Skript Mikrobenphysiologie-Praktikum 2012

1Mikrobenphysiologiepraktikum SS 2012Praktikumsbeginn: 8:00 Uhr s.t.!Skript als Vorbereitung gründlich durcharbeiten!Zu Praktikumsbeginn werden Fragen über die Theorie der praktischen Arbeiten gestellt!Mitzubringen sind:1. Kittel2. Praktikumsskript3. Taschenrechner, Schreibzeug (wasserfester Stift - Edding® 4000 - zum Beschriften)4. Millimeterpapier5. gebundenes A4-Heft kariert6. Schloss für SpindV E R S U C H 1Vorbereitung für Tag 1:- Ökologie und Physiologie von Escherichia coli- Aufbau und Funktionsweise eines Photometers(Begriffsdefinition: Extinktion, Absorption, optische Dichte)- Verlauf einer Wachstumskurve (µ max , t d , …)Vorbereitung für Tag 2:- theoretischer Hintergrund der Protein- und Glucosebestimmung- Parameter eines Wachstumsverlaufs (Berechnung von Y X/S , Y BSW , Y ESW , Y ATP , n , ...)V E R S U C H 2Vorbereitung für Tag 1:- theoretische Grundlagen zur Regulation der Lactoseverwertung durch E. coli- Methoden zur Messung bakteriellen Wachstums- Streulicht-/Extinktionsmessung, Bestimmung der optischen Dichte einer Suspension- Theorie der Kinetiken bakteriellen Wachstums (µ, t d , Y) etc.Vorbereitung für Tag 2:- theoretische Grundlagen zur Glucose- und Lactosebestimmung- Grundlagen zur Messung der Enzymaktivität am Beispiel der ß-Galactosidase- Kinetik enzymatischer Reaktionen (iso- und allosterischer Enzyme)Bei der Abfassung der Praktikumsprotokolle sind die Hinweise auf den Seiten 18/19unbedingt zu beachten!

2Versuch 1Wachstum und Physiologie von Escherichia coliunter aeroben und anaeroben BedingungenAufgabenA) Bestimmen Sie den linearen Messbereich für die Absorption einer Methylenblau-Lösung und für die optische Dichte verschiedener Bakteriensuspensionen. ErläuternSie den Unterschied zwischen der photometrischen Absorptionsmessung und derTrübungsmessung (Streuung).B) Ermitteln Sie experimentell für Escherichia coli die maximalen Wachstumsraten (µ max )und die Ertragskoeffizienten für das Wachstum auf Glucose (Y XS ) unter aeroben undanaeroben Bedingungen und vergleichen Sie die erhaltenen Werte mit den theoretischberechneten Wachstumserträgen. Erläutern Sie außerdem den Verlauf der erhaltenenWachstumskurven in Zusammenhang zum gemessenen Substratverbrauch und zur pH-Änderung vergleichend (aerob, anaerob, verschiedene Glucosekonzentrationen,Proteingehalt, Werte aller Gruppen).EinführungBeim chemoorganoheterotrophen Wachstum wird eine organische Verbindung sowohl als Energie- alsauch als Kohlenstoffquelle genutzt. Dabei wird die Energie, die bei der Oxidation des Substrats (imEnergiestoffwechsel/ESW, Katabolismus) frei wird, genutzt, um Zellmasse zu synthetisieren.Außerdem liefert ein Teil des Substrates die Grundbausteine für die Synthese von Zellmasse (imBaustoffwechsel/BSW, Anabolismus).Der Ertragskoeffizient Y XS gibt an, wie viel g Zellmaterial pro mol Substrat synthetisiert werdenkönnen. Dieser Wert hängt vom Energiegehalt des Substrats und dem Anteil dieser Energie ab, derzur ATP-Regeneration bzw. zum Aufbau von Zellsubstanz genutzt werden kann. Der Energie-Ertragskoeffizient Y ATP (g Trockenzellen/mol ATP) gibt die Zellmasse an, die bei Verwertung eines

