Immobilisierung

Erweiterte Stabilitätseffekte und redox –
aktive Dendrimere für eine orientierte Immobilisierung
von Redoxenzymen auf
Elektroden
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Frank Müller
Bochum, Juli 2016
I

Der praktische Teil dieser Arbeit wurde in der Zeit von November 2011 bis Oktober 2014
in der Arbeitsgruppe von Dr. Plumere im Zentrum für Elektrochemie angefertigt. Die schriftliche
Ausarbeitung erfolgte von November 2014 bis Juli 2016.
Eingereicht am 28.07.2016
Referent:
Korreferent
Dr. Nicolas Plumeré
Prof. Dr. Axel Rosenhahn
II

We are all in the gutter,
But some of us are looking at the stars.
Oscar Wilde, 1892, Lady Windermere’s Fan: A Play About a Good Woman
Wir liegen alle in der Gosse,
aber einige von uns betrachten die Sterne.
Lady Windermeres Fächer
Mit blutverschmierten Händen
Mit einer Träne im Gesicht
Einem Lächeln auf dem Lippen
Und der Hoffnung tief im Blick
Aufzustehen auch aus dem Dreck
Tief beschmutzt und stolz im Herz
Dem Leben neu erwacht
Und erwacht ganz neu im Leben
Lacrimosa, Stolzes Herz
III

Danksagung
Viele Menschen haben mich während der Zeit im Zentrum für Elektrochemie begleitet
und unterstützt. An dieser Stelle möchte ich mich bei ihnen bedanken.
Ich danke ganz besonders Dr. Nicolas Plumeré für die vielen wissenschaftlichen Diskussionen
und sein Vertrauen in mich, als er mir dieses interessante Thema gab. Ich danke ihm
auch dafür, eigenständiges Arbeiten gelernt zu haben und mich auch in meiner persönlichen
Entwicklung unterstützt zu haben.
Prof. Dr. Axel Rosenhahn danke ich, dass er bereit ist, kurzfristig das Korreferat für meine
Promotion zu übernehmen.
Prof. Dr. Thomas Happe und seiner AG danke ich für die Bereitstellung ihrer FNR-
Enzyme für meine Forschung. Zudem danke ich Uli Rant von der TU München für die
switch-sense Messungen meiner FNR-Enzyme.
Ich bedanke mich bei allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Analytische
Chemie/CES für drei schöne und ereignisreiche Jahre. Vor Allem möchte mich bei
der Nachwuchsgruppe Plumeré bedanken. Steffi Stapf danke ich für die unzähligen Frühstücke,
Pausen und nicht immer wissenschaftlichen Diskussionen und dafür, dass sie meine Musik
und meine Launen ertragen hat. Ich danke Rhodri Williams für interessante Geschichten
aus Wales im walisischen Dialekt. Ich danke auch den ehemaligen Mitarbeitern Malte Kokoschka,
Sascha Pöller, Dominik Schäfer, Jakub Tymoczko, Stefan Klink und Lutz Stratmann,
sowie den aktuellen Dr. Jan Clausmeyer, Miri, Ela und Anna.
Ich bedanke mich auch bei den guten Seelen der Analytischen Chemie, Monika Niggemeyer,
Thomas Naber, Bettina Stetzka, Sandra Schmidt, Sabine Seisel, Johannes Schröder,
Thomas Erichsen und Michael Ehrlich. Ohne sie würde im Lehrstuhl nur die Hälfte funktionieren.
Ich bedanke mich bei allen Vertiefern und Studenten, die ich betreuen durfte. Durch sie
konnte meine Arbeit bereichert werden.
Ich danke Thore Schmidt und Tim Kothe dafür, dass sie mir immer genug Enzyme hergestellt
haben. Ich bedanke mich auch für viele wissenschaftliche und nichtwissenschaftliche
IV

Gespräche. Ihre etwas andere Sicht aus Biologenseite hat so manche Tür geöffnet und einige
Fehlschläge leicht geklärt.
Ich danke Chris Nielinger für die Bereitstellung der Hydriereinheit, ein bisschen Palladium
und Wasserstoff.
Ich danke Dr. Max Lieb und Dr. Christiane Klare für viele konstruktive Gespräche neben
der Wissenschaft und dafür, dass sie immer ein offenes Ohr für mich hatten. Ebenso danke
ich Marcus Maschke und David Bulfield, denen man das ein oder andere Mal bei Max über
den Weg gelaufen ist und die jeden Tag aufgewertet haben.
Ich danke meinen Freunden, die mich neben meiner Arbeit begleitet und unterstützt haben.
Besonders seien hier Linda Dudda, Dirk Tanzmann, Linda Krohn und meine Kempo –
Truppe genannt. Besonders möchte ich Sabrina „Quietschie“ Wallner und Bettina Baumgarten
danken, die mir immer geholfen haben und sich in vielen Lebenslagen als gute Freunde
ausgezeichnet haben.
Ich danke meiner Familie, dass sie mir das Studium und die Promotion ermöglichten, dass
sie mir bis zum Ende Rückhalt gaben und mich zu jeder Zeit unterstützten. Meinem Vater
danke ich insbesondere für die Hilfe bei der Korrektur der Arbeit, was den Stil deutlich aufwertetet.
Meiner Mutter danke ich für viele ermutigende Gespräche, die mich Durchhalten
ließen und bis zum Ende begleiteten. Ich danke Katha, dass sie immer an mich geglaubt hat
und nie die Geduld mit mir und meiner Arbeit verlor.
V

Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... IX
1 Einleitung..................................................................................................................... 1
2 Stand der Technik ........................................................................................................ 4
2.1 Oberflächenmodifizierung ................................................................................... 4
2.1.1 Ungerichtete Orientierung der Enzyme auf den Oberflächen .......................... 4
2.1.2 Gerichtete Orientierung der Proteine auf den Oberflächen .............................. 6
2.2 Oberflächenmodifikationen ................................................................................ 12
2.2.1 Allgemeines über die Verwendung von Dendrimeren ................................... 14
2.2.2 Dendrimere in der “Life Science” .................................................................. 17
3 Problemstellung ......................................................................................................... 21
4 Ergebnisse und Diskussion der eigenen Arbeit ......................................................... 24
4.1 Die Kinetik und Anbindung einer Enzymmatrix (FNR) an Oberflächen .......... 24
4.1.1 Synthese und Immobilisierungsstrategien ...................................................... 25
4.1.2 Kinetiken zu enzymatisch katalysierten Reaktionen [1–4] ................................ 30
4.1.3 Kinetiken zur Anbindung an Oberflächen ...................................................... 38
4.2 Synthese und Charakterisierung einer leitfähigen Zwischenschicht
(Dendrimermatrix)................................................................................................................ 66
4.2.1 Synthese der Monomere und Modifikation der Dendrimere .......................... 68
4.2.2 Kinetiken zur Anbindung an Goldoberflächen ............................................... 76
4.2.3 Zusammenfassung der drei NTA – Viologen Dendrimere ............................. 91
4.3 Die Kontaktierung der Enzymmatrix durch die Zwischenschicht mit der
Elektrode 93
4.3.1 Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse ................................................ 93
4.3.2 Ausblick .......................................................................................................... 95
VI

4.3.3 Kinetiken zur Anbindung des FNR Enzyms an die Oberfläche ................... 104
4.3.4 Stabilität des FNR Enzyms an der Oberfläche ............................................. 115
5 Zusammenfassung ................................................................................................... 118
6 Experimentelle Durchführung ................................................................................. 120
6.1 Chemikalien und Geräte ................................................................................... 120
6.1.1 Chemikalien .................................................................................................. 120
6.1.2 Biochemika ................................................................................................... 121
6.1.3 Geräte ............................................................................................................ 122
6.1.4 Verbrauchsmaterialien und Lösungen .......................................................... 122
6.2 Synthese der Monomere für die kinetischen Messungen des FNR Enzyms .... 124
6.2.1 N – (lipoyloxy) – succinimide ...................................................................... 124
6.2.2 N – [5 – (1,2 – dithiolan – 3 – ylpentanoylamino) – 1 – carboxypentyl]
iminodiacetic acid ........................................................................................................... 124
6.3 Synthese der Dendrimere, inkl. Monomerendarstellung .................................. 126
6.4 Elektrochemische Messungen .......................................................................... 133
6.4.1 Vorbereitung der Elektroden; polieren und elektrochemisches Reinigen .... 133
6.4.2 Messung von k 2 und K M ............................................................................... 133
6.4.3 Messung von k 3 ............................................................................................ 134
6.4.4 Generelle Anbindung eines Dendrimers ....................................................... 134
6.4.5 Generelle Anbindung eines veränderten FNR Enzyms an ein Dendrimer ... 135
6.5 SPR Messungen ................................................................................................ 135
6.5.1 FNR Anbindung an NTA – Liponsäureoberflächen..................................... 135
6.5.2 Dendrimeranbindung .................................................................................... 136
7 Literaturverzeichnis ................................................................................................. 137
8 Anhang.......................................................................................................................... i
VII

8.1 Graphen zur kinetischen Untersuchung der FNR ................................................. i
8.1.1 Bestimmung des k 2 – Wertes ............................................................................. i
8.2 NMR Spektren der Dendrimersynthese .............................................................. iii
8.3 Messung der Dendrimere an Elektrodenoberflächen .......................................... vi
8.4 Messungen zur Anlagerung der drei Dendrimere an die SPR Oberfläche .......... ix
8.4.1 Dendrimer 1 (1 – 3) ......................................................................................... ix
8.4.2 Dendrimer 2 (1 – 1) ......................................................................................... xi
8.4.3 Dendrimer 3 (3 – 1) ........................................................................................ xii
VIII

Abkürzungsverzeichnis
A g
bzw.
Cp
CV
d ET
DMSO
D 2 O
F
FNR -
Enzym
IMAC
KNO 3
m ET
MIT
Geometrische Oberfläche der Elektrode
beziehungsweise
Cyclopentadienyl
Zyklische Voltammogramme (cyclic voltammography)
direkter Elektronentransfer
Dimethylsulfoxid
Deuteriumoxid
Faradaykonstante (96485 C/mol)
Ferredoxin – NADP(+) – reductase
Metallionenaffinitätschromatographie (ion metal affinity chromatography)
Kaliumnitrat
Mediierter Elektronentransfer (mediated electron transfer)
Metallionentrasfer (metal ion transfer)
N A (=N/n) Avogadrokonstante (6 ∗ 10 mol )
NCL
NTA
NHE
NHS
NTA
OAc
PAMAM
native chemische Ligation
NαNα-bis(carboxymethyl)-L-lysine Hydrat
Normal Wasserstoff Elektrode (normal hydrogen electrode)
N – Hydroxysuccinimid
Nitrilotricarboxylic acid
Acetat
Polyamidoamin
PB Phosphatpuffer (phosphate buffer, 0.1 M, pH 7.5)
SPPS
Solid phase peptide synthesis; Festphasenpeptidsynthese
IX

SPR
TACN
TCEP
Tos
V++
vllt.
Wt
Surface Plasmon Resonance (Oberflächenplasmonenresonanz)
Triazacyclononan
Tris(2-chlorethyl)phosphat (Sigma – Aldrich)
Tosylat (4-Methylbenzylsulfonat)
Viologen
vielleicht
wildtypisches Enzym, genetisch unverändert
Θ Bedeckungsgrad (R eq /B max )
X

Einleitung
1 Einleitung
In den frühen 60er Jahren entwickelten Clark und Lyons die erste mit Enzymen modifizierte
Elektrode [5] . Seitdem ist das Interesse der Wissenschaft an Immobilisierungsstrategien
für Enzyme stetig gestiegen [6] , da diese ein breites Spektrum an möglichen Anwendungen
bieten [7,8,9] . Beispiele hierfür sind die Bestimmung einzelner Parameter in komplexen Matrizes,
wie zum Beispiel Zucker im Blut [10,11] . Durch die feste Verankerung von Proteinen an
Enzymoberflächen kann heute zum Beispiel die Glukosekonzentration im Blut von Diabetespatienten
über solche auf Enzymelektroden basierenden Biosensoren zu erschwinglichen
Preisen bestimmt werden [9,12,13] . Ebenso lassen sich Hormone, Antigene und Antikörper bestimmen
[14] .
Die Nachfrage nach solchen Systemen, die vor allem in der medizinischen Diagnostik sowohl
ex vivo als auch in vivo Anwendung finden, wächst seit einiger Zeit stetig. Jedoch stellt
die stabile und dauerhafte Immobilisierung unter Retention der biologischen und katalytischen
Aktivität der Proteine eine große Herausforderung dar [7,15–17] . Bislang verfügbare Verfahren
zur Oberflächenmodifikation stellen die Quervernetzung [18] , die kovalente Anbindung
[10,19,20] oder der Membranschluss [21] dar. Der Nachteil dieser Verfahren ist, dass die Reproduzierbarkeit
von Ergebnissen und Messwerten nicht immer gegeben ist.
Ein weiteres Problem ergibt sich auch durch die fehlende Information über die Orientierung,
mit der ein Enzym an die Oberflächen gebunden wird. Eine Bindung in einer ungünstigen
Position kann den Zugang der Substrate zu den aktiven Zentren der Enzyme bzw. der
Bindungsdomäne der Antikörper erschweren oder unmöglich machen. Zudem kann ein Enzym
so gut in seiner Matrix verpackt sein, dass es nicht von der Oberfläche dissoziieren kann,
aber auch kein anderes Molekül mehr zu ihm durchdringt. Daraus ergibt sich die zu überbrückenden
Distanz zwischen den Redoxzentren des Enzyms und dem des Elektronenmediators,
welcher die Elektronen zur Elektrode bringen soll, als eine weitere Schwierigkeit.
Der Abstand zwischen zwei Redoxzentren ist nach der Marcus-Theorie [22] , neben der Potentialdifferenz
und der Reorganisierungsenergie, der wichtigste Parameter, der das detektierbare
Signal qualitativ und quantitativ bestimmt. Die elektrochemische Reaktion findet oft tief
in dem Enzym eingebettet statt, so dass es für den Elektronenmediator wichtig ist, direkt in
das aktive Zentrum zu diffundieren. Eine etablierte und gute Methode für viele Anwendungen
ist die ungerichtete freie Diffusion solcher Mediatoren, die an der Oberfläche reduziert oder
1

Einleitung
oxidiert werden und dann zu dem Ort der biologisch katalysierten Reaktion kommen, um
Elektronen aufzunehmen oder abzugeben.
Daher besteht ein großer Bedarf an neuartigen Immobilisierungsstrategien, welche ein Enzym
zum einen stabil an eine Oberfläche binden, aber auch den nötigen Raum zur Substratumsetzung
bieten. Eine der wichtigsten Entwicklung in diesem Bereich ist die gerichtete Orientierung
von Proteinen auf Oberflächen [1,3,23,24,25] . In frühen und auch aktuellen Arbeiten
werden oft omnipräsente schwache Wechselwirkungen, z.B. Wasserstoffbrücken oder hydrophobe
Wechselwirkungen zwischen den funktionellen Gruppen des Proteins und der Oberfläche
genutzt, jedoch können keine Information über die Orientierung des aktiven Zentrums
gegeben werden. Daher geht ein großer Teil der Effizienz dieser Techniken an einer schlechten
Ausrichtung der Proteine verloren. Eine erste Verbesserung kam durch die Überkompensation
durch die Verwendung von Polymeren [15,26] , die in der Lage sind, die Beladung der
Oberflächen mit Proteinen zu erhöhen. Dadurch kann die erhaltene Signalstärke vergrößert
werden.
In neueren Arbeiten wurde daher angestrebt, selektiv Aminosäurefunktionen wie Histidin,
Tyrosin oder Cytosin als tags (Anker) zur Anbindung von Proteinen in einer spezifischen Biokonjugation
zu verwenden. Bislang sind die möglichen Anwendungen jedoch durch verschiedene
Probleme wie eine schlechte Bindungsaffinität, der Sauerstoffsensibilität oder die
Größe der tags oder eine zu hohe Hydrophobizität der verwendeten Systeme limitiert, da diese
zu Proteindeformationen führen. Zwar ist das Einführen der künstlichen tags zuerst aufwendig,
aber die sich daraus ergebenden Vorteile sind erheblich.
Gut erforscht ist das Einbringen von terminalen Histidin-tags an den C- oder N-Terminus
von Proteinen. Angewandt werden diese Prozeduren schon lange in der Affinitätschromatographie
zur Aufreinigung von Proteinen. Hierfür werden oft Ni(II)-Komplexe basierend auf
Nitrilotriacetic Acid (NTA) verwendet, welche Histidin mit einer Bindungskonstante im nanomolaren
Bereich komplexieren können [27] .
Zur Proteinimmobilisierung wird oftmals eine isotrope Orientierung des Proteins benötigt,
um die Erreichbarkeit des aktiven Zentrums oder der Bindestelle des Enzyms zu sichern. Zudem
muss die Markierung des Proteins mit dem Histidin-tag kontrolliert an der gewünschten
Stelle ablaufen können. Um die Orientierung des Enzyms zu kontrollieren, könnten mehrere
Metallbindestellen durch das Einbringen mehrerer Histidin-Residuen in das Proteinrückgrat
geschaffen werden. Ein Beispiel hierfür ist das His-X 3 -His Motiv, welches aus zwei Histidinen
besteht, die durch eine α-Helix Schleife getrennt werden. Mit diesem Motiv konnten En-
2

Einleitung
zyme an Metalle komplexiert werden [2][47] . Diese Technik könnte sich also zu Nutze gemacht
werden, um Enzyme über Ni-His-Komplexe an eine Oberfläche zu binden.
Für die effektive Anbindung eines Enzyms an eine Elektrode muss auch die Bindung zwischen
dem Linker, der das Protein komplexieren soll und der Oberfläche gegeben sein. Zudem
muss der Linker möglichst geordnet an der Oberfläche binden, um eine größtmögliche
Effizienz zu erreichen.
Für die Darstellung geordneter Oberflächen haben sich in den letzten dreißig Jahren
Dendrimere als innovative Klasse makromolekularer Strukturen herausgebildet. Sie sind
exakt definierte Moleküle, die durch die Kaskadensynthese hergestellt werden [28] . Weiterentwickelt
wurde diese Strategie u.a. von Tomalia [29] und Newkome [30] und hat bis heute eine
weite Evolution durchgemacht [31,32] . Die Anwendung der Dendrimere, insbesondere in der
Life Science, reichen von dem Transport von Wirkstoffen [33,34] über die Unterstützung von
wachsendem Gewebe [35] bis hin zur Diagnostik und der Verwendung als Sensor [36] .
Neben diesen speziellen Eigenschaften gibt es allgemeine Prinzipien, die den Dendrimeren
gemein sind, wie der exakte und geregelte Aufbau durch die Kaskadenreaktion. Die
Strukturen können multifunktionell gestaltet werden, so dass ein Dendrimer unterschiedliche
Aufgaben ausführen kann. Neben den unterschiedlichen Eigenschaften durch den Aufbau,
welche durch die verwendeten funktionellen Gruppen beeinflusst werden, weisen die
Dendrimere auch einzigartige physiologische Bedingungen auf, die in Wechselwirkung mit
Enzymen die Stabilität erhöhen und ein Denaturieren unterdrücken.
Eine neue Immobilisierungsstrategie, welche sich eines genetisch optimierten Enzyms bedient,
könnte zu einer stabileren Bindung an eine Elektrode führen. Dabei ist es denkbar, dass
durch die zweite Bindungsstelle eine Verbesserung der Stabilität erzielt wird, deren Summe
größer ist, als die der einzelnen Metall – Enzym – Bindungen.
Das genetisch veränderte Enzym soll zusammen mit einem speziell angepassten Dendrimer
an einer Elektrode immobilisiert werden. Durch seine exakte Orientierung können die
Redoxmediatoren des Dendrimers sein aktives Zentrum erreichen. Dadurch würde das Enzym
mit einer höheren Stabilität vor der Elektrode kontaktiert sein als bei etablierten Immobilisierungsstrategien.
3

Stand der Technik
2 Stand der Technik
2.1 Oberflächenmodifizierung
In der aktuellen Forschung nimmt die Modifizierung von Oberflächen immer mehr Platz
ein. Eine Vielzahl von Techniken zur Herstellung von hochspezialisierten Materialien wurde
und wird erforscht [16,17] .
Zuerst stellen sich einige Fragen zur Immobilisierung von Enzymen. Zum einen können
sie kovalent, bzw. nicht-kovalent an Oberflächen gebunden werden, zum anderen ist es möglich
sie dabei in einer bestimmten Orientierung und Ordnung aufzubringen, oder eine statistische
Verteilung der einzelnen Moleküle zuzulassen. Jede Art der Immobilisierung eines Enzyms
ist diesen Effekten unterworfen und hat die Tendenz sich im Feld dieser beiden Hauptströmungen
einzuordnen.
Abbildung 1: Ungeordnete Immobilisierung
von Enzymen in einer Polymermatrix
2.1.1 Ungerichtete Orientierung der Enzyme auf den Oberflächen
Betrachtet man als erstes die ungerichteten Immobilisierungstechniken, die dazu führen,
dass ein Enzym an einer Oberfläche adsorbiert, so finden die klassischen schwachen Wechselwirkungen
die häufigste Anwendung. So ist die Anbindung von Proteinen über die Polystyroloberflächen
mit großer Oberfläche zuerst zu nennen. Aber auch ionische Wechselwirkungen,
durch die Exposition von Ammonium- oder Carboxylatgruppen auf der Oberfläche
ermöglicht die Anlagerung von Proteinen [37] . All diese Adsorptionstechniken sind ungerichtet
und das letztendliche Bild spiegelt das energetische Minimum aller abstoßenden Effekte zwischen
dem Enzym, der Oberfläche und anderen Enzymen im Gegensatz zu den attraktiven
Wechselwirkung zwischen dem einzelnen Enzym und den funktionellen Gruppen auf der
Oberfläche wider.
Neben den genannten Beispielen werden Enzyme
auch häufig in Hydrogelen immobilisiert, die auch ohne
weitere Funktionalisierung durch polare Wechselwirkungen
gebunden werden können [38] . Durch die Verwendung
von sulfatfunktionalisiertem Dextran kann die
Bindung zu Enzymen aber noch gesteigert werden, als
wenn nur Cellulose oder Aspartatfunktionalisierte Hydrogele verwendet werden [39] . Ein weiterer
Vorteil solcher dreidimensionalen Matrices ist die wässrige Umgebung die entsteht.
4

Stand der Technik
Dadurch kann das Protein im Raum diffundieren und zusätzlich ist nur wenig Platz vorhanden,
was im lokalen die Viskosität des Wassers etwas heraufsetzt. Dadurch wird die Umgebung,
ähnlich einer Zelle, imitiert, was das Enzym weiter stabilisiert [40] .
Eine weitere Möglichkeit der ungerichteten Immobilisierung ist die Bindung von Cysteingruppen
in der Peripherie des nativen Enzyms an Goldoberflächen [41] . Auch hier ist wieder
ein großer Verlust der Aktivität zu erwarten durch die Denaturierung der Enzyme, bei Kontakt
mit der Oberfläche.
Die nächste Möglichkeit ist die Verknüpfung von funktionellen Gruppen der Oberfläche,
die im Vorfeld auf der Oberfläche synthetisiert werden, mit denen, die auf der Peripherie des
Enzyms liegen. Zu dieser Technik gibt es verschiedene Ansätze die von der jeweiligen Elektrodenoberfläche
abhängig sind. Wählt man als Ausgangsmaterial eine Glas- oder Siliciumoberfläche
befindet man sich in der klassischen organischen Chemie. Die jeweiligen Siliciumatome
an der Phasengrenze müssen durch Oxidationsprozesse aktiviert werden, wodurch
im Allgemeinen Hydroxyde entstehen. Diese können durch klassische Verknüpfungsreaktionen
mit funktionalisierten Silanen oder anderen reaktiven Kohlenstoffverbindungen weiter
aufgebaut werden. Ziel ist es in jedem Fall eine terminale Gruppe zu haben, die mit milden
chemischen Methoden weiter reagiert. So eignet sich besonders die EDC/NHS –Chemie zur
Synthese von Amiden [25] . Dabei muss auf der Elektrodenoberfläche eine terminale organische
Säure vorhanden sein, die durch die Reaktion zu einem Succinimidylester wird, der unter
milden Bedingungen mit primären Aminen reagiert, wie sie im Lysin vorliegen. Lysin ist eine
Aminosäure, die mit einer Häufigkeit von >10 % in Proteinen vorkommt [42] . Weitere Gruppen,
die zu einer Bindungsbildung verwendet werden können sind Isothiocyanate [43] , Aldehyde
[44] oder Epoxide [15,45] .
Eine weitere Methode ist die Verwendung von Carbonsäuren, die auf dem Protein durch
die beiden Aminosäuren Aspartat und Glutamat exponiert werden und mit zu den häufigsten
Aminosäureresten auf den Oberflächen gehören. Auch hier werden wieder milde Kupplungsreagenzien,
wie Carbonyldiimidazol (CDI), verwendet werden um die Aminosäuren zu aktivieren
und dann auf eine mit Aminen modifizierte Oberfläche zu geben [46] . Allerdings kann
bei dieser Methode die Vernetzung der Proteine untereinander, durch Reaktion mit den Aminen
auf der Proteinoberfläche anderer Proteine, auftreten, was die Aktivität der einzelnen Proteine
herabsetzt.
5

Stand der Technik
2.1.2 Gerichtete Orientierung der Proteine auf den Oberflächen
Nachdem die ersten beiden Methoden ungerichtete
Adsorptionstechniken beschrieben,
kommen nun die beiden unterschiedlichen Ansätze
zur gerichteten Aufbringung von Proteinen
auf spezielle Oberflächen. Dabei ist vorweg
zu erwähnen, dass sowohl die Proteine als
auch die verwendeten Oberflächen dafür einer
Vorbehandlung bedürfen, damit es nicht wie
bei der zuletzt beschriebenen Technik zu einer
Abbildung 2; Mechanismus eines gebundenen Enzyms
mit hexa-Histidinstreifen an einer Oberfläche mit
Ni 2+ – NTA Komplexen [23]
ungezielten Reaktion der nativ im Enzym vorhandenen
funktionellen Gruppen und der
Oberfläche kommt.
Das Enzym wird zu einem Vektor, der eine Richtungsinformation enthält und dann an der
komplementären Oberfläche gezielt in dieser Richtung aufgebracht wird. Auch hier gibt es
wieder zwei verschiedene Methoden zur Immobilisierung der Enzyme, zum einen über nichtkovalente
Bindungen, zum anderen über kovalente Bindungen. Als erstes werden wieder die
nicht kovalenten Techniken beschrieben, insbesondere die Verwendung von NTA, die für
diese Arbeit wichtiger sind und danach in einem kurzen Abschnitt die kovalenten gerichteten
Anbindungsmethoden.
Die nicht kovalente Anbindung von Enzymen benutzt ein klassisches anorganisches Konzept
zur Bindungsbildung, die Werner’schen-Metallkomplexe [48] , die, mit einer Bindungskonstanten
[2,49] von 10 -6 – 10 -7 M -1 , stabil genug sind Proteine eine Zeit lang zu binden. Proteine
können, wenn sie genetische verändert werden, durch einen Ionenaffinitätschromatotrgraphieprozess
(vgl. Abbildung 3) gereinigt werden [27,50] . Bei diesem Prozess wird klassisch ein
Streifen von sechs Histidin-Aminosäuren an das Ende des genetischen Codes des Proteins
angefügt, der die Aktivität nicht beeinflusst. Aber mit dem entsprechenden Säulenmaterial,
das zweiwertige Übergangsmetalle exponiert, ist es möglich die entsprechenden Proteine reversibel
zu binden und von einer komplizierten Matrix zu isolieren. Der hexa-Histidinstreifen
kann durch Zugabe von Imidazol oder anderen organischen Basen von dem Metall verdrängt
werden und das Protein dissoziiert von der Säule [2,51,52] .
6

Stand der Technik
FAD
FAD
hexa His
hexa His
[NiNTA] [NiNTA] [NiNTA] [NiNTA]
Abbildung 3: schematische Darstellung der etablierten Affinitätsbindung zwischen Metallkomplexen und Histidin
modifizierten Proteinen.
Links ist die klassische Reinigungsmethode mit einem Polyhistidinschwanz an einem FNR Enzymgezeigt.
Oben ist das Bändermodel zu sehen mit dem in rot eingefärbten Schwanz und unten ist eine schematische Darstellung
des Prinzips und der möglichen Orientierung [27] . Rechts ist eine neuer Anwendung, bei der die Histidine in
dem Enzym in einer his-X 3 -his Anordnung sind und somit eine Richtung für das Enzym vorgeben. Oben ist das
Bändermodel mit den rot eingefärbten mutierten Positionen und unten eine schematische Darstellung, die eine
optimierte Orientierung zeigt [1,47] .
Analog zu diesem Reinigungsschritt können die so modifizierten Enzyme auch auf Oberflächen
adsorbieren. Durch die Art der Bindung können die Proteine leicht auf der Oberfläche
wandern, was im extremsten Fall zu einem langsamen Verlust der assoziierten Fracht führen
kann. Das häufigste Metall für diese Anwendung ist das Ni 2+ Kation, welches optimale Bindungseigenschaften
hat und auch elektrochemisch inaktiv ist. Die häufigsten Chelatliganden
sind Nitriltriessigsäurederivate. Sie weisen vier Bindungsstellen auf, die zwei weitere Bindungsstellen
am Nickel unbesetzt lassen. Zusammen mit zwei der Histidinliganden bildet das
Nickel einen stabilen oktaedrischen Komplex, der in wässrigen Salzlösungen nicht dissoziiert
und vielfach zur Herstellung von Proteinbiochips führte [51,53] .
Mit dieser Technik können Monolagen von Enzymen stabil auf einer Oberfläche immobilisiert
werden, was auf den ersten Moment zu deutlich niedrigeren Signalen führen sollte als
eine massive Polymerschicht mit einer hohen Beladung an Enzymen. Der Vorteil dieser
Technik ist die Nähe der Enzyme zu der Sensoroberfläche, was dazu führt das es keine Transportlimitierung
in dem System gibt. Zusätzlich ist durch den definierten Aufbau auch das ak-
7

Stand der Technik
tive Zentrum eines jeden Enzyms zugänglich, was zu einer höheren Ausbeute an Signal führt.
Die Elektronen können direkt zur Elektrode transportiert werden und der Elektronentransfer
erreicht damit Geschwindigkeiten, die in einem Polymerfilm nicht erreicht werden können [50] .
Eine Erweiterung dieser Technik stellt die intramolekulare Modifizierung des Proteins
dar. So konnte gezeigt werden, dass die Orientierung eines Enzyms noch weiter optimiert
werden kann. Das Erkennungsmerkmal his-X 3 -his wurde näher an das aktive Zentrum verlagert,
was dazu führte, dass das Protein zu der Sensoroberfläche schaut. Die Ergebnisse sind
ermutigend, was die Aktivität der Oberfläche und das detektierte Signal anbelangt [1,3,54] .
Das zweite große Feld der gerichteten, nicht kovalenten Immobilisierung ist die Verwendung
von Biomolekülen, wie Streptavidin. Dabei ist allen Anwendungen gleich, dass sie auf
natürlichem Weg im Stande sind sehr feste und stabile Bindungen [55] , von = 10 −
10 zu bilden. Zu den verschiedenen Bindungsmolekülen gehören die Antikörper [56] , die
Biotin bindenden Moleküle [57] und die Hybridisierung von DNS Strängen [17,58,59] .
Für die Verwendung von Oberflächen auf Basis von Biotin sind große Anwendungsbereich
entwickelt worden [60,61] . Die Verwendung von Biotin zur Immobilisierung von Proteinen
sieht eine Modifizierung der Proteine mit Biotin vor, die dann an eine Streptavidin – Einheit
bindet. Dieses Protein weist vier identische Untereinheiten auf, die alle in der Lage sind jeweils
ein Biotinmolekül zu binden. Über diese Bindung ist das Streptavidin auch auf die
Oberfläche aufgebracht worden, da sich auf diese Weise sehr homogene Monolagen des gewünschten
Zielproteins ausbilden [62] .
8

Stand der Technik
Oligonucleotid
kovalentes
Oligonucleotid
Streptavidinoberfläche
vorab gebildeter Komplex
mit Antikörper
Bindungstasche
Biotin
Abbildung 4: Streptavidin-unterstützte Immobilisierung
von Proteinen [58]
Eine mögliche Anwendung eines kombinierten Verfahrens aller drei nicht kovalenten Methoden
mit biologischen Erkennungsmethoden
wurde von Niemeyer et.al. gezeigt (Abbildung
4). Hier wurde Streptavidin mit Oligonucleotiden
gekoppelt und auf einer Oberfläche abgeschieden,
die mit dem komplementären Oligonucleotid
modifiziert war, das wiederrum an
einem Biotin-Streptavidin Komplex hing. Die
Verbindung einzelner Biotinmoleküle mit großen
Biomolekülen stellt keine Schwierigkeiten
dar und so kann auf vielfältige Weise dieses
Bindungsmotiv genutzt werden, um sowohl die
Vorteile der Basenpaarung zu nutzen, als auch
Antikörper zu binden. So konnte von verschiedenen
Antikörpern, über Enzyme, wie Luciferse
oder Meerrettischperoxidase, unterschiedlichste
Proteine immobilisiert werden [58,63] . Mögliche Anwendungen solcher Strategien ist die Detektion
eines Antikörpers aus einer inhomogenen Matrix auf einer Quarzmikrowaage, oder die
Identifikation von Antikörpern aus Serum.
Die letzte Art ein Enzym an eine Oberfläche zu binden ist die Verwendung von gerichteten
kovalenten Bindungen. Für diesen Bereich kommen nur sehr spezielle Reaktionen in Frage,
die bei milden Bedingungen ablaufen, damit die Biomoleküle nicht zerstört werden. Der
einfachste Weg zu erfolgreichen gerichteten Bindung eines großen Biomoleküls ist die Reaktion
zwischen einem Maleimid und einem Thiol [64] . Das elektrophile Maleimid reagiert sehr
selektiv mit elektronenreichen Gruppen, zu denen auch Thiole gehören. Die Immobilisierung
auf Oberflächen ist durch einfache organische Syntheseprotokolle möglich. Der Reaktionspartner,
das Thiol, kommt zum einen natürlich bei Proteinen vor und kann die globale Struktur
durch die Ausbildung von Disulfidbrücken stabilisieren, zum anderen kann er künstlich,
analog zu den Hexahistidinschwänzen, an die Proteine, C – oder N – terminal als Hexacysteinschwanz
[65] , angehängt werden. Somit ergeben sich zwei verschiedene Reaktionen, die
gerichtete mit dem Polycysteinschwanz und eine ungerichtete mit den nativen Cysteinen auf
der Oberfläche. Die Hauptreaktion erfolgt mit den künstlichen Aminosäuren, die mit einer
deutlich höheren Konzentration vorhanden sind, was zu überwiegend geordneten und dicht
gepackten Strukturen führt. Durch die Ausbildung einer kovalenten Kohlenstoff-Schwefel-
9

