Skript Mikrobenphysiologie-Praktikum 2012

14Durchführung 2. TagGlucosebestimmungGlucose + H 2 O + O 2H 2 O 2 + DH 2GlucoseoxidasePeroxidaseGluconsäure + H 2 O 22 H 2 O + D DH 2 = ABTS red D = ABTS oxEs werden bereitgestellt:A) Phosphatpuffer: 40 mM pH 7.0B) Enzymlösung: 10 mg Glucoseoxidase, 3 mg Peroxidase in 1 ml PufferC) ABTS-Lösung: 50 mg ABTS in 2 ml PufferD) Glucosestandard: 0.2 mg/ml Glucosefrisch herstellen:E) Inkubationslösung: 20 ml A + 0,04 ml B + 0,4 ml C (pro Mikrotiterplatte)F) Verdünnungen Glucosestandard: 0.2 mg/ml, 0.10mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/mlLösung E erst herstellen, wenn alle Proben/Standard auf Mikrotiterplatte gegeben wurden!!!Durchführung:Der Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt (Pipettierreihenfolge beachten)• 0.01 ml Probe/Standard + 0.2 ml E• 60 min inkubieren• E 436 bestimmenBlindwert: statt Probe Aqua dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragenStandard: statt Probe fünf Standardkonzentrationen (siehe F) in jeweils 3 Parallelen auftragenProben: 3fach Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen(Verdünnen! nach Absprache)Lactosebestimmung… erfolgt in 2 Schritten:1. Spaltung der Lactose durch ß-Galactosidase2. Bestimmung der gebildeten Glucose mit der ABTS-MethodeBerechnung der Lactosekonzentration:Aus der Differenz zwischen Glucosewert aus der Lactosebestimmung und Glucosewert aus derGlucosebestimmung berechnen.