3bestimmten (Baustoffwechsel-)Substrates aus einem mol ATP gebildet werden kann (Y ATP für Glucoseals Substrat des Baustoffwechsels = 10 g TZ/mol ATP).E. coli ist als fakultativ anaerobes Bakterium in der Lage, auf Glucose als alleinigem Substrat sowohlaerob als auch anaerob zu wachsen. Unter aeroben Bedingungen wird die Glucose über denEmbden-Meyerhof-Weg und den Citrat-Cyclus vollständig zu CO 2 oxidiert. Die dabei entstehendenReduktionsäquivalente werden in der Atmungskette auf O 2 übertragen. Bei diesem Stoffwechselwegkönnen pro mol Glucose ca. 26 mol ATP (= n aerob , s.u.) gebildet werden. Unter anaerobenBedingungen fermentiert E. coli die Glucose in einer gemischten Säuregärung zu Säuren (Succinat,Lactat, Acetat, Formiat), Ethanol, Wasserstoff und CO 2 (liegt in wässriger Lösung als HCO - 3 vor). Beidieser Art des Energiestoffwechsels werden lediglich 2-3 mol ATP pro mol Glucose (= n anaerob , s.u.) imESW gebildet.Berechnung von WachstumsausbeutenDer Ertragskoeffizient (Y XS ) gibt an, wie viel Gramm Trockenzellen aus einem mol Substrat gebildetwerden können. Y XS lässt sich aus dem Ertragskoeffizienten des Energiestoffwechsels (Y ESW ) unddem Ertragskoeffizienten des Baustoffwechsels (Y BSW ) berechnen:Aufgelöst nach Y XS :1YXS1=YESW1+YBSWYXSY=YESWESW× Y+ YBSWBSWEnergiestoffwechsel: Y ESW = n x Y ATP (g TZ/mol Glucose ESW)n = mol ATP gebildet pro mol Substrat (hängt vom Stoffwechselweg ab)Y ATP = g TZ gebildet pro mol ATP (hängt von der C-Quelle ab; für Glucose10 g TZ pro mol ATP)Baustoffwechsel:Y BSW = Zahl C-Atome/Substratmolekül x M r C (g/mol) (g TZ/mol Glucose BSW)0,5**Kohlenstoffgehalt von Trockenzellen = 50 %Berechnung der EnzymaktivitätenAus der Absorptionsänderung pro Minute und dem Extinktionskoeffizienten wird die Volumenaktivitätnach Lambert-Beer (E = ε x c x d) berechnet:Volumenaktivität (U/ml) = ∆E/∆t (min -1 ) x Gesamtvolumen (µl) _ε (mM -1 x cm -1 ) x d (cm) x Rohextraktvolumen (µl)spezifische Aktivität= Volumenaktivität / ProteinkonzentrationEinheiten:1 U = 1 µmol/min1 Katal = 1 mol/s1 U = 16,67 nkat

4Zur VorbereitungVorlesung MikrobenphysiologieFragen• Was charakterisiert Escherichia coli?• Was bedeutet chemo(organo)heterotrophes Wachstum?• Was ist bei anaeroben Arbeitstechniken zu beachten?• Wie wird das Wachstum von Bakterien untersucht? Welche Parameter müssen Sie beobachtenoder bestimmen? Welche Parameter können aus Versuchsdaten berechnet werden?• Was ist der Unterschied zwischen photometrischen Absorptions- und Streuungsmessungen?• Wie verwertet E. coli Glucose unter aeroben und anaeroben Bedingungen?• Was gibt der Ertragskoeffizient an? Wie wird er berechnet?Zeitplan zu Versuch 11.Tag:• Bestimmung des linearen Messbereiches des Photometers für die Absorption einerMethylenblau-Lösung und für die Bestimmung der optischen Dichte von Kultursuspensionenvon Escherichia coli und Clostridium pasteurianum• Wachstum von Escherichia coli auf unterschiedlichen Glucosekonzentrationen unteraeroben und anaeroben Bedingungen• Korrelation von OD zum Proteingehalt als Maß für das Wachstum (Protein – Teil 1)Von einer aeroben und einer anaeroben Kultur mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen solljeweils eine Wachstumskurve erstellt werden. Hierzu werden stündlich die optische Dichte bei 578 nm(OD 578 ) sowie der pH-Wert gemessen. Desweiteren erfolgt die Probenahme zur Bestimmung derGlucosekonzentration und des Proteingehaltes (Lagerung der Proben bei -21°C) .Nach dem Animpfen soll als erstes der lineare Messbereich des Photometers für Absorptions- sowieStreuungsmessungen ermittelt werden. Die Proben für die OD 578 -Bestimmung der Wachstumskurvesollen dann dementsprechend verdünnt werden, so dass der Messwert im linearen Bereich desPhotometers liegt.Aus den gemessenen Wachstumsparametern sollen der Ertragskoeffizient (Y XS ), die maximaleWachstumsrate (µ max ) und der Einfluss der Glucosekonzentration auf diese Parameter bestimmtwerden.Mit einer bereitgestellten Kulturlösung von E. coli wird die Korrelation der OD 578 zum Proteingehalt derZellen ermittelt und die OD 578 -Werte aus den Wachstumskurven umgerechnet.

