Analytische HPLC

Analytische HPLCUltraschnelle chirale Trennung durch Ligandenaustausch -HPLC mit dynamisch beschichteten Chromolith ® Säulen>Abbildung 1.Dynamische Beschichtung der RP-18-Monolith-Säule mit chiralem SelektorAbstractDie Entwicklung von Verfahren zurEnantiomerentrennung gewinntzunehmend an Bedeutung.Chromatographieverfahren, wie z. B. TLC,GC, SFC und vor allem HPLC, werden seitüber 20 Jahren zur Trennung vonEnantiomeren eingesetzt.Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitungund Anwendung dynamisch beschichteterPhasen für die Ligandenaustausch-Chromatographie zur Enantiomertrennung.Die Phasen wurden durch Einpumpen einern-decyl-L-4-hydroxyprolin-Lösung mit einerhandelsüblichen Chromolith ® RP-18eSäule vorbereitet. Diese Beschichtungenerwiesen sich bei Umgebungstemperaturüber mehrere Monate gegen Desorptionunter Verwendung von wässrigen mobilenPhasen stabil. Die Säulen wurden zurchiralen Trennung von Aminosäuren,Glycyl-Dipeptiden, diastereomerenDipeptiden und Tripeptiden eingesetzt.Einen großen Vorteil bei der Verwendungvon Chromolith ® Säulen stellt der niedrigeRückdruck dar, der zu hohen Flussratenführt. Zudem kann der chirale Selektoreinfach entfernt oder ausgewechseltwerden, indem die Säule mit Acetonitriloder Methanol gewaschen wird. Mit hohenFlussraten erzielt man sehr schnelleTrennungen innerhalb von Sekunden.EinführungFast die Hälfte aller verwendeten Medikamentesind chiral. Es ist bekannt, dass in den meistenFällen nur eines der Enantiomerepharmakologisch wirksam ist (Eutomer). DieAktivität der Enantiomere kann sich sowohlqualitativ als auch quantitativ unterscheiden.Oftmals zeigt das inaktive Enantiomer(Distomer) unerwünschte Nebenwirkungen oderwirkt sogar toxisch. Auch wenn dieNebenwirkungen nicht gravierend sind, so mussdas Distomer doch verstoffwechselt werdenund stellt somit eine unnötige Belastung fürden Organismus dar. Aus diesem Grundgewinnt die Entwicklung von Verfahren zurTrennung von Enantiomeren auf analytischerund präparativer Ebene zunehmend anBedeutung. Das Prinzip der chiralenLigandenaustausch-Chromatographie wurdevon V.A.Davankov [2] eingeführt. Im Vergleichzur Vorbereitung chemisch gebundener chiralerstationärer Phasen stellt das Verfahren, nonchiraleHPLC-Phasen mit chiralen Selektoren zubeschichten, eine weniger aufwändigeAlternative dar. Außerdem kommen zunehmendmonolithische Säulen bei der HPLC zumEinsatz. In diesem Artikel wird nun dargestellt,wie dynamisch beschichtete Phasen auf derBasis handelsüblicher monolithischer Säulenvom Typ RP-18e präpariert und zur chiralenTrennung von Aminosäuren und Dipeptideneingesetzt werden.t1 (s) t2 (s) α RsDOPA 9,9 17,5 2,05 1,46Methionin 9,9 15,7 1,79 1,04Abbildung 2.Beispiele für ultraschnelleEnantiomertrennung von (A) m-Tyrosinund (B) PhenylglycinStationäre Phase: BeschichteteChromolith ® SpeedROD (RP-18e, (A)25x4,6 mm, (B) 50x4,6 mm). Mobile Phase:50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5. Injektion 1 μl;Durchfluss: (A) 7 ml/min, (B) 8 ml/minPhenylglycin 15,8 38,5 2,73 2,45m-Tyrosin 9,5 20,6 2,62 2,78Gly-Leu 10,3 20,3 2,31 1,88Gly-Nle 10,6 19,5 2,11 1,59Gly-Phe 13,8 54,4 4,64 4,42Gly-Trp 22,1 43,0 2,07 1,08Leu-Gly 11,5 15,0 1,39 0,97Tabelle 1: Ultraschnelle Trennung von Aminosäuren und Glycyl-Dipeptiden (ausgewählte Beispiele)Stationäre Phase: Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6 mm). Durchfluss: 8 ml/min.Mobile Phase: Aminosäuren: 50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5. Glycyl-Dipeptide: 0,1 mM Cu(II)-Sulfat12VWR ChromJournal Ausgabe 4 April 2008