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Elektrophoretische MethodenTeil 2: KapillarelektrophoreseDr. Cornelia KasperUniversität HannoverInstitut für Technische ChemieCallinstr. . 330167 HannoverGermanyDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Dr. C. KasperGliederungPrinzip der KapillarelektrophoreseGerätetechnikKapillaren, Injektionsmethoden, DetektionsmethodenElektrophoretische WanderungElektroosmotischer Fluss (EOF)Kapillarzonenelektrophorese (CZE)Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC)Kapillargelelektrophorese (CGE)Isoelektrische Fokussierung (CIEF)Isotachophorese (ITP)Beispielgerät für die KapillarelektrophoreseTCI Institut fürTechnische Chemie

Prinzip der KapillarelektrophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Prinzip der Kapillarelektrophorese• Kapillarelektrophorese:Trägerfrei in einemoffenen Rohr(Kapillare)• CE (capillary(electrophoresis)• Kapillarlängen:5-100 cm• Innendurchmesser derKapillare:20-200 200 µm+ -5-100 cm20-200 200 µmDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport,konstanter pH-Wert• Beispiele:‣ Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH‣ Borat- und TRIS-Pufferbei basichen pH‣ Auch zwitterionische Puffer• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehrerenhundert V/cm• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)• Detektion: on-Column UV-Absorption direkt durch dietransparente KapillareDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

GerätetechnikDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• fused-SilicaSilica-Kapillare• Hochspannungs-versorgung• 2 Elektroden• Pufferreservoirs• On-ColumnColumn-Detektor• Moderne Geräte:‣ Probengeber‣ Fraktionssammler‣ HydrodynamischenInjektionssystem‣ Kapillarthermo-statisierungseinheitGerätetechnikDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Kapillaren• UV transparente Materialien:‣ fused-Silica amorpher Quarz‣ Borsilikatglas‣ Teflon• Geringer Durchmesser: Effiziente WärmeableitungW• Mechanische Stabilität: t: Außenoberflenoberfläche der Kapillaremit Polyimidschicht geschützt Entfernen für f Detektionnötig (Skalpell oder Flamme)Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• HydrodynamischeInjektion‣ Vakuum auf derDetektionsseite‣ Druck auf derEinlassseite‣ Gravitationskraftdurch Anhebender Einlassseite• ElektrokinetischeInjektionInjektionsmethodenDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese‣ Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung• Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl‣ Probenvolumen einige nl• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik• Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen InjektionVi=4∆p⋅ Π ⋅r8 ⋅ η⋅L⋅ t‣ Abhängig von: Druckdifferenz ∆p, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,Viskosität η, , Kapillarradius rDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• ElektrokinetischeInjektion‣ AufgebrachtesProbenmengenimmt mit derMobilität derProben-Ionen zu‣ Injizierte Proben-menge hängt vonder Probenmatrixab• HydrodynamischeInjektion‣ Unhabhängig ngig vonder Mobilität t derProbenmatrixElectrodeElectrodeDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Detektionsmethoden• Absorptions-DetektorDr. C. Kasper⎛I⎞‣ Lambert-BeerscheBeersche-Gesetz= log⎜⎟ = ε ⋅c⎝ I ⎠‣ UV-Detektor‣ Diodenarray-Detektor Detektor (DAD)‣ Photodiodenarray-Detektor (PDA)‣ Empfindlichkeit: 10 -15- 10 -13mol‣ Anwendungen: Proteine, aromatischeVerbindungen0A ⋅ d• Indirekte UV-Detektion(Probenohne Absorption im UV-Bereich)‣ Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal‣ Empfindlichkeit: 10 -16- 10 -13mol‣ Anwendungen: Organische undanorganische Ionen, ZuckerUV-DetektionDetektorzelleTCI KapillareNegatives SignalInstitut fürTechnische Chemie

• Fluoreszenz-DetektorDr. C. Kasper‣ Molekülanregunglanregung Abgabe derAnregungsenergie durch spontaneEmission (Fluoreszenz)‣ Signalintensität ist direkt proportionalder Intensität der eingestrahltenAnregungsenergie‣ Lampenanregung:‣ Empfindlichkeit: 10 -18- 10 -13mol‣ Anwendungen: derivatisierteAminosäuren, DNA, Peptide, Protein‣ Laserinduzierte Fluoreszenz:‣ Hohe Empfindlichkeit:10 -21- 10 -17mol‣ Anwendungen: DNA-Fragmente,derivatisierte AminosäurenTCI KapillareFluoreszenzInstitut fürTechnische Chemie