6AnimpfenVor dem Animpfen eine Probe Medium (1 ml) entnehmen und den OD 578 -Blindwert bestimmen.Das Animpfen erfolgt folgendermaßen:Aerob:Wattestopfen aus dem Schikanenkolben ziehen, Rand des Gefäßes kurz am Bunsenbrennerabflammen (Wattestopfen nicht abflammen! und nicht auf Tisch legen). Ausder Vorkultur (Wattestopfen rausziehen, Gefäß abflammen) zweimal 3,5 ml Bakteriensuspensionmit steriler 5 ml-Pipette in den Schikanenkolben überimpfen (V ges = 7 ml).Anaerob: Schottflasche und Vorkulturflasche mit 70% Ethanol bespritzen, am Bunsenbrennerabflammen; sterile Einmalkanüle auf 20 ml-Spritze aufdrehen, Vorkulturflasche auf denKopf drehen, Kanüle durchstechen, 20 ml Vorkultur entnehmen und in ½-L-Schottflascheüberimpfen. Kanülen in dafür vorgesehene Abfallgefäße werfen!Aus allen Kolben sofort 1. Probe (t = 0) nehmen und die Kolben im 28°C-Brutraum auf einemSchüttelgerät (140 rpm) inkubieren. Anaerobe Kulturen werden als Standkultur bei 28°C inkubiert.Probennahme: OD 578 , pH, [Glucose], [Protein]Alle Proben zuerst in Reagenzgläschen füllen und danach erst entsprechend der durchzuführendenAnalysen umfüllen. pH-Wert kann im Reagenzglas oder Eppendorfgefäß gemessen und Verdünnungenin Reagenzgläsern hergestellt werden.Aerob:Jede Stunde eine Probe von 4 ml mit einer 5-ml-Eppendorf-Pipette entnehmen:- genau 1 ml abzentrifugieren (1 min, 13.000 rpm): Überstand für Glucosebestimmung einfrieren Pellet für Proteinbestimmung einfrieren- 3 ml für OD 578 -Bestimmung (Dreifachbestimmung)Die Proben werden direkt im Brutraum entnommen. Am Anfang und Ende derKultivierung zusätzlich 1 ml für pH-Wert Messung entnehmen.Anaerob: Stopfen der Kulturflaschen mit Ethanol sterilisieren und mit einer Spritze (mit sterilerKanüle) 5 ml Probe entnehmen:- genau 1 ml abzentrifugieren (1 min, 13.000 rpm): Überstand für Glucosebestimmung einfrieren Pellet für Proteinbestimmung einfrieren- 3 ml für OD 578 -Bestimmung (Dreifachbestimmung)- 1 ml für pH-Wert-MessungDie Proben werden am Arbeitsplatz entnommen. Vor jeder Probenahme Kulturflaschenmit Ethanol sterilisieren und neue sterile Kanüle verwenden. Nach ProbenahmeKulturflache sofort wieder in Brutschrank stellen.

8Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mitdem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nmquantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µlMessreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µlH 2 O dest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiertund danach die E 590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen.Für die Korrelation wird zuerst die Konzentration der Proteinstandards gegen die gemesseneExtinktion (E 590 ) aufgetragen (= Eichkurve). Mit Hilfe dieser Eichkurve kann die Proteinkonzentrationin den verdünnten Zellsuspensionen berechnet werden. Anhand der Auftragung der berechnetenProteinkonzentration über die optische Dichte der Zellsuspensionen (= Korrelation) kann der Faktorermittelt werden, mit dem die OD 578 aus den Wachstumskurven in eine Proteinkonzentrationumgerechnet werden kann.Um die Genauigkeit der Dreifachbestimmung der Messwerte (= drei Parallelen auf Mikrotiterplatte) zuüberprüfen, erfolgt die Berechnung der Standardabweichung s' in %. Abweichung von ≤ 5% sindakzeptabel. Im Praktikum werden Werte ≤ 10% toleriert.Standardabweichung s ∑ n … Anzahl der Messwertex i … Messwertx … Mittelwert ⁄ [%]Durchführung 2. TagBESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES DER PROBEN DES WACHSTUMSVERSUCHES(PROTEIN – TEIL 2 )Der Proteingehalt der am ersten Versuchstag entnommenen Proben soll ermittelt und mit denen derKorrelation verglichen werden. Dazu werden die Zellpellets zunächst in je 1 ml A. dest. resuspendiertund bis zur Messung auf Eis gelagert. Die Proteinbestimmung erfolgt analog zu der am erstenVersuchstag angewendeten Methode (siehe oben). Dabei ist zu beachten, das Proben mit einerOD 578nm > 0.3 (siehe Wachstumskurven) vor der alkalischen Lyse verdünnt werden müssen.Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben des Wachstumsversuches wird zunächst ausden Standardwerten eine Eichkurve erstellt. Mit Hilfe dieser können dann die Proteinkonzentrationender Proben berechnet werden. Zur Auswertung soll eine Grafik erstellt werden, in der die tatsächlichenProteinkonzentrationen mit denen der Korrelation verglichen werden (getrennte Abbildung für aerobeund anaerobe Kultur).