Stand der Technik
Bindung ist eine Diffusion wie bei dem ähnlichen Nickel-NTA-Histidin Komplexen nicht
möglich.
Deutlich effektiver und auch besser zu steuern ist die native chemische Ligation (NCL).
Bei dieser Reaktion, die als Endprodukt eine Peptidbindung hat, reagieren ein Cystein und ein
Thioester zusammen. Es ist kein Problem das Cysteinan der Oberfläche zu exponieren und
daran das Enzym zu binden [66] . Auch kann die Vorbereitung des Thioesters durch EDC/NHS
Chemie erfolgen und die Anbindung mit in situ mit SPR verfolgt werden, wie es von Meijer
et.al demonstriert wurde [67] .
Die Reaktion weist viele Vorteile auf, wie den selektiven und wechselseitigen Reaktionsverlauf,
und die Orthogonalität zu anderen funktionellen Gruppen und Aminosäuren. Die Reaktion
läuft im wässrigen Milieu ab und es entstehen keine Nebenprodukte. Die Amidbindung
ist von Natur aus die Verbindugn zwischen zwei Aminosäuren und hat für die Anwendung
mit biologischen Systemen eine herausragende Stabilität.
Aufbauend auf der NCL ist die von Staudinger entwickelte Ligationsmethode. Dabei reagieren
ein Thioester und ein Azid unter Abspaltung von Stickstoff als Koppelprodukt zu einem
Iminophosphoranintermediat. Aus dieser Zwischenstufe kommt es über einen fünfgliedrigen
Übergangszustand zur Ausbildung der Amidbindung unter Aufwendung von einem Molekül
Wasser. Die Reaktivität unter den gegebenen milden Bedingungen gibt nahezu quantitative
Ausbeuten, auch bei extrem geringen Enzymkonzentrationen. So konnte eine erfolgreiche
Immobilisierung noch mit 50 µM Protein nachgewiesen werden [68] .
Die letzte Methode zur Bindung von Enzymen an Oberflächen ist die Cycloaddition. Dabei
gibt es zum einen die Variante der „Klick-Chemie“, die allerdings Kupfer als Katalysator
benötigt. Dabei reagieren ein Akin und ein Azid zusammen zu einem Triazol, ohne das dabei
Neben- oder Koppelprodukte anfallen. Ein breites Spektrum an Beispielen zur Immobilisierung
verschiedener Proteine via kupferkatalysierter Klick-Chemie unter milden Bedingungen
hat sich daraufhin entwickelt [69] . Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist der Erhalt der
Stabilität der Proteine, die nach der Immobilisierung noch aktiv sind. Allerdings ist bei besonders
empfindlichen Proteinen, genauso wie bei elektrochemischen Experimenten Vorsicht
angebracht, da das Kupfer den weiteren Verlauf durch Denaturierung oder störende Signale
beeinflussen kann [70] .
Eine Alternative dazu ist die Diels-Alder Cycloaddition. Die bereits beschriebene Maleimidoberfläche
kann dabei wieder verwendet werden und fungiert als Dienophil, welches
mit einem Peptid, das ein Dien trägt, reagieren kann [71] . Die weitere Reaktion läuft bei
10

Stand der Technik
schwach sauren, wässrigen Bedingungen ab. Geschwindigkeit und Selektivität der Reaktion,
die bei Raumtemperatur ablaufen kann, machen sie zu einem wertvollen Werkzeug bei der
Herstellung von modifizierten Oberflächen.
Waldmann et.al. nutzten die Diels-Alder Cycloaddition zur Immobilisierung von Enzymen,
die die an ein Streptavidin banden. Dieses Streptavidin war mit einem Dien gekoppelt
und wurde auf einer entsprechenden Maleimidoberfläche aufgetragen. Die Überprüfung der
Ergebnisse erfolgt mit fluoreszenzmarkiertem Biotin [72] .
11

Stand der Technik
2.2 Oberflächenmodifikationen
Die unterschiedlichen Immobilisierungsstrategien in Feld der Biosensorik unterscheiden
sich in der Verwendung von ungerichteten Ansätzen, wie einem Polymereinschluss und der
schwachen Wechselwirkungen zwischen Polyesterketten und Enzymen, bis hin zu kleinen
kovalent gebundenen Oberflächenmolekülen, die gezielt in einer vorgesehenen Bindungsdomäne
wechselwirken, was zu einer stark gerichteten Orientierung der Enzyme führt. Viele der
kleinen Moleküle werden sukzessive auf der Oberfläche aufgebaut und die Überprüfung der
mehrstufigen Synthesen erfolgt mit dem detektierten Signal der enzymatisch katalysierten
Reaktion.
Im ersten Schritt werden häufig Thiol-funktionalisierte Moleküle verwendet, die mit
Gold- oder Silberoberflächen interagieren. Die folgenden Mechanismen beinhalten oft eine
Aktivierung einer Carbonsäure mit EDC/NHS basierten Chemie und einer folgenden
Amidknüpfung [67] .
Es gibt auf der anderen Seite nur wenige Quellen, die eine vorherige vollständige Charakterisierung
der Moleküle mit einschließt [3,19,23,54] . Die hauptsächlich verwendeten Synthesestrategien
benutzten Reaktionsmechanismen, die ohne erhebliche Nebenreaktionen, einer
hohen Selektivität und Ausbeute ablaufen, aber ein quantitativer Ansatz ist dabei nicht gegeben.
Daraus resultiert eine unvollständig charakterisierte Oberfläche mit Molekülen, die ggf.
nicht zur Bindung der Proteine beitragen können. Ein Vergleich der Bindungskapazitäten von
diesen klassischen Oberflächen und solchen, mit im Vorfeld hergestellten Molekülen, fehlt
bislang zu einer vergleichenden Begutachtung der Immobilisierungsstrategien.
Die weitere Vorgehensweise hin zu einer intelligenten Oberfläche ist nicht nur eine effiziente
Immobilisierung der Biomoleküle, sondern auch eine zeitgleiche Detektion. Bei verschiedenen
Methoden, wie der SPR-Spektroskopie erfolgt die Detektion einer erfolgreichen
Bindung auf dem Fuße, was weitere Änderungen der Pufferlösung entbehrlich macht. Die
Methode gibt allerdings keinen Aufschluss über die Aktivität der immobilisierten Moleküle.
Zur Bewertung der biochemischen Aktivität eines Biomoleküls müssen andere Techniken
bemüht werden, die eine Antwort geben können. Für solche Fragestellungen müssen die Produkte
der biochemischen Umsetzung nachgewiesen werden. Dafür haben sich unterschiedliche
Methoden etabliert, wie die UV/vis Spektroskopie [73] im Bereich der Immunoassays oder
die Elektrochemie [4,74] . Die Voraussetzungen sind bei beiden Ansätzen gleich, eine Komponente,
die in der Reaktionsgleichung auftaucht, muss über die eine oder andere Methode
nachweisbar sein. So kann die Zu- oder Abnahme einer Substanz durch die korrespondierende
12

Stand der Technik
zu- oder abnehmende Wechselwirkung mit elektro-magnetischer Strahlung nachgewiesen
werden, genauso wie der Verbrauch oder das Entstehen von Elektronen, die durch einen Redoxmediator
an einem elektrochemischen Versuchsaufbau transportiert werden, nachgewiesen
werden kann.
Etwas anspruchsvoller ist es, wenn die nachgewiesenen Substanzen erst in einer weiteren
Folgereaktion dargestellt werden oder durch weitere Transportmechanismen zur Detektionseinheit
transportiert werden müssen. So kann nicht nachgewiesen werden, dass alle Moleküle
auch reagieren oder es nicht einen Austrag an Mediatoren gibt [75] . Da für die weiteren Betrachtungen
die photochemischen Mechanismen keine Rolle spielen, wird dieses Feld an dieser
Stelle verlassen; die elektrochemischen Methoden werden noch weiter beleuchtet. es gibt
hier eine Vielzahl an Entwicklungen, die zur Verbesserung einer Analysenmethode im Feld
der immobilisierten Biomoleküle beiträgt. So sind neben den weiter oben bereits beschriebenen
verschiedenen Immobilisierungsmethoden [7,13,61,76] auch die Materialien zu erwähnen, die
für eine erfolgreiche Immobilisierung noch wichtiger sind als die zu immobilisierenden Biomoleküle,
auch wenn diesen eine deutlich größere Aufmerksamkeit geschenkt wird.
Einer der größten Bereiche der Materialforschung ist die Herstellung von Polymeren. Dabei
ist nicht nur der Bereich der großindustriellen Darstellung für die Kunststoffindustrie gemeint,
sondern auch die vielfältigen Anwendungen im Bereich der gezielten Steuerung der
Eigenschaften einer Oberfläche. Explizit werden in den weiteren Betrachtungen nicht die Errungenschaften
der modernen heterogenen Katalyse konkretisiert, auch wenn es da Überschneidungen
mit den allgemeinen elektro-katalytischen Forschungsthemen gibt, aber diese
verfolgen einen anderen Ansatz, um die Katalyse durchzuführen. Im Allgemeinen wird davon
ausgegangen, dass die Edukte einen durch eine äußere und eine innere Grenzschicht diffundieren,
vielleicht noch in eine Pore, um dann an der Oberfläche adsorbieren. Die Moleküle
sind also nicht mehr vollständig in Lösung, sondern besitzen lediglich noch eine Mobilität auf
der Oberfläche, auf der sie dann auch reagieren. Danach muss das Produkt schwächer an der
Oberfläche binden, als das Edukt, damit es von neuem Edukt vertrieben wird, um seinen Weg
aus der Pore, der inneren und äußeren Grenzschicht anzutreten. Bei der elektrochemischen
Biokatalyse sind die Enzyme zwar an der Oberfläche immobilisiert, aber sie sind immer noch
in Lösung, was für ihre Stabilität auch besser ist, ebenso wie auch die Edukte und Produkte.
So werden eine Vielzahl an Biosensoren und Biobrennstoffzellen auf Grundlage von Polymeren
hergestellt [7,77] . Zum Design von Sensorsystemen mit Polymeren wie Hydrogelen
13

Stand der Technik
und Polysterolen wurde weiter oben bereits eingegangen, weshalb hier eine weitere Klasse
von Makromolekülen vorgestellt wird.
2.2.1 Allgemeines über die Verwendung von Dendrimeren
In der großen Klasse der anthropogenen Makromoleküle teilen sich, wie im normalen Leben
auch, die Untergruppen in ordentliche Moleküle und solche die vollständig im Chaos
existieren auf (Abbildung 5). Für die folgenden Ausführungen werden nur die ordentlichen
Moleküle betrachtet.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der beiden unterschiedlichen Klassen an Polymeren.
Links die Dendrimere mit einem Kern, der ersten und zweiten Generation und der Peripherie. Die hohe Ordnung
des Aufbaus unterscheidet sich grundlegend von den rechts dargestellten klassischen Polymerketten.
Wie weiter oben bereits dargestellt, ist die Verwendung von geordneten Strukturen von
Vorteil, da es den vollständigen Zugang zu den aktiven Zentren gewährleiste [50] . Aber neben
den ordentlich aufgereiten Biomolekülen können auch die zur Immobilisierung benötigten
Moleküle über eine hohe Ordnung verfügen. Die höchste Stufe der Ordnung in diesem Bereich
haben die Dendrimere, die ausgehend von einem Kernbaustein in sich immer wiederholenden
Syntheseschritten, sogenannten Kaskaden, symmetrisch immer weiter wachsen. Dabei
gibt es die ersten Fragen, die die Dendrimere als den abiotischen Übergang von atomaren
Strukturen hin zu mesoskopischen geordneten Varianten einer höheren Ordnung ansehen [78] .
Zur Herstellung von Dendrimeren gibt es zwei verschiedene Wege, einen divergenten und
einen konvergenten Ansatz. Die divergente Synthese der Dendrimere wurde als erstes von
Vögtle et al [28] . beschrieben und in den folgenden Jahren von Tomalia et al. vollendet [29] , was
in der industriellen Herstellung von Polyamidoamin (PAMAM) Dendrimer endete. Im gleichen
Jahr wurde die konvergente Strategie von Frechet et. al. entwickelt [79] .
Um zu verstehen wie Dendrimere hergestellt werden, muss zuerst die Entdeckung der
Kaskadensynthese vorgestellt werden [28,30,33] . Diese ermöglicht einen konkreten Aufbau von
Molekülen ohne dabei statistische Verteilungen zu erhalten, wie es bei klassischen Polymeri-
14

Stand der Technik
sierungsreaktionen der Fall wäre. Dabei gibt es eine alternierende Strategie Reaktionen, die
eine diskrete Kettenerweiterung und eine Aktivierung der terminalen funktionalen Gruppen
umfasst. Somit ist gewährleistet, dass das Wachstum in kontrollierten Schritten abläuft.
Im ersten Schritt wird ein Kern ausgewählt, der als Startpunkt gilt. Die Mindestanzahl an
weiteren Anknüpfungspunkten ist zwei. Nach oben ist die Zahl der weiteren Äste, die sich
von dem Kern entfernen nicht begrenzt. Je mehr Äste an einem Kern sind desto früher kommt
das Dendrimer an seine natürlichen Grenzen, bei denen eine homogene Entwicklung nicht
mehr möglich ist. Diese Umstand wurde exemplarisch von De Gennes et. al. am PAMAM
Dendrimer berechnet [80] . Als Kern können zu Einen homogene Moleküle verwendet werden,
an denen sich das Wachstum fortsetzt [32,79,81] , aber auch andere Moleküle wie Übergangsmetalle,
die von den Chelatbildnern umgeben sind, können als Kern verwendet werden [82] . Eine
weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Clustern (z.B. Gold) an denen in einem
zweiten Schritt einzelne Dendriten oder vorsynthetisierte Äste immobilisiert werden können
[36,83] .
Zur weiteren Synthese, ausgehend von dem Kern, der als reaktive Initiatorkernzelle dient,
werden zum Teil geschützte Reagenzien zugegeben, die die verzweigte Struktur der Dendrimere
bestimmen. Es ist an dieser Stelle sinnvoll Schutzgruppen zu verwenden, die danach
abgespalten werden können. Dieser Iterativer Aufbau der wird immer weiter fortgesetzt. Die
kurzen Ästchen werden wieder aktiviert und fungieren als neuer Ausgangspunkt für die neue
Anlagerung der gleichen oder anderer Moleküle, die die Struktut und die Eigenschaften der
Dendrimere bestimmen. Es werden Reiterativ immer größere Moleküle synthetisiert, die sehr
homogen aufgebaut sind.
Eine andere Möglichkeit ist es von außen zu starten. Die Moleküle, die mal die Eigenschaften
der Peripherie definieren sollen, werden an einen ersten Träger gebunden, der mindestens
zwei davon aufnehmen kann. Somit ist dann der äußerste Teil des Dendrimers fertig.
Der Verknüpfungspunkt, an dem zu diesem Zeitpunkt die funktionellen Gruppen hängen,
wird an einer freien Stelle aktiviert und zusammen mit einem oder mehreren weiteren dieser
Endstücke an einem weiteren Aststück gebunden. Auf diese Art vervielfältigen sich die Endgruppen
und die Reiteration der immer gleichen Reaktionssequenzen führt zu einem Wachstum
der Dendriten [79] .
Im letzten Schritt müssen die Dendriten an einem Kernstück zusammengeführt werden,
damit ein vollständiges Dendrimer entsteht. Diese Art der Herstellung ist, was die Reinheit
der Dendrimere angeht dem divergenten Ansatz überlegen, was mit MALDI-TOF einfach
15

Stand der Technik
nachzuweisen ist [84] . Dieser Effekt ist einfach zu verstehen, da bei der divergenten Synthese
eine immer größere Zahl an Reaktionen abläuft, die, trotz guter Optimierungsversuche nicht
immer quantitativ ablaufen werden. Ein weiterer Faktor ist das Verhältnis von der Dendrimeroberfläche
zu dem Inneren. Die Oberfläche wird mit jeder Generation größer, aber nicht
in dem gleichen Verhältnis wie die Anzahl der Endgruppen. Somit wird eine quantitative Umsetzung
an jedem einzelnen Ende sterisch immer anspruchsvoller. Dies ist was De Gennes
et.al. theoretisch berechnet haben, sich aber auch im rein praktischen vorher schon zu Problemen
führt. Aus diesem Grund sind in Massenspektren kleine Verteilungen an Dendrimeren
zu sehen [85] . Verglichen mit Polymersynthesen sind die Massenverteilungen aber immer noch
sehr gering.
Bei dem konvergenten Ansatz sind es immer nur wenige Reaktionen, die ablaufen, was es
einfacher macht die Umsetzung zu optimieren. Außerdem kann es beim Erreichen einer kritischen
Größe kaum zu Einzelausfällen kommen. Daher gibt es bei dieser Variante singuläre
Peaks in den Massenspektren, die die hohe Reinheit der Produkte widerspiegelt [86] . Ein weiterer
Vorteil des konvergenten Ansatzes ist die Möglichkeit einer größeren Variation, da durch
eine geschickte Wahl an Schutzgruppen verschiedene terminale Funktionen eingesetzt werden
können. Diese können wie oben beschrieben auch zu einem großen Dendrimer zusammengesteckt
werden. Die Forschung hat eine Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen für diese
Art der polyfunktionellen Dendrimere gezeigt [87] .
Eine Anwendung dieser Dendriten ist die selbstständige Anlagerung zu einer gewünschten
Form, die danach durchpolymerisiert werden kann, und so einen Zugang zu neuen Materialien
eröffnet, der mit einer solchen Präzision bislang nicht zugänglich war [88] . Durch geschickte
Planung der Synthese können so die Eigenschaften der Oberfläche definiert werden. So gelang
es Frechet et.al. die Oberfläche einer Sphäre auf einer Seite hydrophob und auf der anderen
Seite hydrophil zu gestalten. [89] . Durch den entstehenden Dipol und die Oberflächeneigenschaften
war das hergestellte Dendrimer in der Lage sich in einer Suspension zwischen die
Phasen zu legen und entsprechend der Phasengrenze auszurichten.
Als Materialwissenschaftler ist dies ein großer Schritt, da anders als bei der Naturstoffsynthese,
versucht wird die Natur zu imitieren. So kann mit einem sphärischen Körper, der unterschiedliche
Domänen mit hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften hat, ein Protein imitiert
werden, was als Dummy zum Design von Oberflächen verwendet werden kann, die in
einem weiteren Schritt von den gewünschten Proteinen über schwache Wechselwirkungen
besetzt werden können. Auf diese Art kann eine starke gerichtete Bindung aufgebaut werden,
16

Stand der Technik
ohne das Protein zu modifizieren oder weitere Reagenzien wie spezifische Bindungsdomänen
zu immobilisieren.
2.2.2 Dendrimere in der “Life Science”
Diese Designmöglichkeiten haben es den Dendrimeren ermöglicht sich einen festen Platz
im großen Feld der Nanopartikel und auch in der heterogenen und homogenen Katalyse zu
erkämpfen. In der Biotechnologie hat sich die Chemie der Dendrimere auch etabliert, was
ihren vielfältigen Anwendungen zu verdanken ist. Es gibt bei dieser vergleichsweise jungen
Klasse von Makromolekülen bereits viele Anstrengungen sie auch in vivo [90] anzuwenden. Ein
großer Vorteil der Dendrimere ist die Konzentrationswirkung durch die hohe Dichte an funktionellen
Gruppen. So ist die hauptsächliche Optimierung in diesem Feld, die Maximierung
der Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe an erkranktem Gewebe bei einer gleichzeitigen Minimierung
der Wirkstoffe im Bereich des gesunden Gewebes. Damit erhöht sich die therapeutische
Effektivität von bereits entwickelten Medikamenten, was zu einer Abnahme zum Teil gefährlicher
Chemikalien führen kann [91–93] .
Der Transport von Wirkstoffen durch einen geeigneten Träger ist bereits von Paul Ehrlich,
mit dem Prinzip der Zauberkugeln, als Vision beschrieben worden [94] . So gibt es viele verschiedene
Strategien die darauf abzielen Wirkstoffe an den Ort des Geschehens zu bringen.
vor allem in der Krebstherapie hat sich ein Wettlauf dahin entwickelt möglichst Effiziente
Medikamente zu erforschen, die nichts anderes sind als Zellgifte, aber auch die gezielte Einbringung
in das Tumorgewebe zu steuern. Eine Strategie beruht auf der Verwendung von
Peptiden, die die Zellwände der Tumore durchdringen können und somit die giftige Ladung in
die kranke Zelle einbringen [95] . Da bei vielen Tumoren charakteristische Rezeptoren stärker
exprimiert sind als bei gesunden Zellen gibt es auch Steuerungsmechanismen, die Anwendung
finden. Aber auch Dendrimere können zum Transport von Medikamenten verwendet
werden.
So gibt es zahlreiche Publikationen über die in vitro Anwendung von Dendrimeren, nur
wenige in vivo Anwendungen, bei denen nur Dendrimere zum Transport der Wirkstoffe verwendet
werden. Eine der ersten Verwendungen ist die Komplexierung von Cisplatin an den
äußeren funktionellen Gruppen mit 20 bis 25 Gew%. Als Resultat davon konnte eine zehnfach
höhere Löslichkeit des Cisplatins verzeichnet werden, aber auch eine Verknüpfung der
einzelnen Dendrimere zu Agglomeraten, bis zu 40 nm Durchmesser. Die Agglomerate wirkten
bevorzugt bei subkutanem Tumorgewebe über einen passiven Zielmechanismus. Im Ver-
17

Stand der Technik
gleich zu herkömmlichem Cisplatin konnte eine deutliche Verminderung des Zellwachstums
festgestellt werden, wenn das Dendrimerderivat verwendet wird [96] .
Eine weitere Anwendung von modifizierten Dendrimeren ist die gezielte Umsetzung mit
verschiedenen Zielmolekülen. So konnte Kuksowka-Latallo et.al [97] . ein PAMAM-Dendrimer
in der fünften Generation gezielt modifizieren, dass es unterschiedliche Aufgaben erfüllen
konnte. Im ersten Schritt wurde ein Teil der terminalen Amine mit Acetaten maskiert, damit
die Oberflächenladung herabgesetzt wird. im nächsten Schritt wird das PAMAM-Dendrimer
nach und nach mit Folsäure, dem Zielliganden, Fluorescein und Methotrexat umgesetzt. Die
so hergestellten Dendrimere konnten erfolgreich an Mäusen untersucht werden und zeigten
eine signifikante Wachstumshemmung bei subkutanen Tumoren im Vergleich zu Dendrimeren,
die keine Folsäureliganden hatten und der Blindgruppe. Die menschlichen KB Tumore,
die untersucht wurden, weisen eine Überexpression des Folsäurerezeptors auf, der eine gesteigerte
Aufnahme der Dendrimere in die Tumorzellen fördert. Auf der anderen Seite ist das
Dendrimer aufgrund der geringen Größe (< 5 nm) nicht lang in den Versuchstieren nachzuweisen,
und wurde schnell über die Nieren entfernt. Aus diesem Grund ist eine biologische
Abbaubarkeit der Dendrimere nicht nötig und eine Akkumulation in den Tieren konnte nicht
nachgewiesen werden.
An diesen Ergebnissen lässt sich sehr gut der große Nutzen der Dendrimere erkennen, da
sich in einem Molekül verschiedene Funktionen gezielt vereinen lassen und so die Effektivität
deutlich erhöht werden kann [98] .
Abbildung 6: Struktur eines Dendrimers, das um
ein Metalloporphyrin synthetisiert wurde.
Eine weitere Anwendung der Dendrimere im
Bereich der „life science“ ist die Detektion von
Sauerstoff. Dieser Befund ist daher besonders
wichtig, da es einige Tumorarten gibt, die eine
Änderung des Sauerstoffbedarfs aufweisen,
wenn sie auf eine Behandlung reagieren. Die
Vorteile von einer solchen Detektionsmethode
liegen auf der Hand, weshalb es nützlich ist an
dieser Stelle weiter zu forschen [99] . So konnte
eine Reihe von Dendrimeren durch das Stabilisieren
von hydrophoben Metalloporphyrinen
im inneren der Dendrimere ist es möglich geworden
wasserlösliche Sauerstoffsensoren zu
18

Stand der Technik
entwickeln [100,101] . Die Phosphoreszenz nimmt bei Kollision mit gelöstem Sauerstoff ab,
wodurch die Entwicklung des interessierenden Gewebeteils in situ beobachtet werden kann.
Durch Anregung mit Licht kann die Phosphoreszenz wieder angeregt werden [101,102] , was eine
kontinuierliche Messung der Therapie ermöglichen kann.
Aber weitere Forschung ist noch nötig, da die Abklingzeiten auch ohne Sauerstoff durch die
Stern-Volmer-Gleichung bestimmt werden und auch die Anregung der Metalloporphyrine
durch sichtbares Licht wegen der Streuung an festen Bestandteilen und Gewebe limitiert wird.
Die essentielle Aussage zu dem Prozess steht allerdings fest und die sterisch stabilisierende
Kern-Hüllen-Konstruktion der Dendrimere bietet eine vielversprechende Grundlage für nicht
invasive bildgebende Verfahren zur Diagnostik.
Eines der größten Probleme bei der Verwendung von Medikamenten ist die Bioverfügbarkeit.
Dies meint die möglichen Abbauprozesse, die mit jeder Anwendung einhergehen. Ein
Problem ist die Verweilzeit eines Medikaments in richtig zu bestimmen ohne das es zu einer
Akkumulation kommt, was einer Schadstoffanreicherung im Köper gleichzusetzten ist, oder
die Wirkstoffe so schnell verstoffwechselt werden, dass diese keine Möglichkeit haben an das
befallene Gewebe zu kommen und zu wirken. Ein Faktor der das bestimmt ist die Größe eines
Medikaments, das sich in dem Wirt befindet. Dazu kommt auch die Biokompatibilität, die
eine Löslichkeit und damit eine Reaktion bewirkt.
Bei den Dendrimeren wird eine Funktion, zu der auch die Induktion eines Zellsterbens
gehört [103] , hauptsächlich durch die terminalen funktionalen Gruppen definiert. Dabei sind
kationische Dendrimere, wie z.B. PAMAM, mit einer konzentrationsabhängigen Toxizität
und Hämolyse einher. Der Effekt korreliert bei dem PAMAM-Dendrimer auch mit der Generation,
was einen Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen den terminalen protonierten
funktionellen Gruppen und der Giftigkeit nahelegt. Dieser Effekt ist bei neutralen und anionischen
Dendrimeren weniger stark ausgeprägt [104,105] . Die beschriebenen Effekte, die in vitro
nachgewiesen wurden, setzten sich auch bei Experimenten mit Mäusen in vivo fort53. So
konnten Beeinträchtigungen bei der Leber nachgewiesen werden, wenn Mäusen ein stark kationisch
geladenes Dendrimer injiziert wird. Bei einer Applikation von 160 mg/kg kann von
einer 100 %-igen Sterblichkeit ausgehen [106] , was sich vollständig ändert, wenn nur 50 % der
terminalen funktionellen Gruppen durch neutrale Polyethylenoxidketten ausgetauscht werden.
So konnte mehr als ein Gramm pro Kilogramm Körpergewicht injiziert werden ohne eine
Auswirkung nachzuweisen [107] . Analog dazu konnte ein ähnliches Ergebnis mit ungeladenen
Polyesterdendrimeren ermittelt werden [108] .
19

Stand der Technik
Es zeigt sich, dass eine breite Verwendung von Dendrimeren im Feld der „life schience“
lange überfällig ist. So kann nicht nur von den vielen chemischen Eigenschaften profitiert
werden, die diese neue Klasse von Makromolekülen mitbringt [78,79,109] , sondern auch von verschiedenen
physiologischen Eigenschaften, wie eine spezifische Toxizität [104,105,110] , die auch
durch geschicktes Design reduziert oder erhöht werden kann, eine hohe Biokompatibilität
sowie die Pharmakokinetiken [111] , die systematisch eingestellt werden können. Ein weiterer
Vorteil ist die strukturelle und chemische Homogenität, die eine statistische Verteilung der
Größe der einzelnen Moleküle durch klassische Polymerisierungen ausschließt. Auch ist die
Modifizierung eines Dendrimers mit unterschiedlichen Gruppen möglich, was die Anwendungen
erweitert [91–93,98] und auch die Verwendung von mehreren Wirkstoffen gleichzeitig
reduziert. Damit geht Hand in Hand die Tatsache, dass alle Teile des Ganzen zusammen am
infizierten Gewebe antreffen und ihre vorgesehene Wirkung entfalten können. Der wichtigste
Punkt ist die Degradation der Komponenten, damit eine Anreicherung in der Natur und den
Schutzgütern verhindert werden kann. Dafür können die Kerne der Dendrimere so gewählt
werden, dass diese unter den gegebenen Umständen zersetzen [112] . Somit ist auch ein Schritt
in Richtung der Reinhaltung unserer Flüsse und Gewässer gegeben.
20

Problemstellung
3 Problemstellung
Wie gezeigt wurde sind die Möglichkeiten zum Verdingen von Biomolekülen weit fortgeschritten,
aber viele Stärken der einzelnen Techniken konnten noch nicht auf andere Verfahren
projiziert werden, damit die Komponenten zusammen eine effiziente Matrix bilden, was
in Abbildung 7 schematisch dargestellt wird.
Abbildung 7: Verschiedene Nachteile etablierter Immobilisierungsstrategien.
1. Der direkte Elektronentransfer ist nur für spezielle Enzyme möglich, wodurch er für eine Breitbandalternative
nicht in Frage kommt. 2. Die Verwendung von biologischen Verbindungen (z.B. Streptavidin) ist sehr stabil, aber nur
in der Peripherie anwendbar, was die Wege zu lang macht für einen effektiven Elektronentransfer. 3. Eine kovalente
Anbindung bietet zu viele Bindungsstellen, die zum einen keinen effizienten Elektronentransfer zulassen, das Enzym
in Kontakt mit der Oberfläche bringen an der es denaturiert und nur ein kleiner Teil bindet in einem optimalen und
intakten Zustand.
Ziel der Arbeit ist es eine neuartige Elektrodenoberfläche zu designen, die in der Lage ist
ohne Mitwirkung weiterer Komponenten spezielle Analyten zu detektieren. Hierdurch kann
ein Enzym mit einer definierten Orientierung an einer Oberfläche über einen langen Zeitraum
immobilisiert werden. Die Effizienz von Enzymelektroden kann somit weiter gesteigert werden
und richtungsweisend für weitere Anwendungen sein. Biobrennstoffzellen, Biosensoren
21

Problemstellung
oder implantierte medizinische Komponenten können somit deutlich platzsparender bei gleicher
Leistung produziert werden.
Hierzu ist es notwendig drei Komplexe zu einem Ganzen zusammenzuführen:
- Die Kinetik und Anbindung einer Enzymmatrix an Oberflächen (Kapitel 4.1)
- Synthese und Charakterisierung einer leitfähigen Zwischenmatrix (Immobilisierungsmatrix;
Kapitel 4.2)
- Die Kontaktierung der Enzymmatrix durch die Zwischenmatrix mit der Elektrode
(Kapitel 4.3)
Somit muss die Immobilisierungsmatrix alle nötigen Komponenten enthalten, um einerseits
das Enzym an der Oberfläche zu binden und andererseits die Elektronen zwischen dem
aktiven Zentrum und der Elektrode zu transportieren. Für dieses Modell steht ein genetisch
modifiziertes FNR-Enzym zur Verfügung, das zwei neue Bindungsdomänen aufweist Diese
binden selektiv an ungesättigte Übergangsmetalle und sind in der Form noch nicht untersucht
worden. Es soll zuerst gezeigt werden, dass sich die katalytischen Eigenschaften des Enzyms
durch die Änderung der Struktur nicht geändert haben, was kinetische Untersuchungen mit
dem wildtypischen Enzym (wt FNR) im Vergleich zu dem einfach (2-his FNR) und dem neuen
zweifach (4-his FNR) modifizierten Enzym nach sich zieht. Bei diesen Messungen ist weder
der Elektronenmediator noch das Enzym in irgendeiner Form an eine Oberfläche gebunden.
Der zweite Teil des ersten Komplexes ist die Untersuchung der Bindungseigenschaften
des Enzyms. Dabei wird wieder zwischen dem wildtypischen Enzym, dem einfach modifizierten
und zweifach modifizierten Enzym unterschieden. Diese Messungen sind der erste
Schritt zu einer neuen Art der Bindung von Proteinen an Oberflächen. Kann die Anbindung
an eine Oberfläche gezeigt werden, müssen die Unterschiede der Stabilität zwischen den beiden
Mutanten herausgearbeitet werden. Nach dem Anbinden der Enzyme müssen die Aktivitäten,
die an der Oberfläche auftreten, mit denen in Lösung verglichen werden.
Als zweiter Komplex der Arbeit soll die Oberfläche modifiziert werden, damit sich neben
der Immobilisierung von Enzymen auch noch weitere Eigenschaften an der Oberfläche assoziieren.
Die Oberfläche soll so auch in der Lage sein einen Elektronenmediator bereitzustellen
(m ET – Mechanismus). Diese Aufgabe wird durch die Dendrimere geleistet, denen durch
ihre große und geordnete Struktur eine Vielzahl an Aufgaben übertragen werden kann.
22

Problemstellung
In einem ersten Schritt muss ein neues Dendrimer konzipiert und synthetisiert werden,
dass in der Lage ist an eine geeignete Elektrodenoberfläche zu binden. Im zweiten Schritt
muss dem Dendrimer eine weitere funktionelle Gruppe zugefügt werden, die es in die Lage
versetzt, Elektronen zu transportieren. Die Untersuchung einer solchen Spezies ist mit elektrochemischen
Methoden möglich. Zu diesem Zeitpunkt würde die an sich leitfähige Oberfläche
eine Erweiterung besitzen, die Elektronen von einem geeigneten Spender entgegen nehmen
oder sie für einen Nutzer zur Verfügung stellen kann. Der letzte Schritt ist die Bereitstellung
einer bindenden Einheit für das Übergangsmetall, das in der Lage ist, das Enzym zu binden.
Im dritten Komplex werden die beiden Systeme kombiniert. Die Immobilisierungsschicht
stellt damit eine nichtkovalente Immobilisierungsmatrix für das neue Enzym zur Verfügung,
sowie einen Elektronentransportweg, der in geordneten Bahnen mit gleichbleibenden minimalen
Konzentrationen an Mediator direkt am Ort der Reaktion arbeiten kann.
23

