54 82 ± 24 91 ± 77
+/+ 1476 ± 266 793 ± 70 814 ± 94 578 ± 64 190 ± 22 58 ± 15
+/T 1122 ± 89 853 ± 252 778 ± 103 629 ± 64 140 ± 46 152 ± 131
Tabelle 11: Gesamtfettsäuren Plasma und Gewebe HFD
In Tabelle 11 sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen des Gehalts an
Gesamtfettsäuren im Plasma und in den Geweben der vier verschiedenen Mausgruppen
dargestellt. Aus der obigen Tabelle geht hervor, dass sich deutliche Unterschiede zwischen
den einzelnen Gruppen lediglich im Plasma, der Leber und im Muskel ergeben. Im Plasma
erreicht nur die Variation zwischen der Wildtyp- und der Transgengruppe Signifikanzniveau
(p=0,012). In der Leber hingegen ist der Gesamtfettsäureanteil in allen drei Gruppen im
Vergleich zum Wildtyp signifikant vermindert (+/T: p=0,041; +/d: p=0,0003); d/d: p=0,001).
Aufgrund der sehr großen Streuung der Werte im Muskelgewebe innerhalb der einzelnen
Gruppen lassen sich hier keine signifikanten Unterschiede feststellen.

3.3.5.2 Ergebnisse im Plasma der Mäuse auf HFD
3.3.5.2.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
* *
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Plasma
der Mäuse auf HFD
*
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 27: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma HFD
* (p≤0,05)
64
*
Ergebnisse
d/d +/d
+/+ +/T
Wie aus Abbildung 27 hervorgeht, ergeben sich im Plasma der vier verschiedenen
Mäusegruppen wenige Unterschiede. Für Myristin- und Myristölsäure sind jedoch deutliche
Differenzen zwischen den d/d und +/d- Tieren im Vergleich zum Wildtyp erkennbar. Auch
für Ölsäure besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den homozygoten Knockout-
Tieren und der Wildtypgruppe (p=0,038).

3.3.5.2.2 Omega-6-Fettsäuren im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf HFD
* *
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 28: Omega-6-Vergleich Plasma HFD
* (p≤0,05)
65
d/d +/d +/+ +/T
Ergebnisse
Betrachtet man die Gehalte der Omega-6-Fettsäuren im Plasma der vier verschiedenen
Mausgruppen auf HFD (Abb. 28), so fällt auf, dass der Vorläufer Linolsäure in der Gruppe
der homo- und heterozygoten Knockout-Tiere angereichert ist, während die anderen Omega-
6-Fettsäuren in geringerer Konzentration im Vergleich zum Wildtyp vorhanden sind.
Signifikanzniveau erreicht dieser Unterschied insbesondere bei der Gammalinolensäure (+/d:
p=0,0464 und d/d: p=0,009).
3.3.5.2.3 Omega-3-Fettsäuren im Plasma
Relative Fettsäurekonz.
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
**
Vergleich der ω-3-Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf HFD
*
Linolensäure Stearidonsäure w3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 29: Omega-3-Vergleich Plasma HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
**
d/d +/d +/+ +/T
*

66
Ergebnisse
Gleiches wie für die Omega-6-Fettsäuren gilt für die Omega-3-Fettsäuren der Mäuse auf HFD
(Abb. 29): Der Vorläufer der Fettsäuren der Omega-3-Reihe Linolensäure ist in den homound
heterozygoten Knockout-Tieren in höherer Konzentration vertreten im Vergleich zu den
Wildtyptieren. Die weiteren Omega-3-Fettsäuren sind hingegen in diesen beiden Gruppen
vermindert. Diese Beobachtung erreicht nur in einigen wenigen Fällen Signifikanz (bei d/d
für Omega-3-Arachidonsäure p=0,006; Eicosapentaensäure p=0,005; Docosahexaensäure
p=0,007), jedoch ist der Trend bei allen Fettsäuren dieser Reihe deutlich erkennbar.
Stearidonsäure konnte in keiner der Gruppen nachgewiesen werden.
3.3.5.3 Ergebnisse in der Leber der Mäuse auf HFD
3.3.5.3.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta 9 Desaturase-Reihe in der Leber
der Mäuse auf HFD
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 30: Delta-9-Desaturase Vergleich Plasma HFD
** (p≤0,005)
**
**
**
d/d +/d
+/+ +/T
Abbildung 30 zeigt einen Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe in der Leber
der Mäuse auf der HFD. Große signifikante Unterschiede gibt es bei der Stearin- und der
Ölsäure. Stearinsäure ist in der +/d und der d/d- Gruppe im Vergleich zum Wildtyp stark
angereichert (p=0,003 und p=0,004), wohingegen sich bei der Ölsäure ein umgekehrtes Bild
zeigt (p=0,001 und p=0,002). Myristölsäure wurde in keiner der Gruppen gefunden.
**

3.3.5.3.2 Omega-6-Fettsäuren in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
2,80
2,40
2,00
1,60
1,20
0,80
0,40
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf HFD
*
*
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 31: Omega-6-Vergleich Leber HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
67
d/d +/d +/+ +/T
*
**
Ergebnisse
In Abbildung 31 ist die Verteilung der Omega-6-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf der
HFD dargestellt. Auffallend sind die signifikant geringeren Linol- und
Gammalinolensäuregehalte in den d/d-Tieren im Vergleich zum Wildtyp (p=0,027 für Linolund
p=0,031 für Gammalinolensäure). Der eklatanteste Unterschied zwischen den Gruppen ist
bei der Arachidonsäure zu sehen. Diese Fettsäure ist in den hetero- und homozygoten
Knockout-Tieren im hohen Maße angereichert.
3.3.5.3.3 Omega-3-Fettsäuren in der Leber
Relative Fettsäurekonz.
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der ω-3-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf HFD
Linolensäure Stearidonsäure w 3-Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure
Abb. 32: Omega-3-Vergleich Leber HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
d/d +/d +/+ +/T
*
**