9GLUCOSEBESTIMMUNG WACHSTUMSVERSUCHGlucose + H 2 O + O 2H 2 O 2 + DH 2GlucoseoxidasePeroxidaseGluconsäure + H 2 O 22 H 2 O + D DH 2 = ABTS red D = ABTS oxEs werden bereitgestellt:A) Phosphatpuffer: 40 mM pH 7.0B) Enzymlösung: 10 mg Glucoseoxidase, 3 mg Peroxidase in 1 ml PufferC) ABTS-Lösung: 50 mg ABTS in 2 ml PufferD) Glucosestandard: 0.2 mg/ml Glucosefrisch herstellen:E) Inkubationslösung: 20 ml A + 0,04 ml B + 0,4 ml C (pro Mikrotiterplatte)F) Verdünnungen Glucosestandard: 0.2 mg/ml, 0.10mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/mlLösung E erst herstellen, wenn alle Proben/Standard auf Mikrotiterplatte gegeben wurden!!!Durchführung:Der Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt.• 0.01 ml Probe/Standard + 0.2 ml E• 60 min inkubieren• E 436 bestimmenBlindwert: statt Probe 210 µl A. dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragenStandard: statt Probe fünf Standardkonzentrationen sowie 0 mg/ml in jeweils 3 Parallelen auftragenProben: 3fach Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragenPro Probe werden zwei Verdünnungen hergestellt, die im Bereich der Eichkurve liegen könnten. DieGlucosekonzentration der Proben wird anhand der Wachstumskurve abgeschätzt!Auswertung:Berechnen Sie anhand der Eichgerade die Glucosekonzentrationen der Proben. Die Werte derProben sollen in mM angegeben werden. Auch die graphische Auftragung der Glucosekonzentration(in der Wachstumskurve) erfolgt in mM.Allgemeiner Hinweis 2. TagAlle Messwerte (Protein, Glucose) werden in drei Parallelen bestimmt. Die Mittelwertbildung ist nursinnvoll, wenn die Standardabweichung unter 10% liegt (= Toleranz Praktikum, siehe Tag 1). Solltensie stark abweichende Messwerte feststellen, können sie anhand oben genannter Formel feststellen,ob sie sich noch im Toleranzbereich befinden. Einzelne „Ausreißer“ können gestrichen und bei derMittelwertberechnung vernachlässigt werden.