Ergebnisse und Diskussion
4 Ergebnisse und Diskussion der eigenen Arbeit
4.1 Die Kinetik und Anbindung einer Enzymmatrix (FNR) an Oberflächen
Die Ferredoxin-NADP + -Reduktase (FNR) ist ein 35-37 kDa großes Flavoenzym das in
oxygenen phototrophen Organismen, wie Cyanobakterien, Grünalgen und höheren Pflanzen
als terminaler Hauptelektronenakzeptor der photosynthetischen Lichtreaktion dient. Es vermittelt
die Elektronenübertragung zwischen Ferredoxin, einem Ein-Elektronenüberträger, und
NADP + , einem Zwei-Elektronenüberträger [113] .
+ 2 !" #$ ⇌ NADP * + * + 2 !" +,- ( 1 )
Im ersten Teil der Arbeit werden kleine organische Moleküle synthetisiert, die an Metalloberflächen
adsorbieren und in der Lage sein sollen, biologische Erkennungssysteme zu binden.
Diese biologischen Bausteine, im allgemeinen Redoxenzyme und im Besonderen das
FNR – Enzym, erweitern die Funktionen der Oberfläche und fügen eine neue Eigenschaft
hinzu, Elektronen zu erzeugen oder zu verbrauchen. Mit dieser neuen Eigenschaft ist es möglich
die Elektronen, die an der enzymatisch katalysieren Reaktion beteiligt sind zu detektieren,
insofern es sich bei der Oberfläche um eine Elektrode handelt. Mit diesem Aufbau der
Elektrode ist es dann möglich die Effekte der Oberflächenimmobilisierung der Enzyme zu
bestimmen, soll heißen, die verschiedenen Kinetiken, die eine enzymatisch katalysierte Reaktion
bestimmen und zu einer globalen Reaktionskinetik zusammenzuführen [4,74] . Vor der Untersuchung
der Reaktionskinetik ist es wichtig zu wissen wie stark das entsprechende Enzym
an die Oberfläche bindet [25,114] , damit von einer immobilisierten Spezies gesprochen werden
kann und nicht von einer Reaktion in Lösung. Für die Bestimmung der Bindungskonstanten
werden deswegen spektroskopische Analysenmethoden, wie die SPR – Spektroskopie, aber
auch die Elektochemie bemüht. Dabei wird sowohl die Assoziation, als auch die Dissoziation
der Enzyme untersucht. Die Informationen aus diesen Experimenten werden für die weitere
Verbesserung der Oberfläche und eine bessere Anbindung der Enzyme an speziell hergestellte
intelligente Oberflächen benötigt.
24

Ergebnisse und Diskussion
FAD
FAD
2His
His2 2His His2
[NiNTA] [NiNTA] [NiNTA] [NiNTA]
Abbildung 8: allgemeiner Aufbau des Enzyms
und der Oberfläche.
Oben zeigt das Bändermodel des genetisch veränderten
FNR – Enzyms. Die rot markierten Stellen zeigen
die Position der gegen Histidin ausgetauschten Aminosäuren.
Unten ist der schematische Aufbau der
immobilisierten Enzyme zu sehen.
4.1.1 Synthese und Immobilisierungsstrategien
Als erstes muss eine geeignete Grundstruktur für die Moleküle gefunden werden, die die
Enzyme an ihrem Platz vor der Oberfläche halten sollen, was bedeutet, sie muss bestimmte
Eigenschaften aufweisen
- Bindung zum Enzym
- Stabile Bindung zur Oberfläche
- Keine Interferenzen während der Messung
Als Enzyme stehen genetisch modifizierte FNR – Enzyme zur Verfügung, wie in Abbildung 8
zu sehen, die in ihrer Hülle zweimal zwei Histidine tragen, die von jeweils drei nativen Aminosäuren
separiert sind. Dadurch sollte es in der Lage sein an kationische Übergangsmetalle
wie Ni 2+ oder Cu 2+ zu binden. Somit ist auch die
Art der funktionellen Gruppe der verbindenden
Moleküle festgesetzt, welches in die Lösung
ragt. Für die Bindung werden Chelatbildner benötigt,
die in der Lage sind eine entsprechende
Komplexchemie mit Übergangsmetallen eizugehen.
Vereinfacht kann gesagt werden, dass die
kleinen organischen Moleküle zusammen mit
dem d-Metall eine Art Anker bilden, der die
Enzyme an der Sensoroberfläche halten soll. Im
Weiteren wird der Anker aufgeteilt in das Ankermolekül
und das Ankermetall. Als Ankermetall
wird vorrangig Nickel verwendet, wie es
auch zur Aufreinigung von modifizierten Enzymen
benutzt wird, die über eine Kette aus sechs
Histidinen in der Peripherie ihrer Gesamtstruktur
verfügen und die dementsprechend keine Einflüsse
auf die katalytische Aktivität des Enzyms
hat.
Da bei der SPR – Spektroskopie vorwiegend
Goldoberflächen verwendet werden, ist es sinnvoll
auch bei der Elektrochemie mit Goldoberflächen,
also Goldelektroden, zu arbeiten, damit der gleiche Anker in beiden Experimenten
25

Ergebnisse und Diskussion
verwendet werden kann. Somit muss für die Ankermoleküle eine funktionelle Gruppe gesucht
werden mit der es möglich ist in Interaktion mit Goldatomen zu treten.
Eine Solche ist das Thiol oder das Disulfid, die beide in der Lage sind sich als Monolage auf
Goldoberflächen anzulagern. Neben der Anlagerung muss auch darauf geachtet werden den
organischen Platzhalter nicht zu lang zu machen, da eine Blockierung der Oberfläche mit der
Länge der immobilisierten organischen Moleküle korreliert. Am anderen Ende der Ankermoleküle
muss eine Gruppe sitzen, die in der Lage ist d-Metalle zu komplexieren. Die meisten
gebräuchlichen Übergangsmetalle bilden eine oktaedrische Ligandensphäre aus, was bedeutet,
dass sechs Liganden an das Ankermetall binden können. Zwei der sechs Plätze an dem Koordinationspolyeder
müssen allerdings frei bleiben, da diese für die Bindung zu dem Enzym
gebraucht werden. Als vierzähnige Liganden stehen standardmäßig Nitrilotriessigsäurederivate
zur Verfügung, die über drei Carbonsäurefunktionen verfügen, sowie ein organisches
Amin, das im Zentrum der drei Carboxylate steht und den vierten Liganden darstellt, der an
das Metall komplexiert.
Abbildung 9: Syntheseschema zur Herstellung modifizierter Oberflächen.
Im ersten Schritt wird die Liponsäure mit n – Hydroxysuccinimid aktiviert, damit die Aminfunktion des Lysinderivats
ohne Nebenprodukte über eine Amidfunktion gekoppelt werden kann. Im nächsten Schritt wird das Ankermolekül
an die Goldoberfläche assoziiert, um im letzten Schritt das Metall zu chelatisieren.
Alternativ zu dem NTA können Triazacyclononanderivate verwendet werden, die ebenso
wie die NTA – Funktionen über hohe Komplexbildungskonstanten verfügen. Allerdings muss
der TACN – Ligand mit einem zusätzlichen Zahn ausgerüstet werden, damit die Metalle nicht
vollständig von zwei Ringen umschlossen werden. Das TACN alleine verfügt über drei Zähne
zur Komplexierung von Metallen und bildet einen der stärksten Liganden in der metallorganischen
Chemie. Wird ein zusätzlicher Zahn in das System eingeführt, sollte sich ein noch
26

Ergebnisse und Diskussion
stabilerer Komplex bilden, der ein potentieller Kandidat für das angestrebte Ankermolekül ist.
Zusammenfassend für die Synthesestrategie [3] wird also auf der einen Seite eine Thiolfunktion
und auf der anderen eine NTA oder TACN – Funktion benötigt. Es stellte sich heraus, dass
eine Verbindung aus der Liponsäure mit dem N α , N α -Biscarboxymethyllysin am einfachsten
zu realisieren ist, wie in Abbildung 9 zu sehen.
4.1.1.1 NTA funktionalisierte Oberflächen
Die Synthese des NTA – Ankermoleküls ist bereits in der Literatur bekannt und von Limoges
et. al. beschrieben [3] . Aus diesem Grund wurden für die Synthese keine Probleme erwartet,
was effektiv nicht der Fall war, sondern einige Probleme mit sich brachte, die im Laufe
der Beschreibung der Synthese erläutert werden sollen.
Im ersten Schritt der Synthese zur Darstellung des Ankermoleküls, der Aktivierung der
Liponsäure, gab es keine weiteren Schwierigkeiten. In die Reaktionsmischung wird erst die zu
aktivierende organische Säure zusammen mit dem Succinimid vorgelegt und in der Kälte
langsam das reaktive Agens, Dicyclohexylcarbodiimid, zugegeben. Nach einer ersten Phase
von drei Stunden, in der weiter bei 0 °C gerührt wird, und einer zweiten Phase von 24 Stunden
in der bei Raumtemperatur gerührt wird, wird das Rohprodukt abfiltriert und in Aceton/Hexan
umkristallisiert, um ein gelbes fein kristallines Pulver mit knapp 70 % Ausbeute zu
erhalten.
In der zweiten Synthesestufe ergaben sich einige Probleme, die erst behoben werden
mussten und ein Abweichen von der Originalvorschrift erforderten. Erstens wurde die gesamte
Vorschrift unter standard Schlenktechnik durchgeführt, was einen weiteren Trockenschritt
aller Reagenzien beinhaltet. Zweitens wurde das Lösemittel gewechselt und die Synthese in
DMSO bei 100 °C durchgeführt. Die wichtigste Änderung in der Vorschrift, die letztendlich
den erwünschten Erfolg brachte, war die richtige Betrachtung des pH – Wertes.
Im ersten Schritt werden die festen Edukte im Vollvakuum bei 70 °C vorgetrocknet, sofern
das möglich ist, und das Triethylamin unter Argonatmosphäre destilliert, bzw. gelagert.
Das N α , N α – bis(carboxymethyl) – lysin wird in trockenem DMSO gelöst und anschließend
das frisch destillierte Trimethylamin zugegeben, wobei ein weißer viskoser Feststoff entsteht.
Zuletzt wird das N – (lipoyloxy)succinimid zugegeben und die gesamte Reaktionsmischung
zehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem mittels Massenspektrometrie die vollständige
Umsetzung festgestellt wurde, kann das Lösemittel im Vakuum entfernt und der verbleibende
klebrige Feststoff im Exsikkator (NaOH) vollständig getrocknet werden. Danach
27

Ergebnisse und Diskussion
wird das Rohprodukt in einigen Millilitern einer Mischung aus Ethanol und Wasser (1:1) aufgenommen
und über Nacht bei 4 °C gelagert. Nach Zentrifugation wird die überstehende Lösung
abgenommen und die verbleibende Lösung vorsichtig mit Ameisensäure versetzt bis
sich ein Niederschlag bildet. Danach wird die Suspension wieder für einige Zeit kalt gestellt,
anschließend Zentrifugiert und die überstehende Lösung von dem fertigen Produkt abgenommen.
Nach trocknen werden 45 % eines gelblich, öligen Produktes erhalten.
Im letzten Schritt der Synthese werden die Goldoberflächen mit einer 0.1 M methanolischen
Lösung des Ankermoleküls über mindestens zehn Stunden inkubiert und danach zuerst
vorsichtig mit Methanol und als zweites mit Wasser abgespült und mit Argon trocken gepustet.
Die so hergestellte Oberfläche ist mit einer homogenen Schicht dieser Ankermoleküle
versehen und kann entweder, je nach verwendetem Träger des Goldes als SPR – Sonde oder
als Elektrode verwendet werden. Zum Binden eines Enzyms muss allerdings noch das Ni 2+ –
Ion in die Chelatorfunktion gebracht werden. Dies geschieht durch die Behandlung der Oberfläche
mit einer 25 mM NiSO 4 – Lösung über einen Zeitraum von 20 Minuten. Diese Prozedur
kann auch mit allen anderen Metallkationen gemacht werden, die in der Lage sind von
einem NTA – Liganden gebunden zu werden, wie Eisen. Wo es bei den reinen organischen
Molekülen kein Problem war die Struktur mit NMR – Spektroskopie und Massenspektrometrie
nachzuweisen, erweist sich die Strukturaufklärung an der Oberfläche schwieriger. Die
Struktur der organischen Verbindungen ändert sich zwar nicht mehr, allerdings kann nicht
zweifelsfrei gesagt werden, ob sich die Moleküle an der Oberfläche angelagert haben oder
nicht, bzw. ob das Ankermetall chelatisiert wurde. Um dies nachzuweisen müssen die unterschiedlichen
Eigenschaften, die die verwendeten Moleküle und Atome aufweisen betrachtet
werden. Die Metalle eignen sich dabei in besonderer Weise, da sie im Idealfall ein reversibles
Redoxpotential haben, welches nachgewiesen werden kann. Zwar ist es bei Nickel nicht möglich,
innerhalb des von Wasser vorgegebenen elektrochemischen Fensters zu bleiben und ein
reversibles ZV aufzunehmen, aber Eisen liegt, mit einem E 0 = 0.36 V 1 vs NHE, in einem Bereich
der gut vermessen werden kann.
Wie in Abbildung 10 links zu sehen, eignet sich in diesem Fall zur Quantifizierung der
einzelnen aktiven gebundenen Metallatome, da die Redoxreaktion zwischen Fe II /Fe III bei ungefähr
-0.3 V gegen Ag/AgCl abläuft, was nicht zur Destabilisierung der Gold – Schwefel
Bindung führt. Die Messung ergibt einen Wert von . = 515 "0 für das chelatisierte Eisen,
gemessen an dem Oxidationspeak. Damit erhält man eine Oberflächenbedeckung von
1 Für das Redoxpaar Fe(CN) 6 3- +e - ↔ Fe(CN) 6
4-
28

Ergebnisse und Diskussion
1.56 pmol/mm 2 Eisenatome auf der Oberfläche. Allerdings kann Eisen nicht zur Bindung des
Enzyms verwendet werden. Dies wird durch Abbildung 10 rechts deutlich, da nach der Zugabe
des Enzyms keine Assoziation an die Oberfläche festgestellt werden kann.
600
400
50
i [nA]
200
0
-200
-400
-600
Winkeländerung [m°]
40
30
20
-800
10
-1000
0
-1200
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0
E [V vs Ag/AgCl]
0 1 2 3 4 5
Zeit [h]
Abbildung 10: Charakterisierung der modifizierten Oberfläche mittels [Fe lll – NTA].
Links ist die Bestimmung des chelatisierten Eisens durch ZV Messungen in 0.1 M PB, pH 7.5, Spannungsvorschubgeschwindigkeit
0.05 V/s. Rechts ist das Sensorgramm mit einer 4 his – FNR an der Fe 3+ modifizierten Goldoberfläche.
In der Assoziationsphase wurde 0.1 M PB, pH 7.5, 500 nM 4 his – FNR über die Oberfläche gespült. In
der Dissoziationsphase 0.1 M PB, pH 7.5.
Vermutlich da die Bindung zu den mit Histidin modifizierten Enzymen nicht stark genug
ist, eine stabile His 2 -Fe-Bindung zu erzielen, die sich mit den oben genannten Methoden
quantifizieren lassen würde. Genauer gesagt, ist das Produkt aus dem Fe 3+ – Ion mit den beiden
Histidinen zu schwach, als dass es ausreichen würde eine stabile Bindung zu favorisieren,
die das ganze Enzym an die Oberfläche bindet. Ein weiterer Grund für die Wahl des Nickels
ist die elektrochemische Inertheit in dem gewählten Potentialbereich. Aus diesem Grund wird
zur weiteren Betrachtung lediglich noch das Nickelkation verwendet.
Eine Redoxreaktion des Nickels ist unter den gegebenen Voraussetzungen also nicht möglich,
da das elektrochemische Fenster im wässrigen Elektrolyt zu klein ist, aber die Verwendung
von Eisen konnte zeigen, dass der metallorganische Anker erfolgreich an der Elektro-
29

Ergebnisse und Diskussion
denoberfläche immobilisiert werden konnte. Im nächsten Schritt muss darüber nachgedacht
werden wie die Enzymanbindung nachgewiesen werden kann.
Dafür kann indirekt über die enzymatisch katalysierte Reaktion der Beweis einer erfolgreichen
Immobilisierung erbracht werden, wenn nach der Assoziations- und Dissoziationsphase
immer noch eine katalytische Reaktion detektiert werden kann. Die nachgewiesenen
Elektronen können in dem Falle nur von dem Enzym kommen, welches das zugegebene Substrat
umsetzt. Die vorgegebene Reaktion, die dabei abläuft ist die Umsetzung von NADPH zu
NADP + und einem Elektron, analog Gleichung ( 2 ).
1
⇌ * + ( 2 )
Dabei werden in einem zweiten Schritt die Elektronen von einem Redoxmediator eingesammelt
und zu der Elektrode transportiert. An der Elektrodenoberfläche werden die Elektronen
dann entsprechend der angelegten Spannung detektiert.
Das folgende Kapitel wird die Gesichtspunkte der einzelnen Teilreaktionen kurz anreißen,
die nötig sind die globale Reaktionskinetik aufzustellen, sowie die einzelnen Experimente
vorstellen, die durchgeführt wurden, um die Reaktionskinetiken für die verschiedenen Enzyme,
die im Laufe dieser Arbeit verwendet wurden, aufzustellen und deren Aktivität vergleichen.
4.1.2 Kinetiken zu enzymatisch katalysierten Reaktionen [1–4]
Die allgemeine Form einer enzymatisch katalysierten Reaktion ist in Gleichung ( 3 ) gegeben
und nachfolgend mit der bioelektrochemischen Reaktion konkretisiert, die im Laufe der
Arbeit zur Bestimmung der Kinetikkonstanten verwendet wird [54]
E + S → E + P ( 3 )
Wobei sich diese einfach aussehende Reaktionsgleichung aus einer größeren Anzahl von
Teilgleichungen zusammensetzt und im Folgenden nur als globale Reaktionsgleichung be-
30

Ergebnisse und Diskussion
zeichnet wird. Werden die einzelnen Teile der Reaktion betrachtet, können auch verschiedene
Teilgleichungen aufgestellt werden.
E 5$ + S
6
⇄
6
8E 5$ S9 ( 4 )
8E 5$ S9 : ;
→ 8E

Ergebnisse und Diskussion
aktiven Zentrum für die Redoxmediatoren ist. Auch an dieser Stelle kann die Reaktion gehemmt
werden, wenn die Elektronen nicht schnell genug von dem Enzym abtransportiert
werden können. Je nachdem wie das Enzym gebunden ist, kann der Zugang blockiert sein und
es kommt zu einem gehemmten Übergang der Elektronen. Andererseits kann es auch zu einer
Verbesserung kommen, wenn die Enzyme in einer optimalen Orientierung zu der Elektrode
stehen. Verluste durch den Massentransport sind somit kaum noch zu berücksichtigen.
4.1.2.1 Bestimmung der Michaelis Menten – Konstante (K M )
Das vorgelagerte Gleichgewicht der katalytischen Reaktion lässt sich nicht direkt bestimmen,
da es sich hier um zwei separate Reaktionen handelt, die auf die Konzentration des intermediär
gebildeten Zwischenproduktes abzielen. Der Enzym-Substrat-Komplex bildet ein
Intermediat, das entweder wieder zerfallen oder weiterreagieren kann. Im Allgemeinen ist
dieser Zustand und die Größe zur Beschreibung dieses Zusammenhangs als Michaelis-
Konstante bekannt. Analog zu den Experimenten mit denen auch k 2 bestimmt wurde, wurde
auch K M bestimmt. So wurde die Konzentration des Substrats so lange erhöht bis es zu einer
Sättigung kommt. Die Konzentration des Substrats bei dem die Hälfte des maximalen Stroms
erreicht wird ist als K M definiert.
Um eine Aussage zu dem Vorgelagerten Gleichgewicht liefern zu können gib es nur einen
Spezialfall, unter der Bedingung, dass k -1

Ergebnisse und Diskussion
Konzentration von 7.3 % entspricht. Dieser Fehler muss bei der Betrachtung der Daten mit
Bedacht werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde das Substrat in einem Teil der vorher
abgenommenen Messlösung gelöst, damit diese Verdünnungseffekte nicht mehr beachtet
werden mussten. Die Konzentration an Enzym und Mediator ist somit während des gesamten
Experiments konstant.
Zum eigentlichen Experiment wurde eine Stammlösung mit dem Substrat angesetzt und
dann in kleinen Portionen zu der Messzelle gegeben, um bestimmte Konzentrationen zu erreichen.
Dabei wurde immer ein Teil der Messlösung vorher abgenommen und durch die
Stammlösung ausgetauscht, damit das Gesamtvolumen konstant bleibt. Vor jeder neuen Zugabe
wurde die Temperatur gemessen und die gesamte Messzelle war untere einer sauerstofffreien
Atmosphäre. Die Lösung wurde nach jeder Zugabe von neuem Substrat für zehn Sekunden
gerührt und dann ein ZV aufgenommen.
Für die weitere Datenverarbeitung wurde nur der erste Teil der Messungen bis zum Umkehrpotential
genutzt. Die erste Messung ohne Substrat wurde als Hintergrund verwendet und
von allen anderen Messungen subtrahiert. Daraus ergibt sich der katalytische Strom, der durch
die Zugabe des Substrats entsteht. Die gemessenen Werte werden gegen die Konzentration
des Substrats aufgetragen.
Die Berechnung des k 2 Wertes ergibt sich aus folgender Gleichung:
6 =
1
∗ D ?A$
( 8 )
2 ?A$ B C B (")
mit D max als Diffusionskoeffizient des Ferrocenmethanols in dm 2 /s, e Σ als Summe des oxidierten
und reduzierten Enzyms, m Σ als Summe des oxidierten und reduzierten Mediators und
I Max als maximal gemessener Strom in der Sättigung des Enzyms. Die ermittelten Werte ergeben
sich aus einer mathematischen Annäherung an die gemessenen Werte, um eine infinite
Annäherung an eine unendlich hohe Substratkonzentration zu simulieren. Die verwendeten
Konzentrationen reichten von (0.05-3) mM. In Abbildung 11 ist exemplarisch eine Messung
mit der entsprechenden Datenbehandlung gezeigt. Aus der Auftragung erhält man nicht nur
nach Gleichung ( 8 ) einen Wert für k 2 sondern auch einen Wert für K M , woraus sich nach
Gleichung ( 7 ) Rückschlüsse auf das Gleichgewicht ergeben was sich zuerst zwischen dem
Enzym und dem Substrat einstellt und in Gleichung ( 4 ) dargestellt ist.
33

Ergebnisse und Diskussion
1600
1400
1200
1000
i [nA]
800
600
400
200
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
NADPH [mM]
Abbildung 11: Substratabhängige katalytische Ströme mit Michaelis Menten Auswertung zur Bestimmung von
k 2 und K M .
Auf der linken Seite sind die gemessenen und korrigierten ZV's. auf der rechten Seite sind die maxima Ströme
aufgetragen und über einen Michaelis Menten Annäherung wurde der Strom ermittelt, der möglich ist. Gemessen
wurde in 0.1 M PB, pH 7.5, 2 *10 -7 M wt-Enzym, 5*10 .-4 M Ferrocenmethanol, steigender Substratkonzentration (0.05,
0.1, 0.15, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3 mM) und 5 mV/s.
4.1.2.3 Bestimmung des k 3 – Wertes
Nachdem die Ermittlung der k 2 Werte geklärt ist wird analog dazu die Ermittlung der
k 3 Werte aufgezeigt.
Analog zu der oben beschriebenen Prozedur wird auch hier die Konzentration des Enzyms
überprüft und entsprechend der Messbedingungen angepasst und verdünnt. Da in dem Experiment
nur eine Abweichung von 1.25 % zu erwarten ist, wurde hier nicht von der eigentlichen
Prozedur abgewichen wie oben. Dies muss bei der Betrachtung der berechneten Werte
beachtet werden. Im Vorfeld wurde eine Leermessung durchgeführt, damit diese später von
den katalytischen Messungen subtrahiert werden kann. Auf diese Weise können die Ladeströme
aus den späteren Messungen entfernt werden. Es wird in einer 0.1 M PB, pH 7.5,
5 mM NADPH Lösung, mit einer Konzentration des Mediators gemessen. Es wurde mit folgenden
Spannungsvorschubgeschwindigkeiten gemessen, 2 mV/s, 5 mV/s, 7.5 mV/s,
10 mV/s, 15 mV/s, 20 mV/s, 50 mV/s, 100 mV/s, 250 mV/s, 500 mV/s, 750 mV/s und
1000 mV/s.
34

Ergebnisse und Diskussion
400
350
300
i [nA]
250
200
150
100
∆
50
0
0,0 0,2 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
0,0 0,2 0,4
Abbildung 12: Messung zur Bestimmung des k 3 – Wertes mit Hintergrundkorrektur.
Beispielhafte Messung bei 7.5 mV/s mit (rot) und ohne (schwarz) Mediator (25 µM) in 0.1 M PB, pH 7.5, 0.5 µM
4-his FNR und 5 mM NADPH. Blau ist der katalytische Strom der sich aus der Differenz der beiden gemessenen
Ströme ergibt.
Zweck des Designs der Experimente und dieser Messungen ist es die Übertragung der
Elektronen von dem Enzym auf den Mediator zu messen. Dafür ist es wichtig verschiedene
Spannungsvorschubgeschwindigkeiten zu messen, die einen Bereich überdecken in dem einerseits
der Übergang der Elektronen von dem Enzym zum Mediator schneller ist als der
Spannungsanstieg, bis hin zu einem Bereich in dem die elektrochemisch induzierte Reaktion
schneller wird als der Elektronentransfer vom katalytischen Zentrum zum Mediator. So lässt
sich relativ genau die Geschwindigkeit des Elektronentransfers von dem Enzym zu dem Mediator
bestimmen.
In einem ersten Schritt muss die Differenz zwischen der Leermessung und der katalytischen
Messung ermittelt werden. Danach wird, was vor allem bei Messungen mit hohen
Spannungsvorschubgeschwindigkeiten wichtig ist, zusätzlich die gemessene latente Ladung
im Hintergrund abgezogen. Damit können kleine Ungenauigkeiten der Messung ausgeglichen
werden. Für die weitere Datenbehandlung wurde den Ausführungen von Bourdillon et al [74]
gefolgt und aus den entsprechenden Verhältnissen und den Auftragungen die k 3 Werte berechnet.
35

Ergebnisse und Diskussion
4.1.2.4 Vergleich zwischen den verschiedenen Mutanten und dem nativen Enzym
In den vorangehenden Unterkapiteln wurde der Hintergrund zu den verschiedenen Konstanten
beschrieben, die hier in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Darunter ist zum einen ein
kurzer theoretischer Hintergrund und zum anderen eine kurze Umschreibung der Experimente,
die zur Ermittlung der Daten durchgeführt wurden subsumiert.
Tabelle 1 zeigt die verschiedenen Konstanten, die via Elektrochemie bestimmt werden konnten.
K M /
µM
k 2 /
k 3 /
I Max /
s -1 (M*s) -1 k red µA
in Lösung
wt (n=3) 430 ± 140 220.11 ± 21.46 4.93E+06 ± 8.22E+05 517.17 1.65
2-his (n=3) 260 ± 60 198.22 ± 20.37 2.19E+06 ± 3.19E+05 765.64 1.56
4-his (n=3) 340 ± 40 195.65 ± 19.86 3.07E+06 ± 2.11E+05 580.44 1.55
Werden die unterschiedlichen Kategorien untereinander verglichen kann in der ersten
festgestellt werden, dass alle Werte in der gleichen Größenordnung liegen. Für das native Enzym
ist der höchste Wert ermittelt worden, was auch nicht verwundert, dass es mehr Substrat
umsetzte, als die genetisch veränderten Enzyme. Die Werte der anderen beiden sind allerdings
nicht viel kleiner, weshalb mit hinreichender Sicherheit gesagt werden kann, dass es für die
untersuchten Enzyme im Hinblick auf die Michaelis-Menten-Konstante kaum Abweichungen
gibt.
Die zweite Konstante, k 2 , ist nach Gleichung ( 5 ) definiert und besagt je höher dieser
Wert ist, desto mehr Substrat wird in der gleichen Zeit zum Produkt umgesetzt. Also wird bei
jedem Katalysator ein möglichst hoher k 2 Wert angestrebt. Bei dem nativen Enzym wurde der
höchste Wert ermittelt, aber hier wurde eine noch bessere Annäherung bei den beiden genetisch
Veränderten Enzymen erreicht. Somit ist die effektive Umsetzung des Substrats zum
Produkt durch die Veränderung des Enzyms nicht sonderlich beeinflusst worden. Dies wird
auch bei dem Vergleich der maximalen Ströme deutlich, die sich kaum voneinander unterscheiden.
Die nächste gemessene Kategorie, die jetzt betrachtet wird ist diejenige des k 3 Wertes, die
den Übergang des Elektrons vom Enzym zum Mediator beschreibt. Dabei wird hier der Wert
durch den Übergang der Elektronen pro Anzahl Enzyme und Zeiteinheiten beschrieben. Also
je höher der Wert, desto, mehr Elektronen werden pro Enzym und pro Sekunde übertragen.
Betrachtet werden als erstes die Größenordnungen der ermittelten Werte, die sich in anderen
Dimensionen abspielen als alle anderen Werte, was auf eine gute „turn over“ Rate des En-
36

Ergebnisse und Diskussion
zyms schließen lässt. Zuerst muss festgehalten werden, dass alle Werte in der gleichen Region
liegen. Zwar ist wieder der Wert des nativen Enzyms höher als die Werte der genetisch veränderten
Mutanten, aber diese sind nicht so gravierend, dass hier von einem Fehlschlag gesprochen
werden kann. Viel eher ist festzuhalten, dass die Ermittlung kinetischer Daten von
Enzymen äußerst anspruchsvoll ist und hier eine grundlegende Strategie entwickelt wurde, die
erste ermutigende Werte liefert. Von dem nativen Enzym zu dem 2-his FNR Enzym ist der
größte Abstieg an Aktivität zu sehen. Interessanterweise steigt der Wert dann wieder vom 2-
his zum 4-his FNR Enzym deutlich an.
Der letzte Wert, der k red , ist nur aus den hier bereits aufgeführten Werten zu ermitteln. Um
die folgende Diskussion zu erleichtern wird an dieser Stelle kurz die Bedeutung verschiedener
Entwicklungen möglicher Werte diskutiert. Die Definition des K Μ ist in Gleichung ( 7 ) gegeben.
Darin ist ersichtlich, dass es sich hierbei um zwei unabhängige Reaktionen handelt, die
beide von der Konzentration des Enzymsubstratkomplexes abhängig sind. Zum einen die
Rückreaktion, die wieder zum Verlust des Substrats aus Sicht des Enzyms führt und die Umsetzung
zum Enzymproduktkomplex. Da bekannt ist, dass die Reaktion mit hohen Geschwindigkeiten
abläuft kann auch davon ausgegangen werden, dass k 1 > k -1 ist. Im Weiteren können
wir die zuvor bestimmten k 2 Werte betrachten, die auch einen Teil zu der Gleichung beisteuern.
Der Unterschied zwischen den Werten für die genetisch modifizierten Enzyme ist dermaßen
klein, dass sich daraus kaum große Änderungen für den k red erklären lassen würden. Als
logische Konsequenz bleibt nur noch das zweite Gleichgewicht, welches sich an dieser Konstanten
beteiligt. Für die Werte bedeutet dies, dass k red nur unter zwei Bedingungen zu größeren
Werten streben kann. Entweder wird der Nenner kleiner, was mit einer Verringerung der
Zugänglichkeit der enzymatischen Tasche verbunden wäre, oder der Zähler wird größer, was
mit einer Zunahme einer der beiden Folgereaktionen zu tun hat. Da die eine Reaktion durch
die ermittelten k 2 Werte hinreichend beschrieben ist fällt diese Erklärung in großen Teilen
raus. Somit ist in der logischen Konsequenz eine schlechtere Bindung zwischen dem Enzym
und dem Substrat ein Auslöser. Dies ist der Fall für die 2-his FNR, die die höchsten Werte für
k red aufweist. Ob k 1 kleiner wird oder k 2 zunimmt, konnte unter den gegebenen Umständen
nicht geklärt werden. Im Gegensatz dazu sind die Werte für die anderen beiden Enzymvarianten
erstaunlich nah beieinander.
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Veränderung der äußeren Struktur der Enzyme
durch die „intrachain his tag“ Funktionen nur geringe Auswirkungen auf die globale Reaktionskinetik
hat, wird im nächsten Abschnitt die Anbindung der Enzyme an die modifizierten
37