68
Ergebnisse
Bezüglich der Omega-3-Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf der HFD sind für Linolen- und
Stearidonsäure geringere Konzentrationen dieser Fettsäuren in den homozygoten und
heterozygoten Knockout-Tieren festzustellen, die jedoch nicht signifikant sind. Doch das
Endprodukt der Omega-3-Fettsäure-Reihe, Docosahexaensäure, ist in diesen beiden
Tiergruppen im Vergleich zum Wildtyp stark angereichert (+/d: p=0,001 und d/d: p=0,006).
3.3.5.4 Ergebnisse im Muskel der Mäuse auf HFD
3.3.5.4.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Muskel
Relative Fettsäurekonz.
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9 Desaturase-Reihe im Muskel
der Mäuse auf HFD
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 33: Delta-9-Desaturase-Vergleich Muskel HFD
* (p≤0,05)
* *
d/d +/d
+/+ +/T
Abbildung 33 zeigt die unterschiedlichen Konzentrationen der Fettsäuren der Delta-9-
Desaturase-Reihe in den vier Mausgruppen. Lediglich für Palmitölsäure lassen sich
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen beschreiben. Die hetero- und homozygoten
Knockout-Tiere weisen geringere Konzentrationen an Palmitölsäure auf als der Wildtyp (+/d:
p=0,022 und d/d: p=0,021). Die Unterschiede für Stearinsäure sind aufgrund starker Streuung
der einzelnen Messwerte innerhalb einer Gruppe nicht signifikant.

3.3.5.4.2 Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren im Muskel
69
Ergebnisse
Für die Omega-6- und die Omega-3-Fettsäuren im Muskel der Mäuse auf der HFD ergeben
sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Gruppen. Die Omega-3-Fettsäuren
sind zudem in allen Gruppen im Muskel nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden.
3.3.6 Ergebnisse im Fettgewebe der Mäuse auf HFD
3.3.6.1.1 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im Fettgewebe
Relative Fettsäurekonz.
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta -9-Desaturase-Reihe im EpiWAT
der Mäuse auf HFD
*
*
**
*
*
*
d/d +/d
+/+ +/T
* *
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 34: Delta-9-Desaturase-Vergleich EpiWAT HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
Im epiWAT erscheinen deutliche Unterschiede zwischen der Transgengruppe im Vergleich
zum Wildtyp bei Myristin- und Myristölsäure sowie bei Palmitöl-, Stearin- und Ölsäure.
Dabei ist die Fettsäurekonzentration der Myristin-, Myristöl- und Palmitinsäure erhöht,
während Stearinsäure und Ölsäure im Verhältnis zum Wildtyp in geringerer Konzentration
nachgewiesen wurden. Zwischen der homo- und heterozygoten Knockout-Gruppe und dem
Wildtyp besteht hinsichtlich der Palmitin- und der Palmitölsäure ein signifikanter
Unterschied. Palmitinsäure ist in diesen beiden Gruppen im Vergleich zum Wildtyp
vermindert (+/d: p=0,038 und d/d: p=0,003), wohingegen Palmitölsäure erhöht ist (+/d:
p=0,007 und d/d: p=0,08).

Relative Fettsäurekonz.
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Vergleich der Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im SubWAT
der Mäuse auf HFD
Myristinsäure Myristölsäure Palmitinsäure Palmitölsäure Stearinsäure Ölsäure
Abb. 35: Delta-9-Desaturase-Vergleich SubWAT HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
70
**
*
Ergebnisse
d/d +/d
+/+ +/T
In Abbildung 35 sind die Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe im subkutanen Fettgewebe
dargestellt. Bezüglich der Stearinsäure unterscheiden sich die +/d und die d/d–Gruppe im
Verhältnis zum Wildtyp. Diese Säure ist in den genannten Gruppen signifikant erhöht (+/d:
p=0,04 und d/d: p=0,0004).
Im braunen Fettgewebe ergeben sich keine signifikanten Änderungen zwischen den vier
Gruppen.

3.3.6.1.2 Omega-6-Fettsäuren im Fettgewebe
Relative Fettsäurekonz.
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im EpiWATder Mäuse auf HFD
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
*
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 36: Omega-6-Vergleich EpiWAT HFD
Relative Fettsäurekonz.
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im SubWAT der Mäuse auf HFD
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
*
71
d/d +/d +/+ +/T
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 37: Omega-6-Vergleich SubWAT HFD
Relative Fettsäurekonz.
2,00
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Vergleich der ω-6-Fettsäuren im BATder Mäuse auf HFD
**
*
d/d +/d +/+ +/T
Linolsäure g-Linolensäure Dihomogammalinolensäure Arachidonsäure
Abb. 38: Omega-6-Vergleich BAT HFD
* (p≤0,05), ** (p≤0,005)
d/d +/d +/+ +/T
Ergebnisse

