Basismodul Biologie Praxis I Molekulare Pflanzenphysiologie

Im Versuch soll der Einfluss von DCMU auf die Photoreduktion von DCPiP ox untersuchtwerden.Lösungen:Medium A: Medium B:0,33 M Sorbit30 mM KCl 30 mM KCl5 mM NaCl 5 mM NaCl25 mM Hepes-KOH pH 7,6 25 mM Hepes-KOH pH 7,62 mM EDTA 2 mM EDTA1 mM MgCl 2 1 mM MgCl 21 mM MnCl 2 1 mM MnCl 20,5 mM KH 2 PO 45 mM Ascorbat4 mM Cystein1 mM DCPiP – Stammlösung Endkonzentration in den Proben: 0,05 mMDCMU – Stammlösungen Endkonzentrationen in den Proben:(in 10 % EtOH):A: 1 x 10 -6 M 5 x 10 -8 M (für Probe 4)B: 2 x 10 -6 M 1 x 10 -7 M (für Probe 5)C: 5 x 10 -6 M 2,5 x 10 -7 M (für Probe 6)D: 1 x 10 -5 M 5 x 10 -7 M (für Probe 7)E: 2 x 10 -5 M 1 x 10 -6 M (für Probe 8)Versuchsdurchführung:1. Herstellung der Thylakoidsuspension:Wichtig: Isolierung mit vorgekühlten Glaswaren auf Eis durchführen!10 g frische Erbsenblätter werden für alle Gruppen gemeinsam mit 160 mL eiskaltemMedium A im Mixer drei mal drei Sekunden lang homogenisiert. Das Homogenisat wird miteinem Trichter durch vier Lagen Mulltuch filtriert. Das Filtrat wird in einem vorgekühltenErlenmeyerkolben aufgefangen.Von dem Filtrat bekommt jede Gruppe 40 mL in ein 50 mL-Zentrifugenröhrchen; dieGewichte je zweier Röhrchen werden auf der Balkenwaage abgeglichen.Die Chloroplasten werden 5 min in der Zentrifuge (Typ Heraeus Megafuge 1.0) im Kühlraumbei 3500 u/min sedimentiert. Der Überstand wird dekantiert und verworfen. Flüssigkeitsrestewerden auf Papiertüchern abgetropft. Die Pellets werden zunächst in 2 mL Medium B mit derKunststoffpipette gründlich resuspendiert (auf Eis), bevor mit Medium B auf ein Volumenvon 20 mL aufgefüllt wird. Dabei werden die Thylakoide aus den Chloroplasten freigesetzt.Die Suspension wird noch einmal 10 min bei 3500 u/min zentrifugiert. Der Überstand wirdwie oben dekantiert und verworfen. Das Pellet wird in 2 mL Medium B resuspendiert, bevormit Medium B auf ein Volumen von 4 mL aufgefüllt wird.Für die nachfolgenden Reaktionsansätze soll eine Thylakoidsuspension mit einer Extinktionvon 2,0 verwendet werden. Zur Bestimmung der Extinktion werden 20 µL der Suspension in3