• Massenspektrometrie-Detektor‣ Empfindlichkeit: 10 -17- 10 - 8 mol‣ Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring‣ z.B. ESI-MS (Electrospray(Ionization)Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische WanderungDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Wanderung• Zunehmende Spannung und damit wachsende Feld-stärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischenWanderungsgeschwindigkeit v EPH der IonenLEFFvEPH= µEPH⋅E=t‣ Elektrophoretische Mobilität µ EPH , effektive Kapillarlänge L EFFMigrationszeit t M• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegtKräftegleichgewicht+K RE+zMK B-EFF ,K R = ReibungskraftK B = BeschleunigungskraftDr. C. Kasperv EPHTCI Institut fürTechnische Chemie

‣ Beschleunigungskraft K B‣ Reibungskraft K R (StokeschesGesetz)• WanderungsgeschwindigkeitvEPH=z ⋅F⋅E6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅NAKBK Rz ⋅F⋅E=N= 6 ⋅Aπ ⋅ η⋅r ⋅ vz = effektive Ladung des IonsF = Faraday-KonstanteN A = Avogadrozahlη = dynamische Viskositätr = Stokescher Radius desIons• Für die elektrophoretische Mobilität µ EPH ergibt sichdamit:z ⋅FµEPH=6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅NADr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Trennungaufgrund verschiedener Wanderungsgeschwindigkeitender Probe im Trennpuffer• Berechnung der Mobilität µ EPH im elektrischen Feld EµEPH⋅L⋅U‣ Elektrisches Feld fällt füber gesamte Länge Lder Kapillare ab(L GES )‣ Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge L(L EFF ) (bis zumDetektor) in der Migrationszeit (t M )⋅E• Elektrophoretische Trennungen nur möglich mbeiunterschiedlicher Mobilität t der Ionen=LtMEFF=LEFFtMGESDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer FlussDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Negativ geladeneKapillarwand (fused(silica)• Hydratisierte Kationenakkumulieren nahe derKapillarwand• Elektroosmotischen Fluß(EOF) in Richtung derKathode bei Anlegen eineselektrischen FeldesDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Trennungsprinzip‣ Interaktionen der Analyten mit dem EOF• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Unbehandelte Kapillaren (uncoated(uncoated)‣ Elektrophoretische Geschwindigkeit‣ Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Gesamtgeschwindigkeit:‣ Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) undelektroosmotischer (v(EOF )GeschwindigkeitDiffuse Doppelschicht Zeta-PotenitalDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Ladungsunterschiede an der Innenseite der Kapillare(diffuse Doppelschicht) resultieren in Zeta-Potential(ζ)• Zeta-Potentialund damit der EOF ist abhängig von derDissoziation der Silanolgruppen und dadurch vom pH-Wert der Elektrolytlösung• Basischer pH EOF höher h her alsWanderungsgeschwindigkeit der Ionen‣ Auch Anionen werden durch den EOF zur Kathode transportiert• Saurer pH EOF geringer alsWanderungsgeschwindigkeit der IonenDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen‣ Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterungbei• Wanderungsgeschwindigkeit (v(EOF ) des EOF:v EOFε ⋅E⋅ ζ= 4 ⋅ π ⋅ η‣ Dielektrizitätskonstantetskonstante ε, Zeta-Potentialζ, , Viskosität ηDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Elektrischer Stromfluss führt fzu Joulescher Wärme-entwicklung‣ Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierenderTemperaturgradient‣ Maximale Trenneffizienz kleiner TemperaturgradientVerringerung KapillarinnendurchmesserFlüssigkssigkühlung der Kapillare‣ Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradiententsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil‣ Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität t (Kapillarwand)‣ Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität t (Kapillarmitte)Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

KapillarzonenelektrophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)• Trennung nach Unterschied inGröße und Ladung• Zunächst wird die Probe (AB) indie Kapillare injiziert• Unter Einfluss des elektrischenFeldes wird die Probe indiskrete Zonen (A und B)unterteilt, die ihrerseitsAnalyten mit der gleichenelektrophoretische Mobilitätenthalten• Puffer, pH-Wert, elektrischeFeldstärke bleiben konstantDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion• Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianzder Konzentrationsverteilung durch die Einstein-Gleichung bestimmt2σ = 2 ⋅D⋅ tz2σ z‣ Diffusionskoeffizient D; Zeit t‣ Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zuDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Elektrodispersion zusätzlicherPeakverbreiterung‣ Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität t von Analyt-Ionund Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größößer als Analyt-Ion (> Faktor 100)Mobilität t des Proben-IonuA < Puffer-IonuCEPeak-TailinguA > uCEPeak-Leading(Fronting)Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Auflösung R zweier PeaksRt24 ⋅ σ‣ Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;gemittelte Standardabweichungσ t=−• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:=N4‣ Theoretische Trennstufen N, Mobilität utt1⎛ u⋅⎜⎝− u2 1Ru⎞⎟⎠Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Anforderungen an den Puffer‣ Selektivität t für f r die zu trennenden Ionen‣ pH-WertstabilitWertstabilität, , Pufferkapazität t (Reproduzierbarkeit)‣ Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlängenge‣ Anpassung der Mobilität t zwischen Probe- und Pufferion‣ Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität t besitzen (kleineStröme)‣ Reproduzierbare Herstellung des Puffers‣ Stabilität t des PuffersDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter:‣ pH-Wert‣ Ionenstärke‣ Temperatur‣ Kapillarbelegung‣ PufferzusätzeDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Beispiel-ElectropherogrammDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

KapillaraffinitätselektrophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einemRezeptor und Liganden• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie• Unterschied in der Mobilität t zwischen Protein und demgebildeten Komplex‣ Ligand trägt eine Ladung‣ Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlichvon der des ProteinsDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

MicellarelektrokinetischeChromatographieDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

MicellarelektrokinetischeChromatographie (MEKC)• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien)) zumPuffersystem pseudostationäre Phase aus geladenenMicellen• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischenLösung und MicelleninnerenDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Neutralmoleküle le erhalten elektrophoretische Mobilität t u iui'⎛ ki⎜⎝1+k= uMC'i⎞⎟⎠‣ Abhängig von Mobilität t der Mizelle u MC und dem Kapazitätsfaktortsfaktork‘ i• Kapazitätsfaktortsfaktor k‘ i ist Verhältnis der Analytaufenthalts-zeit in der mobilen zur pseudostationären Phasek'i=toti−⎛ ⋅⎜1−⎝t0ttiMC⎞⎟⎠Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

• Auflösung R zweier Komponentent01−'N α −1k2tMCR = ⋅ ⋅ ⋅'{ 4 213 α 1+k t2 0 '1+⋅kEffizienz1Selektivität tMC14 44 24443Re tention• Verbesserung der Auflösung durch:‣ Steigende Micellbildnerkonzentration‣ Vergrößößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs‣ Wahl unterschiedlicher Micellbildner‣ Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen wPhaseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

KapillargelelektrophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Kapillargelelektrophorese (CGE)• Trennung nach unterschiedlichen Masse/LadungsLadungs-verhältnissen• DNA-Moleküeund SDS-denaturierteProteine besitzenbei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/Ladungsverhältnissen• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert dieelektrophoretische Wanderung der größeren Molekülestärker als die der kleineren• Vergleich mit klassischen GelelektrophoreseVorteileSchneller TrennzeitenOnline-DetektionGeringer Arbeits- und GeräteaufwandNachteileKeine präparative ProbensammlungKeine parallele Trennung mehrerer ProbenNicht zweidimensional durchführbarDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Isoelektrische FokussierungDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Isoelektrische Fokussierung (CIEF)• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in dieKapillare• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt(Anolyt),eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt(Katholyt).• Anlegen der Spannung pH-Gradient Ampholyt-Ionen wandern entsprechend ihrem pI.• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.Dr. C. KasperAnode+DiffusionE-FeldKathode+ Ladung des--Verd.H 3 PO 4AnalytmolekülspH = pIpH-GradientVerd.NaOHTCI Institut fürTechnische Chemie

IsotachophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Isotachophorese (ITP)• Trennung nach Größe und Ladung• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt(TE)‣ Mobilität t Leitelektrolyt > Mobilität t aller Analyt-Ionen‣ Mobilität t Endelektrolyt < Mobilität t aller Analyt-Ionen‣ Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärkenrken-gradients‣ Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte‣ Feldstärkengradient verhindert Diffusionscharfer ZonengrenzenDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Beispielgerät für dieKapillarelektrophoreseDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

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Quellen• F. Lottspeich/H.Zorbas, , Bioanalytik• H.Engelhardt, W.Beck, , T. Schmitt, Kapillarelektrophorese• Altria, , Kevin; http://www.ceandcec.com• Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de• P.W. Atkins, Physikalische ChemieDr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie

Vielen Dank für dieAufmerksamkeit !Dr. C. KasperTCI Institut fürTechnische Chemie