72
Ergebnisse
Die obigen drei Abbildungen (36-38) stellen das Verteilungsmuster der Omega-6-Fettsäuren
im epididymalen, subkutanen und braunen Fettgewebe dar. Für alle drei Fettgewebsarten lässt
sich ein ähnliches Muster erkennen. Gammalinolensäure ist in der homo- und heterozygoten
Knockout-Gruppe in allen drei Geweben im Verhältnis zum Wildtyp vermindert. Nicht
überall erreicht diese Beobachtung Signifikanzniveau, doch der Trend ist eindeutig. Auch bei
Dihomogammalinolen- und Arachidonsäure scheinen Unterschiede zwischen den Gruppen zu
bestehen. Jedoch sind die gemessenen Konzentrationen dieser Fettsäuren sehr gering und die
Streuung der Werte sehr hoch, so dass über deren Verteilung bezüglich der einzelnen
Gruppen keine Aussage getroffen werden kann.
3.3.6.1.3 Omega-3-Fettsäuren im Fettgewebe
EpiWAT C 18:3 (n-3) C 18:4 (n-3) C 20:4 (n-3) C 20:5 (n-3) C 22:5 (n-3) C 22:6 (n-3)
d/d 0,4 ± 0,08 0,004 ± 0,002 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,001 0,02 ± 0,02
+/d 0,43 ± 0,1 0,01 ± 0,001 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,001 0,03 ± 0,03
+/+ 0,33 ± 0,16 0,01 ± 0,003 n. ng. n. ng. 0,03 ± 0,01 0,04 ± 0,01
+/T 0,55 ± 0,19 0,01 ± 0,001 n. ng. n. ng. 0,02 ± 0,01 0,04 ± 0,03
Tabelle 12: Omega-3-Fettsäuren EpiWAT HFD
n.ng = nicht nachgewiesen
subWAT C 18:3 (n-3) C 18:4 (n-3) C 20:4 (n-3) C 20:5 (n-3) C 22:5 (n-3) C 22:6 (n-3)
d/d 0,33 ± 0,14 0,003 ± 0,002 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01
+/d 0,33 ± 0,09 0,003 ± 0,002 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,002 0,01 ± 0,04
+/+ 0,4 ± 0,8 0,004 ± 0,001 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,03 0,01 ± 0,03
+/T 0,47 ± 0,07 0,004 ± 0,001 n. ng. n. ng. 0,01 ± 0,003 0,02 ± 0,07
Tabelle 13: Omega-3-Fettsäuren SubWAT HFD
n.ng. = nicht nachgewiesen
BAT C 18:3 (n-3) C 18:4 (n-3) C 20:4 (n-3) C 20:5 (n-3) C 22:5 (n-3) C 22:6 (n-3)
d/d 0,38 ± 0,6 0,03 ± 0,005 0,008 ± 0,001 0,01 ± 0,003 0,04 ± 0,02 0,18 ± 0,08
+/d 0,4 ± 0,05 0,03 ± 0,002 0,006 ± 0,001 0,008 ± 0,001 0,03 ± 0,01 0,15 ± 0,02
+/+ 0,39 ± 0,7 0,03 ± 0,01 0,007 ±.0,001 0,01 ±. 0,003 0,04 ± 0,01 0,13 ± 0,06
+/T 0,42 ± 0,04 0,04 ± 0,004 0,006. ± 0,001 0,009 ± 0,002 0,03 ± 0,004 0,1 ± 0,04
Tabelle 14: Omega-3-Fettsäuren BAT HFD
n.ng. = nicht nachgewiesen

73
Ergebnisse
In den drei obigen Tabellen (12-14) sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der
prozentualen Fettsäureanteile der Omega-3-Fettsäuren im Fettgewebe in den vier
Mausgruppen dargestellt. Es wird ersichtlich, dass die Konzentration der Omega-3-Fettsäuren
in allen drei Fettgeweben sehr gering ist. Omega-3-Arachidon- und Eicosapentaensäure liegen
im epididymalen und subkutanen Fettgewebe sogar unter der Nachweisgrenze. Die im
epididymalen Fettgewebe auftretenden signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bei
der Linolen- (C 18:3) und Docosapentaensäure (C 22:5) sind aufgrund der gemessenen
Konzentrationen und der Streuung der Werte innerhalb der Gruppen nicht auswertbar. Somit
ergeben sich im Fettgewebe für die Omega-3- Fettsäuren keinerlei nennenswerte
Unterschiede zwischen den Gruppen.

3.3.6.1.4 Gesättigte und einfach ungesättigten Fettsäuren in Plasma und Leber
Relative Fettsäurekonzentration
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
Auswahl gesättigter Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf HFD
Stearinsäure Arachinsäure Behensäure Lignoceronsäure
Abb. 39: Gesättigte Fettsäuren Plasma HFD
Relative Fettsäurekonzentration
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Auswahl gesättigter Fettsäuren in der Leber der Mäuse auf HFD
Stearinsäure Arachinsäure Behensäure Lignoceronsäure
Abb. 40: Gesättigte Fettsäuren Leber HFD
74
Ergebnisse
d/d +/d
+/+ +/T
d/d +/d
+/+ +/T
Die Abbildungen 39 und 40 zeigen die relative Fettsäurekonzentration einiger gesättigter
Fettsäuren im Plasma und in der Leber der Mäuse auf der HFD. Es ist deutlich zu erkennen,
dass Behen- und Lignoceronsäure im Plasma in der homo- und heterozygoten Knockout-
Gruppe im Vergleich zum Wildtyp vermindert sind, während es in der Leber dieser beiden
Gruppen zu einer Anreicherung dieser Fettsäuren kommt.

Relative Fettsäurekonzentration
Auswahl einfach ungesättigter Fettsäuren im Plasma der Mäuse auf HFD
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Ölsäure Eicosaensäure Erucasäure Nervonsäure
Abb. 41: einfach ungesättigte Fettsäuren Plasma HFD
Relative Fettsäurekonzentration
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Auswahl einfach ungesättigter Fettsäuren in der Leber
der Mäuse auf HFD
75
Ergebnisse
d/d +/d
+/+ +/T
d/d +/d
+/+ +/T
Ölsäure Eicosaensäure Erucasäure Nervonsäure
Abb. 42: einfach ungesättigte Fettsäuren Leber HFD
Auch für die einfach ungesättigten Fettsäuren im Plasma und in der Leber der Mäuse auf der
HFD ergibt sich ein eindeutiges Verteilungsmuster, das dem der gesättigten Fettsäuren ähnelt
(Abb. 41 und 42). Eruca- und Nervonsäure sind im Plasma der homo- und heterozygoten
Knockout-Gruppe in geringerer Konzentration vorhanden im Vergleich zum Wildtyp. In der
Leber bietet sich jedoch ein umgekehrtes Bild. Dort sind Eruca- und Nervonsäure in diesen
Gruppen erhöht. Bezüglich der Eicosaensäure lässt sich für d/d und die +/d Gruppe im Plasma
eine Erhöhung und in der Leber eine Verminderung im Vergleich zur Wildtypgruppe