einer Küvette mit 1,98 mL Medium B verdünnt (entspricht einer 1:100 Verdünnung), undgemischt. Die Extinktion wird im Photometer bei 600 nm gegen Medium B gemessen.Die Extinktion in der Ausgangssuspension entspricht also dem Hundertfachen desgemessenen Wertes, wenn man von einem linearen Konzentrations- / Extinktions-Verhältnisausgeht.Die Thylakoidsuspension wird nun auf eine Extinktion von 2,0 verdünnt, indem dieentsprechend berechnete Menge der Ausgangssuspension mit Medium B auf ein Volumenvon 5 mL aufgefüllt wird.2. Versuchsansätze:Jetzt werden 8 verschiedene Ansätze in Reagenzgläser pipettiert:Ansatz 1:Ansatz 2:Ansatz 3:erhitzte Probe; durch die Behandlung bei 60°C werden die Proteinkomponentender Elektronentransportkette denaturiert und dadurch inaktiviert.Dunkelprobe; dieses Röhrchen wird dicht mit Aluminiumfolie umwickelt.Ohne Belichtung können keine Elektronen auf DCPiP übertragen werden.LichtprobeAnsatz 4 – 8: Hemmung des Elektronentransports durch steigende Mengen an DCMU.Zunächst wird Ansatz 1 hergestellt (DCPiP noch nicht zugeben!).Während Ansatz 1 10 min bei 60 °C im Wasserbad inkubiert wird, werden die anderenAnsätze vorbereitet.Ansatz 2 wird dicht mit Alufolie umwickelt.Von den fünf DCMU-Stammlösungen A - E (s.o.) werden in die Ansätze 4 – 8 je 200 µLpipettiert.Das DCPiP wird erst unmittelbar vor der Lichtinkubation zu den Ansätzen zugegeben.Ansätze:Ansatz-Nr.1 2 3 4 5 6 7 8erhitzt Dunkel Licht DCMU DCMU DCMU DCMU DCMUThylakoide 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µLH 2 0 300 µL 300 µL 300 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLMedium B 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3.0 mL 3.0 mLDCMU - - -200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL„A“ „B“ „C“ „D“ „E“DCPiP 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µLDie Reagenzgläser werden mit Parafilm verschlossen und durch mehrmaliges Invertieren gutgemischt. Dann werden die Proben vor eine Lichtbank gestellt und beobachtet. Wenn dieFärbung von Probe 4 die von Probe 3 erreicht hat, spätestens aber nach 10 min werden dieReagenzgläser noch einmal invertiert.3. Photometrischer Nachweis der DCPiP-Reduktion:Danach werden aus jedem Ansatz 2 mL in ein 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert undin der Tischzentrifuge 10 min bei 16000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig in4

Plastikküvetten pipettiert und die Extinktion [Ε] im Photometer bei 600 nm gegen Medium Bgemessen.4. Auswertung:• Die gemessene Extinktion der Ansätze 3 bis 8 wird auf halblogarithmischem Papierauf der y-Achse gegen die DCMU-Konzentration auf der x-Achse aufgetragen.• Die Extinktionen der Ansätze 1 und 2 werden ebenfalls auf der y-Achse eingezeichnet.• Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse.Versuch 2Anatomie des Angiospermen-LaubblattesAllgemeines:Die Blätter der Angiospermen sind seitliche Anhaftungorgane der Sproßachse, welche in ihrerGestalt an ihre jeweilige Funktion angepasst sind. Es gibt Keim-, Laub-, Kelch-, Kron-,Staub- und Fruchtblätter. Laubblätter sind die Orte der Photosynthese und der Transpiration.Blattspreiten können unifazial oder bifazial aufgebaut sein. Bei unifazialen Blättern sind dieOber- und Unterseite aus einer Seite des Blattprimordiums hervorgegangen. Sie sind daran zuerkennen, dass die Leitbündel im Blattquerschnitt als Ring oder auch als Bogen angeordnetsind und deren Phloem nach außen weist. Beispiele für unifaziale Blätter sind die Blätter vonJuncus- oder Iris-Arten. Bei bifazialen Blättern gehen die Blattober- und Unterseite aus denentsprechend orientierten Seiten der Blattprimordien hervor. Sie sind oftmals sowohlmorphologisch als auch anatomisch dorsiventral differenziert, d.h. Blattober- und unterseitesind verschieden: dorsal findet sich Palisadenparenchym, ventral Schwammparenchym. ImRahmen dieses Versuches wird der anatomische Bau eines bifazialen Laubblattes betrachtet.Das Vorgehen wird durch die Kursassistentinnen und –assistenten demonstriert.Kutikulaobere EpidermisPalisadenparenchymLeitbündelInterzellularen„Mesophyll“Schwammparenchym“Atemhöhle”untere EpidermisSpaltöffnungsapparat aus:• Nebenzellen• Spaltöffnung (Stoma)5