Ergebnisse und Diskussion
Goldoberflächen diskutiert. Dabei werden zuerst die Modelle vorgestellt, die den Experimenten
zugrunde liegen und im Anschluss die verschiedenen Experimente mit den Ergebnissen
diskutiert.
4.1.3 Kinetiken zur Anbindung an Oberflächen
Das nächste Kapitel beschäftigt sich mit der Analyse der Bindungskinetiken der Enzyme
an die hergestellten Oberflächen. Zuerst gibt es einen kurzen theoretischen Teil über das
Messprinzip, sowie die physikochemischen Hintergründe zur Oberflächenkinetik, gefolgt von
der Darstellung und Diskussion der Ergebnisse [74] .
4.1.3.1 SPR Untersuchungen
Die Analyse von Oberflächen ist schon immer etwas anspruchsvoller gewesen als die
Routineanalytik von gelösten Stoffen, die in der Lage sind in verschiedene Wechselwirkungen
mit elektromagnetischer Strahlung zu treten, nach dem Verteilungssatz von Nernst chromatographisch
aufgetrennt zu werden oder durch aufladen im elektrischen Feld entsprechend
ihrer Masse detektiert werden können [115] . Ist ein Stoff an eine Oberfläche gebunden, muss
versucht werden diese, zusammen mit dem Analyten, während der Analyse zu schützen.
Dadurch reduziert sich die Anzahl der möglichen Techniken, da nicht alle Zerstörungsfrei
sind. Eine weitere Möglichkeit zur Analyse von Kinetiken neben der Elektrochemie, ist die
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (surface plasmon resonance, SPR). Bei dieser
Art der Spektroskopie, die nicht als klassische Spektroskopieart zu zählen ist, da es keine direkte
Wechselwirkung zwischen der eingestrahlten elektromagnetischen Strahlung und dem
Analyten gibt, wird p polarisiertes Licht durch ein Prisma gestrahlt, welches mit einer dünnen
Schicht eines Edelmetalls 3 bedeckt ist. An dem Edelmetall wird das Licht reflektiert und der
austretende Strahl, sowie dessen Intensität, detektiert. Ändert sich der Eintrittswinkel, kann es
passieren, dass ein Teil der Strahlung in Wechselwirkung mit den freien Elektronen des Metalls
tritt, was auf der anderen Seite zu einem Intensitätsverlust an dem Detektor führt. Wird
der Winkel weiter geändert nimmt die Wechselwirkung zwischen Licht und Materie wieder
ab und die Intensität erreicht wieder ihr Maximum. Um die SPR – Spektroskopie als analytisches
Mittel nutzen zu können, um weitere Fragestellungen zu klären, muss es eine Wechselwirkung
geben, die zu einer Änderung des Signals führt. Aus diesem Grund muss der Einfallswinkel
so eingestellt werden, dass es eine maximale Wechselwirkung zwischen dem polarisierten
Licht und den freien Elektronen gibt, was in einer Minimalen Intensität resultiert,
3 20 – 40 nm von Gold oder Silber sind ausreichend.
38

Ergebnisse und Diskussion
die detektiert wird. Der Winkel mit der geringsten Intensität in diesem Tal wird Resonanz –
oder SPR – Winkel genannt.
Nachdem die Erzeugung des Signals geklärt wurde, besteht immer noch die Frage wie
sich das Signal über die Zeit ändern soll, wenn es keine Wechselwirkung zwischen dem Licht
und dem Analyten gibt. In der Tat verhält es sich bei der SPR – Spektroskopie so, dass es
einen trockenen und einen nassen Bereich gibt, und beide Bereiche durch den Metallbeschichteten
Objektträger räumlich voneinander getrennt sind. Das Laserlicht bleibt auf der trockenen
Seite und wird abgeschwächt reflektiert, und auf der anderen Seite, in Lösung, findet die
Chemie statt. Auch wenn es eine räumliche Trennung zwischen den beiden Bereichen gibt,
sind sie über die angeregten, oszillierenden Plasmonen miteinander verbunden, was umgekehrt
bedeutet, dass das ganze System von einfachen physikalischen Charakteristika, wie dem
Brechungsgesetzt und den optischen Dichten der Medien, bestimmt wird. Da auf der trockenen
Seite keine Änderung zu erwarten ist und auch in einem gut geplanten Experiment nicht
stattfinden wird, da es dann mit einem Phasentransfer des Glases zusammenhängt, kann sich
die optische Dichte nur auf der nassen Seite ändern. Die optischen Dichten von wässrigen
Puffern und Proteinen unterscheiden sich, was zur Folge hat, dass die Eigenschaften des ganzen
Systems geändert werden. Daraus folgt eine Änderung des Resonanzwinkels in Abhängigkeit
der adsorbierten Menge an Protein vor der Metalloberfläche. Von dieser Information
ist es ein leichtes ein kontinuierliches Signal gegen die Zeit aufzutragen 4 , was, in erster Linie
eine qualitative Antwort über ein mögliches Adsorptionsverhalten und in weiteren Fragestellungen
die Lösung der Dissoziationskonstanten der genetisch veränderten FNR – Enzyme an
die modifizierte Oberfläche gibt.
Im nächsten Schritt, nachdem das Messprinzip der SPR – Spektroskopie kurz umrissen
wurde, muss die Grundlage für die Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziationskonstanten
(K D ) im Allgemeinen und der Dissoziationskonstanten im Besonderen, die im Zuge dieser
Arbeit ermittelt wurden, geschaffen werden.
Neben der uneingeschränkten Aktivität der genetisch veränderten Enzyme ist es wichtig
zu wissen ob sie auch an strukturierte Oberflächen binden. Zudem muss untersucht werden
wie gut sie an die Oberflächen binden und wie stabil diese Bindung ist. Ein weithin bekanntes
Modell zur Untersuchung des Adsorptionsverhaltens von Stoffen an Oberflächen wurde von
Langmuir entwickelt. Es ist die einfachste Sorptionsisotherme, die eine physikalische Grund-
4 Bei dem verwendeten Gerät (Autolab Twingle) wurden 10 Winkelmessungen pro Sekunde durchgeführt
mit einer Genauigkeit von 0.1 m°
39

Ergebnisse und Diskussion
lage besitzt und Basis für weitere, kompliziertere Sorptionsisothermen bildet. Die Langmuir-
Isotherme liefert bei Systemen mit gleichwertigen Adsorptionsplätzen, bei denen es zwischen
den einzelnen adsorbierten Spezies keine interferierende Wechselwirkung gibt, und sich lediglich
eine Monolage des Adsorbens anlagern kann, zutreffende Ergebnisse.
Im vorliegenden Fall gilt es eine bimolekulare Reaktion zu beschreiben, die zwischen dem
Enzym in Lösung und den Ankermolekülen an der Oberfläche abläuft. Das Enzym bindet an
die Oberfläche, was entsprechend mit einer Verschiebung des Signals einhergeht. Es sind
mehrere Messungen, die verschiedene Konzentrationen an Enzym haben notwendig, damit
die jeweilige Maximalkonzentration, widergegeben in der Winkeländerung (m°), gegen die
einzelnen Gesamtkonzentrationen aufgetragen werden können. Dies ist nötig, da nicht bei
jeder Konzentration alle Bindungsplätze belegt werden, sondern nur so viele bis sich ein
Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation einstellt, wie in Gleichung ( 9 ) beschrieben.
6 5F
8A9 + 8E9 ⇄ 8AB9 ( 9 )
6 5GG
Dabei ist [A] die Konzentration des freien Analyten, [B] die Konzentration der freien
Plätze an der Oberfläche, [AB] die Konzentration der gebundenen Analyten, k on die Ratenkonstante
der Adsorption und k off die Ratenkonstante der Desorption. Die Dissoziationskonstante
K D lässt sich demnach aus dem Quotienten der beiden Ratenkonstanten berechnen,
I = k 5GGK 65F
( 10 )
bzw. aus den konzentrationsabhängigen Experimenten bestimmen.
1 ,L = 819 ∗ E MA$
819 + I ( 11 )
R eq ist der Messwert im Gleichgewicht, [FNR] die Konzentration des freien Enzyms und
B max die maximale Bedeckung, wenn die größtmögliche Anzahl an Bindungsstellen besetzt
ist. Daraus folgt das bei einer Auftragung der Messwerte gegen die Konzentration sowohl K D
als auch B max bestimmt werden können. Der folgende Abschnitt wird sich mit den Experimenten
und der Behandlung der gewonnenen Daten beschäftigen.
4.1.3.2 Bindungskinetiken
40

Ergebnisse und Diskussion
Grundlage für die Bindungskinetiken ist die Langmuir – Isotherme, die die entsprechenden
Werte liefert. Die Dissoziationskonstante ist dabei, analog zu der Kinetik der Enzyme, die
halbmaximale Konzentration der ermittelten Maximalkonzentration. Im Laufe der Experimente
wird sich zeigen, dass die oben getroffenen Annahmen zur Verwendung der Langmuir –
Isotherme hier nicht mehr gelten wird. Dies wird nach der Präsentation der ersten Ergebnisse
diskutiert.
4.1.3.2.1 Die Bestimmung der Oberflächenkonzentration und der Dissoziationskonstanten
Zuerst werden die Messungen der beiden unterschiedlichen FNR Mutanten miteinander
verglichen, was in Abbildung 13 zu sehen ist. Bereits ohne jegliche Bemühung einer mathematischen
Betrachtung kann ein deutlicher Unterschied in dem Assoziations- und Dissoziationsverhalten
ausgemacht werden.
700
600
Winkeländerung [m°]
500
400
300
200
100
0
-100
4-his FNR
2-his FNR
0 500 1000 1500 2000 2500 0 500 1000 1500 2000 2500
Zeit [s]
Abbildung 13: Messungen zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten K D .
Auf der linken Seite ist die Messreihe, die mit der 4-his FNR durchgeführt wurde und auf der rechten Seite entsprechend
die Messreihe der 2-his FNR. Alle Messungen wurde in 0.1 M PB, pH 7.5,durchgeführt. Die Enzymkonzentrationen
sind 12.5 nM (schwarz), 25 nM(rot), 50 nM (blau), 100 nM (pink), 200 nM (oliv), 500 nM (lila), 1000 nM
(purpur).
41

Ergebnisse und Diskussion
Die niedrigen Konzentrationen zeigen noch eine ähnliche Bedeckung, bis ca. 50 nM. Bei
höheren Konzentrationen wird θ 4 his > θ 2 his . Der extremste Fall ist der Unterschied von
200 nM im Fall der 4-his – FNR und der fünfmal höher konzentrierten 2his – FNR wenn beide
Messungen den gleichen Grad der Bedeckung aufweisen, wie Tabelle 2 zu entnehmen ist.
Zusätzlich fällt auf, dass bei der 2-his FNR die Assoziation innerhalb der ersten zehn Minuten
abgeschlossen ist und sich kurz ein Gleichgewicht einstellt, welches dann in eine langsame
Desorption des Enzyms übergeht. Dieses Verhalten ist bei der 4-his FNR nicht zu beobachten.
Im Gegenteil, zum einen ist nur in der niedrigsten Konzentration der Gleichgewichtszustand
erreicht worden und alle anderen Messungen waren noch dabei weiteres Material anzulagern,
zum anderen ist auch in der Dissoziationsphase nur eine leichte Abnahme des Signals zu sehen,
die sich deutlich von dem der 2-his FNR unterscheidet.
FNR
Tabelle 2: Übersicht der prozentualen Bedeckungen in Abhängigkeit der Konzentration und der verwendeten
4-his FNR
2-his FNR
Konzentration/
nM
θ (global) /
%
Konzentration/
nM
θ (lokal) ) /
%
θ (global) ) /
%
500 0,66 1000 0,91 0,39
100 0,42 200 0,48 0,21
50 0,28 100 0,36 0,16
25 0,17 50 0,20 0,09
12.5 0,08 25 0,08 0,03
Nach den ersten Betrachtungen der Messungen gehen wir jetzt dazu über die Messwerte
gegen die Konzentrationen aufzutragen, damit die Dissoziationskonstanten nach Gleichung
( 11 ) berechnet werden können. wie in den einleitenden Worten zu diesem Teilkapitel bereits
gesagt, handelt es sich bei dieser Betrachtung um die halbmaximale Bedeckung der Oberfläche,
ausgehend von den ermittelten Maximalwerten der Messreihen und der daraus approximierten
Maximalbedeckung B max . Da die 2-his FNR innerhalb der ersten zehn Minuten bereits
ihr Maximum überschreitet ist auch die mathematisch erreichbare Oberflächenbedeckung für
dieses System nicht sehr hoch. Aus Tabelle 2 wird deutlich, dass für dieses Enzym, auf dieser
Oberfläche bereits 91 % der zugänglichen Plätze belegt sind wenn eine 1 µM Enzymlösung
über die Oberfläche gespült wird. Dies bedeutet jedoch bei einer globalen Betrachtung nicht,
dass das alle zugänglichen Plätze auf der Oberfläche sind. Die 4-his FNR zeigt eine deutlich
dichtere Packung auf den Sensoroberflächen, was, wird die maximale Bedeckung ausgehend
von den ermittelten Werten der 4-his FNR auch für die 2-his FNR zugrunde gelegt, den Bedeckungsgrad
auf 39 % herabsetzt. Aus diesen Gründen ist hier ein Verhältnis von
42

Ergebnisse und Diskussion
K D 2-his < K D 4-his zu erwarten. Dies bedeutet, dass das Gleichgewicht der 4-his FNR mehr auf
der dissoziierten Seite liegt als bei der 2-his FNR, bzw. sich das Gleichgewicht langsamer
einstellen wird.
Als erstes wird die 2-his FNR betrachtet, deren gefittete Messungen zusammen mit der
Projektion der maximalen Winkeländerung gegen die Konzentration in Abbildung 14 dargestellt
sind. Es ist in den ersten Messungen ein sehr steiler Anstieg zu sehen, der für diese Art
von Reaktion charakteristisch ist. Dies ist in der Tatsache begründet, dass die Oberfläche viele
freie Plätze hat und die Enzyme sich schnell anlagern können, ohne gegenseitige Wechselwirkung
zu spüren. Diese Wechselwirkungen sind es, die ein Abflache der Kurve verursachen
und schließlich in die maximale Bedeckung laufen.
400
Winkeländerung [m°]
300
200
100
0
0 500 1000 1500
t [s]
0 200 400 600 800 1000
Konzentration [nM]
Abbildung 14: Gefittete Messreihen und konzentrationsabhängige Projektion der Maximalbedeckung an 2 his –
FNR.
Links die gefitteten Messreihen, rechts ist der maximale Wert gegen die Konzentration projeziert und die Langmuir
– Isotherme durch die Punkte gelegt. Gemessen wurde in 50 mM PB, pH 7.5, in einer 35 µL Messzelle, Oberfläche
6 mm 2 , Konzentration an Enzym 12.5 nM (schwarz), 25 nM (rot), 50 nM (blau), 100 nM (pink) und 1000 nM
(oliv).
Sowohl bei den simulierten Kurven, als auch bei der daraus extrahierten Auftragung gegen
die Konzentration kann bei den ersten vier Messpunkten nahezu eine Gerade durch die
Punkte gelegt werden, was in diesem Bereich durchaus berechtigt ist. Bei niedrigen Konzentrationen,
wenn der variable Reaktionspartner nicht durch den anderen limitiert wird, kommt
43

Ergebnisse und Diskussion
es bei einer Verdoppelung des Reaktanten zu einer Verdoppelung des Messwerts. Erst bei
höheren Konzentrationen kommt es durch intermolekulare Wechselwirkungen und Platzmangel
5 zu einer Limitierung der Reaktion, bis sie gegen einen Grenzwert läuft. Aus dieser Messreihe
lässt sich eine maximale Bedeckung bei einem Grenzwert von 426 m° ermitteln, und
damit eine Dissoziationskonstante von 100.9±9.2 nmolL 1- . Die gewählten Experimente liegen
also in guter Übereinstimmung mit den ermittelten Daten. Es hat sich als sinnvoll erwiesen,
die Konzentrationen so zu wählen, dass sie im Bereich der zu ermittelnden Konstante sind,
bzw. im Bereich der maximal möglichen Messergebnisse, um in dem wichtigen Bereich Ungenauigkeiten
zu vermeiden.
Im Vergleich dazu erreicht die 4-his FNR höhere Bedeckungen, benötigt dazu aber auch
etwa doppelt so hohe Konzentrationen. In Abbildung 15 sind die, aus den Experimenten
extrahierten und mathematisch simulierten Daten für die Oberflächenbedeckung zu sehen und
auf der rechten Seite gegen die Konzentration aufgetragen.
700
600
Winkeländerung [m°]
500
400
300
200
100
0
0 500 1000 1500
t [s]
0 100 200 300 400 500
Konzentration [nM]
Abbildung 15: Gefittete Messreihen und konzentrationsabhängige Projektion der Maximalbedeckung an 4 his –
FNR.
Auf der linken Seite sind die gefitteten Messreihen in den Konzentrationen 500 nM (oliv), 200 nM (pink),
100 nM (blau), 50 nM (rot) und 25 nM (schwarz). Auf der rechten Seite ist der simulierte Maximalwert auf der Ordinatenachse
gegen die jeweilige eingesetzte Konzentration aufgetragen. Gemessen wurde in 50 mM PB, pH 7.5, in einer
35 µL Messzelle, Oberfläche 6 mm 2 .
5 bzw. einem Mangel an reaktiven Zentren wenn von Katalysatoren gesprochen wird
44

Ergebnisse und Diskussion
Wie bereits bei der 2-his FNR sind auch hier die ersten Punkte der Messung nahezu auf
einer Linie, was bedeutet, dass die freien Bindungsstellen nicht der limitierende Faktor bei
den Experimenten waren. Es ist aber auch deutlich zu sehen, dass sich der Gleichgewichtszustand
deutlich langsamer einstellt als bei der 2-his FNR. Die Dissoziationskonstante für die 4-
his FNR wurde mit 263.6±27.3 nmolL -1 ermittelt. Die maximale Bedeckung konnte mit
985.2 m° bestimmt werden, was mehr als das doppelte ist im Vergleich zu der 2-his FNR.
Dadurch kann auch direkt ein Rückschluss auf die Gesamtmenge an adsorbiertem Material
gezogen werden, was bedeutet, dass sich auch mehr als doppelt so viele Enzyme angelagert
haben.
In einem ersten Fazit kann zusammengefasst werden, dass sich bei der 4 his Mutante sowohl
die Bedeckung als auch die Dissoziationskonstante deutlich vergrößert. Jetzt gilt es herauszufinden
warum zum einen die Assoziation bei der 4-his FNR langsamer stattfindet, aber
trotzdem effektiver zu sein scheint als bei der 2-his Mutante.
Um diese Fragen mit einem zufriedenstellenden Ergebnis zu beantworten müssen die Informationen
aus dem Kapitel und in einem größeren Kontext betrachtet werden. Als erstes ist
zu klären, warum die beiden Enzyme unterschiedlich stabil an die Metallzentren binden. Die
Enzyme unterscheiden sich lediglich in der Anzahl zweier Histidine, die in die Struktur eingebaut
wurden. Diese zusätzlichen funktionellen Gruppen sind auf der anderen Seite der
Grund, warum das eine Enzym stabiler an die Oberfläche, nicht an die einzelnen Metalle, bindet.
Die Bindung der Histidine erfolgt über eine Komplexbildung mit zwei basischen Stickstoffen.
Befinden sich zwei dieser Gruppen an der Oberfläche des Enzyms kann es entsprechend
zu zwei Ankermolekülen binden und, falls sich eine der beiden Bindungen löst, ist immer
noch genug Zeit eine neue Bindung zu dem freien oder einem anderen freien Metall aufzubauen.
Das Enzym verbleibt an der Oberfläche und kann nur in dem unwahrscheinlicheren
Fall wegdiffundieren, dass beide Bindungen von den beiden Ankern gespalten werden. Es
stellt sich allerdings noch weiter die Frage, warum die Bedeckung und damit einhergehend
die maximale Anzahl an potentiellen Bindungsplätzen bei der gleichen Vorbehandlung unterschiedlich
sein soll.
Zur Beantwortung dieser Frage wird wieder die Fähigkeit zur Anbindung an zwei Metallzentren
bemüht. Eine Bedingung für die Langmuir – Isotherme ist, dass es keine Wechselwirkungen
zwischen die einzelnen Teilchen gibt, die sich an der Oberfläche anlagern, was in der
Realität nicht der Fall ist. Dadurch, dass eine stärkere Bindung der 4-his FNR zur Oberfläche
besteht als bei der 2-his FNR ist sie auch in der Lage repulsive Wechselwirkung besser zu
45

Ergebnisse und Diskussion
kompensieren. Zusätzlich ist die Wahrscheinlichkeit der 4-his FNR doppelt so groß mit einer
der beiden his-X 3 -his Funktionen in die Nähe eines Metallzentrums zu gelangen und damit
auch eine Bindung auszubilden. Ist die erste Bindung vorhanden steigt auch die Wahrscheinlichkeit
für einen Überlapp der anderen his-X 3 -his Funktionen mit einem Metall, da es eine
erste gerichtete Orientierung im Raum gibt. Diese beiden Vorteile erhöhen die mögliche Anzahl
an Plätzen an der Oberfläche, an die die FNR Mutante binden kann. Die Einstellung des
Gleichgewichts verschiebt sich dadurch zu längeren Zeiten. Der letzte Grund für die längere
Einstellung des Gleichgewichts liegt in der abnehmenden Anzahl an freien Plätzen. Damit
sinkt die Wahrscheinlichkeit eine Stelle zu treffen die groß genug ist den Platz für ein ganzes
Enzym zu bieten und auch weit genug von den anderen Enzymen entfernt ist, damit die repulsiven
Wechselwirkung schwächer sind als die beiden neugeformten Bindungen.
Die nächste Frage die geklärt werden muss ist, warum es bei den Messungen der 2-his
FNR zuerst zu einem Maximum der Adsorption kommt und nicht zu einem Gleichgewicht. In
einem idealen Experiment verändert sich keiner der Reaktanten, also weder das Protein, wenn
es an die Oberfläche bindet, noch die Oberfläche, wenn sich das Protein anlagert. Da sich, wie
in Gleichung ( 9 ) beschrieben, ein Gleichgewicht einstellt muss dies, wiederum in einem idealen
Experiment, auch für die Dissoziation gelten und das gemessene Signal ändert sich nicht
mehr. Bei der 2-his Mutante des FNR Enzyms ist das allerdings nicht der Fall und das Signal
fällt recht schnell nach Erreichen des Maximums ab. Dies kann nur bedeuten, dass sich etwas
verändert, was in dem idealen Experiment nicht passiert. Die Antwort zu dieser Frage liegt in
dem Mechanismus der Desorption. Die Bindung zum Enzym kann sowohl zwischen dem Anker
und der his-X 3 -his Funktion brechen, als auch zwischen dem Ankermolekül und der his-
X 3 -his Funktion, die immer noch das Metallion trägt. Somit hat sich der wieder frei gewordene
Platz verändert und steht nicht mehr für andere Enzyme zur Verfügung. Die Gesamtanzahl
an Plätzen nimmt ab, und damit auch das Signal, da sich die Bedingungen dynamisch verändern.
Durch diese Beobachtung ist eine weitere Bedingung der Langmuir – Isotherme betroffen,
die Forderung nach einer unveränderlichen Oberfläche. Diese essentielle Annahme der
Langmuir – Isotherme ist damit nicht mehr erfüllt und die Ergebnisse nicht mehr als korrekt
betrachtet werden. In Abbildung 16 sind die verschiedenen Dissoziationsprozesse schematisch
dargestellt und erläutern die Veränderung der Oberfläche.
46

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 16: Wechselwirkungen der 2 – und 4 his – FNR während der Dissoziation.
Im oberen Teil ist die Dissoziation der 4 his – FNR dargestellt, die seltener vollständig abläuft und in den meisten
Fällen durch eine zweite Bindung das Enzym an der Oberfläche hält. Im unteren Teil sind die zwei möglichen Dissoziationswege
der 2 his –FNR aufgezeigt, die auch die Veränderung der Oberfläche mit einschließen.
Im Vergleich dazu kann es bei der 4-his Variante auch passieren, dass das Metallion aus
dem Chelatliganden dissoziiert, aber durch die zweite Bindung bleibt die räumliche Nähe
zwischen den beiden Reaktanten erhalten, was die Wahrscheinlichkeit für einen erneuten
Überlapp und eine erneute Rückbindung stark favorisiert. Besonders deutlich wird dies im
Dissoziationsverhalten der beiden untersuchten Enzyme. Während bei der 4-his Mutante recht
stabile Geraden beobachtet werden, gibt es bei der 2-his Mutante eine Art aktives Dissoziationsverhalten,
damit das Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Enzym wieder eingestellt
wird.
Abschließend kann gesagt werden, dass zwar das Gleichgewicht der 4-his FNR eher auf
der Seite der Dissoziation liegt, wenn es mit demjenigen der 2-his FNR verglichen wird, doch
überwiegen die Vorteile der stabileren Bindung die der langsameren Gleichgewichtseinstel-
47

Ergebnisse und Diskussion
lung. Durch die stärkere Bindung kommt es zu einer höheren Bedeckung der Oberfläche mit
dem Enzym, die Oberfläche bleibt intakt, da kaum Metall aus den Chelatliganden entfernt
werden kann. Dieser Metallionentransfer (MIT) vom NTA zu den his – X 3 – his Funktionen
wurde auch schon in der Fachliteratur beobachtet.
Das nächste Kapitel ist eine Erweiterung der Dissoziationskonstanten, die die Abnahme
der Enzymkonzentration über die Dauer des Experiments mit einbezieht. Ein beachtlicher Teil
der Enzyme wird durch die Assoziation aus der Lösung entfernt, aber für die Bestimmung der
K D Werte wird immer mit der Anfangskonzentration gerechnet, was zu einer Verfälschung
führt, die je nach Bedeckung und Gewicht des Enzyms erheblich sein kann.
4.1.3.2.2 Einflüsse durch die Verarmung der Messlösung an Enzym
Zunächst wird für die Korrektur des K D – Wertes Gleichung ( 12 ) eingeführt. Dabei ist
die Grundlage der Berechnung die Subtraktion der assoziierten Spezies von der Anfangskonzentration.
Das Signal wird dabei in Abhängigkeit von dem Volumen, der Sensoroberfläche
und einem Faktor zur Umrechnung von m° in mol/L verrechnet.
Das Signal im Gleichgewicht (R eq in m°) ist proportional zu der Masse an gebundenem
Analyten (122 bei der vorliegenden Messeinheit Autolab Twingle) und der Oberfläche (S in
mm 2 ) des Sensors. Unter Zuhilfenahme der Masse des Analyten und des Volumens der Messzelle,
kann Gleichung ( 12 ) die Verarmung an freiem Analyten, bzw. FNR Enzym, berechnen.
G

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 3 gibt die Werte für R eq , R eq korr , K D und K D korr an. Daneben ist die Abweichung der einzelnen Werte
durch die Verarmung der Messlösung angegeben.
4-his FNR Änderung [%] 2-his FNR Änderung [%]
R eq / m° 985.2 426.4
R eq korr / m° 948.2 4 422.3 1
K D / nM 263.6 100.9
K D korr / nM 224.8 15 89.3 11
Trotz der unterschiedlichen Anlagerungen, die in Kapitel 4.1.3.2 besprochen wurden, sind
die Änderungen in der Dissoziationskonstante bei beiden Enzymen sehr ähnlich ausgefallen.
Dies spricht wiederrum für ein sehr ähnliches Assoziationsverhalten der beiden unterschiedlichen
Mutanten.
Bei einem Vergleich der realen Werte fällt auf, dass die Änderung der Dissoziationskonstante
bei den 4-his Enzym viermal größer ausfällt als bei dem 2-his Enzym, womit der
Tatsache Rechnung getragen wird, dass sich deutlich mehr Enzym anlagert und sich beide
ermittelten Konstanten einander annähern.
700
600
Winkeländerung [m°]
500
400
300
200
100
0
0 100 200 300 400 500
Konzentration [nM]
0 100 200 300 400 500
Abbildung 17: Betrachtung der Dissoziationskonstanten mit der Verarmung der Messlösung an 4 his – FNR.
Die schwarzen Kästen zeigen die eingewogene Konzentration und die roten Kreise die veränderte Konzentration
nach der Verarmung. Links sind die gemessenen und die korrigierten Messwerte zu sehen, und rechts die korrigierte
Langmuir – Isotherme.
49

Ergebnisse und Diskussion
Es ergibt sich also eine leicht reduzierte Dissoziationskonstante für die 4-his FNR von
224.8 nM. Abbildung 17 zeigt die Unterschiede der Messungen und die Langmuir – Isotherme
für das System Was schon für die 4-his FNR gilt, ist ebenso für die 2-his FNR gültig. Die
Dissoziationskonstante verringert sich leicht von 100.9 nM auf 89.3 nM. Die Abnahme verläuft
geringer, was sich, neben der Berechnung auch, schon an der Auftragung der korrigierten
Konzentrationen zusammen mit den gemessenen Konzentrationen zeigt. Die Punkte sind
weniger stark zu kleineren Werten verschoben, was für eine kleinere Abnahme spricht. Die
entsprechenden Auftragungen und die Langmuir – Isotherme sind in Abbildung 18 gezeigt.
400
350
Winkeländerung [m°]
300
250
200
150
100
50
0
0 200 400 600 800 1000
Konzentration [nM]
0 200 400 600 800 1000
Abbildung 18: Betrachtung der Dissoziationskonstanten mit der Verarmung der Messlösung.
Die schwarzen Kästen zeigen die eingewogene Konzentration und die roten Kreise die veränderte Konzentration
nach der Verarmung. Links sind die gemessenen und die korrigierten Messwerte zu sehen, und rechts die korrigierte
Langmuir – Isotherme.
Zum Abschluss dieses Kapitels kann gesagt werden, dass die Thermodynamik der Bindung
an die Ankermoleküle mittels SPR – Spektroskopie erfolgreich ermittelt werden konnte
und sich herausgestellt hat, dass das neue genetisch modifizierte Enzym deutlich stabiler an
der Oberfläche bleibt als die wild typischen, bzw. diejenige, welche lediglich die Hälfte an
Histidingruppen in ihrer Peripherie tragen. Damit konnte gezeigt werden, das, analog zu dem
50

Ergebnisse und Diskussion
Chelateffekt in der metallorganischen Chemie, ein erweiterter Bindungseffekt vorliegt, der
auch quantifiziert werden kann, indem die verschiedenen Bindungstypen verglichen werden.
Nachdem gezeigt wurde, dass die Dissoziationskonstante für die modifizierten Enzyme
unterschiedlich ist, wird im nächsten Abschnitt die Langzeitstabilität näher betrachtet. Es wird
dabei unterschieden, wie lange die eigentliche Assoziationsphase dauert, so dass beide Enzyme
die Möglichkeit haben auf dem Zenit ihrer Assoziation in die Dissoziationsphase überzugehen.
zusätzlich wird bei dem 4-his Enzym die erste elektrochemische Untersuchung in
Form einer chronoamperometrischen Messung beschrieben, damit neben der Anbindung auch
die Aktivität in Gegenwart von Substrat gemessen werden kann.
4.1.3.2.3 Einfluss der Immobilisierungsdauer des Enzyms und Langzeitstabilität
auf der Oberfläche
Die Vorbereitung der Sensoroberfläche wurde etwas modifiziert, indem die Lösung mit
dem Ankermolekül nicht mehr mit Ethanol sondern mit Methanol angesetzt wurde, was anscheinend
zu einer weniger guten Vernetzung der Ankermoleküle untereinander führt. Grund
für die Änderung war die weniger starke Löslichkeit der Liponsäurederivate, was die langsame
Polymerisierung der einzelnen Moleküle weiter unterbinden sollte. Es scheint so zu sein,
dass die Moleküle besser solvatisiert sind und dadurch eine geringere Wahrscheinlichkeit besteht
durch diesen Solvenskäfig mit einem anderen Molekül zu reagieren. Auf der anderen
Seite schient die Affinität zu der Goldoberfläche groß genug zu sein, so dass sich deutlich
mehr Bindungen ausbilden. Die Ergebnisse zu den verbesserten Anbindungen der Enzyme
sind in Abbildung 19 zu sehen.
Die erreichten Bedeckungen sind mehr als das doppelte der bisher ermittelten Werte, was
zu einer generellen Änderung in der Vorschrift zur Modifizierung von Sensoroberflächen
führte. Zusätzlich zeigt Abbildung 19 auch die erste Langzeitmessung der beiden Enzyme mit
je drei Stunden Assoziations- und Dissoziationsphase. Für die 4-his FNR ist dabei ein Maximum
nach 33.6 Minuten mit einer Winkeländerung von 1304 m° erreicht. Die 2-his FNR erreicht,
wie bereits diskutiert, ihr Maximum nach 13.3 Minuten mit 1627.3 m°. Allerdings ist
bereits vierzig Minuten später der Vorsprung von der stärkeren Bindung der 4-his FNR kompensiert.
Das Signal der 2-his FNR fällt rapide durch die Verarmung an möglichen Bindungsstellen
an der Oberfläche. Das Enzym verringert die Anzahl der Metallionen. Dieser Effekt
verstärkt sich durch den Austausch der Lösung vor der Oberfläche, da die Konzentration auf
null gesetzt wird und sich ein neues Gleichgewicht einstellt. Die Bedeckung fällt auf 170 m°,
was ungefähr 10 % der maximalen Bedeckung entspricht.
51

Ergebnisse und Diskussion
1600
Winkeländerung [m°]
1200
800
400
0
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [h]
Abbildung 19: Anbindung der 2- und 4 his – FNR an eine Nickel – NTA Oberfläche.
Die Messungen zeigen, wie sich die Enzyme (schwarze Linie 2 his und rote Linie 4 his – FNR) an der Sensoroberfläche
anlagern und danach wieder dissoziieren, wobei die 4-his FNR eine deutlich höhere Stabilität aufweist als die 2-
his FNR. Gemessen wurde in 0.1 M PB, pH 7.5, einer 35 µL Messzelle, Oberfläche 6 mm 2 und 500 nM Enzym.
Bei der 4-his FNR sieht es anders aus; das Maximum ist später und geringer ausgeprägt
als bei der 2-his FNR, dafür fällt auch in der Assoziationsphase das Signal nicht annähernd so
stark, noch bricht es bei dem Wechsel zu der Dissoziationsphase ein. Es erfolgt sogar eine
leichte Stabilisierung auf, da die Steigung, wird in der letzten halben Stunde der Assoziationsphase
eine Tangente extrapoliert und mit der Dissoziationsphase, die näherungsweise als
Gerade interpretiert werden kann, verglichen, einen leicht positiveren Wert aufweist.
Tabelle 4 gibt die Werte der Steigung am Ende der Assoziation und Dissoziation der Messung an. Dabei wurden
die Messwerte in der letzten Stunde näherungsweise als linear interpretiert die Steigung bestimmt.
Steigung/ m°/h 4-his FNR 2-his FNR
Assoziation -53.80 -101.18
Dissoziation -23.50 -44.12
Beide Systeme hatten in dieser Betrachtung genug Zeit sich auf der Oberfläche richtig zu
orientieren, bzw. sich anzuordnen. Es stellt sich die Frage ob es bei den Enzymen eine Art der
Optimierung auf der Oberfläche gibt, die dazu führt, dass sich ein Assoziationsoptimum
ergibt. Die Anlagerung nach drei Stunden, wird dabei als das erste Extrem mit ausreichend
52