76
Ergebnisse
verzeichnen. Signifikant ist diese Beobachtung allerdings nur in der Leber für die d/d-Gruppe
(p=0,028).

4 DISKUSSION
77
Diskussion
ApoA5 spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation des Triglyzeridmetabolismus.
Bekanntermaßen aktiviert ApoA5 die Lipoproteinlipase, wodurch es zu einer gesteigerten
plasmatischen Hydrolyse von VLDL und Chylomikronen kommt. In dieser Arbeit sollte
untersucht werden, ob ApoA5 auch auf Organfettsäuren eine Hydrolysesteigernde Wirkung
ausübt.
Anhand einer detaillierten Fettsäureanalyse der Organe und des Plasmas von ApoA5defizienten,
ApoA5-transgenen und Wildtyptieren wurde deren Fettsäureverteilungsmuster
bestimmt. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer Hochfettdiät auf die
Fettsäureverteilungsmuster der Mäuse mit den verschiedenen genetischen Hintergründen
untersucht.
Veränderungen im Fettsäuremetabolismus wird eine zentrale Rolle in der Entstehung der
Insulinresistenz beigemessen. Daher sollte in einer weiteren Fragestellung geklärt werden, ob
die bei ApoA5-defizienten Mäusen erhöhten Triglyzeridkonzentrationen im Plasma eine
periphere Insulinresistenz verursachen können.
4.1 Ergebnisse der Studie auf Standardfutter
4.1.1 Gesamtfettsäuregehalt im Plasma und in den Organen
Das Plasma der Knockout-Mäuse weist einen höheren Gesamtfettsäuregehalt auf als das der
Wildtyp-Mäuse. Dieser Fettsäuregehalt korrespondiert mit den hohen Plasma-Triglyzeriden
der Tiere, die durch eine vermindertete plasmatische Triglyzerid-Hydrolyse entstehen
(PENNACCHIO et al. 2001, MERKEL et al. 2005, SCHAAB et al. 2004). Passend dazu
findet sich im epididymalen und braunen Fettgewebe sowie im Muskel ein geringerer
Fettsäuregehalt. Das subkutane Fettgewebe ist nicht von der A5-Veränderung betroffen.
Möglicherweise verhält sich das subkutane Fettgewebe biologisch anders. Beim Menschen
sind die Unterschiede zwischen viszeralen und subkutanen Fettdepots hinreichend bekannt.
Insbesondere die im Gegensatz zum subkutanen Fettgewebe erhöhte Ansprechbarkeit auf die
Katecholamin-induzierte Lipolyse und das Sekretionsmuster des viszeralen Fettgewebes,

78
Diskussion
welches das epididymale Fettgewebe einschließt, weisen auf eine andere biologische Aktivität
dieser Fettdepots hin (HAUNER 2006).
Anhand der Werte der Transgen-Gruppe wird ersichtlich, dass transgene Expression von Apo
A5 nicht zu einer signifikanten Veränderung führt. Somit ist lediglich das Vorhandensein von
ApoA5 und nicht dessen Menge für die hydrolysierende Wirkung von Bedeutung. Diese
Beobachtung steht im Gegensatz zu den Ergebnissen bei organspezifischer Überexpression
von LPL (LEVAK-FRANK et al 1995, LEVAK-FRANK et al 1997, LEVAK-FRANK et al
1999, WEINSTOCK et al. 1997).
4.1.2 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe
Die Herkunft der Fettsäuren (Futter oder Synthese) war mit den durchgeführten Experimenten
nicht zu untersuchen. Jedoch findet man im normalen Futter große Anteile an Palmitin- und
Ölsäure; beide Fettsäuren werden auch im Säuger in den meisten Organen, vor allem in Leber
und Fettgewebe, de novo synthetisiert Dies spiegelt sich auch im Plasma der Mäuse aller
Gruppen wider. Im Vergleich der Gruppen miteinander zeigen sich erhöhte Werte dieser
beiden Fettsäuren in der Knockout-Gruppe. Dies ist mit den höheren Triglyzeriden, die diese
Tiere aufweisen, zu erklären. Palmitin- und Ölsäure stellen den prozentual größten Anteil der
Fettsäuren in den Triglyzeriden. Auch das erhöhte Verhältnis von Ölsäure zu Stearinsäure
(C18:1/C18:0) im Plasma in der Knockout-Gruppe könnte somit in diesem Falle durch die
erhöhten Triglyzeride bedingt sein. Stearinsäure ist relativ wenig in Triglyzeriden vorhanden.
Die Stearinsäure-Spiegel stellen also am ehesten einen Verdünnungseffekt dar. Palmitölsäure
ist im Futter nicht vorhanden und ist daher de novo synthetisiert.
Überraschenderweise sind die Anteile der Palmitöl- und Ölsäure in allen Geweben in der
Knockout-Gruppe verringert. Dies entspricht dem geringeren Gesamtfettgehalt in diesen
Geweben, da Ölsäure als wichtigste Triglyzeridspeicherform gilt. Die Verhältnisse von
Palmitölsäure zu Palmitinsäure (C16:1/C16:0) und von Ölsäure zu Stearinsäure
(C18:1/C18:0) sind im epididymalen Fettgewebe, in der Leber und am auffälligsten im
Muskel in den Knockout-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp vermindert.
Dies deutet zum einen auf einen geringeren Triglyzeridgehalt wie auch auf eine verminderte
Aktivität der Delta-9-Desaturase hin. Der Palmitölsäure-Gehalt spiegelt somit den geringeren