Versuch 3Dünnschichtchromatographische Trennung der ChloroplastenpigmenteAllgemeines:Damit Licht photosynthetisch wirksam sein kann, muss es von Pigmenten in der Zelleabsorbiert werden. Bei höheren Pflanzen sind Chlorophyll a und Chlorophyll b dieHauptpigmente. Chlorophyll, bei dem das zentrale Magnesiumion durch zwei Wasserstoffatomeersetzt ist, wird als Pheophytin bezeichnet. Daneben findet man Carotinoide,lipophile Farbstoffe, die infolge zahlreicher Doppelbindungen gelb, orange oder rot gefärbtsind. Carotine sind reine Kohlenwasserstoffe; am weitesten verbreitet ist das β-Carotin. AlsCarotinoid (Carotin-ähnlich) kommt vor allem ein sauerstoffhaltiges Derivat, das Lutein, vor.β-CarotinLuteinNeoxanthinChlorophyll aChlorophyll bVersuchshintergrund:Im Versuch werden die Pigmente mit einem organischen Lösungsmittel aus den Thylakoidenherausgelöst. Mit diesem Extrakt können die einzelnen Pigmente mittels Dünnschicht-Chromatographie aufgetrennt werden. Die Pigmente werden dabei entsprechend ihrerLöslichkeit zwischen einer stationären Phase und einer mobilen Phase verteilt. Als stationärepolare Phase dient die Kieselgelschicht der Dünnschichtchromatographieplatte und als mobileapolare Phase das organische Laufmittel Petroleumbenzin/Isopropanol/H 2 O. Pigmente mit6

hydrophilen Gruppen, z. B. Aldehydgruppen „-CHO“ oder Hydroxylgruppen „-OH“ wandernweniger weit als Pigmente, die reine Kohlenwasserstoffmoleküle sind.Es soll die Pigmentzusammensetzung von Erbsen, die im Licht bzw. im Dunkeln angezogenwurden, verglichen werden.Versuchsdurchführung:1. Extraktion:Grundsätzlich: Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln mit Handschuhen durchführen!15 Erbsenblätter aus der Dunkelanzucht oder der Lichtanzucht werden in einem Mörser mit3 mL Aceton/Petroleumbenzin (10:1) unter Zugabe einer Spatelspitze CaCO 3 (zurNeutralisation des sauren Zellsaftes) gründlich homogenisiert.Ein Faltenfilter in einem Trichter wird unmittelbar vor der Filtration mit 1 mL des gleichenExtraktionsmittels angefeuchtet. Der Blattbrei wird durch diesen filtriert und in einemErlenmeyerkolben aufgefangen.Der Mörser wird mit 1 mL Extraktionsmittel gewaschen, welches dann ebenfalls auf denFilter gegeben wird.Die Filtermasse wird zweimal mit je 1 mL reinem Petroleumbenzin nachgewaschen.In einem Scheidetrichter werden 5 mL 10 % NaCl-Lösung vorgelegt.Die klare Pigmentlösung wird dazugegeben.Nach Zugabe von 2 mL Petroleumbenzin wird 1 min kräftig geschüttelt, wobei der Hahn undder Stopfen des Scheidetrichters gut festgehalten werden müssen. Zwischendurch wird derKolben kurz belüftet, da Lösemittel einen hohen Dampfdruck haben.Wo beim Schütteln die wässrige und die organische Phasen aufeinandertreffen, gehen dieChloroplastenpigmente, Chinone und Membranlipide in die Petrolbenzinphase über. Diewasserlöslichen Zellkomponenten, z. B. Zucker und Salze, gehen in die Phase aus wässrigemAceton.Während 1 min Ruhe trennen sich die Phasen voneinander. Die untere wässrige Phase wirdvollständig abgelassen, ebenso evtl. ausgefallene Substanzen zwischen den Phasen.Die Benzinphase wird zweimal mit dest. Wasser (ca. 5 ml) durch kräftiges Schüttelngewaschen, um Reste von Aceton zu entfernen. Sollten sich die Phasen nicht gut trennen,kann statt des Wassers die 10% NaCl-Lösung verwendet werden. Die wässrige Phase wirdjeweils abgelassen.Der Petroleumbenzinextrakt wird anschließend in ein 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäßabgefüllt./NaClAceton/PetrolbenzinRohextrakt7