Ergebnisse und Diskussion
Zeit angesehen. Wird die Assoziation soweit verkürzt, dass die Mutanten nicht die Zeit haben
im Gleichgewicht ihr Optimum zu finden wenn die Dissoziation eingeleitet wird, sollte das
weitere Informationen über die Vorgänge an der Oberfläche liefern sowie ein besseres Verständnis
der möglichen Mechanismen.
1600
1400
Winkeländerung [m°]
1200
1000
800
600
400
200
0
-200
0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [h]
Abbildung 20: Messungen ohne ein vollständig eingestelltes Gleichgewicht.
Da die 2 his – FNR (schwarze Linie) ihr Gleichgewicht schneller einstellt als die 4 his – FNR (rote Linie) wurde
die Assoziationsphase schneller abgebrochen. Die Messungen wurden in 0.1 M PB, pH 7.5, 500 nM FNR durchgeführt.
In Abbildung 20 kann der Unterschied der Anbindung bei dem anderen Extrem gesehen
werden. Es ist nicht genug Zeit vergangen, dass sich ein Gleichgewicht zwischen Adsorption
und Desorption einstellen konnte. Es kann demzufolge auch davon ausgegangen werden, dass
sich die Enzyme noch nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander angeordnet haben. Der
wichtigste Unterschied zu dem andern Extrem ist das die 2-his Mutante noch nicht genug Zeit
hatte die für die Bindung notwendigen Metalle aus den NTA – Funktionen zu lösen. Von daher
ist von einer intakten Oberfläche auszugehen.
53

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 5: Steigung der Dissoziationsphase. Bei der 4-his FNR konnte zu Beginn und am Ende der Messung näherungsweise
Linearität der Messwerte angenommen und die Steigung bestimmt werden. Bei der 2-his FNR was das
nur am Ende möglich.
Steigung der 4-his FNR 2-his FNR
Dissoziation
Anfang -67.57 ---
Ende -28.16 -29.59
Anhand der Tabelle 5 kann ein Vergleich zu den vorhergehenden Messungen gezogen
werden. Die 4-his FNR zeigt etwas schlechtere Werte. Im Gegensatz dazu weißt die 2-his
FNR stabilere Werte nach sechs Stunden auf als in dem Experiment mit drei Stunden Assoziationsphase.
Der gemessene Wert für die Winkeländerung ist hier 155 m°, was etwa gleich
ist mit dem Wert weiter oben. Die Steigung ist allerdings deutlich niedriger als oben, was auf
eine stabilere Bindung schließen lässt. Im Vergleich kann festgehalten werden, dass die erste
Variante für die 4-his FNR bessere Werte aufweist, was auf eine optimale Reorganisierung
der Enzyme auf der Oberfläche während der Assoziation schließen lässt. Im Gegensatz dazu
führt die Reorganisierung bei der 2-his FNR zu einer Reduzierung der Bindungseigenschaften
der Oberfläche. Der Steigung zufolge, die im ersten Experiment etwa das Doppelte der 4-his
aufweist, liegt sie im zweiten Experiment nahezu gleichauf mit der Steigung der 4-his FNR.
Daraus kann geschlussfolgert werden, dass sich für die 4-his FNR eine lange Assoziationsphase
zur Reorganisation der Enzyme besser eignet, als eine kurze. Die Enzyme sind so in
der Lage über Hin- und Rückbindungen einen optimalen Abstand zueinander zu erreichen,
was in einer optimalen Oberflächenkonzentration resultiert. Die 2-his FNR sollte lediglich
kurz assoziiert werden, da andernfalls zu viele Bindungsstellen wegfallen. Zwar können damit
nicht die gleichen hohen Bedeckungen erreicht werden wie mit der 4-his FNR, aber der Film
ist stabiler als bei langen Assoziationszeiten.
Als nächstes werden elektrochemische Untersuchungen zur Anbindung und Dissoziation
des Enzyms an die Oberfläche untersucht. Dabei wird zwischen einer Kurzen und einer langen
Zeitskala unterschieden.
4.1.3.3 Elektrochemische Untersuchungen
Bislang wurde hinreichend mit spektroskopischen Methoden gezeigt, dass sich bei Zugabe
einer Enzymlösung ein Film vor der Sensoroberfläche anlagert, der bei der 4-his FNR stabiler
ist als bei dem wt und der 2-his FNR. Im letzten Teil des Kapitels werden wir uns der Frage
widmen ob der angelagerte Film auch eine katalytische Aktivität aufweist. Für die entspre-
54

Ergebnisse und Diskussion
chenden Experimente wird die 4-his FNR wie oben besprochen an eine gereinigte und modifizierte
Goldelektrode gebunden. Im nächsten Schritt wird die beladene Elektrode in eine
elektrochemische Zelle eingebracht und das Signal in Abhängigkeit des Substrats gemessen.
Die wirkenden Mechanismen sind wieder die gleichen, die auch weiter oben in Kapitel 4.1.2
schon bemüht wurden. Wie bereits angekündigt werden als erstes die Langzeitmessungen
präsentiert, damit das vorherige Kapitel abgeschlossen werden kann. Dabei wurden zwei Unterschiedliche
Fälle betrachtet. Zum einen die Aktivität des Enzyms wenn es arbeitet. Dabei
wird von der Chronoamperometrie Gebrauch gemacht, die eine konstante Spannung über einen
gewünschten Zeitraum zwischen zwei Elektroden anlegt. Zum anderen werden in eintägigen
Abständen ZV’s gemessen, um die Haltbarkeit der Enzymschicht vor der Elektrode zu
testen.
4.1.3.3.1 Langzeitmessungen des Enzyms an Oberflächen
Analog zu den bereits gemessenen Sensorgrammen wird der gemessene Strom gegen die
Zeit aufgetragen. Das Experiment findet in einem Milliliter 0.1 M PB, pH 7.5, mit 50 µM
Ferrocenmethanol und 2 mM NADPH unter Schutzgasatmosphäre statt. Die Lösung wird
kontinuierlich gerührt, weshalb das Signal etwas rauscht.
In Abbildung 21 ist die entsprechende Messung zu sehen. Der Strom sinkt in den ersten
Minuten stärker ab, aber verläuft dann mit einer leichten negativen Steigung über den gesamten
Zeitraum stabil. Somit kann anhand dieser Messungen eine gute Übereinkunft zu den SPR
– Messugen gezogen werden, die sehr ähnlich verlaufen. Werden die chronoamperometrischen
und SPR spektroskopischen Messungen normiert und überlagert, erkennt man, dass das
aktive Signal nicht viel schneller fällt als das statische Signal. Somit kann auch aus den elektrochemischen
Messungen eine Aussage über die Stabilität des Enzyms auf der Oberfläche
getroffen werden. Diese Antwort ist insofern noch interessanter, da das gemessene Signal
auch zeigt, dass das Enzym stabil ist und die bioelektrokatalytische Reaktion erfolgreich betreiben
kann. Zudem ist es genau vor der Sensoroberfläche lokalisiert, was für den Mediator
einen besonders kurzen Weg zwischen dem aktiven Zentrum und der Elektrode bedeutet.
55

Ergebnisse und Diskussion
1,2
1,0
i [normiert]
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
3 4 5 6
t [h]
Abbildung 21: Elektrochemische Langzeitmessung der Enzymmatrix auf der Elektrodenoberfläche.
Zwei Chronoamperometriemessungen über drei Stunden. Die Messungen wurden in 2 mM NADPH unter Rühren
in entgasten 0.1 M PB, pH 7.5, 50 µM Ferrocenmethanol unter Argonatmosphäre durchgeführt.
Daneben scheint das Enzym auch über einen längeren Zeitraum und unter dem Einfluss
einer starken laminaren Strömung stabil auf der Oberfläche zu verbleiben, was im Hinblick
auf die neuartige Bindung besonders hervorgehoben werden sollte. Im Gegensatz zu anderen
Immobilisierungsmethoden, wie dem Einschluss in einer Polymer- oder Dendrimermatrix
oder der direkten Reaktion des Enzyms mit der modifizierten Elektrodenoberfläche, sind hier
lediglich zwei Übergangsmetallkomplexe an der Bindungsbildung beteiligt.
4.1.3.3.2 Langzeitstabilität über Tage
Nachdem gezeigt wurde, dass das Enzym unter einer laminaren Strömung stabil arbeitet
und gute Signale liefert, wird auch untersucht wie lange eine solche Elektrode haltbar ist. Der
Aufbau der Messvorrichtung ist analog zu den chronoamperometrischen Messungen. Die
Konzentration an Substrat wird auf 1 mM reduziert. Die Elektroden werden in 0.1 M PB, pH
7.5, bei vier °C gelagert und jeden Tag vermessen. Es wurde an vier aufeinanderfolgenden
Tagen gemessen.
Anhand von Abbildung 22 wird ersichtlich, dass der Enzymfilm am ersten Tag eine sehr
hohe Aktivität zeigt und an den folgenden Tagen auf ca. ein µA abfällt. Dieser Wert ist allerdings
stabil und wurde in früheren Experimenten auch teilweise am ersten Tag erreicht. Der
56

Ergebnisse und Diskussion
allgemeine Trend ist allerdings deutlich zu erkennen. Die Stabilität des Enzyms wird durch
die Immobilisierung auf der Elektrodenoberfläche nur wenig beeinflusst. Auch die Lagerung
bei vier Grad Celsius in 0.1 M PB, pH 7.5, scheint dem Enzym wenig auszumachen. Die Daten
erstrecken sich allerdings nur über wenige Tage und sollten in weiteren Experimenten
untersucht und weiter untermauert werden.
2
i [µA]
1
0
1 2 3 4
Tag
Abbildung 22: Langzeitstabilität der Enzymmatrix auf der Elektrodenoberfläche.
Stabilität der Enzyme über einen Zeitraum von vier Tagen. Die Messungen wurden in 1 mM NADPH in entgasten
0.1 M PB, pH 7.5, 50 µM Ferrocenmethanol unter Argonatmosphäre durchgeführt. Die Lagerung erfolgt bei 4° C in
0.1 M PB, pH 7.5, unter Argonatmosphäre.
4.1.3.3.3 Aktivität des Enzyms an einer Oberfläche
Nachdem die Aktivität der veränderten FNR bereits untersucht wurde, wird jetzt die Aktivität
des Enzyms gebunden an der Oberfläche untersucht. Dafür werden analog zu der Theorie
weiter oben in diesem Kapitel die Gleichungen ( 4 ), ( 5 ) und ( 6 ) verwendet. Zusätzlich
ist die Reaktionsrate υ zur Definition des Gesamtsystems eine wichtige Größe. υ ist folgendermaßen
definiert:
V = W MA$ ∗ X YZI[\
? + X YZI[\
( 13 )
57

Ergebnisse und Diskussion
Mit v max als größte Umsatzrate für das gegebene System, C NADPH der Konzentration an
NADPH und K M als Michaelis – Menden Konstante.
Wie oben bereits diskutiert geben K M und k 2 Aufschluss über die Reaktionskinetik des
Enzyms und der Umwandlung des Substrats zum Produkt. Daher sind sie von der Konzentration
des Substrats abhängig, weshalb es als Variable in den Experimenten geführt wird. Die
Konzentration des Mediators ist im Überschuss angesiedelt, da dieser auf keinen Fall der limitierende
Faktor sein darf. Bei k 3 ist es andersrum und es werden Informationen über die Reaktion
zwischen dem Mediator und dem Enzym ermittelt. Daher darf das Substrat nicht der limitierende
Faktor sein und der Mediator wird die variable Größe in dem System.
Zur Bestimmung dieser Größen werden die gemessenen Ströme gegen die jeweilige Konzentration
der Variablen aufgetragen, bzw. die jeweils reziproken Werte. Daraus resultieren
Michaelis – Menden und Linweaver – Burk Diagramme aus denen die nötigen Größen abgelesen
werden können, bzw. relevante Werte in entsprechende Gleichungen eingesetzt werden,
die daraufhin die entsprechenden Werte liefern für die weitere Datenverarbeitung.
Zur Bestimmung von k 2 wird folgende Formel verwendet:
]^A_ = 2 ∗ ∗ 6 ∗ Γ a ( 14 )
Γ E ist die Bedeckung der Elektrodenoberfläche mit dem Enzym und wurde mit
19.3 ± 7pmol/mm 2 ermittelt 6 .
In Abbildung 23 links sind die Originalmessungen. Zum einen ist vor der Zugabe von
NADPH nur der Grundstrom zu sehen. Bei Zugabe des Substrates entsteht dann ein katalytischer
Strom, der mit steigender Substratkonzentration immer höher wird. Daraus wird ersichtlich,
dass es sich um eine gerichtete enzymatisch katalysierte Reaktion handelt und die Anbindung
des Enzyms erfolgreich war. Im nächsten Schritt wird die blanke Messung als Hintergrund
angenommen und von den anderen Messungen subtrahiert. Damit ist das Signal des
Mediators also konstant gesetzt und alles was darüber hinaus geht muss von der Zugabe des
Substrats kommen, da dies die einzige Änderung an dem System ist. Dargestellt sind die Ergebnisse
der Rechenoperation in Abbildung 23 rechts und auch hier ist ein Zuwachs des Signals
festzustellen. Aus den absoluten Strömen, I cat , lässt sich dann klassisch eine Auftragung
des gemessenen Signals in Abhängigkeit der variierenden Substratkonzentration darstellen.
Aus dieser Auftragung lassen sich K M und v max ermitteln. Da erfahrungsgemäß die direkte
6 Vgl. Arbeit von Mie und Corinna
58

Ergebnisse und Diskussion
Auftragung der Werte nicht immer gut auszuwerten und leichter anfällig für Fehler ist, ist es
gebräuchlich die reziproken Werte zu verwenden, um damit die Auftragung zu linearisieren.
5
4
4
3
i [µA]
3
i [µA]
2
2
1
1
0
0
-0,2 0,0 0,2 0,4
E [V vs. Ag/AgCl]
-0,2 0,0 0,2 0,4
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 23: (links) die Original Messungen des oberflächengebundenen Enzyms mit steigenden Konzentrationen
an NADPH. (rechts) Zeigt die Messungen nach Abzug des Hintergrundes des oberflächengebundenen Enzyms
mit steigenden Konzentrationen an NADPH. Die Messungen wurden in 500 µM Ferrocenmethanol unter Argon,
Spannungsvorschubsgeschwindigkeit 5 mVs -1 , -0.1 V bis 0.32 V, ½ Zyklus. NADPH Konzentrationen von 0 µM,
0.1 µM, 0.25 µM, 0.5 µM, 0.75 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM und 5 µM.
Beide Auftragungen, nach Michaelis und Lineweaver – Burk, sind in den darauffolgenden
Abbildungen zu finden und ähneln denen der anderen Experimente. Anhand der mathematischen
Modelle lässt sich eine gute Korrelation mit den Messwerten sehen, was für eine gute
Durchführung der Experimente spricht. Als Mittelwert für die Messungen ergeben sich für
den maximalen Strom 7.30 ± 2.28 µA nach Michaelis und 9.51 ± 4.64 µA nach Linweaver
Burk. Beide Werte sind etwa im gleichen Rahmen und liegen nah genug beieinander, um sich
gegenseitig zu stützen.
4,5
4,0
3,5
4
i p
[µA]
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1/i p
[1/µA]
2
0
0 1000 2000 3000 4000 5000
c NADPH
[µM]
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
1/c NADPH
[1/µM]
Abbildung 24: (links) direkte Auftragung nach Michaelis, (rechts) doppelt reziproke Auftragung nach Lineweaver
Burk.
Innerhalb der gesamten Messreihe ergeben sich für k 2 nach Gleichung 12 241 ± 75 s -1 und
für K M 3.16 ± 0.8 mM. Im Vergleich zu den weiter oben ermittelten Werten für das freidiffundierende
Enzym liegen diese etwas niedriger. Eine Erklärung für dieses Verhalten kann in
59

Ergebnisse und Diskussion
dem Zugang der einzelnen Teile zu dem aktiven Zentrum des Enzyms liegen. So ist die prosthetische
zu der Elektrode hingewandt, was für die Teilgleichung, die k 2 bestimmt, von Nachteil
ist. Deshalb steigt die Konzentration des Produktes lokal stark an, was zu einer Verschiebung
des Gleichgewichts führt. Somit muss nach dem Massenwirkungsgesetz die Kinetik
kleiner werden als bei einem freidiffundierendem Enzym, ohne räumliche Begrenzung.
Für k 3 verfährt man ebenso wie für k 2 und trägt die Variable, hier der Mediator, gegen den
gemessenen Strom auf. Zur Bestimmung von k 3 wird die folgende Gleichung 13 verwendet
und aus der Steigung extrahiert.
−]^A_ = −!^A_
= 2 ∗ ∗ Γ a
1
@ 6
+ 1 @ 6 b ?
( 15 )
c M ist die Konzentration des Mediators, die hier im Laufe des Experiments erhöht wird. In
den folgenden Abbildungen ist exemplarisch eine Messung zu sehen. Dabei sind links die
Originaldaten aufgetragen und rechts die Grundstromkorrigierten. Es wurde in einer 5 mM
Lösung von NADPH, 0.1 M PB, pH 7.5, gemessen. Somit konnte sichergestellt werden, dass
zu jeder Zeit genug Substrat in der Lösung vorhanden war und lediglich der Mediator den
Elektronenfluss limitiert hat.
1,6
1,4
1,2
1,0
1,6
1,4
1,2
1,0
i [µA]
0,8
0,6
i [µA]
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
-0,2
-0,2 0,0 0,2 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,2
-0,2 0,0 0,2 0,4
E vs. Ag/AgCl [V]
Abbildung 25 (links) Messreihe mit Ferrocenmethanol in verschiedenen Konzentrationen und nur in Puffer.
(rechts) Stromantwort nachdem der Grundstrom abgezogen wurde und das Ferrocenmethanol der limitierende Faktor
für den Elektronenübertrag ist. Gemessen wurde in 0.1 M PB, pH 7.5, 5 mM NADPH und 5 mV/s von -0.1 V bis
0.35 V vs Ag/AgCl. Konzentrationen an Ferrocenmethanol 1 µM, 2.5 µM, 5 µM, 7.5 µM, 10 µM, 15 µM und
25 µM.
In den Originaldaten kann man wieder sehen, dass sich nur etwas ereignet, wenn alle
Komponenten zusammen sind. Bei der Messung in reinem Puffer mit der modifizierten Elektrode
wird kein Strom detektiert. Auch nach der Zugabe des Substrats gibt es noch keinen
Strom, was einen direkten Elektronentransfer ausschließt. Erst bei Zugabe des Mediators kann
60

Ergebnisse und Diskussion
eine chemische Reaktion beobachtet werden, die dann auch noch von der Konzentration des
Mediators abhängig ist.
In Abbildung 26 kann die Auftragung des katalytischen Stroms gegen die Mediatorkonzentration
abgelesen werden. Es zeigt sich ein nahezu linearer Anstieg. Aber erst bei einer
doppelt reziproken Auftragung ergibt sich eine Gerade mit der k3 Bestimmt werden kann. Für
die Messreihe ergibt sich ein Wert von 4.42 ± 0.1*10 6 M -1 s -1 .
i cat
[µA]
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
1/j cat
[cm²/µA]
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,0
0 5 10 15 20 25
c FcMeOH
[µM]
0,00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
1/c FcMeOH
[1/µM]
Abbildung 26 zeigt auf der linken Seite die Plateauströme der katalysierten Reaktion gegen die Konzentration
des Mediators und auf der rechten Seite die zweifach reziproke Linearisierung der Messwerte zur Extraktion des k 3
Wertes nach Gleichung 13.
Dieser Wert ist auch in der gleichen Größenordnung, wie die weiter oben bestimmten
Werte für k 3 . Allerdings ist er auch größer als die anderen k 3 Werte, wofür es einen Grund
geben muss. Vergleicht man die unterschiedlichen Experimente, fällt auf, dass die Entfernung,
die der Mediator zurücklegen muss, bei den oben beschriebenen Experimenten deutlich
größer ist. Auch unter der Berücksichtigung einer Wanderung der Elektronen von einem Mediator
zu einem anderen, der näher an der Elektrodenoberfläche ist und somit die Distanz verkürzt,
vergeht immer noch mehr Zeit, was durch den niedrigeren k 3 Wert zum Ausdruck
kommt. Es verhält sich aller Wahrscheinlichkeit so, dass das aktive Zentrum stark in Richtung
der Elektrodenoberfläche orientiert sein muss, damit der Abstand, im Vergleich zu den Experimenten
mit den freidiffundierenden Enzymen, signifikant kleiner wird. Somit kann auch
behauptet werden, dass ein Teil der Mediatoren, analog zu einem aufgeladenem Tischtennisball
zwischen zwei unterschiedlich geladenen Kondensatorplatten, hin und her diffundiert und
die Elektronen auf dem kürzesten Weg befördert und dabei zum Teil von Coulombkräften
weiter beschleunigt wird.
61

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 6: Vergleich der Kinetikkonstanten der 4 his – FNR im gebundenen Zustand und in Lösung.
4-his K M / µM k 2 / s -1 k 3 /(M*s) -1 k red
in Lösung
340 ± 40 195.65 ± 19.86 3.07E+06 ± 2.11E+05 580.44
auf der Elektrode gebunden
3160 ± 800 241 ± 75 4,42E+06 ± 0.1
Oberflächenbedeckung/ pmol*cm -2 = Γ FNR = 19.3 ± 7
4.1.3.4 Switch sense
Als letzten Teil der Arbeiten mit dem Enzym werden die Experimente mit Switch sense
vorgestellt, die in Kooperation mit Uli Rant von der TU München durchgeführt wurden. Alle
Abbildungen und Ergebnisse in diesem Abschnitt wurden von der AG Rant erstellt und hier
zur Verfügung gestellt.
Switch sense ist eine sehr junge Technologie mit der verschiedene kinetische Informationen
aus einem einzigen Experiment gezogen werden können. Aus diesem Grund werden die
Grundzüge hier kurz umrissen. In Abbildung 27 ist das Grundprinzip von Switch sense zu
sehen.
Abbildung 27: Grundprinzip von Switch sense; ohne Analyt
Im unteren Teil ist eine oszillierende Rechteckspannung zu sehen, die gegen die Zeit aufgetragen
ist. Durch diese Spannung wird eine Elektrode polarisiert, die einen DNS – Strang
anziehen oder abstoßen kann. An diesem DNS Strang sitzt ein Fluoreszenzmarker, der ein
Signal emittiert, je weiter er von der Elektrodenoberfläche entfernt ist, da diese mit einem
Quencher modifiziert ist. Im normalen Zustand geht diese auf – und ab Bewegung sehr
schnell, da an der DNS keine größeren Moleküle sind, die die Bewegung verhindern können.
62

Ergebnisse und Diskussion
Also folgt das Fluoreszenzsignal mit einer kleinen Hysterese der vorgegebenen Oszillation
des Stroms.
Abbildung 28: Grundprinzip von Switch sense; mit Analyt
Mit der Abbildung 28 wird der Unterschied zwischen dem Grundzustand, ohne gebundenen
Analyten, und dem Zustand mit gebundenem Analyten deutlich. Auf der linken Seite
(schwarze Linie) ist die zeitlich aufgelöste Aufwärtsbewegung zusehen, die durch eine Zunahme
des Fluoreszenzsignals beschrieben wird. Die Fläche unter der Kurve kann durch Integration
bestimmt werden und wird als „dynamic response“ bezeichnet. Ist ein Analyt an den
DNS – Strang gebunden, erhöht sich die Masse um ein Vielfaches, was, unter Berücksichtigung
der Massenträgheit, zu einer Verlangsamung der Aufwärtsbewegung führt. Somit ändert
sich die detektierte Kurve und auch die Fläche unter Jener (rote Kurve in Abbildung 28). Eine
idealisierte Messung ist in Abbildung 29 zusehen.
Abbildung 29: theoretische Messung mit Switch sense
Aufgetragen ist hier die Fläche unter dem gemessenen Signal, als „dynamic response“ gegen
die Zeit. Vor der Assoziationsphase ist der DNS – Strang am schnellsten, da keine anderen
Stoffe gebunden sind. Während der Assoziationsphase kommt es zu einer Bindung mit
dem Analyten und dadurch auch zu einer Verlangsamung der oszillierenden Bewegung des
63

Ergebnisse und Diskussion
DNS – Strangs, was sich in der Absenkung des Signals bemerkbar macht. In der Dissoziationsphase
wird die Lösung vor der Sensoroberfläche gegen Puffer ausgetauscht und die Konzentration
des Analyten auf null gesetzt. Dadurch stellt sich das Gleichgewicht zwischen adsorbierten
und desorbierten Stoffen neu ein und ein Teil (in dem theoretischen Beispiel alles)
des Analyten geht wieder in Lösung. Aus der Form der Kurven lässt sich mit mathematischen
Methoden, analog zu den oben beschriebenen Teilen in der SPR Spektroskopie, die Adsorptions-
und Desorptionskonstante (k on und k off ) bestimmen und aus dieser dann die Dissoziationskonstante
(K D ).
Im konkreten Fall der 2 – und 4 – his FNR sind die Messungen in der folgenden Abbildung
30 zu sehen.
Abbildung 30: links zeigt die Messungen der 4 – his FNR; rechts zeigt die Messungen der 2 – his FNR. Alle Messungen
wurden in 0.5 M PB, pH 7.5, durchgeführt.
Wie auch schon vorher in den SPR Messungen beobachtet benötigt die 4 – his FNR etwas
länger zur Ausbildung der Bindung (τ 4-his > τ 2-his). Aber auch in der sonstigen Betrachtung
der Messungen sieht man hier die bisherigen Ergebnisse bestätigt. Beide Enzyme binden gut
an der verwendeten Oberfläche, die etwas anders aufgebaut ist als diejenige, welche in den
vorhergehenden Experimenten verwendet wurde. Die entsprechenden Übergangsmetalle sind
an einen tris-NTA Linker gebunden. Anhand der großen Anzahl an NTA Funktionen und der
somit höheren Konzentration an Übergangsmetallionen, die für eine Bindung des Enzyms
bereit stehen ist zu erwarten, dass das Enzym eine höhere Affinität zu dieser Oberfläche aufweisen
wird und der K D – Wert kleiner ausfällt als bei den SPR Experimenten.
Interessant wird es jetzt bei dem Dissoziationsverhalten der Enzyme, welches in Abbildung
31 vergleichend dargestellt ist.
64

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 31: links zeigt die Messungen der 4 – his FNR; rechts zeigt die Messungen der 2 – his FNR. Alle Messungen
wurden in 0.5 M PB, pH 7.5, durchgeführt.
Wird zuerst die Form betrachtet, so fällt direkt auf, dass es keine vollständige
Dissoziation der Enzyme gibt. Beide Kurven konvergieren gegen einen Grenzwert, der auf
der "dynamic response" – Skala ungefähr bei 65 liegt. Als nächstes erkennt man, wie auch
schon vorher zu sehen war, dass das Desorptionsverhalten der 2 – his FNR deutlich schneller
ist und sich eine Stufe ausbildet (kink). Nachdem fast alles Material desorbiert ist, steigt der
Wert nur noch langsam an. Zur mathematischen Beschreibung wird auf eine doppelt
exponentielle Form zurückgegriffen. Ein Grund dafür könnte das Vorliegen zweier
unabhängiger Prozesse an der Oberfläche sein, wie dem Desorbieren des Enzyms und dem
Herauslösen des Metalls von dem tris-NTA Linker. Die genaue Zuordnung dieser Prozesse ist
anahnd dieses Experiments nicht möglich, weshalb auch keine weiteren spekulationen dazu
unternommen werden. Die τ off Werte sind zum einen τ off 1 = 59 s ± 7 s und τ off 2 = 632 s ± 48 s.
Verglichen mit dem τ off des 4-his Enzyms mit 4672 s ±26 s, sieht man eine deutlich höhere
Affinität des 4-his Enzyms. Zur Unterstützung werden zum Schluss noch die K D – Werte der
beiden FNR miteinander verglichen. Im 4 his Fall erhält man einen Wert von 0.35 nM, was
um ein vielfaches niedriger ist als im anderen Fall mit 14.42 nM.
Somit ist auch durch dieses Experiment abgesichert, dass das 4-his Enzym deutlich stärker
an Ni 2+ - modifizierte Oberflächen bindet als das 2-his Enzym.
65

Ergebnisse und Diskussion
4.2 Synthese und Charakterisierung einer leitfähigen Zwischenschicht
(Dendrimermatrix)
Im Zuge der Arbeit ist es notwendig Enzyme im Allgemeinen und das FNR – Enzym im
Besonderen an Oberflächen zu binden. Die Bindung muss spezifisch und gerichtet sein, damit
ein effektiver Elektronentransfer zwischen dem Redoxrelais und dem Enzym gewährleistet
werden kann. Zusätzlich soll auf einen diffusiblen Redoxmediator verzichtet werden, der bei
Messungen immer hinzugegeben werden muss. Diffusible Redoxmediatoren sind zur Untersuchung
von Kinetiken nützliche Werkzeuge, aber zur Optimierung von Sensorsystemen gehören
sie zu den ersten Variablen, die ersetzt, bzw. deren Eigenschaften von intelligenten
Oberflächen ausgefüllt werden müssen [75] .
Damit muss die organische Matrix, in der das FNR – Enzym immobilisiert wird, folgende
Eigenschaften aufweisen:
- Bindungsbildung zu einer Sensoroberfläche
- Selektive und stabile Bindung des FNR – Enzyms
- Elektronentransfer von dem reaktiven Zentrum zum Detektor
- Stabilisierung des FNR – Enzyms im aktiven Zustand
In der Chemie gibt es neben der Modifizierung von Goldoberflächen ein breites Spektrum
von Analysenmethode, die spezifisch an solchen Oberflächen zum Einsatz kommen. Für die
vorliegende Arbeit haben sich vor allem elektrochemische und SPR-spektroskopische Verfahren
geeignet. Zur Immobilisierung der Moleküle wird auf die Thiol – Gold – Bindung zurückgegriffen.
Weiterhin wird resultierend aus Ergebnissen der vorangegangenen Arbeiten,
wieder mit den Chelatliganden gearbeitet. Ein geeigneter Redoxmediator ist Viologen, das in
anderen Arbeiten u.a. zur Reduktion von Sauerstoff verwendet wurde. Es ist mit einem Redoxpotential
von E= -0.446 mV vs NHE (für Methylviologen) ein stabiler Einelektronenmediator
und kann über organische Modifikationen an Oberflächen oder andere Moleküle gebunden
werden. Wird das Viologen modifiziert, ändert sich das Formalpotential des Elektronenübergangs.
Dadurch ist es möglich ein großes elektrochemisches Fenster mit dieser Verbindung
abzudecken, solange die richtigen Modifikationen vorgenommen werden.
Um diese drei unterschiedlichen Eigenschaften in einem Molekül zu vereinen, kommt
man nicht umhin, Makromoleküle zu verwenden, die eine große Anzahl von Seitenketten tragen
und unterschiedlich modifiziert werden können. Für die Auswahl der Makromoleküle
kommen prinzipiell zwei verschiedene Typen infrage:
66

Ergebnisse und Diskussion
- Polymere
- Dendrimere
Polymere sind in der Regel ungeordnete lange Ketten von verschiedenen Monomeren, die
oft nur mit Hilfe eines Katalysators reagieren. Zudem benötigt man gute Synthesestrategien
zur Herstellung geeigneter Polymere, was viel Zeit in Anspruch nimmt.
Eine Alternative zu klassischen Polymeren sind die seit 30 Jahren bekannten Dendrimere.
Diese Klasse von Makromolekülen zeichnet sich dadurch aus, dass sie schichtweise aufgebaut
werden und mit einer Vielzahl an spektroskopischen Methoden untersucht werden können.
Aufgrund der verwendeten Polyamidoamin – (PAMAM) – Dendrimere wird nur diese Art
kurz in ihrem Aufbau und ihren Eigenschaften beschrieben [28–30,79] .
Das PAMAM – Dendrimer wurde 1984/85 das erste Mal von D. Tomalia [29] beschrieben
und wird mit einer iterativen Synthesestrategie aufgebaut. Dabei startet man bei einem 1,2 –
Ethyldiaminkern über eine doppelte Michael – Addition mit anschließender Amidbildung.
Diese Abfolge von Reaktionen wird so oft wiederholt bis das Dendrimer die gewünschten
Eigenschaften aufweist, so erhält man z.B. bei kleineren Generationen weichere und flexiblere
Dendrimere und je größer sie werden desto starrer werden sie. Die Anzahl der Endgruppen
wächst dabei exponentiell und wird der dominierende Faktor für die endgültigen Eigenschaften
des Dendrimers. Das innere des Dendrimers ist über diese Grenzschicht von der Umgebung
separiert, was dieser Verbindungsklasse interessante Eigenschaften als Vektor für kleinere
Moleküle oder miniaturisierte Reaktoren verleiht.
Das in dieser Arbeit verwendete PAMAM – Dendrimer hat in der Peripherie 32 primäre
Amine, die für eine weitere Funktionalisierung zur Verfügung stehen. Es bildet die dritte Generation
innerhalb der Klasse der PAMAM – Dendrimere. Die Anzahl der terminalen Gruppen
wächst exponentiell (2 n ). Die Verwendung der dritten Generation hat verschiedene Vorteile.
Zum einen ist die Löslichkeit in organischen Lösemitteln gegeben, was zur Charakterisierung
der hergestellten Verbindung bzw. zur weiteren Verarbeitung an den Oberflächen
dient, zum anderen bietet es genügend funktionelle Gruppen um sie mit hinreichend terminalen
Endgruppen zu versehen, die die Eigenschaften der Dendrimere für die weiteren Anwendungen
spezifizieren.
Durch die Verwendung der PAMAM – Dendrimere ist es möglich, die oben beschriebenen
Eigenschaften in die Matrix zu integrieren. Die freien Aminogruppen in der Hülle lassen
sich mittels klassischer organischer Synthesen modifizieren. Dabei teilen sich die verschiedenen
Eigenschaften auf zwei unterschiedliche Moleküle auf. Zum einen ein Viologen, das un-
67

