Skript Mikrobenphysiologie-Praktikum 2012

16Proteinbestimmung der RE (für Berechnung der spezifischen Aktivität der ß-Galaktosidase):Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mitdem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nmquantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µlMessreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µlH 2 O dest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiertund danach die E 590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen.Aus einer Protein-Standardlösung (RSA, 1 mg/ml) werden die Proben für die Protein-Eichkurvevorbereit – dazu Verdünnungen mit jeweils 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml Protein in H 2 O destherstellen. Der Standard 0 µg/ml entspricht der Blank-Probe.Auswertung des Wachstumsversuches• µ max1 (Glucose)• µ max2 (Lactose)• Ertrag (X) auf Glucose und auf Lactose• Ertragskoeffizienten (Y x/s ) für beide C/E-Quellen• Verdopplungszeiten für das Wachstum auf Glucose und Lactose (t d )• Trockenmassezunahme, Abnahme von Glucose und Lactose, Änderung der ß-Galactosidaseaktivität alles im Zusammenhang als f(t) grafisch darstellen undinterpretieren.Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ausPseudomonas syringaeGlucose-6-Phosphat-Glucose-6-Phosphat + NAD + Dehydrogenase6-Phosphogluconolacton + NADH + H +Die Messgröße ist der Extinktionsanstieg, der durch die Bildung von NADH 1erfolgt und bei 340 nmverfolgt wird. (ε 340 = 6.2 mM -1 *cm -1 )Durchführung:In eine Küvette werden pipettiert:• 0.6 ml 0.05 M Triethanolamin-Puffer pH 7.5 (TEA-Puffer)• + 0.05 ml 15 mM NAD• + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat-DH• + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat (Reaktionsstart; mit 150 mM Glc-6-Phosphat beginnen)• mit Plastikspatel gut mischen und Küvette in Messgerät stellen