79
Diskussion
Grad an de novo Lipogenese in den Organen wider. Die Delta-9-Desaturase wird auch als
Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD) bezeichnet und katalysiert den entscheidenden Schritt in der
Synthese von MUFAs. In der Maus sind bisher vier Isoformen der SCD identifiziert worden
(POPEIJUS et al. 2008). SCD1 wird hauptsächlich im weißen Fettgewebe, der Leber und
Lunge sowie in der Haut exprimiert. SCD2 ist im Wesentlichen im Gehirn und in geringerer
Ausprägung auch im weißen Fettgewebe, der Lunge, Haut und Leber exprimiert. SCD3 wird
exklusiv in der Haut und SCD4 hauptsächlich im Herzen exprimiert. Somit könnte es sich bei
den oben beschriebenen Ergebnissen um eine verringerte Aktivität der SCD1 oder SCD2 in
den Geweben der Knockout-Mäuse handeln. Eine erhöhte SCD-Aktivität ist mit Adipositas
und Insulinresistenz in Verbindung gebracht worden (VESSBY et al. 2002). Somit ließe eine
verminderte SCD-Aktivität auf erhaltene Insulinsensitivität schließen.
4.1.3 Omega-6-Fettsäuren
Der Linolsäureanteil im Futter der Tiere auf normaler Diät beträgt mehr als 50% und ist also
als essentielle Fettsäure im Überfluss vorhanden. Entsprechend finden sich in Leber und
Muskel ähnliche Konzentrationen. Über das Futter nehmen alle Tiere im Prinzip die gleiche
Menge an Linolsäure auf. Dennoch ist die Linolsäure im Fettgewebe deutlich angereichert,
während sie in der Leber vermindert ist.
Errechnet man den Lipogenese-Index, welcher sich aus dem Verhältnis von Palmitinsäure zu
Linolsäure (C16:0/C18:2 n-6) ergibt (CHONG et al. 2008), wird ersichtlich, dass die
Lipogenese in der Leber bei den Knockout-Tieren hochreguliert, im epididymalen und
subkutanen Fettgewebe jedoch verringert ist. Dies könnte die unterschiedlich hohen Anteile
an Linolsäure erklären, da Lipogenese durch einen Anstieg von Palmitin- und eine Abnahme
von Linolsäure in den Trigylzeriden gekennzeichnet ist.
Die Verteilung von Dihomogammalinolen- und Arachidonsäure im Plasma und in den
Geweben ist gegensätzlich. Während die beiden Fettsäuren im Plasma der KO-Gruppe
vermindert sind, weisen die Gewebe der KO-Mäuse in den meisten Fällen signifikant höhere
Anteile dieser Fettsäuren auf. Dies könnte auf einen Verdünnungsefekt im Plasma bzw. eine
Omega-6-Induktion in den Geweben zurückzuführen sein. Die hohe Linolensäure im Plasma

80
Diskussion
entspricht ihrem hohen Anteil in den Triglyzeriden und entstammt als essentielle Fettsäure
dem Futter.
Die signifikante Verminderung des Arachidonsäuregehalts im Plasma in der KO-Gruppe ist
vermutlich auf die erhöhten Triglyzeride zurückzuführen, wodurch es zu einem
„Verdünnungseffekt“ der PUFAs kommt. Die Erhöhung der Dihomogammalinolen- und
Arachidonsäure in den Geweben könnte auf einen prozentual höheren Phospholipidanteil in
den Geweben hindeuten, da diese Fettsäuren in Phospholipiden angereichert sind.
4.1.4 Omega-3-Fettsäuren
Betrachtet man die Omega-3-Fettsäuren im Plasma und den Geweben, fällt auf, dass
Linolensäure im Plasma, im epididymalen und subkutanen Fettgewebe in der KO-Gruppe
angereichert ist. In der Leber und im Muskel ist diese Fettsäure vermindert. Erhöhte Delta-6-
Desaturase-Indices (Stearidonsäure zu Alpha-Linolensäure, C18:4 n-3 und C18:3 n-3) in
diesen Organen in der KO- Gruppe sprechen für einen vermehrten Umsatz von Linolensäure
zu Omega-3-PUFAs.
Docosapenta- und Docosahexaensäure sind in der Leber und im Muskel in den Knockout-
Tieren erhöht. Diese Fettsäuren sind vorwiegend in Phospholipiden zu finden und sind
wichtig für die Funktionsfähigkeit der Neuronen (UNDURTI 2006). Ihre Konzentrationen
werden vom Körper möglichst konstant gehalten, so dass eine Erhöhung dieser Fettsäuren
aufgrund einer Erniedrigung anderer zustande kommt.
4.2 Ergebnisse der Studie auf Hochfettdiät
4.2.1 Gewichtsverlauf
Die zu Beginn der Fütterungsstudie differierenden Gewichte der Mäuse der vier Gruppen sind
durch das unterschiedliche Alter der Mäuse erklärbar.

4.2.2 Lipide
81
Diskussion
Bei den gemessenen Lipoproteinprofilen der vier verschiedenen Gruppen ist ein deutlicher
Gen-Dosis-Effekt erkennbar. Insbesondere das Plasma, die VLDL- und HDL-Fraktionen
weisen beträchtliche Unterschiede zwischen den gemessenen Triglyzeridkonzentrationen von
Wildtyp- und Knockout-Mäusen auf. Dies deckt sich mit der von O’Brien et al. (2005)
ermittelten Assoziation von ApoA5 mit VLDL, HDL und Chylomikronen.
Jedoch ist die zu erwartende Triglyzeridsenkung in der Transgen-Gruppe auf der HFD nur am
Ende der Fütterungsstudie in schwacher Ausprägung erkennbar. Möglicherweise maskiert
daher die HFD die normalerweise triglyzeridsenkende Wirkung des ApoA5-Transgens.
4.2.3 Insulinresistenz
Die eingangs formulierte Hypothese einer Insulinresistenz bei den ApoA5-Knockout-Tieren
aufgrund erhöhter Triglyzeridwerte konnte nicht bestätigt werden. Die homozygoten
Knockout-Mäuse weisen im Gegenteil die höchste Glukosetoleranz auf. Die im Vergleich
zum Wildtyp erniedrigten Insulin- und HOMA-Werte der homozygoten Knockout-Mäuse
unterstreichen diese Beobachtung.
Aufgrund der hohen Insulin- und HOMA-Werte bei den transgenen Tieren lässt sich jedoch
eine andere Hypothese formulieren. Die nachgewiesene Interaktion von LPL und ApoA5
(SCHAAP et al. 2004, MERKEL et al. 2005) lässt aufgrund einer Überexpression von ApoA5
in den transgenen Mäusen eine erhöhte Aktivität der LPL und einen damit erhöhten
Fettsäureeinstrom aus dem Plasma vermuten. Überexpression von LPL ist
nachgewiesenermaßen mit Insulinresistenz assoziiert (FERREIRA et al. 2001, KIM et al.
2001). Somit könnte für die transgenen Tiere ein insulinresistenzinduzierender Mechanismus
durch Anreicherung von Fettsäuren und ihrer Metaboliten in den Geweben angenommen
werden. In den Knockout-Tieren ist die LPL-Aktivität vermindert, und der Hypothese folgend
zeigen diese Tiere auch eine bessere Insulinsensitivität.
In der Leber führt eine vermehrte Aufnahme und Produktion von Fetten zu einer
Akkumulation von Lipiden (Steatose), welche ursächlich mit der Entstehung von
Insulinresistenz in Zusammenhang gebracht werden kann (UTZSCHNEIDER u. KAHN
2006). Der Vergleich der Lebergewichte der vier verschiedenen Gruppen zeigt, dass die