Ergebnisse und Diskussion
symmetrisch modifiziert wurde, zum anderen ein Nitrilotriessigsäurederivat (Nitrilotriacetic
acid, NTA). Das Viologen, als ein Einelektronmediator, transportiert die Elektronen von dem
aktiven Zentrum zu dem Detektor und zusätzlich besitzt es ein terminales Thiol, welches von
dem Dendrimer weg zeigt und damit an Goldoberflächen binden kann. Das NTA chelatisiert
Metalle wie Ni 2+ oder Fe 3+ und kann damit genetisch modifizierte Enzyme an der Oberfläche
binden. Die Enzyme müssen dafür eine künstliche Bindestelle tragen, die aus zwei oder mehreren
Histidin – Aminosäuren besteht.
4.2.1 Synthese der Monomere und Modifikation der Dendrimere
Im Folgenden werden zuerst die Synthese der verschiedenen Monomere und danach die
Modifizierung der Dendrimere dargestellt. Anschließend wird die Anbindung der Dendrimere
an Goldoberflächen mit unterschiedlichen Detektionsmethoden untersucht.
4.2.1.1 Synthese der Monomere
Um alle Bedingungen für eine stabile und intelligente Matrix zu erfüllen wurden in dieser
Arbeit drei verschiedene Monomere synthetisiert. Zum einen ein Viologen als Elektronüberträger
und zur Bindungsbildung zu Goldoberflächen, ein NTA – und ein TACN – Ligand zur
Chelatisierung von Übergangsmetallkationen, um genetisch modifizierte Enzyme zu binden.
Die Synthese der verschiedenen Dendrimere basiert auf der Reaktion der Isothiocyanatgruppen
mit den freien Aminen der Dendrimere. Diese Reaktion läuft ohne Neben – oder Koppelprodukte
ab, weshalb eine aufwendige Reinigung der Produkte entfällt. Als einzige Reinigungsschritte
werden die Dendrimere filtriert und lyophilisiert. Da das PAMAM – Dendrimer
in der dritten Generation kommerziell erhältlich ist entfällt eine aufwendige divergente Synthese
des Grundkörpers.
68

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 32: Retrosyntheseschema eines Viologenlinkers mit terminalen Gruppen zur Reaktion mit Aminen
auf der einen Seite und Goldoberflächen auf der anderen Seite 7 .
Die Viologene werden nach dem Retrosyntheseschema in Abbildung 32 hergestellt. Dafür
wird das Viologen zuerst mit 1-Iod-3-thioacetatpropan im Unterschuss umgesetzt und flüssigchromatographisch
gereinigt. Das einseitig modifizierte Viologen wird im zweiten Schritt
mit 1-Brom-3-isothiocyanatpropan in trockenem Acetonitril refluxiert. Das fertige Produkt ist
ein zweiwertiges organisches Ion, was in Acetonitril eine geringere Löslichkeit aufweist und
kann durch Kristallisation aus der Reaktionsmischung in hoher Reinheit isoliert werden. Die
Ausbeute der Reaktion beträgt 20.15 %.
Der NTA – Linker wurde über eine Kupplung zwischen N α , N α – Bis(carboxymethyl)-Llysine
mit N – Hydroxysuccinimid (NHS) aktivierter p – Nitrobenzoesäure dargestellt. Die
Nitrogruppe wurde nach der Amidbildung zuerst durch katalytische Hydrierung in ein Amin
und im letzten Schritt mit Thiophosgen in ein aromatisches Isothiocyanat umgewandelt. Die
einzelnen Syntheseschritte wurden mit NMR – Spektroskopie und ESI – MS – Spektrometrie
überprüft und die Gesamtausbeute des Syntheseweges beträgt
7 Nach der Vorschrift von R.Williams synthetisiert
69

Ergebnisse und Diskussion
HOOCH 2 C
HOOCH 2 C
N
CH 2 COOH
N
CH 2 COOH
O
HOOC
HOOC
O
OH
1
O
O
N
O
2 3, 4
NH
NH
NO 2
O
O
NO 2
NO 2
NCS
Abbildung 33: Syntheseschema zur Darstellung des NTA – Linkers. 1 Aktivierung der Carbonsäure mit NHS; 2
Amidierung der aktivierten Säure mit NTA; 3 Pd – katalytische Hydrierung der Nitrogruppe zum Amin; 4 Konvertierung
des Anilins zu einem Isothiocyanat mit Thiophosgen [54] .
Als erstes wird ein Dendrimer hergestellt, welches ausschließlich mit Viologen modifiziert
wird. Dies stellt ein einfaches System dar, um erste spektroskopische Daten zu sammeln
und um erste Testuntersuchungen an Elektroden vorzunehmen. Nach ersten Erfahrungen mit
dem System werden gemischte Dendrimere synthetisiert, die neben dem Viologen noch den
NTA – Linker enthalten. Es wurden drei verschiedene Verhältnisse in der Zusammensetzung
von Viologen zu NTA untersucht. Als drittes wird ein Dendrimer untersucht, dass Viologen
und einen TACN – Linker enthält. Der TACN – Linker soll eine Verbesserung zu den NTA –
Viologen Dendrimern darstellen, da die Metallkationen in dem Makrozyklus in einer stabileren
Ligandensphäre sind. Dadurch ist eine Diffusion der Metalle von dem Dendrimer in die
Lösung und somit der Verlust einer Ankergruppe noch geringer.
Zur besseren Übersicht ist im Folgenden die Zusammenfassung der einzelnen Teilkapitel
voran gestellt.
4.2.1.2 Zusammenfassung der Modifizierungen der Dendrimere
In Zuge der Arbeit wurden drei verschiedene Arten von Dendrimeren hergestellt. Das reine
Viologendendrimer, ein gemischtes Dendrimer mit Viologen und NTA und eine gemischte
Variante mit Viologen und TACN. Die Klasse der NTA Dendrimere wurde im Laufe der Arbeit
mit unterschiedlichen Verhältnissen (V++/NTA: 3/1; 1/1; 1/3) hergestellt. Dadurch sollten
die Grenzen und Möglichkeiten des Systems erkundet werden. Alle Dendrimere konnten
nach der Synthese durch Filtrierung gereinigt und mit NMR –Spektroskopie charakterisiert
70

Ergebnisse und Diskussion
werden. Der Grad der Modifizierung wurde durch Integration der entsprechenden 1 H NMR
Signale bestimmt und ist im Folgenden in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7: Zusammenfassung der Ausbeuten aus der Integration der entsprechenden 1 H NMR Analysen aller
Modifizierungen der Dendrimere
Dendrimer Viologen Viologen/ NTA
Monomerenverhältnis 3/ 1 1/ 1 1/ 3
Ausbeute/ % 100 92.3 82.6 43.6
modifizierte Amine 32 29.7 26.5 14
Molgewicht/ g/mol 25648 22422 19122 13191
Mit einer generellen Ausbeute von deutlich über 80 %, außer für NTA – Viologen
Dendrimer 3, und damit einer minimalen Anzahl von 26 funktionalisierten Aminen ist die
Modifizierung der Dendrimere während der Arbeit gut etabliert, um eine Grundlage für weitere
Experimente zu schaffen, die sich mit den Oberflächeneigenschaften der Dendrimere beschäftigen.
4.2.1.3 Dendrimer mit Viologen substituiert
Für die erste Dendrimersynthese wurde das Viologen in einem 1.5 fachen Überschuss, bezogen
auf die Anzahl der primären Amine, zu dem freien Dendrimer in trockenem und entgastem
DMSO gegeben. Das elektrophile Zentrum der kumulierten Doppelbindungen des
Isothiocyanates reagiert mit dem freien Elektronpaar der Amine des Dendrimers über einen
nucleophilen Angriff. Nach der Bindungsbildung zwischen dem Stickstoff und dem Kohlenstoff
und einer Umlagerung des Protons vom Amin des Dendrimers an das neu entstandene
Amin vom Viologen entsteht eine Thioharnstoffbindung, die eine hohe Stabilität gegenüber
Temperaturänderungen, Sauerstoff und Redoxreaktionen innerhalb des für die weiteren Untersuchungen
nötigen elektrochemischen Fensters bietet. Nachdem das fertige Dendrimer filtriert
wurde, kann es mit NMR – Spektroskopie untersucht und charakterisiert werden.
71

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 34: Nachweis der Abspaltung der Schutzgruppe von dem Dendrimer.
Die Verwendung der NMR – Spektroskopie hilft auch bei dem letzten Schritt, der Abspaltung
der Acetatschutzgruppe von dem Thiol. Dafür wird das Dendrimer in entgastem D 2 O
gelöst und getrocknetes Hydroxylamin – Hydrochlorid zugegeben. Unter den basischen Bedingungen
spaltet sich über einen Additions – Eliminierungs – Mechanismus Essigsäure ab,
die eine signifikante Hochfeldverschiebung im NMR – Spektrum zeigt. Das Signal des gebundenen
Acetats liegt bei 2.4 ppm, wohingegen die CH 3 – Gruppe der Essigsäure bei 2 ppm
gemessen wird. Mit diesem einfachen Experiment kann nachgewiesen werden, dass sich das
System entsprechend den Erwartungen verhält. In Abbildung 34 kann durch eine Messung
vor und nach der Reaktion gesehen werden, wie sich das Signal verschiebt. Damit ist ein einfacher
Nachweis über die erfolgreiche Synthese des gewünschten Zielmoleküls gelungen.
Abbildung 35 zeigt das erste Dendrimer, das homogen mit Viologen modifiziert wurde.
72

O
O
O
HOOC
S
O
S
S
HOOC
HOOC
N
S
HOOC
N
O
COOH
N +
HP
S
N +
COOH
S
N +
N
H
O
N
H
O
N +
N +
N +
HOOC
N +
S
S
N
HOOC
N +
NH
NH
S
NH
HOOC
S
HN
S
NH
N +
H
N
HN
COOH
N
O
COOH
NH
S
N
H
HN
NH
O
S
HN
HN
NH
COOH
H
N
HN
HN
S
NH
O
N
H
O
H
N
O
O
HN
N +
O
O
O
O
S
S
N
HN
N +
O
N
N
HN
NH
HN
O
N
H
N
S
HN
N +
O
HN
NH
N
H
N +
HOOC
O
HN
O
NH
HOOC
S
O
O
COOH
N
HN
H
N
HN
O
N
NH
N
S
N
S
N
HN
N
NH
COOH
COOH
COOH
O
HN
S
HN
O
O
NH
NH
H
N
HN
HN
O
O
O
N
H
NH
NH
O
O
O
NH
O
NH
N
HN
O
HN
N +
N
N
HN
N
HN
N +
S
N +
O
N
N
O
HN
O
H
N
O
S
O
N +
NH
O
HN
O
H
N
NH
NH
O
S
O
N
NH
S
HOOC
HOOC
S
N
HN
HOOC
O
S
HOOC
HN
HN
N
O
N
NH
NH
O
HN
O
HN
O
O
NH
HN
NH
O
N
N
O
COOH
O
COOH
NH
S
N
N
N
O
NH
NH
HN
O
NH
N
HN
S
NH
O
O
NH
NH
HN
H
N
O
O
O
NH
N
H
HN
O
O
S
O
O
HN
N
S
NH
N
S
N
HN
N
O
NH
S
N
H
O
O
HOOC
H
N
HN
O
NH
O
H
N
HN
NH
O
HN
HOOC
HOOC
N
H
N
HN
N
O
O
N
N
HOOC
COOH
NH
NH
N
O
O
NH
HN
NH
N
S
O
O
O
COOH
HN
NH
O
O
S
H
N
O
HN
S
NH
NH
N
H
NH
NH
NH
S
HN
H
N
N
H
H
N
HN
HN
HN
H
N
HN
HN
S
S
S
S
HN
S
O
O
O
O
H
N
O
O
HN
N
COOH
COOH
COOH
HOOC
HN N + N+
S
HN
NH
S
S
N + N +
S
HOOC
N
COOH
COOH
N
S
O
S
COOH
S
COOH
S
O
O
O
Ergebnisse und Diskussion
N + N +
N + N +
N + N H
NH
N +
N + N +
N +
N+
S
N + H N
NH
N + N +
N + N +
N + N +
Abbildung 35: Zwei Zielmoleküle der PAMAM - Dendrimer Modifizierung. Links ist das homogen mit Viologen
hergestellte und rechts eins mit NTA und Viologen gemischte PAMAM - Dendrimer dargestellt.
Zusätzlich kann mit der NMR – Spektroskopie auch den Grad der Modifizierung bestimmt
werden. Dabei werden die aromatischen Signale des Viologens mit allen aliphatischen
Signalen, die sich aus denen des Dendrimerkerns und den beiden Propylketten des Viologens
zusammensetzten integriert. Für die Auswertung ist es wichtig zu wissen, dass im statistischen
Mittel alle Verhältnisse zwischen aromatischen und aliphatischen Protonen simuliert
und mit den ermittelten Daten abgeglichen werden können. Daraus ergibt sich eine Modifizierung
des Dendrimers von 100 %, alle terminalen Amine haben mit den Isothiocyanaten abreagiert.
4.2.1.4 Dendrimer mit Viologen und NTA
Die nächsten Dendrimere werden heterogen mit den zwei verschiedenen Funktionen, dem
Viologen und dem NTA, modifiziert. Die Zielstruktur, die für die Anbindung an Goldoberflächen
und zur Bindung von Enzymen erwartet wird ist in Abbildung 35 dargestellt. Für die
Synthese werden, analog zu den Ergebnissen der ersten Modifizierung des Dendrimers, wieder
1.5 Äquivalente der Edukte zur Kopplung an die Amine verwendet. Diese teilen sich auf
die entsprechenden Verhältnisse Viologen und NTA auf. Die Synthesen werden analog zu der
oben beschriebenem Vorschrift in trockenem und entgastem DMSO durchgeführt. Nach der
Filtration des fertigen Dendrimers erhält man durch NMR – Spektroskopische Analyse und
Simulation der möglichen Verhältnisse eine Ausbeute von 92.3 % abreagierter NH 2 – Gruppen
(29.7 modifizierte Amine; vgl. Abbildung 65) für das erste verwendete Verhältnis von
drei Viologenen und einem NTA.
73

Ergebnisse und Diskussion
In Abbildung 37 ist das NMR – Spektrum des ersten Dendrimers gezeigt. Es sind die einzelnen
Signale der aromatischen Protonen des Viologens und die Signale des Dendrimers mit
den Propylketten und dem Acetat zu sehen. Bei den Signalen des Dendrimers kann man keine
genaue Zuordnung durchführen, da zu viele ähnliche Protonen im Kern sind. Dadurch überlagern
die einzelnen Signale und geben keine sauber aufgelösten Aufspaltungsmuster.
Als letztes NTA – Viologen Dendrimer wurde das Verhältnis 1 zu 3 (Viologen/NTA)
verwendet. Es wurde ähnliche Ausbeuten erwartet, wie in der Testreaktion mit dem homogenen
Dendrimer, bzw. mit den beiden anderen NTA – Viologen Dendrimeren. Nachdem die
Reaktion und die Aufreinigung beendet war, konnte das NTA – Viologen Dendrimer 3 spektroskopisch
untersucht werden und ergab lediglich eine Ausbeute von 43.6 % modifizierter
Amine. Da die Prozedur bei den anderen Dendrimeren erfolgreich funktioniert hat und auch
die eingesetzten Edukte keine Anzeichen von Alterungsprozessen zeigten kann zum jetzigen
Zeitpunkt nicht gesagt werden, wo der Fehler in der Synthese lag.
Es wurden im Durchschnitt 2.3 Viologene an ein Dendrimer gebunden, was möglicherweise
zu wenig für eine stabile Immobilisierung eines Makromoleküls auf einer Oberfläche
ist. Die Anzahl der NTA – Funktionen ist mit durchschnittlich 11.7 ausreichend hoch zur Immobilisierung
der Metallkationen, die nötig sein werden um als Ankergruppen für die genetisch
modifizierten Proteine zu dienen.
Nachfolgend, in Abbildung 36, ist eine Reaktionsgleichung exemplarisch dargestellt und
die NMR Spektren der verschiedenen Dendrimere. Ob die Bedeckung der Dendrimere mit
Viologenen ausreichend ist, um eine stabile Bindung aufzubauen wird in dem nächsten Kapitel
4.2.2 untersucht und diskutiert.
74

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 36: Syntheseschema zur Darstellung von heterogen modifizierten Dendrimeren.
Die Dendrimere wurden in ausgeheizten Glasgeräten getrocknet, in trockenem DMSO aufgenommen, entgast
und die anderen beiden Komponenten (V ++ : NTA [3/1; 1/1; 1/3]) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde drei Tage
bei Raumtemperatur gerührt.
Abbildung 37: Vergleichende NMR Spektren der unterschiedlichen Dendrimere.
Unten ist das reine Viologendendrimer zu sehen. In der aromatischen Region sind nur die Signale der Bipyridine
zu sehen. Die beiden Spektren in der Mitte zeigen zwei mit NTA und Viologen umgesetzte Dendrimere. Im sp 3 Bereich
ist die Schutzgruppe für die Thiole sehr gut zu erkennen.
75

Ergebnisse und Diskussion
4.2.1.5 Dendrimer mit Viologen und TACN
Analog zu den Synthesen der NTA – Viologen Dendrimere wurde auch das TACN – Viologen
– Dendrimer hergestellt. Als Eingangsverhältnis wurden auf ein TACN drei Viologene
gegeben mit einem 1.5 fachen Überschuss in Bezug auf die freien Amine des Dendrimers.
Die Synthese wurde in entgastem und trockenem DMSO durchgeführt. Nachdem die fertigen
Dendrimere filtriert und lyophilisiert wurden, wurde 1 mg der Substanz in 1 ml Wasser
mit 15 µl TCEP gelöst und dann in 0.1 ml Aliquoten aufgeteilt. Die ersten NMR – Untersuchungen
wurden in Deuteriumoxid durchgeführt, um das reale Verhältnis zwischen TACN
und Viologen zu ermitteln.
NMR – spektroskopische Untersuchungen, dargestellt in Abbildung 68, ergaben ein Verhältnis
von 1/1.35 (TACN zu Viologen) bei einer gesamt Ausbeute von 85.5 % (27.4 modifizierte
Amine). Damit ist das letzte Dendrimer für weitere Untersuchungen, zur Herstellung
einer Immobilisierungsmatrix für Enzyme, dargestellt.
4.2.2 Kinetiken zur Anbindung an Goldoberflächen
Die Anbindung und insbesondere die Charakterisierung eines Moleküls an einer Oberfläche
war und ist noch immer eine schwierige Aufgabe in dem Gebiet der Oberflächenanalyse.
Neben der Anbindung und Stabilisierung einer Matrix muss auch gewährleistet sein, ein Enzym,
als essentieller Bestandteil eines Biosensors, zu immobilisieren. Nachdem die Synthese
der Matrixmoleküle erfolgreich abgeschlossen wurde und die Charakterisierung ergab, dass es
sich um gemischte Dendrimere handelt, die zum einen Schwefelgruppen und zum anderen
Chelatliganden in der Peripherie tragen, kann damit begonnen werden die Immobilisierungseigenschaften
zu untersuchen.
Die erste Frage, die beantwortet werden muss, ist, ob das modifizierte Dendrimer mit seinen
Thioacetaten bzw. mit seinen Thiolen in der Lage ist, stabil an eine Oberfläche zu binden
und ob es möglich ist dies mit elektrochemischen und spektroskopischen Methoden nachzuweisen.
In den nächsten Experimenten wird die Assoziation der verschiedenen Dendrimere an
Goldoberflächen untersucht. Die eingesetzten Techniken sind die zyklische Voltammetrie, die
mit den Viologenen, als Einelektronenmediator, der Dendrimere arbeitet, und die Oberflächenplasmonenresonanz
– Spektroskopie, die die Änderung des Brechungsindexes vor der
Oberfläche als Detektionsgrundlage nimmt. Aus diesen Messungen können sowohl qualitative
76

Ergebnisse und Diskussion
Angaben über den Aufbau einer Schicht, als auch quantitative Aussagen über die Bindungskonstante
der Dendrimere gemacht werden.
4.2.2.1 Elektrochemische Untersuchungen
Die zyklische Voltammetrie ist eine sehr aussagekräftige Messmethode in der Elektrochemie
und kann qualitative Rückschlüsse auf die Fragestellung einer stabilen Assoziation
der Dendrimere an Goldoberflächen geben. Die hergestellten Dendrimere tragen neben den
Schwefelgruppen kovalent gebundene Redoxmediatoren in der Peripherie und sollten somit
elektrochemisch adressierbar sein. Wird die Spannung im Bereich des Formalpotentials der
verwendeten Viologene in einer elektrochemischen Messzelle periodisch linear erhöht und
erniedrigt (E 0 = -438 mV vs. NHE) wird ein sich eine Stromantwort einstellen, welche zu
einem der beiden Kriterien zugeordnet werden kann:
- Stabiles Signal über die Zeit
- Wert des Signals ändert sich mit zunehmender Anzahl der Zyklen
Im ersten Fall, bei einem stabilen Signal über eine große Anzahl von Zyklen (" > 100),
kann von einer diffundieren Redoxspezies ausgegangen werden 8 . Ändert sich das Signal mit
der Zeit gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten, entweder geht der Redoxmediator kaputt,
indem chemische Reaktionen an der oxidierten Form des Viologens ablaufen, was mit einer
Abnahme des Signals einhergehen würde, oder das Signal wird größer, was für eine Zunahme
der redoxaktiven Spezies vor der Elektrodenoberfläche spricht. In diesem Fall kann davon
ausgegangen werden, dass sich eine Bindung zwischen dem Dendrimer und der Goldoberflächen
ausbildet. Die gemessenen Signale wachsen, da die Dendrimere nicht mehr wegdiffundieren
können und weitere freidiffundierende Dendrimere aus der Lösung zu der Elektrodenoberfläche
kommen und ebenfalls mit dieser eine Bindung eingehen. Da sie nicht mehr in der
Lage sind die Oberfläche zu verlassen nimmt die Konzentration der Viologene zu und der
Maximumstrom in den Strom – Spannungskurven wächst. Dieses Verhalten gehorcht der
Langmuir‘schen Isotherme, die als monolagen Adsorption beschrieben werden kann. Durch
die Besetzung freier Stellen auf der Oberfläche durch die Dendrimere wird der Platz auf der
Oberfläche immer geringer. Unter Ausschluss von Sauerstoff wird die Bildung von Disulfidbrücken
unterdrückt und keine weiteren Dendrimere können sich an die Oberfläche anlagern.
Es kommt zur Stagnation des Signals und der Assoziationsprozess ist beendet.
8 Alternativ sieht man nur eine Puffermessung, da die Zugabe des Dendrimers vergessen wurde.
77

Ergebnisse und Diskussion
4.2.2.2 Elektrochemie des homogenen Dendrimers
Die zyklischen Voltammogramme wurden in einem elektrochemischen Fenster von
(-0.2 V) – (-0.6 V) vs. Ag/AgCl in einer entgasten Dendrimerlösung 9 mit 0.05 M PB und
0.1 M KNO 3 aufgenommen. Wird das erste hergestellte Dendrimer betrachtet, welches nur
Viologene trägt, kann im zeitlichen Verlauf eine Zunahme des Stromsignals festgestellt werden.
Unter den gegebenen Umständen und der aufgestellten Hypothese kann davon ausgegangen
werden, dass die Konzentration an redoxaktiven Spezies vor der Elektrodenoberfläche
über die Zeit ansteigt.
Dendrimer
mit
Viologenen
6
4
Goldelektrode
R
R
i [µA]
2
0
N
N
-2
-4
N
+/- e -
N
-6
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
E [V vs Ag/AgCl]
0 5 10 15 20 25 30 35
t [min]
R
R
Abbildung 38: Elektrochemischer Nachweis der Entstehung einer stabilen Dendrimerschicht.
Links ist der schematische Aufbau der Elektrode mit der Dendrimerschicht und der Redoxreaktion der Viologene
dargestellt. In der Mitte ist das CV in dem Messbereich von (-0.6) – (-0.2) V vs. Ag/AgCl den gemessenen Strom
einer 0.05 M PB,pH 7.5, 0.1 M KNO 3 mit freiem Dendrimer. Über die Zeit nimmt die Stromantwort im Bereich des
Formalpotentials (-0.428 V) des Viologens zu. Rechts zeigt die Auftragung die Maxima und Minima der einzelnen
Zyklen im zeitlichen Verlauf. Ein Anstieg in den ersten fünf Minuten zeigt den schnellen Ablauf der Reaktion.
Die Redoxwellen in der zyklischen Voltammetrie entsprechen bei einer Redoxspezies, die
auf einer Oberfläche gebunden ist, der Anzahl an gebundenen Analyten. Es ist daher möglich
mit der Messung die Oberflächenkonzentration des Dendrimers und die Anzahl der Dendrimere
zu errechnen. Aus der Integration der letzten Zyklen erhält man die Werte für die Ladung,
die übertragen wurde. Für die Oxidation ergeben sich 1,375 µAs und für die Reduktion
1,185 µAs 10 . Mit Gleichung ( 16 ) lässt sich die Oberflächenbedeckung der Dendrimere in
[mol/mm 2 ] berechnen.
9 Ein Aliquot (0.1 ml) wurde in 0.9 ml des Puffers verdünnt und dann mit 5 µl TCEP versetzt
10 Die Werte, die aus den CVs extrahiert wurden sind -0.237µAV für die Reduktion und 0.275 µAV für die
Oxidation und wurden mit der Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 0.2 V/s verrechnet, um die Ladung zu
berechnen
78

Ergebnisse und Diskussion
Γ =
Q
nFA g
( 16 )
Γ = Oberflächenbedeckung in [mol/cm 2 ]; Q = Übertragene Ladung in [As]; n = Anzahl der übertragenen Elektronen;
F = Faradaykonstante (96485 C/mol); A g = geometrische Oberfläche der Elektrode (3.14 mm 2 )
Für die Viologene ergibt sich eine Konzentration von Γ ox, V = 4.45 pmol/mm 2 bzw.
Γ red, V = 3.91 pmol/mm 2 . Da jedes Dendrimer mit 32 Viologenen modifiziert ist ergibt sich
eine Oberflächenkonzentration von Γ hi,k = 0.139 pmol/mm bzw. Γ qrs,k = 0.122 pmol/
mm bzw. eine Gesamtanzahl an Dendrimeren von 7.32 ∗ 10 O − 8.34 ∗ 10 O . Mit einer
Größe von ca. 4 nm im Durchmesser kann man die gesamte Fläche berechnen, die von den
Dendrimeren bedeckt wird. Mit Gleichung ( 17 ) und der Gesamtzahl der Dendrimere erhält
man eine Fläche von 0.92 mm 2 .
A = πr ( 17 )
Im Vergleich zu der möglichen Gesamtfläche der Elektrode mit A g = 3.14 mm 2 sind dementsprechend
29.29 % der Elektrode mit dem Dendrimer bedeckt. Dieser Wert ist für die Gesamtbedeckung
der Elektrode relativ gering, aber da es sich bei den Dendrimeren um Kugeln
handelt, die in einer zweidimensionalen Projektion mit maximal 78 % Ausbeute angeordnet
werden können 11 , relativiert sich der Wert auf 37.56 % der möglichen Oberflächenbedeckung.
Die geringe Bedeckung der Elektrodenoberfläche stützt die Behauptung, dass sich die
Dendrimere in einer Monolage angeordnet haben. Eine mögliche Erklärung für die geringe
Bedeckung der Oberfläche mit Dendrimeren kann mit dem generellen Aufbau der Dendrimere
gegeben werden. Die Dendrimere sind in ihrer makromolekularen Struktur mit 32 Viologenen
modifiziert, von denen jedes zwei negative Ladungen trägt. Somit konzentrieren sich 64 negative
Ladungen auf ein Volumen von 33.5 ∗ 10 y m 3 , die, gelöst in Puffer, von einer Reihe
Gegenionen stabilisiert und durch räumliche Abgrenzung, sowie Solvatisierungseffekte abgeschirmt
werden. Lagern sich die Dendrimere auf einer Oberfläche an und werden dort durch
Chemisorption festgehalten lädt sich die Oberfläche auf und in der Lösung befindliche
Dendrimere werden von der Coulombwechselwirkung immer mehr abgestoßen. Dieser Effekt
wird durch das Vorhandensein der Ionen in dem Leitelektrolyten zwar etwas ausgeglichen, ist
aber trotzdem ein Hauptgrund für die geringe Oberflächenbedeckung. Der Effekt der elektrostatischen
Abstoßung wird auch in späteren Experimenten noch deutlich.
11 Ausgehend von einer primitiven Kugelpackung
79

Ergebnisse und Diskussion
4.2.2.3 Elektrochemie der heterogenen Dendrimere
Nachdem mit dem ersten Dendrimer gezeigt werden konnte, dass eine Immobilisierung an
Elektrodenoberflächen möglich ist, nachgewiesen und quantifiziert werden kann, werden auch
die anderen Dendrimere, die verschiedene Verhältnisse von Viologen – und NTA – bzw.
TACN – Linker tragen, auf dieselbe Art und Weise untersucht. Die voran beschriebenen Methoden
werden analog weiter verwendet und es werden nur noch die Ergebnisse betrachtet.
Anhand von Abbildung 39 wird die stabile Bindung aller drei Viologen – NTA Dendrimere
deutlich. In jedem Experiment sind die Signale der Redoxwellen immer größer geworden.
Der Peakaufspaltung aller Messungen war deutlich unter 59 mV, was für eine oberflächengebundene
Spezies spricht. Die größte Differenz lag bei Dendrimer 3 vor. Für die weiteren Betrachtungen
werden nur die kathodischen Teile der ZV's betrachtet, da sie stabiler und auch
besser zu vergleichen sind.
6
4
2
i [µA]
0
-2
-4
-0,6 -0,4 -0,2
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 -0,75 -0,50 -0,25 0,00
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 39: Elektrochemische on-line Kontrolle der Dendrimeranbindung zur Verwendung als Redoxrlais.
Von links nach rechts ist das Dendrimer 1, 2 & 3 zu sehen. Gemessen wurde in 0.1 M KNO 3 , 0.05 M PB, pH 7.5,
mit einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 0.2 V/s und 200 Zyklen. Im Verlauf der Messungen wachsen die
Signale an und zeigen eine stabile Bindung der Dendrimere an die Elektrodenoberfläche und eine gute Kontaktierung
der Viologene.
Besonders fällt die maximale Auslenkung der Redoxwellen auf, die vom Ersten bis zum
dritten Dendrimer immer geringer wird. Dies korreliert direkt mit der übertragenen Ladung,
80

Ergebnisse und Diskussion
die auch immer weiter abnimmt. Allerdings kann daraus nicht geschlossen werden, dass auch
weniger Material auf den Elektrodenoberflächen abgelagert wurde. Zur Interpretation der
Werte müssen die NMR Messungen einbezogen werden, die für jedes Dendrimer sagen, wie
viele Viologene sich in der Peripherie befinden und wie viele Ladungen übertragen werden
können. Das erste Dendrimer hat die größte Anzahl an Viologenen und kann daher auch die
meisten Elektronen übertragen oder aufnehmen. Es ist auch nicht verwunderlich, dass die
größten Redoxwellen bei diesem Molekül gemessen wurden. Die geringste Ausbeute an Viologen
war bei dem Dendrimer 3 zu finden, wo durchschnittlich 2 bis 3 Viologene an einem
Dendrimer binden konnten.
6
4
2
i [µA]
0
-2
-4
0 10 20
t [min]
0 10 20
t [min]
Abbildung 40: Zeitliche Projektion der minimalen/ maximalen Stromantworten bei der Dendrimeranbindung.
Für Dendrimer 1 & 2 sind aus den in Abbildung 39 gezeigten ZV's die jeweils höchsten und niedrigsten Auslenkungen
der Stromantwort gegen die Zeit aufgezeichnet.
Für die anderen beiden Dendrimere kann die Näherung „größeres Signal gleich höhere
Bedeckung der Oberfläche“ nicht mehr angewendet werden. Die übertragene Ladung ist zwar
größer, was auch zu einer höheren Dichte an Viologen führt (Γ D2, V++ > Γ D3, V++ ), aber auf die
effektive Anzahl an Dendrimeren gerechnet, ergibt sich das umgekehrte Verhältnis von Γ D2,
V** = 0.109 pmol/mm 2 < Γ D3, V** = 0.180 pmol/mm 2 . Für die Bedeckung macht das einen Unterschied
von 17 % aus. So kann die für die Oberflächenbedeckung die Reihe D1 > D3 > D2
aufgestellt werden. Da die Anbindung in allen Fällen irreversibel zu erfolgen scheint müssen
81

Ergebnisse und Diskussion
für die teilweise stark voneinander abweichenden Werte andere Erklärungen gefunden werden.
Am wahrscheinlichsten sind intermolekulare Wechselwirkungen, die für eine Änderung
im Oberflächenpotential während der Adsorption sorgen.
Als Referenz zur weiteren Diskussion der Bedeckung der Oberfläche mit den unterschiedlichen
Dendrimeren dient das reine Viologendendrimer, welches als erstes vermessen wurde.
Die bedeckte Fläche des Dendrimers 1 konnte im Vergleich zu dem reinen Viologendendrimer
verdoppelt werden. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt ist die Stabilisierung
der beiden positiven Ladungen des Viologens durch die drei Carbonsäuren, die den NTA –
Linker definieren. Die Messung wurde in einem Puffer mit einem pH – Wert von 7.5 durchgeführt,
was die Säuren deprotoniert und somit die negativen Ladungen ausgleichen kann.
Bilanziert man die Ladungen des gesamten Dendrimers, erhält man 29.6 positive Ladungen,
die von 29.4 negativen Ladungen kompensiert werden. Damit ergibt sich eine Nettoladung
von ∆ = 0.2 12 für das gesamte Dendrimer und näherungsweise kann davon ausgegangen werden,
dass die Dendrimere nicht geladen sind. Aus diesem Grund können sich die Dendrimere
auch in größerer Anzahl auf der Elektrode zusammenrotten, was in dem Fall des reinen Viologendendrimers
nicht möglich ist.
Die Anzahl der Viologenfunktionen ist bei Dendrimer 2 deutlich höher als bei Dendrimer
1, weshalb die Nettoladung in diesem Dendrimer bei ca. 32 13 liegt. Damit erhält man, analog
zu dem reinen Viologendendrimer eine positive Aufladung der Oberfläche und eine elektrostatische
Abstoßung zwischen den gebundenen und den ungebundenen Dendrimeren. Diese
scheint nur teilweise von den Gegenionen kompensiert zu werden, was zu der geringen Bedeckung
mit Dendrimeren führt.
Das Dendrimer 3 zeigt ein anderes Verhalten als die bisher untersuchten Dendrimere 1
und 2, was die elektrochemische Adressierbarkeit der Viologene anbelangt. Das Formalpotential
ist zu negativeren Potentialen verschoben, wie in Abbildung 39 rechts zu sehen ist.
Das Formalpotential liegt bei -0.525 V und ist damit 0.063 V negativer als das von
Dendrimer 2. Zusätzlich ist die Aufspaltung der Redoxwellen mit 18 mV mehr als doppelt so
groß als bei den vorher untersuchten Dendrimeren. Dies kann mit der geringen Konzentration
von Viologenen zusammenhängen, die an diesem Dendrimer gebunden sind. Im Mittel sind
2.4 Viologene an ein Dendrimer gebunden. Da die Elektronen über die einzelnen Viologene
12 Dieser Wert geht aus statistischen Betrachtungen hervor. Es gibt nur ganze Elementarladungen.
13 Das Verhältnis zwischen dem NTA und dem Viologen betrug bei diesem Dendrimer 1 zu 4.7 bei einer
Ausbeute von 88.95 %. Dies entspricht einer Verteilung von fünf NTA Gruppen zu 23.5 Viologenen.
82