2. Dünnschichtchromatographie:Auf einer DC-Kieselgelplatte wird mit Bleistift vorsichtig und ohne die Kieselgelschicht zuverletzen 2 cm vom unteren Rand entfernt die Startlinie eingezeichnet.Auf Höhe der Startlinie werden einmal 5 µL und einmal insgesamt 30 µl desFarbstoffgemisches (Benzinphase) aufgetragen, indem mit einer 20 µL Pipette sechsmal 5 µLauf einen Punkt aufgetropft werden (auch hierbei die Kieselgelschicht nicht verletzen). Nachjedem Auftrag läßt man die Probe kurz antrocknen.Wenn nach dem Auftragen das Lösemittel vollständig verdampft ist, wird die Platte aufrechtin eine vorbereitete DC-Kammer (Laufmittel: 100 mL Petroleumbenzin, 12 mL Isopropanol,0,25 mL H 2 O) gestellt.Achtung: die Kammern werden von mehreren Gruppen gemeinsam benutzt;sie müssen gleichzeitig bestückt werden und dürfen während des Laufs nicht geöffnet werden.Die Atmosphäre in der Kammer muss mit Laufmittel gesättigt sein, damit dieses gleichmäßigfließen kann, ohne dass die Platten zwischendurch austrocknen.Wenn die Laufmittelfront kurz unterhalb des oberen Randes der Platte angekommen ist, wirddie Platte aus dem Tank herausgenommen, die Front sofort mit Bleistift markiert und diePlatte trocknen gelassen.Auswertung:Umranden Sie die Lagen der Pigmentbanden und berechnen Sie die R f -Werte.Wanderungstrecke der SubstanzR f (Retention factor) = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯Wanderungsstrecke der LaufmittelfrontErklären Sie das Laufverhalten der von Ihnen identifizierten Pigmente in derDünnschichtchromatographie.Welche Unterschiede sehen Sie zwischen den im Dunkeln bzw. im Licht angezogenenErbsenpflanzen?8

Versuch 4Induktion der Nitratreduktaseaktivität in GerstenkeimlingenAllgemeines:Stickstoff ist der quantitativ bedeutendste Mineralstoff für Pflanzen. In Form von Nitrat(NO - 3 ) und Ammonium (NH + 4 ) kommt er im Boden vor. Für diese Stickstoff-Formen habenPflanzen spezifische Transportproteine in der Cytoplasmamembran entwickelt, die dieseIonen unter Energieverbrauch über die Wurzeln aufnehmen.+Das aus dem Boden aufgenommene Nitrat muß zu NH 4 reduziert werden, um inAminosäuren eingebaut werden zu können. Die Reduktion erfolgt in mehreren Teilschritten.Der erste Schritt wird durch das Enzym Nitratreduktase katalysiertNO - 3 + NADH + H + → NO - 2 + H 2 O + NAD +Die Nitratreduktase wird erst induziert, wenn der Pflanze Nitrat zur Verfügung steht, d.h. diePflanze synthetisiert das Enzym nur bei Bedarf.Versuchshintergrund:Im Versuch soll die Nitratreduktaseaktivität in Gerstenkeimlingen gemessen werden, dieentweder mit oder ohne Nitrat im Gießwasser angezogen worden sind.Als Maß für die Nitratreduktaseaktivität dient das bei der Reaktion entstehende Nitrit (NO 2 - ).Nitrit bildet in Gegenwart von Sulfanilamid und N-Naphthyl-(1-)ethylendiammoniumdichlorideinen roten Azofarbstoff, dessen Konzentration im Photometer bei 540 nmgemessen werden kann.Lösungen:Aufschlusspuffer: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,50,1 M Tris-HCl pH 8,0 0,1 M Kaliumnitratlösung1 mM EDTA 1 mM NADH-Lösung10 mM Cystein 1 M ZinksulfatlösungVersuchsdurchführung:1. Herstellung des Enzymrohextraktes:Grundsätzlich: Alle Gefäße ausreichend beschriften. Alle Arbeiten auf Eis durchführen.Sie bekommen zwei Schalen mit 10 Tage alten, im Licht gewachsenen Gerstenkeimlingen.Die eine Schale wurde nur mit destilliertem Wasser, die andere Schale mit 5 mM KNO 3 -Lösung gegossen. Je 1 g (10 etwa 5 cm lange Halme) Sprossmaterial werden im Mörser mit4 mL kaltem Aufschlusspuffer gründlich zerrieben.Von beiden Homogenisaten (+NO 3 - , -NO 3 - ) werden 2 mL mit einer Kunststoffpipette in2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und in der Tischzentrifuge 10 min auf höchsterStufe zentrifugiert.2. Versuchsansätze:9