82
Diskussion
homo- und heterozygoten Knockout-Tiere verglichen mit dem Wildtyp signifikant geringere
Lebergewichte aufweisen. Diese Beobachtung korreliert mit den gemessenen
Gesamtfettsäuren in der Leber. Der Gehalt an Gesamtfettsäuren in der Leber bei den homound
heterozygoten Knockout-Tieren ist um die Hälfte geringer als bei der Wildtypgruppe.
Somit ist bei den Knockouts keine insulinresistenzinduzierende Lipotoxizität in der Leber
gegeben.
4.2.4 Fettsäuren der Delta-9-Desaturase-Reihe
Im Plasma der Knockout-Mäuse sind sowohl Myristin- als auch Ölsäure im Vergleich zum
Wildtyp erhöht. Die Erhöhung dieser Fettsäuren in den Knockouts ist auf den erhöhten
Triglyzeridspiegel im Plasma dieser Tiere zurückzuführen. Ölsäure ist die dominierende
Fettsäure in Triglyzeriden.
Im epididymalen Fettgewebe sind Myristöl- und Palmitölsäure bei den Knockouts erhöht,
während Palmitinsäure im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt ist. Eine mögliche Erklärung für
diese Beobachtung wäre eine höhere Aktivität der Delta-9-Desaturase bei den Knockouts. Auf
der anderen Seite könnte aber auch ein höherer Anteil an Triglyzeriden für den Anstieg
verantwortlich sein. Beide Delta-9-Desaturase-Indices Palmitölsäure zu Palmitinsäure und
Ölsäure zu Stearinsäure (C16:1/C16:0 und C18:1/C18:0) sind im epididymalen Fettgewebe
der Knockouts im Vergleich zum Wildtyp erhöht, so dass eine Aktivierung der SCD1 oder
SCD2 angenommen werden kann.
Die geringere Konzentration an Palmitinsäure deutet auf eine Reduzierung der
lipogenetischen Aktivität des epididymalen Fettgewebes bei den Knockouts hin. Ein Blick auf
den Lipogenese-Index für das epididymalen Fettgewebe bestätigt diese Vermutung.
Das subkutane Fettgewebe weist keine dem epididymalen Fettgewebe vergleichbaren
Ergebnisse auf. Auffallend ist der hohe Stearinsäuregehalt bei den Knockout-Tieren
verglichen mit dem Wildtyp. Möglicherweise enthält das subkutane Fettgewebe prozentual
gesehen mehr Phospholipide, die einen hohen Anteil an ungesättigten Fettsäuren zur
Aufrechterhaltung der Funktionen und Fluidität zellulärer Membranen aufweisen
(NAKAMURA u. NARA 2004). Die Verhältnisse von Palmitölsäure zu Palmitinsäure und
Ölsäure zu Stearinsäure (C16:1/C16:0 und C18:1/C18:0) im subkutanen Fettgewebe der

83
Diskussion
Knockout-Tiere zeigen eine Verringerung im Vergleich zum Wildtyp. Dies ist vermutlich auf
einen depotspezifischen Effekt zurückzuführen.
In der Leber fällt wie im subkutanen Fettgewebe ein erhöhter Stearinsäureanteil bei den
Knockout-Tieren auf, während Ölsäure bei diesen Tieren im Vergleich zum Wildtyp in
geringerer Konzentration vorhanden ist. Stearinsäure ist im Gegensatz zur Ölsäure in
Triglyzeriden deutlich unterrepräsentiert, so dass auch in der Leber auf einen prozentual
höheren Anteil an Phospholipiden aufgrund eines verminderten Gehalts an Triglyzeriden
geschlossen werden kann. In der Leber ist lediglich das Verhältnis von Ölsäure zu
Stearinsäure (C18:1/C18:0) bei den Knockout-Tieren im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt,
so dass der Effekt wahrscheinlich auf dem oben beschriebenen Mechanismus beruht und nicht
auf einer Veränderung der SCD-Aktivität.
4.2.5 Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren
Im Plasma ist der Vorläufer der Omega-6-Fettsäuren Linolsäure bei den homo- und
heterozygoten Knockout-Tieren erhöht, wohingegen die nachgeordneten Produkte in
geringeren Konzentrationen vorliegen. Ein ähnliches Verteilungsmuster ergibt sich im
epididymalen Fettgewebe. Im subkutanen und braunen Fettgewebe verhält sich lediglich die
Gammalinolensäure nach dem oben genannten Muster. Auch für Leber und Muskel ist eine
Verringerung der Gammalinolensäurekonzentration bei den Knockouts erkennbar. Diese
Beobachtung lässt eine verringerte Konversionsrate von Linolsäure zu Arachidonsäure
vermuten. Die Delta-6-Desaturase katalysiert den Schritt von Linolsäure zu
Gammalinolensäure (NAKAMURA u. NARA 2002). Eine Anreicherung von Linolsäure
könnte auf eine verringerte Enzymaktivität der Delta-6-Desaturase bei den Knockouts
hindeuten. Betrachtet man die Delta-6-Desaturase-Indices, das Verhältnis von Gammalinolenzu
Linolsäure (C 18:3 n-6/ C 18:2 n-6) bzw. von Stearidon- zu Alphalinolensäure (C 18:4 n-3/
C 18:2 n-3), so zeigt sich tatsächlich in einigen Fällen eine Verminderung bei den Knockouts.
Auf der anderen Seite könnte eine verringerte Gammalinolensäurekonzentration auch durch
eine erhöhte Aktivität der Elongase 5 (ELOVL5) zustande kommen. MOON et al. (2009)
konnten zeigen, dass die Konversion von Gammalinolensäure zu Dihomogammalinolensäure
von der Aktivität der ELOVL5 abhängt. Eine Anreicherung von Gammalinolensäure wäre
folglich durch eine verringerte ELOVL5-Aktivität bedingt. Als Konsequenz einer