Ergebnisse und Diskussion
zu der Oberfläche, bzw. von der Oberfläche zu den Viologenen, transportiert werden müssen,
kann dies bei einer geringen Konzentration zu einer Limitierung im Seegras – Mechanismus
führen. Die Diffusion ist eine ungerichtete Bewegung von Atomen und Molekülen, die ggf.
einem Gradienten folgt, falls ein solcher Vorliegt. Nichts desto weniger trotz müssen die
zwei, bzw. drei Viologene an dem Dendrimer eine räumliche Nähe zueinander haben bis ein
Elektron erfolgreich übertragen werden kann. Wenn die Anzahl der Redoxmediatoren allerdings
zu gering ist, kann es länger dauern bis es zu einer solchen Annäherung kommt.
Dadurch lässt sich die größere Aufspaltung der Redoxwellen erklären, obwohl es sich um eine
oberflächengebundene Spezies handelt.
Aus den ZV – Messungen lässt sich eine Oberflächenkonzentration von Dendrimer 3 mit
Γ ox, D3 = 0,18 pmol/mm 2 bestimmen. Für die prozentuale Bedeckung wird ein Wert von 43 %
erhalten. Dieser Wert ist deutlich größer als für das reine Viologendendrimer und das
Dendrimer 2, aber kleiner als für das Dendrimer 1. Dies ist ein Indiz für eine gute Kompensation
der positiven Ladungen der Viologene durch die deprotonierten Carbonsäuren der NTA –
Gruppen. Auch die geringe Bedeckung der NTA – Gruppen rund um das Dendrimer mit
durchschnittlich 11.6 Funktionen führt zu einer Abnahme des mittleren Radius und gibt den
Dendrimeren genug Platz, um sich ausreichend auf der Oberfläche anzuordnen. Durch die
größere Anzahl an Dendrimeren auf der Oberfläche kommt es zu einer Kompensation der
geringen Anzahl an Viologenen in der Peripherie der Dendrimere. Dadurch können hinreichend
hohe Ströme erreicht werden, die zu einer aussagekräftigen Analyse des Dendrimers
führen.
4.2.2.4 Zusammenfassung der elektrochemischen Experimente
Die elektrochemischen Experimente zur Charakterisierung der ersten vier Dendrimere
werden kurz zusammengefasst.
Das homogen modifizierte Dendrimer zeigt eine symmetrische Form in den CV – Messungen,
wie es bei einer oberflächengebundenen Spezies sein soll. Die Aufspaltung der Redoxwellen,
die in einem idealen Fall gleich null sein soll, liegt bei 14 mV und ist damit deutlich
von einer freidiffundierenden Redoxspezies zu unterscheiden, die ≥ 59 mV ist. Bei den
drei NTA – Viologen Dendrimeren liegt die Aufspaltung nur bei dem dritten Dendrimer mit
vier mV minimal höher. Die anderen beiden Dendrimere sind mit 6 mV bzw. 8 mV nahezu
ohne Aufspaltung der Redoxwellen.
83

Ergebnisse und Diskussion
Die Formalpotentiale der Dendrimere liegen im gleichen Bereich wie das des freien
Dipropylviologens. Damit kann davon ausgegangen werden, dass der Elektronentransfer der
einzelnen Viologene über einen Seegrasmechanismus hinreichend schnell ist. Lediglich das
NTA – Viologen Dendrimer 3 zeigt ein anderes elektrochemisches Verhalten, was das Formalpotential
betrifft, da es um ca. 87 mV von dem des Dipropylviologens verschoben ist. Eine
schlüssige Erklärung für diese Verschiebung konnte während der Arbeit nicht gefunden
werden.
Tabelle 8: Zusammenfassung der elektrochemischen Untersuchungen der verschiedenen Dendrimere
NTA - Viologen
Dendrimer
1
NTA - Viologen
Dendrimer
2
NTA - Viologen
Dendrimer
3
Viologen
Dendrimer
Formalpotential/ mV -455 -462 -525 -428
Ladung ox/ µAs 1.65 0.155 0.307 1.375
Peakaufspaltung/ mV 6 7.75 18 14
Bedeckung/ fmol/mm 2 275 109 180 139
Bedeckung/ % 66 26 43 38
Molekulargewicht/ g/mol 22422 19122 13191 25468
Die berechneten Bedeckungen aus den übertragenen Ladungen zeigen eine ähnliche Bedeckung
mit Dendrimer auf alle Elektroden. Bei allen vier Dendrimeren ist eine Bedeckung
im Bereich von 110 – 275 fmol/mm 2 gefunden worden. Dabei wurde die größte Bedeckung
bei dem NTA – Viologen Dendrimer 1 festgestellt. Die geringste bei dem NTA – Viologen
Dendrimer 2. Die Werte schwanken damit zwischen 20 – 50 % der gesamten Oberfläche der
Elektrode.
4.2.2.5 SPR – Untersuchungen
Neben der Detektion von oberflächengebundenen Spezies mittels Elektrochemie bieten
sich auch andere Methoden an, die auf der Wechselwirkung zwischen Licht und Materie beruhen.
Dabei eignet sich die Oberflächen Plasmonen Resonanz (surface plasmon resonance,
SPR) Spektroskopie besonders, da sie die Probe nicht zerstört, äußerst sensitiv ist und den
schrittweisen Aufbau von molekularen Architekturen aufzeichnen kann.
Die Wirkweise eines SPR Detektors sieht folgendermaßen aus, dass eine metallische
Oberfläche (meist Gold) auf einem Prisma liegt und durch das Glas mit einem Laser angestrahlt
und das, von der Goldoberfläche reflektierte, Licht gemessen wird. Diese Totalreflexion
tritt auf, wenn auf der anderen Seite ein optisch dünneres Medium ist als das Prisma, was
für wässrige Lösungen wie Puffer gilt. Wird die Intensität des Lichtes gemessen, welches an
84

Ergebnisse und Diskussion
der Phasengrenze reflektiert wird, kann man feststellen, dass bei bestimmten Winkeleinstellungen
nicht alles Licht am Detektor ankommt. Es bildet sich ein Minimum der Intensität aus,
bei dem ein Teil des eingestrahlten Lichtes mit den freien Elektronen (oder Plasmonen) des
Metalls in Wechselwirkung tritt und auf der anderen Seite als evaneszente Welle frei wird.
Diese evaneszente Welle kann mit dem optisch dünneren Medium in Wechselwirkung treten
und ist damit von der Konzentration der wässrigen Lösung oder den Vorgängen an der Oberfläche
abhängig. Durch die Änderung des Brechungsindex ändert sich der kritische Winkel
bei dem die Plasmonen in Resonanz mit dem Licht treten. Die Abweichung des Intensitätsverlustes
kann gemessen werden und steht in direktem Zusammenhang mit dem Brechungsindex
der Lösung vor der Oberfläche. Werden große Biomoleküle vor der Oberfläche immobilisiert
ändert sich der Brechungsindex und man kann eine Verschiebung des Intensitätsminimums
sehen, was, wird der Winkel des Minimums gegen die Zeit aufgetragen, zu einem Sensorgramm
führt. Man kann also eine chemische Reaktion auf einer Seite eines Metallfilms ablaufen
lassen und untersuchen, wenn die andere Seite mit einem Laser im richtigen Winkel bestrahlt
wird. Man erhält ein zweigeteiltes System mit einer trocknen und einer nassen Seite.
Unter zu Hilfenahme dieser Sensorgramme und einfacher mathematischer Methoden können
sowohl Assoziationskonstanten als auch Dissoziationskonstanten bestimmt werden.
Zur Bestimmung der Bindungskonstante des Dendrimers wird die Arbeit von
O’Shannessy et. al. [114] verwendet. Dabei werden die Ratengleichungen integriert und die Daten
direkt mathematisch angenähert. Die Folgende Gleichung ( 18 ) wird zur Bestimmung der
Assoziationskonstanten herangezogen
1 _ = b6 A1 MA$ z1 − (^: {*: | )_ }
b6 A + 6 -
( 18 )
Unter der Annahme, dass die Chemisorption des Dendrimers an eine Goldoberfläche ein
irreversibler Prozess ist, da die Bindungsenergie der ausgebildeten Gold – Schwefel – Bindung
mit 40 kcal/mol zu groß ist als das sich das Dendrimer von der Oberfläche abwaschen
lässt, wird der Dissoziationsterm vernachlässigt und k d = 0 gesetzt. Dadurch vereinfacht sich
Gleichung ( 18 ) zu
1 _ = 1 MA$ (1 − ^: {_ ) ( 19 )
Unter der Verwendung der Konzentration der Dendrimerlösung lässt sich durch mathematische
Anpassung die Assoziationskonstante der Dendrimere bestimmen. Für die drei ver-
85

Ergebnisse und Diskussion
schiedenen Viologen – NTA – Dendrimere als auch für das Viologen – TACN – Dendrimer
werden zuerst Bindungskurven gezeigt und anschließend die mathematisch angenäherten
Funktionen überlagert. Eine Diskussion der Assoziationskonstanten mit einer tabellarischen
Auflistung der ermittelten Werte folgt.
Die oben gemachte Vereinfachung die von Gleichung ( 18 ) zu Gleichung ( 19 ) führt wird
vor der analytischen Auswertung der Ergebnisse gezeigt und anhand von Messungen bewiesen.
Neben der kinetischen Untersuchung müssen erst die Gegebenheiten der Anbindung untersucht
werden. Da außer dem Dendrimer auch noch TCEP zu der Inkubationslösung gegeben
wird, um eine Agglomeration der Dendrimere zu verhindern, muss überprüft werden, ob
sich das TCEP an die Oberfläche anlagert oder sie anderweitig blockiert. Da es sich bei TCEP
um eine organische Verbindung handelt weißt sie einen anderen Brechungsindex auf als PB –
Puffer, und kann so auch mittels SPR – Spektroskopie untersucht werden.
4.2.2.5.1 Dissoziation der Dendrimere
Im folgenden Kapitel wird dargelegt, warum die Dissoziationskonstante k D = 0 gesetzt
werden kann und es sich bei den Anbindungen der Dendrimere um einen reinen Assoziationsprozess
handelt. Die Graphen in Abbildung 41 zeigen das Assoziations – und Dissoziationsverhalten
der Dendrimere an Goldoberflächen. In der Assozaitionsphase kann man bei
allen vier Messungen einen exponentiellen Anstieg sehen, der wie in der oben beschriebenen
Gleichung ( 19 ) beschrieben wird. In dem vergrößerten Bereich von 0.57 – 0.67 h ist die Dissoziation
der Dendrimere zu sehen. Eine nennenswerte Dissoziation der Dendrimere weg von
der Oberfläche, würde eine Abnahme des Signals zur Folge haben. In den durchgeführten
Messungen ist keine Abnahme des Signals zu sehen, weshalb davon ausgegangen werden
kann, dass die Dendrimere stabil auf der Oberfläche gebunden sind und auch nicht nach dem
Wechsel des Assoziationspuffers wieder in Lösung gehen, wie man es von anderen Bindungsexperimenten
kennt, in denen die Assoziationsratenkonstante aus dem Ausdruck hervorgeht.
86

Ergebnisse und Diskussion
Winkeländerung [m°]
800
600
400
200
0
-200
-400
-600
-800
750
700
650
600
550
500
450
-1000
0,0 0,2 0,4 0,6
t [h]
400
0,60 0,65
t [h]
Abbildung 41: Nachweis der irreversiblen Bindung des Dendrimers an Goldoberflächen.
Vier typische kinetische Untersuchungen von dem NTA – Viologen Dendrimer 1 mit einem zoom in den Bereich
der Dissoziation sind dargestellt. Die Daten von den Anbindungen 2 und 4 zeigen einen leichten Anstieg im Signal und
die anderen beiden Anbindungen 1 und 3 einen konstanten Wert. Für keinen der vier Graphen ist eine signifikante
Abnahme zu sehen, die für eine Dissoziation der Dendrimere sprechen würde.
8E9⁄ ~ = 6 A 898E9 − 6 - 8E9 ( 20 )
Also ist die Bindung des Dendrimers an die Oberfläche von der Konzentration der einzelnen
freien Bindungsstellen abhängig. Limitiert wird sie durch die Abnahme der freien Plätze
auf der Oberfläche im Laufe des Experiments.
In den folgenden Abschnitten werden die einzelnen Bindungsereignisse der verschiedenen
NTA – Viologen Dendrimere beschrieben und diskutiert. Die Assoziationskonstanten an die
Goldoberfläche, sowie der Grad der Bedeckung werden ermittelt. Ein abschließender Vergleich
mit den elektrochemischen Methoden folgt in der Zusammenfassung des Kapitels.
4.2.2.5.2 Assoziation und Bindungskonstanten der Dendrimere 1 – 3
Die wichtigsten Grundlagen zur Beurteilung des Systems ist die Bindungskonstante. Im
Folgenden wird zwischen den verschiedenen Dendrimeren verglichen wie sich die durch-
87

Ergebnisse und Diskussion
schnittlichen Bindungskonstanten voneinander unterscheiden. Danach folgt die analytische
Aufarbeitung.
Tabelle 9: Zusammenfassung der Messergebnisse zur SPR Untersuchung der NTA – Dendrimere
Dendrimer 1 2 3
Winkeländerung/ m° 474.9 839.1 820.6
k a *c/ min -1 0.55 0.28 0.25
k a / (mM*min) -1 10.5 5.26 4.78
Masse/ ng/mm 2 3.89 6.88 6.72
Oberflächenbedeckung/ fmol/mm 2 173 360 509
Anhand von Tabelle 9 können schon die Gemeinsamkeiten der einzelnen Experimente erkannt
werden, aber auch Unterschiede zwischen den Dendrimeren. So lässt sich von Dendrimer
2 & 3 das Assoziationsverhalten sehr ähnlich beschreiben, aber die Oberflächenbedeckung
ist sehr unterschiedlich. Dendrimer 1 weist ein Assoziationsverhalten auf, dass sich ungefähr
um den Faktor zwei unterscheidet. So ist die Winkeländerung etwa halb so groß, was
sich in einem doppelt so großen k a Wert widerspiegelt. Von der Stoffmenge pro Fläche ist es
wieder sehr nah an den Werten von Dendrimer 2. An dieser Stelle verhält sich Dendrimer 3
auf den ersten Blick nicht entsprechend den Erwartungen, da es deutlich mehr Dendrimere auf
der gleichen Fläche unterbringt. Dies ist bei näheren Betrachtungen nicht weiter verwunderlich,
denn analog zu den elektrochemischen Experimenten muss auch hier wieder die Größe
der Moleküle berücksichtigt werden und damit der Grad der Modifizierung. Dendrimer 3 ist
viel kleiner und hat damit auch einen kleineren Fußabdruck.
In Abbildung 42 sind verschiedene Messungen mit den NTA - Viologen Dendrimern 1, 2
& 3 zu sehen, die alle einen ähnlichen Verlauf zeigen. Die durchschnittliche Bedeckung für
Dendrimer 1 beträgt 474 m°, was 3.88 ng Dendrimer pro mm 2 entspricht. Daraus ergibt sich
eine durchschnittliche Oberflächenkonzentration von 173 fmol/mm 2 . Vergleicht man diesen
Wert mit der elektrochemischen Messung, die einen Wert von 275 fmol/mm 2 ergaben, liegt
man in einem Bereich in dem sich die bestimmten Werte gut überlagern.
88

Ergebnisse und Diskussion
800
Winkeländerung [m°]
600
400
200
0
0 20
-20 0 20 40 60 -20 0 20 40 60
t [min]
Abbildung 42: Sensorgramme der Immobilisierung der Dendrimere 1, 2 & 3.
Von links nach rechts ist Dendrimer 1, 2 & 3 zu sehen. Es ist je eine typische Anbindung aufgetragen. In jeder
Messung wurde die Oberfläche erst bis zur Stabilität gespült und dann zu dem Laufpuffer (0.05 M PB, pH 7.5, 0.1 M
KNO 3 ) das Dendrimer gegeben. Jede Messung lief mindestens 30 min.
Die durchschnittliche Bedeckung der Sensoroberfläche mit dem Dendrimer 2 beträgt
6.88 ng/mm 2 . Dadurch ergibt sich für dieses Dendrimer eine Oberflächenkonzentration von
360 fmol/mm 2 , während aus den elektrochemischen Experimenten eine Oberflächenbedeckung
von109 fmol/mm 2 gefunden wurde. Zwar weichen die Werte voneinander ab, aber sie
liegen noch immer in der gleichen Größenordnung, was die hohe Genauigkeit der beiden Methoden
zeigt. Die größere Unsicherheit liegt in diesem Fall auch bei den elektrochemischen
Experimenten, da hier die Festlegung der Grundlinie nicht automatisch erfolgt, sondern separat
hinzugefügt werden muss. Zusätzlich können bei den CV Messungen weitere Stoffe wie
Sauerstoff die Messung beeinflussen, was zu größeren Unsicherheiten führen kann.
Das dritte NTA – Viologen Dendrimer mit den geringsten Ausbeuten an Viologenen und
NTA – Funktionen zeigt für sein geringes Molekulargewicht sehr gute Ergebnisse bei den
SPR – Experimenten, was sich in der Stabilität der Signale und dem hohen Grad der Winkeländerung
widerspiegelt. Die durchschnittliche Änderung des Winkels beträgt 820.6 m° was
einer Anlagerung von 6.72 ng/mm 2 entspricht. Dieser Wert ist fast genauso groß wie bei dem
NTA – Viologen Dendrimer 2, aber durch das deutlich geringere Molekulargewicht erhält
89

Ergebnisse und Diskussion
man eine Oberflächenkonzentration von 509 fmol/mm 2 . Dies ist die höchste Oberflächenbedeckung
mit einem Dendrimer, die in dieser Arbeit gemessen wurde. Vergleicht man die SPR
– Daten mit den elektrochemischen Werten, findet man eine Oberflächenkonzentration von
180 fmol/mm 2 , was einerseits noch in der gleichen Größenordnung ist, aber dennoch stark
abweicht. Die elektrochemischen Messungen zeigen Abweichungen von dem erwarteten Verhalten,
weshalb sie eher qualitative Hinweise auf eine Anbindung geben sollten. Für die analytischen
Daten sind die SPR – Messungen weitaus aufschlussreicher.
Die hohe Bedeckung an Dendrimer 3 kommt durch die geringe Anzahl an funktionellen
Gruppen in der Peripherie des Dendrimers. Dadurch kommt es zu einem geringeren Radius,
was zu einer höheren Anzahl an freien Bindungsplätzen auf der Oberfläche führt. Verstärk
wird dieser Effekt durch die geringe Oberflächenladung des Dendrimers, was in weniger stark
ausgeprägten Wechselwirkungen resultiert. Aus diesen beiden Gründen können sich die
Dendrimere dichter auf der Oberfläche packen und eine höhere Oberflächenkonzentration
erzeugen.
Damit konnte gezeigt werden, dass beide Methoden sich zur Untersuchung von oberflächengebundenen
Spezies eignen. Im nächsten Schritt werden die Assoziationskonstanten der
Dendrimeranbindung anhand der SPR – Daten bestimmt, damit die Reaktion genauer beschrieben
werden kann und die Einstellung des Gleichgewichtes besser beschrieben wird.
Zur Bestimmung der Assoziationskonstanten der einzelnen Messungen werden die Rohdaten
mathematisch gefittet und überlagert. Der Maximalwert R Max der Assoziation ergibt sich
aus dem mathematischen Fit, genauso wie der Wert für c*k a . mit der Konzentration lässt sich
daraus die Assoziationskonstante ermitteln. Im Anhang sind Messungen als Beispiele gezeigt.
Für diese Messung erhält man einen Wert von k a = 12.2 mM -1 min -1 . In der ersten Minute der
Messung ist eine sehr schnelle Änderung des Winkels zu beobachten, die nach ca. zehn Minuten
in eine Sättigung läuft und damit das Ende der Anbindung anzeigt. Im Bereich des Plateaus
sind noch leichte Schwankungen des Signals zu sehen, die von der Art der Messung und
der bewegten Lösung herrührt.
In Tabelle 12 sind die verschiedenen Daten aus den ermittelten Funktionen weiterer Experimente
mit dem ersten NTA – Viologen Dendrimer zu finden.
Die Oberflächenbedeckung des Dendrimers ergibt sich näherungsweise aus dem Grenzwert
bei längeren Wartezeiten. Im vorliegenden Beispiel erhalten wir eine Änderung des
Winkels von 479.0 m°, was bei einer Umrechnung von 122 m° zu 1 ng/mm 2 zu einer gesamt
90

Ergebnisse und Diskussion
Anlagerung von 3.92 ng/mm 2 führt. Damit erhält man für diese Messung eine Oberflächenkonzentration
von 1.75 fmol/mm 2 .
Für die anderen Messungen dieses und der weiteren Dendrimere wurde analog verfahren.
Die zusammenfassenden Daten finden sich in Tabelle 9 und die entsprechenden Messungen
und einzelnen Daten finden sich im Anhang.
4.2.3 Zusammenfassung der drei NTA – Viologen Dendrimere
Zur kurzen Übersicht werden die Daten der verschiedenen Experimente (elektrochemisch
und SPR) noch einmal kurz zusammengefasst.
4.2.3.1 Elektrochemie
Bei allen drei Dendrimeren konnte eine Anlagerung an die Elektroden durch CV - Messungen
bestätigt werden. Zusätzlich wurden Strom – Zeit Kurven erstellt, damit ein besserer
Überblick von der Assoziation bekommen werden kann. Anhand dieser Auftragung konnte
gezeigt werden, dass die Dendrimere sich zu Beginn der Messung sehr schnell an die Elektrodenoberfläche
anlagern, durch einen stetigen Zuwachs der Stromantwort. Durch dieses Verhalten
ist es auch eindeutig von einer frei diffundierenden Redoxspezies zu unterscheiden, die
einen konstanten Wert über die Zeit liefert. Alle drei Dendrimere zeigen in den Messungen
ein exponentielles Wachstum, das in eine Sättigung übergeht und asymptotisch gegen einen
Grenzwert konvergiert. Dieses Verhalten ist analog zu dem in den SPR – Messungen.
Aus den elektrochemischen Messungen ist ergibt sich durch Integration der letzten Redoxwellen
die übertragene Ladung, aus der sich die Bedeckung, bzw. die Oberflächenkonzentration
an Dendrimer berechnen lässt. Für die einzelnen Dendrimere ergeben sich die in
Tabelle 8 aufgeführten Werte.
4.2.3.2 SPR – Untersuchungen
Die drei verschiedenen Dendrimere wurden einzelnen beschrieben und diskutiert. In diesem
Kapitel werden die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der drei NTA – Viologen
Dendrimere zusammengefasst.
Allen drei Dendrimeren ist gemeinsam, dass, sobald einmal an der Sensoroberfläche gebunden,
sie nicht wieder desorbieren. Dieses Verhalten wird aus den verschiedenen Sensorgrammen
deutlich, die sowohl die Assoziation – als auch die Dissoziationsphase der Dendrimere
zeigen. Für die weiteren Betrachtungen kann davon ausgegangen werden, dass die
91

Ergebnisse und Diskussion
Dendrimere nicht ohne weiteres von der Oberfläche dissoziieren. Damit ist eine stabile
Grundlage für den Aufbau einer stabilen Matrix für Biosensoren geschaffen.
Als nächstes wurde die Bedeckung der Sensoroberfläche mit den verschiedenen Dendrimeren
betrachtet. Die Werte für die Bedeckung ergaben sich aus den gemessenen Änderungen
des Winkels durch die SPR – Messungen.
Alle Ergebnisse liegen in einem ähnlichen Bereich. Kleine Unterschiede gibt es bei der
Assoziationskonstanten k a , die bei dem Dendrimer 1 um den Faktor zwei größer ist als bei den
anderen beiden Dendrimeren. Dafür ist die maximale Bedeckung mit dem Dendrimer niedriger,
was sich deutlich auf die Oberflächenbedeckung auswirkt. Am höchsten ist die bei dem
Dendrimer 3.
92

Ergebnisse und Diskussion
4.3 Die Kontaktierung der Enzymmatrix durch die Zwischenschicht mit der
Elektrode
Im letzten Teil der Arbeit werden die bisherigen Ergebnisse rekapituliert und zu einem
vollständigen Bild zusammengeführt. Ziel ist es eine Enzymelektrode zu synthetisieren, die es
in der Form noch nicht gibt.
4.3.1 Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse
Bisher wurde gezeigt, dass das FNR –
Enzym an NTA modifizierte Oberflächen
binden kann und dabei gute Leistungen
zeigt. Das konnte durch die k red , k 2 , k 3 und
die K D – Werte, die im Teilkapitel 4.1 ermittelt
wurden, gezeigt werden (Abbildung
43). Die Veränderungen im Enzym haben
Abbildung 43: Schematische Darstellung der Experimente
mit den genetisch veränderten Enzymen
nur geringe Auswirkungen auf die Funktionsparameter
und erlauben die weitere
Abbildung 44: Schematische Darstellung der Experimente
zur Dendrimeranbindung (Kapitel 4.2)
Verwendung ohne gravierende Verluste in der Wirksamkeit. Zudem konnte gezeigt werden,
dass der Elektronentransfer vom gebundenen Enzym zur Elektrode äußerst effizient ist.
Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Dendrimere stabil und irreversibel an Goldoberflächen
binden und dabei elektrochemisch adressierbar sind (Abbildung 44). Die Formalpotentiale,
sowie die durchschnittliche Bedeckung wurden für die verschiedenen Dendrimere
ermittelt.
Jetzt sollen die Dendrimere verwendet werden,
um die Elektronen, die das FNR – Enzym bei der
Oxidation des NADPH’s produziert, von dem aktiven
Zentrum zur Elektrodenoberfläche zu transportieren.
Die vollständige bioaffine Matrix ist dabei aus
drei verschiedenen Teilen aufgebaut, der Elektrode, darüber das Dendrimer mit seinen Viologenen
und dem Ankermetall und ganz oben das genetisch veränderte Enzym, wie in Abbildung
45 dargestellt. Diese drei separaten Einheiten bilden zusammen eine Enzymelektrode.
Diese sollte das Enzym zu binden und die Elektronen ohne weitere Mediatoren transportieren.
Zum Nachweis der aktiven Bindung wird wieder die Elektrochemie und die SPR – Spektro-
93

Ergebnisse und Diskussion
skopie genutzt. Zum besseren Verständnis des Aufbaus und der Funktion wird die Diskussion
zu den Kontrollexperimenten vorweg genommen. So zeichnet sich ein vollständiges Bild der
Enzymelektrode.
In der Theorie sollten alle drei Sektionen essentiell sein, damit die Enzymelektrode arbeiten
kann. Trotzdem ist es wichtig zu prüfen ob dies auch wirklich so ist oder verschiedene
Teile für die Enzymelektrode nicht wichtig sind und damit der Theorie widersprechen. Dies
wird im Zuge verschiedener Kontrollexperimente
untersucht. Zur besseren Vorstellung
sollen hier bereits die Einzelheiten diskutiert
werden, damit sich das Bild der Enzymelektrode
und der Mechanismus dahinter klarer darstellt.
Die Elektrode als Grundlage und zur Aufzeichnung
des Signals ist eine unverzichtbare
Abbildung 45: schematischer Aufbau der Enzymelektrode
Grundlage. Aus Abbildung 45 wird deutlich,
dass auch das Dendrimer mit seinen Viologenen
nicht weggelassen werden kann, da andernfalls die Elektronen nicht von dem aktiven
Zentrum zu der Elektrode transportiert werden können und das Enzym keinen Grund hat an
der Elektrodenoberfläche zu verbleiben. Sollte es doch unspezifisch adsorbieren, wie es unter
bestimmten Bedingungen in Kapitel 2 diskutiert wurde, ist es denaturiert und liefert keinen
Beitrag zu einem Signal. Unabhängig zu diesen Betrachtungen ist ein direkter Elektronentransfer
von dem Enzym zu einer Elektrode nicht bekannt und schon oft untersucht worden,
weshalb speziell modifizierte Oberflächen notwendig sind.
Allerdings kann das Ankermetall, welches von der NTA – Funktion chelatisiert wird, ausgespart
werden, um zu sehen, ob es unspezifische Wechselwirkungen zwischen dem reinen
Dendrimer und dem Enzym gibt, die zu einer Anlagerung führen. Mögliche unspezifische
Wechselwirkungen könnten z.B. zwischen den basischen Histidinen und den Carbonsäuren
der NTA – Funktionen auftreten. Sollte es eine positive Stromantwort in diesen Kontrollexperimenten
mit den verschiedenen Enzymen geben, kann angenommen werden, dass die Assoziation
der Enzyme nicht auf dem Chelateffekt der Ni 2+ – Ionen mit den Histidinen beruht,
sondern eine andere Ursache hat.
Im letzten Teil wird untersucht, ob das genetisch veränderte Enzym ebenso gut an die
Dendrimermatrix bindet wie an die homogene NTA – Oberfläche, wie es in Kapitel 4.1.3 be-
94

Ergebnisse und Diskussion
schrieben wurde. Dafür muss nachgewiesen werden, dass das 4 – his Enzym spezifisch an die
Ankermetalle bindet und die anderen beiden Enzyme, das 2 – his und das wildtypische, nicht.
Daraus folgt, dass zwei unterschiedliche Messreihen zur Überprüfung nötig sind, damit
gezeigt werden kann, ob der vorgeschlagene Mechanismus zum Aufbau der reagenzlosen
Bioelektrode korrekt ist. Zuerst wird untersucht, ob es Wechselwirkungen zwischen der metallfreien
Dendrimeroberfläche und den verschiedenen Enzymen gibt und im zweiten Schritt
wird das Ni 2+ – Kation chelatisiert, um herauszufinden, ob die erweiterten Bindungseigenschaften
des 4 – his Enzyms auch für die Dendrimere zutreffen.
Als erstes soll die Assoziation des Enzyms an eine mit Dendrimeren modifizierte Goldoberfläche
untersucht werden. Dabei wird die SPR – Spektroskopie als analytisches Mittel zur
Beobachtung der Anlagerung eines Enzyms an eine Oberfläche verwendet, um einen qualitativen
Indiz zu geben, ob es möglich ist ein Enzym an die Dendrimere zu binden. Die in Kapitel
4.2.2.5 beschriebene Prozedur zur Anlagerung der Dendrimere an die SPR – Sensoroberfläche
wurde angewandt, um das mit NTA und Viologen modifizierte Dendrimer anzulagern.
Im nächsten Schritt wurde die Dendrimeroberfläche mit einer 0.025 M NiSO 4 , 0.1 M KNO 3 ,
Lösung gespült, damit das NTA ein zweiwertiges Übergangsmetall als Ankergruppe chelatisiert.
Im letzten Schritt wird mit einer FNR – Enzymlösung gespült. Die Anlagerung des Enzyms
an die Oberfläche lässt sich wieder über die Änderung des SPR – Winkels erkennen.
4.3.2 Ausblick
Die ersten SPR – spektroskopischen Experimente zur Anbindung des FNR – Enzyms verliefen
positiv, was exemplarische in Abbildung 46 dargestellt ist. Die Anlagerung des Enzyms
ist in dem ersten Viertel der Messung besonders hoch. Es wird eine Änderung von ca. 250 m°
gemessen. Der in Abbildung 45 dargestellte schematische Aufbau konnte durch die ermittelten
Daten bestätigt werden. Danach flacht die Steigung merklich ab und konvergiert langsam
gegen einen Grenzwert von 230 m°. Nachdem die Assoziationsphase abgeschlossen ist und
zur Dissoziationsphase übergegangen wird, diffundiert auch ein Teil des Enzyms wieder von
der Oberfläche weg. Dieser Abfall des Signals ist nicht unerwartet, da sich ein Gleichgewicht
zwischen dem gebundenen und dem freien Enzym einstellt. Auch bei den früheren Messungen
wurde das festgestellt. Die Analyse der Dissoziation zeigt einen Verlust von
0.65 ng/mm 2 , bzw. einen Rückgang des Signals von 80 m°. Die Dissoziation des Enzyms verläuft
langsam und nach vier Stunden pendelt sich ein Grenzwert ein.
95

Ergebnisse und Diskussion
500 nM 4-his- FNR
Enzymmatrix
Ni 2+ Ni 2+ Ni 2+
Dendrimermatrix
Winkeländerung [m°]
250
200
150
100
50
0
Goldelektrode
0 1 2 3 4 5
t [h]
Abbildung 46: Kinetischer Plot zum Assoziations- und Dissoziationsverhalten der 4 his – FNR am Dendrimer 1.
SPR – spektroskopische Messung einer 500 nM 4 his – FNR in 0.1 M PB, 0.1 M KNO 3 . Links ist eine schematische
Darstellung des Assoziationsvorgangs an die Dendrimermatrix. Die Enzymlösung wurde eine Stunde über die
Oberfläche des SPR – Detektors gespült und anschließend mit reinem Puffer gewaschen. Links ist schematisch der
Aufbau der Enzymelekrode zu sehen.
Somit wird exemplarisch gezeigt, dass die Dendrimere in der Lage sind über die verwendeten
NTA Funktionen und Ni 2+ als Ankermetall FNR – Enzyme, die mit zusätzlichen Histidinen
in der Peripherie ausgestattet sind, zu binden. Mit diesen ersten Ergebnissen kann nun
zum nächsten Schritt übergegangen werden, in dem ein genauerer Blick auf die Anbindung
der Enzyme und der weiteren Eigenschaften die Dendrimere geworfen wird.
4.3.2.1 Elektronentransport über gebundene Viologene
Es soll auf elektrochemischem Wege die qualitative Anbindung der FNR – Enzyme gezeigt
werden, um somit einen Nachweis auf eine erfolgreiche Immobilisierung zu erbringen.
Genauso aussagekräftig sind elektrochemische Messungen, die deutlich schneller durchzuführen
sind. Die SPR – Spektroskopie stellt eine Methode dar, um die Anlagerung eines Proteins
an eine Oberfläche zu untersuchen. So konnte gezeigt werden, dass die FNR – Enzyme an
Dendrimeroberflächen binden. Doch auch durch zyklische Voltammetrie analytische elektrochemisch
Methode kann die Anbindung zu visualisiert werden. Zwar ist die Detektion des
Signals komplizierter als mit spektroskopischen Methoden, da das Enzym keine reversiblen
elektrochemischen Sonden oder Funktionen trägt und das einzige zu erwartende Signal von
den Viologenen des Dendrimers kommt. Doch das Enzym als Oxidoreduktase ist in der Lage
Elektronen aus dem Substrat zu ziehen, die detektiert werden können.
Wird zu dem Messpuffer das Substrat gegeben und um das Formalpotential der Viologene
gemessen, sollte demnach das Enzym stetig neue Elektronen liefern, um die oxidierten Violo-
96

