Skript Mikrobenphysiologie-Praktikum 2012

8Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mitdem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nmquantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µlMessreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µlH 2 O dest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiertund danach die E 590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen.Für die Korrelation wird zuerst die Konzentration der Proteinstandards gegen die gemesseneExtinktion (E 590 ) aufgetragen (= Eichkurve). Mit Hilfe dieser Eichkurve kann die Proteinkonzentrationin den verdünnten Zellsuspensionen berechnet werden. Anhand der Auftragung der berechnetenProteinkonzentration über die optische Dichte der Zellsuspensionen (= Korrelation) kann der Faktorermittelt werden, mit dem die OD 578 aus den Wachstumskurven in eine Proteinkonzentrationumgerechnet werden kann.Um die Genauigkeit der Dreifachbestimmung der Messwerte (= drei Parallelen auf Mikrotiterplatte) zuüberprüfen, erfolgt die Berechnung der Standardabweichung s' in %. Abweichung von ≤ 5% sindakzeptabel. Im Praktikum werden Werte ≤ 10% toleriert.Standardabweichung s ∑ n … Anzahl der Messwertex i … Messwertx … Mittelwert ⁄ [%]Durchführung 2. TagBESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES DER PROBEN DES WACHSTUMSVERSUCHES(PROTEIN – TEIL 2 )Der Proteingehalt der am ersten Versuchstag entnommenen Proben soll ermittelt und mit denen derKorrelation verglichen werden. Dazu werden die Zellpellets zunächst in je 1 ml A. dest. resuspendiertund bis zur Messung auf Eis gelagert. Die Proteinbestimmung erfolgt analog zu der am erstenVersuchstag angewendeten Methode (siehe oben). Dabei ist zu beachten, das Proben mit einerOD 578nm > 0.3 (siehe Wachstumskurven) vor der alkalischen Lyse verdünnt werden müssen.Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben des Wachstumsversuches wird zunächst ausden Standardwerten eine Eichkurve erstellt. Mit Hilfe dieser können dann die Proteinkonzentrationender Proben berechnet werden. Zur Auswertung soll eine Grafik erstellt werden, in der die tatsächlichenProteinkonzentrationen mit denen der Korrelation verglichen werden (getrennte Abbildung für aerobeund anaerobe Kultur).