84
Diskussion
verminderten ELOVL5-Aktivität kommt es zu einer Verringerung der Arachidonsäure und
Docosahexaensäure. Dies wiederum führt zu einer Aktivierung von Sterol Regulatory
Element Binding Protein (SREBP)-1c (MOON et al. 2009). SREBP-1c ist die dominierende
SREBP-1-Isoform in der Leber, welche die Expression von Genen der Lipogenese reguliert
(HORTON et al. 2002). Letztlich kumuliert die überschießende Lipogenese in einer Steatose.
Die erhöhten Leberorgangewichte und Gesamtfettsäuregehalte der Wildtyp- und
Transgentiere könnten ein Hinweis auf den oben beschriebenen Mechanismus sein.
In der Leber fällt eine Erhöhung der Arachidonsäurekonzentration bei den homo- und
heterozygoten Knockout-Tieren auf. Dies ist am ehesten auf einen Verdünnungseffekt
zurückzuführen. Die Leber der Knockout-Tiere weist weniger Triglyzeride auf. Der Anteil an
den in den Triglyzeriden dominierenden C:16 und C:18-Fettsäuren am Gesamtfettsäuregehalt
ist somit geringer. Prozentual steigt daher der Arachidonsäureanteil. Arachidonsäure ist neben
Docosahexaensäure eine der Hauptfettsäuren in Phospholipidmembranen (SPRECHER 2000).
Außerdem ist sie das Substrat für die Synthese von Eikosanoiden. Aus diesem Grund ist diese
Fettsäure mit am stärksten reguliert, so dass deren Konzentration in den Geweben möglichst
konstant gehalten wird (ZHOU u. NILSSON 2001).
Das Verteilungsmuster der Omega-3-Fettsäuren im Plasma und den Geweben der Mäuse
erscheint uneinheitlich. Sofern nachweisbar, ist eine Verringerung der
Stearidonsäurekonzentration bei den Knockouts erkennbar. Dies könnte mit den oben
beschriebenen Aktivitäten von der Delta-6-Desaturase oder der ELOVL5 in Zusammenhang
gebracht werden, da auch die Omega-3-Fettsäure-Synthese von diesen Enzymen reguliert
wird. Auch die Anreicherung des Endprodukts Docosahexaensäure spricht - analog zur
Arachidonsäure - bei den Omega-6-Fettsäuren- für eine selektive Erhaltung von PUFAs in
Phospholipidmembranen.

4.3 Methodendiskussion
Lipidextraktion und gaschromatographische Fettsäurebestimmung
85
Diskussion
Um reproduzierbare Ergebnisse bei der Analyse zu erhalten, ist eine Kontamination der
Lösungsmittel, der Lipidstandards und der Glaswaren zu vermeiden. Die Bördelkappen
müssen eine Teflonbeschichtung haben, da die Lösungsmittel andere Kunststoffe angreifen
und Bestandteile aus dem Deckel in die Probe entweichen könnten.
Die Methode der Lipidextraktion ist für das Muskelgewebe aufgrund dessen Inhomogenität
nicht optimal. Differierende Anteile des die Muskelfasern umgebenden Bindegewebes und
unterschiedlicher Wassergehalt sind für hohe Standardabweichungen beim Muskelgewebe
verantwortlich.
Die gaschromatische Fettsäurebestimmung unter Verwendung eines internen Standards gilt
als sehr zuverlässig. Der interne Standard, eine festgelegte Menge an Heptadekansäure (C
17:0), wurde mindestens einmal vor und einmal nach jeder Sequenz in den Injektor des
Gaschromatographen eingespritzt. Dadurch entsteht eine stets gleich bleibende Referenz für
alle anderen Fettsäuren.
Für alle Proben wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Abweichungen von 10%
wurden toleriert. In Einzelfällen flossen Abweichungen bis zu 20% in die Ergebnisse mit ein.
Bei den Abweichungen von 20% handelte es sich meistens um Fettsäuren geringer
Konzentration. Hier war es dem Auswertungsprogramm oft nicht möglich, zwischen
Störpeaks und den Peaks der Fettsäuren zu unterscheiden. Um für diese Fettsäuren dennoch
zu einem Ergebnis zu kommen, wurden die Peaks manuell nachintegriert. Diese manuelle
Nachintegration ist nicht immer reproduzierbar und mit Ungenauigkeiten behaftet. Ein
weiteres Problem ergibt sich bei der Überlagerung von Peaks, wodurch ebenfalls eine
manuelle Integration erforderlich wird.

5 ZUSAMMENFASSUNG
Maina Wehner
86
Zusammenfassung
Untersuchung zum Einfluss von Apoprotein A5 auf Glukose- und Fettsäurestoffwechsel
im genetisch manipulierten Mausmodell
Apolipoprotein A5 ist ein von der Leber produziertes Protein, welches in kleinen Mengen im
Plasma vorhanden ist, jedoch einen großen Einfluss auf den Plasmatriglyzeridlevel ausübt.
Der diesem Einfluss zugrunde liegende Mechanismus ist bis heute nicht sicher geklärt. In
vitro- und in vivo-Studien haben gezeigt, dass ApoA5 die proteoglykangebundene
Lipoproteinlipase aktiviert. Somit trägt ApoA5 zur Triglyzeridhydrolyse in VLDL und
Chylomikronen bei und bedingt die Freisetzung von freien Fettsäuren.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von ApoA5 auf die Fettsäureverteilungsmuster im
Plasma und den verschiedenen Organen sowohl auf Standardfutter als auch auf einer
Hochfettdiät zu untersuchen. Aufgrund der Annahme, dass erhöhte freie Fettsäurespiegel eine
Insulinresistenz begünstigen, wurden außerdem die Glukosetoleranz und die
Insulinsensitivität der Mäuse auf der Hochfettdiät bestimmt.
Drei verschiedene Tiergruppen (ApoA5 Wildtyp, ApoA5 Transgen, ApoA5 Knockout)
wurden mit Standardfutter ernährt, während die folgenden 4 Tiergruppen (ApoA5 Wildtyp,
ApoA5 Transgen, ApoA5 heterozygot Knockout, ApoA5 homozygot Knockout) für 12
Wochen mit einer hochfetthaltigen Nahrung gefüttert wurden. Sowohl für die Tiere auf
Standardfutter als auch für die Tiere auf der Hochfettdiät wurde ein Lipoproteinprofil erstellt
und eine gaschromatographische Analyse zur Bestimmung der Fettsäuremuster in den
Organen durchgeführt.
Betrachtet wurden neben den Gesamtfettsäuregehalten der Organe jeweils die Fettsäuren der
Delta-9-Desaturase-Reihe sowie die Omega-6-und Omega-3-Fettsäuren. Dabei zeigen sich für
einzelne Fettsäuren Unterschiede insbesondere zwischen den Knockout-Tieren und dem
Wildtyp, welche jeweils auf Induktion oder Verringerung von Enzymaktivitäten oder

