Analytische HPLC

SäulenInformationen zu unseren Produkten erhalten Sie bei Ihrem lokalen VWR-Ansprechpartner,senden Sie uns eine E-Mail an:chromjournal@eu.vwr.comoder besuchen Sie unsere Website www.vwr.comAbbildung 3.Chirale Trennung eines Gemisches aus o-,m- and p-Tyrosin. Stationäre Phase:Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6 mm). Mobile Phase: 50 mMPhosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5.Injektion 3 μl; Durchfluss 1,5 ml/minAbbildung 4.Reinheitsprüfung einer handelsüblichenProbe von D-DOPA mit 0,05 % LDOPAStationäre Phase: BeschichteteChromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6mm).Mobile Phase: 50 mM Phosphatlösung, 0,1mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5.Injektion 1 μl; Durchfluss: 2 ml/minMaterial und VerfahrenAlle Aminosäuren, Dipeptide, Kupfer(II)-Sulfateund N-Decyl-L-4-Hydroxyprolin stammen vonSigma Chemicals, Co. (St. Louis, USA).Natriumdihydrogenphosphat, Diethylether,Acetonitril und Methanol (Gradient Grade)stammen von VWR International (Darmstadt). Eskamen 2 HPLC-Systeme zum Einsatz: ein Hewlett-Packard 1050 Chromatograph (Waldbronn) mitAutosampler und UV-Detektor (System 1100,Agilent Technologies, Waldbronn), und ein MerckHitachi HPLC-System vom Typ LaChrom ® ,bestehend aus einer L-7100 Pumpe und einem L-7455 Diodenarray-Detektor. Die Detektion wurdebei 208 nm durchgeführt. Die monolithischenSäulen vom Typ Chromolith ® SpeedROD (RP-18e,50 oder 25x4,6 mm) stammen von VWRInternational (Darmstadt). Durch 90-minütigesEinpumpen einer 0,025%igen wässrigen Lösungmit dem chiralen Selektor wurden die Säulendynamisch beschichtet. Danach wurde durchEinpumpen einer wässrigen Cu(II)-Sulfat-LösungKupfer(II) in die Säule geladen. Die Phase wurdedann 15 Minuten lang mit der mobilen Phase insGleichgewicht gebracht. Mobile Phasen wurdenvor dem Gebrauch mit Helium entgast und durcheinen Membranfilter (0,2 μm, Schleicher & Schüll,Dassel) geleitet. Die Probenlösungen wurden,soweit nicht anders angegeben, durch Lösung derAnalyten (1 mg) in bidestilliertem, deionisiertemWasser (1 ml) vorbereitet. Das Injektionsvolumenbetrug, soweit nicht anders angegeben, 1 μl. ZumAustausch des chiralen Selektors wurde die Säulemit Acetonitril oder Methanol gespült, um dieBeschichtung zu entfernen.ErgebnisseDie Vorbereitung der Phasen ist ein sehr einfachesund kostengünstiges Verfahren. Ein Ausbluten derSäulen wird verhindert, wenn wässrige Puffer miteinem höchstens 50%igen Anteil an organischenModifizierern eingesetzt werden. Die hydrophobenMoleküle des chiralen Selektors binden diesendurch hydrophobe Wechselwirkungen an dieChromolith ® SpeedROD (Abb. 1). DieBasislinienauflösung eines breiten Spektrumsunderivatisierter Aminosäuren erfolgte mit einerNatriumdihyrogenphosphat/Cu(II)-Lösung (pH-Wert4,5) als mobile Phase. Dieses Verfahren eignet sichauch für Reinheitsuntersuchungen. In einerhandelsüblichen Probe D-DOPA wurde ein Anteilvon 0,05 % des L-Enantiomers festgestellt. Dieenantiomere Elutionsfolge kann dann durch denWechsel der Chiralität des Selektors umgekehrtwerden. Da Chromolith ® Säulen aufgrund ihrerhohen Durchlässigkeit hohe Flussraten ermöglichen,wurden bei einer Flussrate von 8 ml/minultraschnelle Trennungen innerhalb von 30Sekunden erreicht.SchlussfolgerungChromolith ® SpeedROD bietet ein einfaches undschnelles Verfahren zur Enantiomertrennung beiAminosäuren und Dipeptiden durchLigandenaustausch-Chromatographie. Dank derausgezeichneten Durchlässigkeit dieser Säulenkönnen hohe Flussraten angewendet werden. DieZugabe von organischen Modifizierern wieMethanol führte zu einer Verringerung derRetentionszeiten. Bei einer Flussrate von 8 ml/minwurden in Minutenbruchteilen ultraschnelleTrennungen erzielt. Mit diesem Verfahren konnteeine Basislinienauflösung von 23 Aminosäurenund 3 Dipeptiden durchgeführt werden [1].Referenzen[1] M. G. Schmid, K. Schreiner, D. Reisinger andG. Gübitz, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1470[2] S.V. Rogozhin, V.A. Davankov, Dokl. Akad.Nauk. 1970, 193, 94.Martin G. Schmid, Elfriede Pittler, Karin Schreiner,Daniela Reisinger and Gerald GübitzInstitut für pharmazeutische Wissenschaften,Abteilung pharnazeutische Chemmie, Karl-Franzens-Universität, Universitätsplatz 1, A-8010 Graz,AustriaKontakt: Martin G. Schmid, Karl-Franzens-UniversitätGraz, Institut für pharmazeutische Wissenschaften,Abteilung pharmazeutische Chemie,Universitätsplatz 1, 8010 Graz, Austria.Tel.: +43-316-380 5386, Fax: +43-316-380 9846e-mail : martin.schmid@uni-graz.atVWR ChromJournal Ausgabe 4 April 2008 13