10Versuch 2Diauxisches Wachstum von E. coli auf Glucose und LactoseNachweis der allosterischen Regulierbarkeit derGlucose-6-phosphat-Dehydrogenaseaus Pseudomonas syringae pv. phaseolicolaEinführungIn einer synthetischen Nährlösung befinden sich zwei unterschiedliche Kohlenstoff- undEnergiequellen (C/E-Quellen), die wachstumslimitierend sind. Ihre Verwertung kann auf zweierleiWeise erfolgen:1. Beide C/E-Quellen werden simultan abgebaut.2. Eine der C/E-Quellen wird bevorzugt oder ausschließlich vor der anderen verwertet.Wachstumskinetisch kann man diauxisches Wachstum folgendermaßen beschreiben:Der Wachstumsverlauf ist durch zwei exponentielle Phasen (log-Phase 1 und 2) gekennzeichnet, diedurch eine intermediäre lag-Phase voneinander getrennt sind. In der Regel ist die maximalespezifische Wachstumsrate in der log-Phase 1 (µ max1 ) größer als die in der log-Phase 2 (µ max 2 ).Für das diauxische Wachstum von E. coli auf dem C/E-Quellengemisch Glucose und Lactose ist C-Katabolitrepression verantwortlich:1. Die Enzyme für den Glucoseabbau sind in E. coli konstitutiv vorhanden; die Enzyme für denLactoseabbau (Permease, ß-Galactosidase und Transacetylase) sind jedoch induzierbar.2. Obwohl Lactose als physiologischer Induktor in der Nährlösung vorhanden ist, kommt es erstnach dem vollständigen Glucoseverbrauch zur Induktion, d.h. zur Transkription des Lactose-Operons.3. Den Strukturgenen des Lactoseoperons ist ein schwacher Promotor vorgeschaltet. Deshalb istauch bei Vorhandensein eines inaktiven Repressors nur dann eine Transkription möglich, wenngenügend cAMP-CAP-Komplex in der Zelle vorliegt (CAP = catabolite activation protein).Während des Wachstums auf Glucose ist jedoch der zelluläre cAMP-Spiegel gering, was dieAusbildung einer regulatorisch wirksamen cAMP-CAP-Komplexmenge verhindert.Bei allosterischen Enzymen kann die Bindung des Substrates an ein aktives Zentrum dieEigenschaften des anderen Zentrums im gleichen Enzymmolekül beeinflussen. Darüber hinausunterliegt die Aktivität von allosterischen Enzymen oft dem Einfluß regulatorisch wirkender Moleküle(Effektoren), die an anderen Stellen als dem aktiven Zentrum gebunden werden. Man spricht vonKooperativität zwischen den substratbindenden bzw. effektorbindenden Stellen am oligomerenEnzymmolekül.

11Es ist oft schwierig, bei linearer Auftragung experimentell ermittelter Abhängigkeiten der Reaktionsgeschwindigkeitvon der Substratkonzentration zwischen nicht-allosterischen und allosterischenEnzymen zu unterscheiden. Ursache dafür ist, daß Substanzen, die eine positive Kooperativitätbedingen, schon in sehr geringen Konzentrationen eine starke Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeitbewirken. Dadurch nähert sich die sigmoidale Kennlinie der hyperbolen Kennlinienicht-allosterischer Enzyme an. Eine Aussage darüber, ob es sich um ein allosterisches Enzymhandelt ergibt sich aus der Darstellung der Meßdaten im LINEWEAVER-BURK-Diagramm. Man trägtv(s) als 1/v gegen 1/s auf. Nicht allosterische Enzyme ergeben in dieser Auftragung für v(s) eineGerade, allosterische dagegen eine Kurve. Trägt man nach HILLln [v / (v max - v)] = n x ln s – ln k m auf,so erhält man als Anstieg der Geraden den HILL-Koeffizienten (n). Dieser beschreibt das Ausmaß derKooperativität. Folgende Fälle können auftreten:1. n = 1 keine Kooperativität, das Enzym ist isosterisch und gehorcht der Michaelis-Menten-Beziehung2. n > 1 positive Kooperativität, das Enzym ist allosterisch3. n < 1 negative Kooperativität, das Enzym ist allosterischAm Beispiel der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicolasoll der Einfluß der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit eines allosterischenEnzyms untersucht werden.Zeitplan zu Versuch 21. Tag: Wachstum auf einer Nährlösung, die Glucose und Lactose enthältZu Versuchsbeginn wird ein Kolben mit einer mit Puffer gewaschenen 16 Stunden alten Vorkulturbeimpft. Halbstündlich wird die optische Dichte bestimmt. Im Zusammenhang mit jeder Probenahmewird die Biomasse aus 1,5 ml Kultursuspension durch Zentrifugation gewonnen. Die Sedimentewerden bis zum nächsten Praktikumstag eingefroren. Die zellfreien Überstände werden abgetrenntund für die weitere Analytik eingefroren.Vom verwendeten E. coli-Stamm wird eine Trockenmasseeichkurve erstellt.2. Tag: Bestimmung der Substratkonzentrationen und der EnzymaktivitätenIn den Proben aus dem Wachstumsversuch werden mittels eines kolorimetrischen Tests dieKonzentrationen von Glucose und Lactose bestimmt. Aus den eingefrorenen Zellen wird durchZellaufschluß mit Natriumdesoxycholat ein Proteinrohextrakt (RE) hergestellt. Im RE wird dieVolumenaktivität der ß-Galactosidase bestimmt. Nach Bestimmung des Proteingehaltes im RE kanndie spezifische Aktivität errechnet werden.Am Beispiel des allosterisch regulierten Enzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ausPseudomonas syringae pv. phaseolicola wird die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von derSubstratkonzentration ermittelt.