87
Zusammenfassung
Verschiebungen in den Lipidklassen hindeuten. Bei der Bestimmung des
Gesamtfettsäuregehalts der Tiere auf Standardfutter wurden im Plasma der Knockout-Mäuse
signifikant höhere Gehalte festgestellt, während im epididymalen Fettgewebe und im Muskel
geringere Gehalte vorlagen. Interessanterweise fanden sich im subkutanen Fettgewebe
keinerlei Unterschiede zwischen den Gruppen. Die Ergebnisse der Messung von Fettsäuren
der Delta-9-Desaturase-Reihe, der Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren in den Organen
ergaben für einzelne Fettsäuren signifikante Unterschiede zwischen den Knockout-Tieren und
der Wildtypgruppe.
Die Fettsäureverteilungsmuster in den Organen der Tiere auf der Hochfettdiät weisen
Parallelen zu denen der Tiere auf Standardfutter auf, wobei die Unterschiede teilweise
weniger ausgeprägt erscheinen, so dass man von einem Demaskierungseffekt der Hochfettdiät
sprechen kann.
Die Ergebnisse des oralen Glukosetoleranztests sowie die ermittelten Insulin- und HOMA-
Werte zeigen eine deutlich bessere Glukosetoleranz und Insulinsensitivität der Knockout-
Tiere gegenüber dem Wildtyp.
Zusammenfassend kann durch die Untersuchungen ein Einfluss von ApoA5 auf die
Fettsäureverteilungsmuster angenommen werden. In weiteren Untersuchungen ist zu klären,
welche Mechanismen den unterschiedlichen Fettverteilungsmustern in den Organen zugrunde
liegen. Eine verbesserte Insulinsensitivität von homozygoten Knockout-Tieren verglichen mit
dem Wildtyp konnte nachgewiesen werden.

6 SUMMARY
Maina Wehner
88
Zusammenfassung
A study on the influence of Apolipoprotein A5 on glucose and fatty acid metabolism in a
genetically engineered mouse model
Apolipoprotein A5 is a protein produced by the liver. Its concentration in plasma is minimal
but it has a great impact on plasma triglyceride levels. The mechanism by which apoA5
influences plasma triglycerides is not yet fully elucidated. Studies in vitro and in vivo have
demonstrated that apoA5 activates proteoglycan-bound lipoprotein lipase. Contributing
thereby to the hydrolysis of trigylcerides and chylomikrons and faciliating the release of fatty
acids.
Aim of this study was to investigate the influence of apoA5 on the fatty acid composition in
plasma and various organs on a normal and on a high fat diet. Since elevated free fatty acid
levels foster insulin resistance we also determined glucose tolerance and insulin sensitivity in
the mice on high fat diet.
Three different groups of mice (apoA5 wildtype, apoA5 transgene, apoA5 knockout) were fed
with standard chow while four groups of mice (apoA4 wildtype, apoA5 transgene, apoA5
heterozygous knockout, apoA5 homozygous knockout) received for 12 weeks a high fat diet.
For both the mice on normal chow and the mice on high fat diet there was made a lipoprotein
profile and a gaschromatographic analysis of free fatty acid compositions in various organs.
In addition to the the overall fatty acid concentrations in the organs the fatty acids of the
delta-9-desaturase-pathway as well as the omega-6- and omega-3 fatty acids were examined.
Differences in single fatty acids were found especially between the knockout and the wildtype
mice. These differences indicate induction or decrease of enzymatic activities or shifting in
lipid classes. The overall fatty acid content in plasma of the knockout mice on standard chow
was significantly higher compared to wildtype mice whereas the contents in epidiymal fat and
in muscle were lower. Interestingly there were no differences in subcutaneous fat between the
groups. For fatty acids of the delta-9-desaturase pathway and the omega-6 and the omega 3

89
Zusammenfassung
fatty acids significant differences were found in single fatty acids between the knockout and
the wildtype mice.
In the organs of the mice on high fat diet the fatty acid composition was similar to that of the
mice on standard chow. Partially the differences were less distinct. That could be assigned to
an unmasking effect of the high fat diet.
Unexpectedly the results of the oral glucose tolerance test and the insulin and HOMA-data
showed a much better glucose tolerance and insulin sensitivity of the knockout mice
compared to the wildtype.
In summary, an impact of apoA5 on the fatty acid contents can be supposed. Further
investigations are necessary to elucidate the mechanisms underlying the different fatty acid
contents in the organs. An improved insulin sensitivity of homozygous knockout mice
compared to wildtype mice has been demonstrated.

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8 DANKSAGUNG
106
Danksagung
Herrn PD Dr. Martin Merkel danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die
Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die hervorragende Betreuung und die Organisation
finanzieller Mittel.
Herrn Prof. Dr. rer. nat. Hassan Y. Naim danke ich für die freundliche, unkomplizierte
Unterstützung während des Promotionsverfahrens.
Herrn PD Dr. Jörg Heeren und den Mitarbeitern seiner Arbeitsgruppe danke ich für die
Unterstützung bei der Durchführung der mausexperimentellen Arbeiten.
Außerdem danke ich Herrn Dr. Klaus Tödter und seiner Mitarbeiterin Maike Kröger für die
ausführliche Beratung bei den gaschromatographischen Analysen sowie bei der Ordnung und
Darstellung des umfangreichen Datenmaterials.
Herrn Dr. Ludger Scheja gilt mein Dank für die Hilfestellung bei der Datenauswertung.
Herzlichen Dank meinen Eltern ohne deren Unterstützung weder das Studium noch die
Anfertigung dieser Dissertation möglich gewesen wäre.