Von jeder der beiden Proben werden jeweils 400 µL Überstand in je zwei 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und auf Eis gelagert.Zu je einem der Gefäße jeder Probe werden 200 µL 1 M Zinksulfatlösung gegeben.Ansatz(Anzuchtbedingung)(Inhibitor)(A)-+NO 3−Zn(B)+NO 3-+Zn(C)-−NO 3−Zn(D)−NO 3-+ZnKaliumphosphatpuffer 400 µL 400 µL 400 µL 400 µLKNO 3 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLNADH 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL_ZnSO 4200 µL200 µL-Extrakt +NO 3 400 µL 400 µL__-Extrakt −NO 3_ _400 µL 400µL1h RT 1h Eis 1h RT 1h EisDie Ansätze ohne Zinksulfat (Ansätze (A) und (C)) werden eine Stunde bei Raumtemperaturinkubiert, die Ansätze mit Zinksulfat (Ansätze (B) und (D)) werden auf Eis belassen!In dieser Zeit wird die Eichkurve vorbereitet.3. Nitrit – Eichkurve:Für die Eichkurve werden folgende Ansätze einer 0,1 mM KNO 2 -Lösung in Reagenzgläserpipettiert:_Ansatz Nummer 1 2 3 4 5 6 7 8KNO 2 0,0 20 µL 50 µL 100 µL 200 µL 300 µL 400 µL 500 µLH 2 O 1000 µL 980 µL 950 µL 900 µL 800 µL 700 µL 600 µL 500 µLnmol KNO 2 abs. _(bitte ausrechnen)Extinktion NullprobeBeispiel zur Berechnung der Nitritmenge:Probe 8 enthält 500 µl einer 100 µMolaren KNO 2 – Lösung:1 l 100 µmol, 500 ml 50 µmol, 500 µl 50 nmol4. Nitrit – Nachweis:Die Versuchsansätze und die Proben für die Eichkurve werden parallel weiterbearbeitet.Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden die Reaktionen in den Versuchsansätzen(A) und (C) durch Zugabe von je 200 µL 1 M Zinksulfatlösung gestoppt.Die Eppendorf-Reaktionsgefäße (Ansätze (A)-(D)) werden 1 min auf höchster Stufezentrifugiert. Je 1 mL des klaren Überstandes wird in beschriftete Reagenzgläser überführt.10

Jetzt werden sowohl zu den Enzymproben (Ansätze (A)-(D)), als auch zu den Proben 1 – 8der Eichkurve je 1 mL Sulfanilamid- und Naphtyl-Reagenz zugegeben. Die Proben werdengut gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert.Das Nitrit reagiert mit der Aminogruppe des Sulfanilamids zu Diazoniumchlorid, das durchKupplung mit N-[Naphtyl-(1)-]-ethylendiamin einen roten Azofarbstoff bildet.Die Extinktionen werden bei 540 nm gegen die Nullprobe der Eichansätze imSpektralphotometer gemessen.Auswertung:Tragen Sie die Extinktionswerte der Eichkurve in einem Graphen auf der y-Achse gegen dieNitritmenge (in nmol) auf der x-Achse auf.Bestimmen Sie die gebildete Nitritmenge der Pflanzenextrakte.Vergleichen Sie die Aktivität der Nitratreduktase aus beiden Rohextrakten.Viel Erfolg und viel Spaß!11