12Durchführung 1. TagWachstumsversuchMedien und Vorkulturen werden bereitgestellt.Medium: Stamm: Escherichia coli ML 3010 g KH 2 PO 4 ca. 16 Stunden alte Suspension in Puffer10 g K 2 HPO 41 g Na Cl4 g (NH 4 ) 2 SO 40.7 g MgSO 4 x 7 H 2 O1 l Aqua dest.pro Gruppe werden gestellt:1 Standrundkolben mit 80 ml MediumKolben für Wachstumskinetik und für ß-Gal20 ml Glucose/LactoseVor Beimpfen Substrat ergänzenC-Substrat (Endkonzentration)1 g Glucose x 1 H 2 O / Liter1 g Lactose / LiterBeimpfen: Animpfdichte OD 578 = 0,1entsprechendes Volumen der Vorkultur verwenden (berechnen)Achtung! Kolben enthalten bereits 100 ml MediumKolben in den 37°C Brutraum - auf Schüttelmaschin e (ca. 200 RPM)Probennahme: Probe unmittelbar nach dem Beimpfen aus Kolben entnehmen -alle weiteren Proben werden gleich im Brutraum genommenMaschine möglichst kurze Zeit anhalten (O 2 –Limitation vermeiden)Probevolumen 1. 4-5 ml in Zentrifugenglas zur OD 578 -Bestimmungsterile Spitzen verwenden!2. 1,5 ml im Eppendorfgefäß 5 min zentrifugieren, Überstandgewinnen und einfrieren3. Sediment in 750 µl Phosphatpuffer pH 7,5 (0,1M) aufnehmen, 50 µlNa-desoxycholat (2 mg/ml) dazugeben und einfrieren.4. Probe für OD-Messung (3fach) verdünnen (E x maximal 0,3) undmessen (578 nm)5. ab 3 Stunden bis zum Glucoseverbrauch die Glucosekonzentrationmit Teststreifen kontrollieren und dokumentieren

13Trockenmasse-Eichkurve für E. coli ML305 getrocknete Wägeschälchen je 5 x wägen↓Vorkulturkolben (Mitte log-Phase) abzentrifugieren (10 min, 4.000 rpm)↓Sediment in Aqua dest. resuspendieren (30 ml)Suspension einsetzen für:Aje 5 ml in getrocknete und gewogeneWägeschälchen pipettieren↓bei ca. 80°C trocknen↓(2.Praktikumstag)5x wägen(Ergebnis: TM (mg/5ml))BSuspension verdünnen1. Schritt :auf OD 578 zwischen 0,7 u. 0,9 verdünnenVerdünnung notieren (= V 1 )2. Schritt:weiter verdünnen: 1/1.5 1/2 1/4 1/6 1/10 1/201/30 1/60 (= V 2 )Berechnung der GesamtverdünnungV gesamt = V 1 x V 2 ( z.B. 1/20 x 1/1,5 = 1/30)↓Messung der OD 578 aller Verdünnungsstufen↓Zeichnen der Eichkurve OD 578 = f (TM).Die Konzentrationen in den Verdünnungenkönnen aus den gewogenen Trockenmassen undden Verdünnungsfaktoren errechnet werden.C (mg/ml) = (TM * V gesamt )/ 5Der Reziprokwert des Anstieges der Eichkurveist der Faktor (F), mit dem die OD 578 -Wertemultipliziert werden müssen, um denTrockenmasssewert zu erhalten.Messung der optischen Dichte:1. Probe in den linearen Bereich der Trockenmasseeichkurve (OD 578 unter 0,3) verdünnen (!) undmöglichst wenige verschiedene Verdünnungen verwenden! (1/2, 1/5, 1/10); stets 3fach-Bestimmungen2. OD 578 in Plastikküvetten messen, zuvor jedoch im Zentrifugenglas oder Eppi verdünnen (!)3. OD 578 x F x Verdünnung = Trockenmasse (mg/ml)F = Faktor, der sich aus dem Anstieg der Eichkurve ergibt (ist zu ermitteln)

14Durchführung 2. TagGlucosebestimmungGlucose + H 2 O + O 2H 2 O 2 + DH 2GlucoseoxidasePeroxidaseGluconsäure + H 2 O 22 H 2 O + D DH 2 = ABTS red D = ABTS oxEs werden bereitgestellt:A) Phosphatpuffer: 40 mM pH 7.0B) Enzymlösung: 10 mg Glucoseoxidase, 3 mg Peroxidase in 1 ml PufferC) ABTS-Lösung: 50 mg ABTS in 2 ml PufferD) Glucosestandard: 0.2 mg/ml Glucosefrisch herstellen:E) Inkubationslösung: 20 ml A + 0,04 ml B + 0,4 ml C (pro Mikrotiterplatte)F) Verdünnungen Glucosestandard: 0.2 mg/ml, 0.10mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/mlLösung E erst herstellen, wenn alle Proben/Standard auf Mikrotiterplatte gegeben wurden!!!Durchführung:Der Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt (Pipettierreihenfolge beachten)• 0.01 ml Probe/Standard + 0.2 ml E• 60 min inkubieren• E 436 bestimmenBlindwert: statt Probe Aqua dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragenStandard: statt Probe fünf Standardkonzentrationen (siehe F) in jeweils 3 Parallelen auftragenProben: 3fach Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen(Verdünnen! nach Absprache)Lactosebestimmung… erfolgt in 2 Schritten:1. Spaltung der Lactose durch ß-Galactosidase2. Bestimmung der gebildeten Glucose mit der ABTS-MethodeBerechnung der Lactosekonzentration:Aus der Differenz zwischen Glucosewert aus der Lactosebestimmung und Glucosewert aus derGlucosebestimmung berechnen.

15In die Felder (= Well) einer Mikrotiterplatte werden pipettiert:• 0.02 ml Probe/Standard + 0.04 ml ß-Galactosidase• 120 min inkubieren• + 0,2 ml Lösung E (siehe Glucosetest)• 60 min inkubieren• E 436 bestimmenBlindwert: statt Probe Aqua dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragenStandard: statt Probe Glucosekonzentrationen auftragen 0.2 / 0.1 / 0.05 / 0.02 / 0.01 mg/mlProben: 3fach-Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen(Verdünnen! nach Absprache)Bestimmung der Volumenaktivität der ß-GalactosidaseHerstellung von Rohextrakt RE• suspendierte Feuchtzellen auftauen (Proben enthalten bereits Natriumdesoxycholat)• ≥ 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubieren• 30 min bei 13000 x g zentrifugieren (Raumtemperatur)• Überstand in neues Reaktionsgefäß geben und bis zur Messung auf Eis lagernMessung:ß-Galactosidaseo-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid (NPGP) + H 2 Oo-Nitrophenol + GalactoseDas Reaktionsprodukt o-Nitrophenol wird bei 408 nm (E 408 ) vermessen. Die Messung erfolgt inMikrotiterplatten in je drei Parallelen (pro Probe):• 0.025 ml RE + 0.075 ml Substratpuffer (1,5 mM NPGP in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5)• 10 min messen (kinetische Messung)Die Reaktionsgeschwindigkeit wird als Extinktionsänderung pro Minute ausgedruckt.Molarer Extinktionskoeffizient für o-Nitrophenol: 3.06 mM -1 x cm -1Schichtdicke: 0.5 cmUnter Berücksichtigung aller Verdünnungen ergibt sich die Volumenaktivität (V A) der ß-Galaktosidaseim RE in der Dimension U/ml (Formel S. 2). Die spezifische Aktivität ist der Quotient aus der V A undder Gesamtproteinmenge in 1 ml RE mit der Dimension U/mg.

16Proteinbestimmung der RE (für Berechnung der spezifischen Aktivität der ß-Galaktosidase):Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mitdem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nmquantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µlMessreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µlH 2 O dest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiertund danach die E 590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen.Aus einer Protein-Standardlösung (RSA, 1 mg/ml) werden die Proben für die Protein-Eichkurvevorbereit – dazu Verdünnungen mit jeweils 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml Protein in H 2 O destherstellen. Der Standard 0 µg/ml entspricht der Blank-Probe.Auswertung des Wachstumsversuches• µ max1 (Glucose)• µ max2 (Lactose)• Ertrag (X) auf Glucose und auf Lactose• Ertragskoeffizienten (Y x/s ) für beide C/E-Quellen• Verdopplungszeiten für das Wachstum auf Glucose und Lactose (t d )• Trockenmassezunahme, Abnahme von Glucose und Lactose, Änderung der ß-Galactosidaseaktivität alles im Zusammenhang als f(t) grafisch darstellen undinterpretieren.Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ausPseudomonas syringaeGlucose-6-Phosphat-Glucose-6-Phosphat + NAD + Dehydrogenase6-Phosphogluconolacton + NADH + H +Die Messgröße ist der Extinktionsanstieg, der durch die Bildung von NADH 1erfolgt und bei 340 nmverfolgt wird. (ε 340 = 6.2 mM -1 *cm -1 )Durchführung:In eine Küvette werden pipettiert:• 0.6 ml 0.05 M Triethanolamin-Puffer pH 7.5 (TEA-Puffer)• + 0.05 ml 15 mM NAD• + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat-DH• + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat (Reaktionsstart; mit 150 mM Glc-6-Phosphat beginnen)• mit Plastikspatel gut mischen und Küvette in Messgerät stellen

17Folgende Konzentrationen Glucose-6-Phosphat werden eingesetzt:150 mM, 75 mM, 37.5 mM, 18.75 mM, 15 mM, 7.5mM, 5 mM, 3.75 mM, 3 mM, 1.5 mM, 1 mMStammlösung: 150 mMDie Ermittlung der Volumenaktivitäten für die einzelnen Substratkonzentrationen erfolgt über dasLambert-Beersche Gesetz wie im Versuch 1 dargestellt.Auswertung der Enzymkinetik (Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase)• Die ermittelte Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentrationist im LINEWEAVER-BURK und im HILL-PLOT darzustellen. Der Hill-Koeffizient ist zu bestimmen.Anmerkung: Die im Experiment ermittelten Daten liegen im HILL-PLOT nicht alle aufeiner Geraden. Für die Berechnung von n wird die Gerade mit dem größten Anstiegzugrunde gelegt (Konzentrationen < 10 mM).

198. Tabellen• Jede Tabelle erhält eine Nummer. Diese Nummern sind im ganzen Heft fortlaufend.• Jede Tabelle erhält einen Titel und eine Überschrift die beschreibt, was dargestelltist. Außerdem kann auf eine Abbildung verwiesen werden.• Alle Zeilen und Spalten müssen eindeutig beschriftet sein mit Werten und Einheiten in(runden) Klammern.• Wird eine Zeile oder Spalte aus einer anderen berechnet, so ist in der Überschrift derRechenweg anzugeben.• Ausreißer auf jeden Fall mit in der Tabelle auflisten.• Anmerkungen zu einzelnen Werten werden als Fußnote angegeben.Beispiel für eine Tabelle:Tabelle 15: Zunahme der OD 578 , der Wasserstoffmenge und Abnahme des pH-Wertes beimWachstum von Clostridium pasteurianum auf Glucose-Mini-malmedium. OD berechnet 578 =gemessen(OD 578 - Blindwert)*Verdünnung. Der Blindwert betrug OD 578 = 0,07. DieberechnetZunahme von OD 578 und die Abnahme des pH-Wertes sind in Abbildung 27dargestellt.Zeit (h)gemessenOD 578 VerdünnungberechnetOD 578 pHH 2 (l)0,0 0,330 1 0,263 7,40 0,002,5 0,400 1 0,331 7,24 0,0254,75 0,360 2 0,582 7,00 0,055,0 * 0,268* 10* 1,98* 6,50* 0,40*6,25 0,268 5 0,993 6,68 0,197,75 0,270 10 2,00 6,20 0,418,25 0,335 10 2,65 5,98 0,548,75 0,1016 10 3,16 5,87 0,659,25 0,1011 10 3,11 5,77 0,6810,0 0,337 10 2,67 5,84 0,7010,75 0,343 10 2,73 5,76 0,70*) Werte wurden nicht in die Berechnung mit einbezogen, da eventuell zwei Proben vertauscht wurden9. Alle Nebenrechnungen und Beobachtungen kommen ins Heft und sonst nirgendwo hin;z.B. falls eine 1:20-Verdünnung gemacht wurde, schreibt man auf, wie man sie gemachthat, also:50 µl Probe + 950 µl Wasser entspricht einer 1:20 Verdünnung10. Abgabe immer spätestens am auf das Blockende folgenden Montag. Deshalb wird dasProtokoll während und nicht nach dem Versuch geschrieben. Eichkurven, Tabellen oderAbbildung können, müssen aber nicht mit dem Computer erstellt werden.Viel Spaß und Erfolg im Praktikum!!!