Ergebnisse und Diskussion
gene erneut zu reduzieren. Dadurch ergibt sich ein konstanter Strom an Elektronen von dem
Substrat über das Enzym und von da aus durch die Viologene zu der Elektrode. Durch die
Gewissheit, dass das FNR – Enzym an die Dendrimeroberflächen bindet kann die ZV als weiteres
Werkzeug verwendet werden, um die Bindung zwischen diesen Beiden zu bestätigen.
Zusätzlich geben diese Experimente auch Aufschluss darüber, ob die Dendrimere als geeignete
Immobilisierungsmatrix für Enzyme geeignet sind. Hierfür müssen zwei Voraussetzungen
erfüllt sein, die Assoziation der Enzyme in ihrer nativen Form, damit sie Reaktionen katalysieren
können, und der Transport der Elektronen von dem aktiven Zentrum zu der Elektrodenoberfläche.
Die Ergebnisse dieser Experimente werden auf den nächsten Seiten beschrieben
4.3.2.2 Die qualitative Anbindung der Enzyme an Dendrimeroberflächen
Die vorbereiteten Elektroden 14 werden in den Messaufbau eingesetzt und mittels zyklischer
Voltametrie untersucht. Wird eine Messung mit der vollständig aufgebauten Oberfläche
in Phosphatpuffer ohne Substrat betrachtet, sollte nur das reversible Signal der Viologene
aufgezeichnet werden. Im nächsten Schritt, nach der NADPH Zugabe, sollte sich die aufgezeichnete
Strom – Spannungskurve ändern, insofern es einen Elektronentransfer von dem
Enzym über die Viologengruppen zu der Elektrode gibt. In Abbildung 47 links ist der Vergleich
zwischen einer Messung mit und ohne NADPH zu sehen. Die schwarze Linie zeigt den
Hintergrund, in dem nur ein Signal von den Viologenen bei E 0 = -0.46 V erscheint. Das Enzym
selber ist in diesem elektrochemischen Fenster nicht zu detektieren. Nach Zugabe des
NADPHs zu dem Leitelektrolyten und erneutem Messen verändert sich das detektierte Signal.
Zwar ist das Enzym an sich immer noch nicht elektrochemisch adressierbar, aber es erzeugt
Elektronen aus der Reaktion mit dem Substrat. Somit wird eine erfolgreiche Anbindung des
Enzyms qualitativ bestätigt.
14 Ohne KNO 3 in der Inkubations- und Messlösung
97

Ergebnisse und Diskussion
600
400
400
300
200
i [nA]
0
200
374 nA
100
-200
0
-400
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
E [V vs. Ag/AgCl]
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
Abbildung 47: Qualitative Strom – Spannungskurve der Enzymelektrode.
Links ist der schematische Aufbau der Enzymelektrode und der katalytischen Reaktion dargestellt. In der Mitte
sind im Vergleich die Stromspannungskurven mit (schwarze Linie) und ohne (rote Linie) NADPH zu sehen. Die ZVs
wurden mit 5 mV/s aufgenommen. Rechts ist die Differenz der Kurven zu sehen. Die Kurve zeigt einen Sprung beim
E 0 der Viologene und zeigt den Strom der enzymatisch katalysierten Reaktion. Die Messungen wurden in 0.1 M PB,
pH 7.5, durchgeführt.
Die Form des ZVs zeigt, dass es sich um eine katalysierte Reaktion handeln muss. In dem
Potentialbereich kleiner -0.46 V vs. Ag/AgCl liegen die Viologene in der reduzierten Form
vor. Wird die Spannung positiver als -0.46 V, werden die Viologene oxidiert, was sich in einem
Anstieg des Signals zeigt. Bei einer oberflächengebundenen Spezies ist die Anzahl der
verfügbaren Elektronen der Redoxspezies bekannt. Bei ZV – Messungen werden beim Überschreiten
des Formalpotentials alle elektrochemischen Sonden oxidiert (oder reduziert) und
die Fläche, die in der Stromspannungskurve erscheint ist proportional zur Anzahl der übertragenen
Ladung. Wird die Anzahl der Elektronen künstlich erhöht, wie in dem hier beschriebenen
Experiment, steigt der gemessene Strom, unabhängig von der angelegten Spannung, deutlich
an und läuft gegen einen Plateauwert. Dieser ist abhängig von der Geschwindigkeit der
katalysierten Reaktion und der Elektronentransferrate über die Redoxsonden.
98

Ergebnisse und Diskussion
NADPH NADP + +H + -0,2 -0,1 0,0
Dendrimerfilm
2 e -
Goldelektrode
i [µA]
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
ZV zur Enzymanbindung
0,0
-0,2
-0,4
E [V vs Ag/AgCl]
0 2000 4000
t [s]
Abbildung 48: ZV's und zeitliche Projektion des Stroms während der Enzymanbindung.
Links ist eine schematische Darstellung der ablaufenden Reaktion vor der Elektrode. In der Mitte ist die Strom –
Spannungskurve während der Anbindung der 4 his – FNR an die Dendrimermatrix. Rechts ist die Auftragung des
Stroms bei -0.2 V gegen die Zeit. Die ZVs wurden mit 5 mV/s aufgenommen, in 5 mM NADPH, 0.1 M KNO 3 ,
0.05 M PB, pH 7.5.
In einem weiteren Experiment (Abbildung 48) wurde das Enzym zusammen mit seinem
Substrat zu der vollständig aufgebauten Dendrimeroberfläche gegeben. Während der Adsorption
konnten von den Enzymen, die sich in der Nähe der leitfähigen Matrix aufhielten, die
durch bioelektrokatalytische Reaktion entstandenen Elektronen abgeleitet werden. Somit kann
ein Rückschluss auf die Assoziation der Enzyme an die Oberfläche gezogen werden, da der
Strom immer größer wird. Deshalb müssen immer mehr Enzyme an der Phasengrenze sein
und liegen nicht homogen in der Lösung verteilt vor. Zwischen den Enzymen und der
Dendrimermatrix muss eine Bindung aufgebaut worden sein.
Dieser Versuch zeigt ein analoges Verhalten zu den SPR Untersuchungen, die bereits vorgestellt
wurden, und bestätigt die erfolgreiche Assoziation der Enzyme an die Oberfläche.
Zusätzlich zeigt es die große Stabilität des Enzyms, da die Reaktion über eine Stunde andauerte
und sich nur langsam ein Plateau abzeichnet.
Mit diesem Experiment wurden zwei Dinge gezeigt, zum einen wurde eine schnelle Alternative
zu den SPR – Experimenten gefunden. Zum anderen konnte eruiert werden, dass es
möglich ist die freigesetzten Elektronen aus der enzymatisch katalysierten Reaktion über die
Viologene zur der Elektrode zu transportieren. Durch Kontrollexperimente, die im nächsten
99

Ergebnisse und Diskussion
Kapitel beschrieben werden, wird gezeigt, dass nur wenn alle Komponenten des Aufbaus
vollständig sind, der Sensor korrekt funktioniert.
4.3.2.3 Kontrollexperimente
Abbildung 49: schematische Darstellung der Kontrollexperimente.
Diese beiden Fälle zeigen warum es
in diesen Fällen nicht zu einer Bindung kommen wird.
Der Hintergrund zu diesen Experimenten ist
bereits oben dargestellt und hier werden nur die
Ergebnisse vorgestellt und diskutiert. Abbildung
49 stellt die beiden Fälle die den Kontrollexperimenten
zugrunde liegen noch mal dar. Im
linken Fall kann es nicht zu einer Bindung
kommen, da das Metall als Verbindung fehlt
und in dem zweiten Fall sind die Histidine nicht
vorhanden, die zu dem Metall binden könnten.
4.3.2.3.1 Bindungseigenschaften der metallfreien Dendrimeroberflächen zu den
FNR – Enzymen
Der Aufbau des Biosensors erfolgte wie in Abschnitt Fehler! Verweisquelle konnte
nicht gefunden werden. beschrieben, mit der Änderung, dass das Ni 2+ – Kation nicht in die
NTA – Funktion eingelagert, sondern die Elektrode sofort in die jeweilige Enzymlösung getaucht
wurde. Wenn die Theorie zum Aufbau des Biosensors korrekt ist, sollte in keinem der
Experimente ein elektrochemisches Signal zu sehen sein, das auf katalytischen Strom hindeutet.
Zu erwarten ist nur das Signal der Viologene, die an das Dendrimer gebunden sind. Falls
sich eine Strom – Spannungskurve in den Messungen zeigt, die auf eine katalytische Aktivität
hindeutet, muss ein anderer Bindungsprozess involviert sein. Typischerweise ist unspezifische
Adsorption, ausgehend von schwachen Wechselwirkungen, zu erwarten, die allerdings nicht
annähernd so viel ausmacht wie die spezifische und gerichtete Bindung eines voll ausgearbeiteten
Biosensors. In Abbildung 50 ist links die erste Kontrollmessung zu sehen, die mit dem
wildtypischen Enzym durchgeführt wurde. In der ersten der zwei Messungen (schwarze Linie)
ist die Hintergrundmessung zu sehen, bei der kein NADPH zugegeben wurde. Lediglich
die Redoxwellen der Viologene sind gut ausgebildet und geben ein reversibles Signal. Im
Vergleich zu Abbildung 47 verlaufen die Hintergrundmessungen analog zueinander.
100

Ergebnisse und Diskussion
100
50
0
i [nA]
-50
-100
-150
-200
-0,50 -0,25 0,00
-0,50 -0,25 0,00 -0,50 -0,25 0,00
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 50: ZV's zur Bestimmung des Bindungsmechanismus am Dendrimer 1.
Von links nach rechts sind die WT – FNR, die 2 his –FNR und die 4 his – FNR dargestellt. Die Oberfläche ist mit
dem Dendrimer inkubiert und wurde danach mit der jeweiligen 500 nM Enzymlösung behandelt. Gemessen wurde in
0.1 KNO 3 , 0.05 M PB, pH 7.5 und einer Spannungsvorschubsgeschwindigkeit von 5 mV/s. Die rote Linie zeigt den
Grundstrom und die schwarze Linie den Strom nach Zugabe von 5 mM NADPH.
In der zweiten Messung (rote Linie) nach Zugabe des Substrats, die mit der gleichen Elektrode
durchgeführt wurde, kann keine Änderung in der Form des ZVs festgestellt werden. Weiterhin
sind die einzigen Signale, die detektiert werden, diejenigen der Viologene. Es kann also
davon ausgegangen werden, dass sich kein Enzym an die Elektrode angelagert hat, weshalb es
auch nicht zu einem Anstieg der Stromantwort kommt.
Für das Fehlen des katalytischen Stroms bei diesem Experiment gibt es zwei Gründe. Einerseits
handelt es sich um das native Enzym, welches keine zusätzlich eingebrachten Histidine
in der Primärstruktur aufweist, die in der Lage sind an Übergangsmetalle zu binden. Andererseits
fehlt das Übergangsmetall in der Dendrimermatrix zur Ausbildung der Bindung. Es kann
festgehalten werden, dass mit einer unvollständigen Immobilisierungsmatrix und dem nativen
Enzym keine Enzymelektrode aufgebaut werden kann und auch die unspezifische Adsorption
keinen nennenswerten Beitrag zu der Stromantwort liefert.
101

Ergebnisse und Diskussion
Das nächste Enzym, welches auf der inaktiven Oberfläche untersucht wird ist die 2 – his
FNR, die in ihrer Peripherie zwei zusätzliche Histidine trägt. Damit ist es möglich an eine
modifizierte Oberfläche zu binden, wie es auch in den Messungen in Kapitel 4.1 gezeigt wurde.
In Abbildung 50 ist die entsprechende Messung in der Mitte zu sehen. Nach Zugabe des
NADPH zu dem Elektrolyten sollte sich bei einer erfolgreichen Immobilisierung des Enzyms
ein katalytischer Strom zeigen. Doch in der zweiten Messung (rote Linie) ist kein Unterschied
zu der Hintergrundmessung zu erkennen. Wie in der vorhergehenden Messung kann auch hier
eine Assoziation des Enzyms an die Oberfläche ausgeschlossen werden. Aus Kapitel 4.1 ist
bekannt, dass es zu einer Anlagerung des 2 – his FNR Enzyms kommt, solange es eine hohe
Konzentration an freiem Enzym in der Inkubationslösung gibt, die im Gleichgewicht mit der
gebundenen Spezies steht. Nachdem die Elektrode gespült wurde, dissoziiert ein Großteil des
Enzyms von der Elektrode weg, weshalb die Oberflächenkonzentration an Enzym zu gering
sein, bzw. gegen null konvergieren wird, als das ein Signal detektiert werden könnte.
Im letzten Schritt wird untersucht, ob das 4 – his FNR Enzym an die unvollständige Matrix
bindet. Analog zu den vorhergehenden Messungen und den Erfahrungen der anderen Enzyme
sollte auch in diesem Fall kein Bindungsereignis eintreten. In Abbildung 50 sind die
entsprechenden Messungen auf der rechten Seite abgebildet und es ist kein katalytischer
Strom nach der Zugabe von NADPH zu sehen. Die Erklärung ist analog zu der 2 his – FNR.
Der Mechanismus der Bindungsbildung ist damit zwingend an die Übergangsmetallionen
gebunden.
Alle drei Enzyme wurden auf der Dendrimermatrix ohne das Nickelkation untersucht und
bei allen Messungen wurde immer dasselbe Ergebnis erhalten. Keines der Enzyme bindet an
den reinen Dendrimeren solange keine Metallkationen mit freien Bindungsstellen vorhanden
sind. Daraus kann geschlossen werden, dass die Metallkationen ein essentieller Bestandteil
bei dem Aufbau der Immobilisierungsmatrix sind und die Theorie über die Bindung zwischen
dem Enzym und dem Dendrimer gestärkt werden.
4.3.2.3.2 Vergleich der verschiedenen Enzyme auf der Dendrimermatrix
Analog zu der vorhergehenden Messreihe wird wieder mit dem wildtypischen Enzym angefangen
und danach mit steigender Zahl der eingefügten Histidine weitergearbeitet. Die einzelnen
Untersuchungen werden mit ZV gemacht.
Für das wildtypische Enzym konnte das vorhergesagte Bindungsverhalten bestätigt werden.
In Abbildung 51 kann in der Kontrollmessung mit NADPH nur die Redoxwelle der Vio-
102

Ergebnisse und Diskussion
logene detektiert werden, die keine Unterschiede zu der Blankmessung aufweisen. Auch bei
der 2 – his FNR konnte nach der Zugabe des Substrates keine katalytische Aktivität festgestellt
werden.
100
50
0
i [nA]
-50
-100
-150
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0
E [V vs. Ag/AgCl]
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0
Abbildung 51: Untersuchung des „avidity“ Effekts am Dendrimer 1 zur Bestätigung des Bindungsmechanismus.
Die ZV's der wildtypischen (links) und der 2 – his FNR (rechts) auf der Dendrimermatrix. Die rote Linie zeigt
die Hintergrundmessung ohne Substrat und die schwarze Linie die Messung mit Substrat. Alle Messungen wurde in
0.1 M KNO 3 , 0.1 M entgastem PB, pH 7.5, Spannungsvorschubsgeschwindigkeit 5 mV/s
Als letztes wird die die 4 – his FNR erneut untersucht, damit die Ergebnisse aus den Voruntersuchungen,
die in Abbildung 47 zu sehen sind bestätigt werden. Die Vorbereitung der
Elektrode erfolgte mit einer Änderung analog zu der oben beschriebenen Durchführung 15 . Die
entsprechende Messung ist in Abbildung 52 abgebildet. Im Vergleich zu der oben gezeigten
Messung konnte die Immobilisierung durch einen Zusatz von KNO 3 in der Nickellösung, sowie
allen weiteren Lösungen die mit dem Dendrimer in Kontakt treten, verbessert werden.
Durch den komplexen Aufbau und die hohe Ladungsdichte der Dendrimere ist ein Kollaps
vorstellbar, wenn zu wenige Ionen in der Lösung vorliegen. Die größere Ionenstärke könnte
der entscheidende Unterschied zu der oben beschriebenen Prozedur sein, die das Dendrimer in
jedem Schritt stabilisiert und dafür sorgt, dass die Struktur besser erhalten bleibt.
15 Mit KNO 3 in der Inkubationslösung
103

Ergebnisse und Diskussion
700
600
500
400
i [nA]
300
200
600 nA
100
0
-100
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
E [V vs. Ag/AgCl]
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
Abbildung 52: Untersuchung der 4-his FNR mit optimierter Vorbehandlung des Dendrimers.
Die erneute Messung der 4 – his FNR mit (schwarze Linie) und ohne (rote Linie) NADPH in 0.1 M KNO 3 , 0.05 M
entgastem PB, pH 7.5, mit einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 5 mV/s zeigt ein deutlich besseres Verhalten.
Das katalytische ZV ist schärfer abgegrenzt von dem Hintergrundstrom des Dendrimers. Rechts ist die Differenz der
beiden ZV's abgebildet. Es konnte ein katalytischer Strom von ca. 600 nA gemessen werden.
Der katalytische Strom lag bei diesen Messungen, nach Abzug der Blankmessung, bei
knapp 600 nA und ist damit über 200 nA höher als bei den ersten Messungen. Auch der
Grundstrom und die Form des singuiden ZV's ist besser ausgeprägt als in den Voruntersuchungen.
Der Zusatz an KNO 3 , der schon in der Aufarbeitung der Dendrimere verwendet
wird, hat auch hier eine wichtige Rolle gespielt. Die Elektronen werden deutlich besser durch
die Dendrimermatix transportiert.
4.3.3 Kinetiken zur Anbindung des FNR Enzyms an die Oberfläche
Im nächsten Schritt wird die Anbindung des Enzyms an Goldoberflächen untersucht, analog
zu den Messungen mit dem Dendrimer. Dabei stehen wie in Kapitel 4.2.2 die SPR Spektroskopie
und die ZV als Werkzeuge zur Verfügung. Die Anbindung des FNR – Enzyms soll
auf beide Arten untersucht und die Ergebnisse dann miteinander verglichen werden.
4.3.3.1 SPR Untersuchungen
104

Ergebnisse und Diskussion
Für die Messungen an den Dendrimeren wird das gleiche Verhalten erwartet wie für die
kinetischen Untersuchungen, die in Kapitel 4.1.3 vorgestellt wurden. Bei Zugabe des Enzyms
auf die modifizierte Oberfläche wird ein Bindungsereignis eintreten, was auch schon in Abbildung
46 für Dendrimer 1 demonstriert wurde. In den ersten Minuten springt das Signal und
läuft in eine Sättigung, da sich das System im Gleichgewicht befindet und die Anzahl der
freien Bindungsstellen abnimmt. Wenn es nach dem sprunghaften Anstieg nicht zu einer Veränderung
der Oberfläche kommt bleibt das Signal stabil und schwankt um einen konstanten
Wert. Nach der Assoziation sollte es in der Dissoziation zu keinem signifikanten Absinken
des Signals kommen, solange die Oberfläche stabil ist und keine Metalle von dem Enzym aus
dem NTA – Molekül herausgelöst werden.
In der ersten Messung(Abbildung 46) wurde eine Konzentration von 500 nM FNR – Enzym
verwendet. Wie aus Kapitel 4.2.2 zu erwarten, ist in den ersten Minuten eine signifikante
Zunahme des Signals zu sehen, die gegen einen Plateauwert strebt, was auf die Einstellung
des Gleichgewichts zwischen Assoziation und Dissoziation schließen lässt, und dann langsam
ein wenig abnimmt. Dieses Verhalten entspricht den Erwartungen. Im zweiten Teil der Messung,
in der kein Enzym in der Lösung vor dem Messpunkt ist, kann ein Dissoziationsverhalten
beobachtet werden, welches auch gegen einen Grenzwert konvergiert. Das Dissoziationsverhalten
des Enzyms ist mit ca. 83 m° in einem ähnlichen Rahmen, wie im oben beschriebenen
Experiment. Damit konnten die vorher angestellten Vermutungen mit dem Experiment
bestätigt werden.
Die gesamte Winkeländerung der Messung ist kleiner als in den Experimenten in denen
das FNR – Enzym direkt über ein kurzes Verbindungsmolekül an die Oberfläche gebunden
war. Der geringere Anstieg kann mit der größeren Entfernung zu der Oberfläche zusammenhängen,
da die Wechselwirkung zwischen dem eingekoppelten Licht und der angelagerten
Materie zusätzlich von dem Dendrimer abgeschwächt wird und die Strahlung mit wachsendem
Abstand von der Oberfläche exponentiell abnimmt.
4.3.3.1.1 Abhängigkeit der Enzymkonzentration
Als nächstes wurden verschiedene Konzentrationen des 4 his FNR – Enzyms untersucht
und miteinander verglichen. Es ist zu erwarten, dass bei sehr kleinen Konzentrationen kaum
ein Signal zu detektieren sein wird, welches im Anfangsbereich linear ansteigt. Ab einer bestimmten
Konzentration wird das Signal langsam in eine Sättigung laufen, da mit steigenden
Bindungsereignissen auch die Wahrscheinlichkeit einer Dissoziation immer wahrscheinlicher
wird und sich ein Gleichgewicht zwischen Bindung und Bindungsbruch einstellt. Je häufiger
105

Ergebnisse und Diskussion
ein solcher Bindungsbruch auftritt, desto wahrscheinlicher ist es, dass sich ein Metallkation
aus der NTA – Funktion löst und in der Ankergruppe des Enzyms verbleibt.
In Abbildung 53 sind drei verschiedene Konzentrationen abgebildet, die untersucht wurden.
Neben der Änderung der maximalen Bedeckungen ist auch eine zeitliche Verschiebung
der Gleichgewichte zu sehen. Bei der ersten Messung mit der geringsten Konzentration von
25 nM stellt sich das Gleichgewicht quasi sofort ein. Das Signal springt nach der Injektion
nach oben und fällt dann leichten ab. In der Dissoziationsphase, sobald der Puffer gewechselt
wurde, kommt es erneut zu einem Sprung. Das Signal stabilisiert sich bei einer Winkeländerung
von 24.4 m°. Die zweite Messung mit einer Konzentration von 250 nM an 4 his FNR –
Enzym steigt auf 142 m° an und die Einstellung des Gleichgewichts erfolgt erst nach ca. 11
Minuten. Bei der letzten Messung mit der höchsten Konzentration von 500 nM wird ein Maximalwert
von 237 m° erreicht. Um auf diesen Wert zu kommen, benötigt das System ca. 24
Minuten. Allen drei Messungen ist gemein, dass sie noch einen kleinen Sprung zu höheren
Werten machen, wenn von dem Assoziationspuffer zurück auf den Dissoziationspuffer gewechselt
wird. Dabei kann festgehalten werden, dass dies gegenläufig zur Konzentration des
Enzyms ist. Das zweite Gleichgewicht, in der Dissoziationsphase, stellt sich analog zu den
ersten Gleichgewichten auch mit zunehmender Konzentration später ein und konvergiert gegen
einen Grenzwert, der konstant bleibt. Bei 25 nM ergibt sich ein Grenzwert von 24.4 m°,
was für eine sehr geringe Anlagerung an spricht. Bei der zehnfachen Konzentration wird ein
Grenzwert von 120.0 m°. Dies entspricht fast dem zehnfachen an angelagertem Enzym und
gibt einen guten Trend wider. Wird die Konzentration verdoppelt stellt sich aber das Gleichgewicht
nicht im doppelten Wert ein, sondern bei 153.9 m°, was zeigt, dass der Trend lediglich
bei kleinen Konzentrationen auftritt, sich aber nicht unendlich fortsetzt. Wahrscheinlich
verhält es sich, wie bei vielen anderen Techniken auch 16 , dass die Signale bei kleinen Konzentrationen
linear ansteigen, dann aber in eine Sättigung laufen. Das ist dadurch zu erklären,
dass die Anzahl der möglichen Plätze durch die Anzahl der Ni 2+ – Kationen in den NTA –
Funktionen limitiert ist.
16 Vergleiche UV/vis – Spektroskopie und weitere Spektroskopiearten
106

Ergebnisse und Diskussion
250
25 nM
250 nM
500 nM
Winkeländerung [m°]
200
150
100
50
0
1,0 1,5 2,0 2,5
t [h]
Abbildung 53: Konzentrationsabhängige Sensorgramm zur 4 his – FNR Anbindung an Dendrimer 1.
Ein Vergleich zwischen drei verschiedenen Konzentrationen der 4 his – FNR in 0.1 M PB, pH 7.5.
4.3.3.1.2 Unterschiede der verschiedenen NTA – Viologen Dendrimere
Nachdem die Anlagerung des 4 his FNR – Enzyms an dem NTA – Viologen Dendrimer 1
in verschiedenen Konzentrationen untersucht und die besten Ergebnisse mit einer Konzentration
von 500 nM erreicht wurden, die eine lange Stabilität auf der Dendrimeroberfläche erzielten,
sollen auch die anderen beiden Dendrimere, die im Laufe der Arbeit hergestellt wurden,
untersucht und mit dem ersten NTA – Viologen Dendrimer verglichen werden. Die Experimente
dazu verliefen analog zu der oben beschriebenen Methode.
In den Experimenten soll ein Unterschied der verschiedenen Modifizierungen untersucht
werden, wobei von dem NTA – Viologen Dendrimer 1 die besten Ergebnisse erwartet werden,
da es die höchste Anzahl an funktionalisierten Gruppen aufweist. Das NTA – Viologen
Dendrimer 2 sollte auch gute Ergebnisse zeigen, da die Ausbeute bei der Umsetzung des
Dendrimers mit über 80 % sehr gut war. Bei diesen beiden Dendrimeren ist sowohl die Anzahl
an Viologenen hoch genug, um die zusätzliche Last der Enzyme stabil auf der Oberfläche
zu halten, als auch die der NTA – Funktionen, damit ausreichend Ni 2+ auf der Oberfläche ist,
damit das Enzym an die Ankermetalle binden kann.
107

Ergebnisse und Diskussion
Bei der Synthese des dritten NTA – Viologen Dendrimers wurde keine gute Ausbeute erzielt
und es ist anzunehmen, dass sich das auch auf die Eigenschaften als Immobilisierungsmatrix
auswirken wird. Einerseits sind nur durchschnittlich drei Viologene pro Dendrimer
gebunden, weshalb die Makromoleküle nicht auf eine so starke akkumulierte Bindungsenergie
zurückgreifen können. Zudem kann es sein, dass der Elektronentransfer nicht gewährleistet
ist, da die vorhandene Viologene zu weit voneinander entfernt sind, als das die Elektronen
von einem Viologen zum anderen übertragen werden können. Andererseits sind nur fünf NTA
– Funktionen gebunden, was sehr wenige Bindungsplätze für das FNR – Enzym bedeutet. Da
aber das FNR – Enzym deutlich größer ist als ein Dendrimer stehen genügend Bindungsstellen
zur Verfügung, um trotzdem eine vergleichbare Oberflächenkonzentration an Enzym zu
erhalten.
Betrachten wir zuerst das NTA – Viologen Dendrimer 1, welches auch schon in Kapitel
4.3.3.1.1 mit verschiedenen Konzentrationen des 4 his FNR – Enzyms untersucht wurde. In
Abbildung 54 sind drei Sensorgramme zu sehen, welche die vollständige kinetische Untersuchung
mit der Assoziation und der Dissoziation des Bindungsverhaltens des FNR – Enzyms
zeigen. In der Assoziationsphase ist der erwartete sprunghafte Anstieg des Signals zu sehen,
der dann in eine leichte Abwärtsdrift übergeht. Bei der Dissoziation verläuft das Experiment
wie erwartet und aus vorherigen Untersuchungen bestätigt, es kommt zu einer erneuten Einstellung
des Gleichgewichts zwischen der Assoziation und der Dissoziation, die langsam gegen
einen Grenzwert konvergiert, der bei ca. 150 m° bis 120 m° liegt. Werden diese Messungen
mit denen des NTA – Viologen Dendrimers 2 verglichen, wie sie in Abbildung 55 zu sehen
sind, fällt zuerst auf, dass die Signale weder in der Dissoziationsphase noch in der Assoziationsphase
abfallen, wie es zu erwarten wäre, sondern konstant weiter ansteigen, selbst
wenn schon kein Enzym mehr in der Lösung vor der Detektoroberfläche ist. Diese Drift des
Signals kann zum einen thermische Gründe haben, was bedeutet, dass das Signal sich neben
der Änderung des Brechungsindex auch mit der Änderung der Temperatur ändert. Da die Änderungen
der Signale sehr klein sind im Vergleich zu dem Anstieg bei Zugabe des Enzyms
und den zu erwarteten Dissoziationen, kann diese Drift damit erklärt werden. Zudem zeigt es,
dass das Enzym an diesem Dendrimer sehr stark gebunden ist und nahezu keine Dissoziation
von der Oberfläche weg stattfindet.
108

Ergebnisse und Diskussion
300
250
Winkeländerung [m°]
200
150
100
50
0
-50
-50 0 50 100 150 200 250 300 350
Zeit [min]
Abbildung 54: Vergleichender kinetischer Plot des NTA – Viologen Dendrimers 1.
Es wurde mit 500 nM 4 his – FNR in 0.5 M PB, pH 7.5 inkubiert. Bei zwei Messungen wurde das Enzym zwei
Stunden inkubiert und bei einer Messung eine Stunde, wobei die fehlende Stunde zu der Dissoziation hinzugefügt
wurde.
Der Sprung des Signals bei dem Wechsel des Puffers kann durch die kurze Zeit kommen,
in der die Oberfläche nicht unter Solvens stand sondern lediglich benetzt war und es zu einem
Zusammenschrumpfen der gesamten Oberflächenkonstruktion, also dem Dendrimer mit dem
Enzym, kam. Dieser Effekt kann allerdings nicht sehr groß sein, da das Signal nur um wenige
m° schwankt. Die ermittelten Werte aus den Experimenten für eine Oberflächenbedeckung
mit dem Enzym liegen bei 204 bzw. 233 m°. Ein Endwert für die Dissoziation kann nicht angegeben
werden, da die thermische Drift bei den Experimenten zu groß ist. Die Anbindung
des FNR Enzyms an das dritte NTA – Viologen Dendrimer zeigt, wie erwartet, einen schnellen
Anstieg nach der Zugabe des Enzyms, die dann in eine langsamere, aber konstante Zunahme
des Signals läuft (Abbildung 56). Dabei werden sehr hohe Werte für die Assoziation
von über 300 m° gemessen. Ein so hoher Wert wurde aufgrund der schlechten Modifizierung
allerdings nicht erwartet. Ein Grund für diesen deutlich höheren Wert kann in der Größe des
Dendrimers liegen, da ein kleinerer Durchmesser angenommen werden kann und dadurch ist
das Enzym näher an der Oberfläche gebunden ist. Somit wird der Brechungsindex stärker
beeinflusst.
109

Ergebnisse und Diskussion
350
300
Winkeländerung [m°]
250
200
150
100
50
0
-50
0 50 100 150 200 250 300
Zeit [min]
Abbildung 55: Anbindung der 4 his – FNR an die Oberfläche des Dendrimers 2.
Vergleichende Assoziation und Dissoziation der 4 his FNR an der NTA – Viologen Dendrimer 2 Oberflächen. Es
wurde mit 500 nM 4 his – FNR in 0.5 M PB, pH 7.5 inkubiert und danach mit 0.5 M PB, pH 7.5, die Dissoziation
beobachtet.
Wie weiter oben schon angedacht, hat die geringe Bedeckung mit funktionellen Gruppen
am Dendrimer keinen negativen Einfluss auf die Assoziation des Enzyms, sondern gibt eher
exaktere Werte, da das Bindungsereignis näher am Detektor stattfindet. Bei der Dissoziation
wird beobachtet, dass ein großer Teil des Enzyms schwach an das Dendrimer gebunden ist
und die Werte sich bei 194 m° bzw. 144 m° einpendeln. Dadurch ergeben sich Oberflächenkonzentration
an Enzym, die im gleichen Bereich liegen, wie die des ersten NTA – Viologen
Dendrimers. Zusätzlich scheint sich das Gleichgewicht direkt eingestellt zu haben, da es nicht
zu einem langen Abfall des Signals kommt, sondern die Werte sich sofort um einen konstanten
Wert pendeln.
110

Ergebnisse und Diskussion
400
350
Winkeländerung [m°]
300
250
200
150
100
50
0
-50 0 50 100 150 200 250 300 350
Zeit [min]
Abbildung 56: Anbindung der 4 his FNR an das Dendrimer 3
Vergleichende Assoziation und Dissoziation der 4 his FNR an der NTA – Viologen Dendrimer 3 Oberfläche. Es
wurde mit 500 nM 4 his – FNR in 0.5 M PB, pH 7.5 inkubiert und danach mit 0.5 M PB, pH 7.5, die Dissoziation
beobachtet.
Zusammenfassend für alle drei Dendrimere kann festgehalten werden, dass sich Enzyme
binden lassen, die in ihrer Peripherie Histidingruppen tragen, die als Anker an Übergangsmetalle
binden können. Weitere Untersuchungen über den Elektronentransfer über die Viologene
werden im folgenden Kapitel vorgestellt.
4.3.3.2 Elektrochemische Untersuchungen
Die ersten elektrochemischen Experimente zu dem NTA – Viologen Dendrimer 1 sind bereits
in Kapitel 4.3.2.3.2 beschrieben, weshalb an dieser Stelle auf diese Ausführungen verwiesen
wird.
Die elektrochemischen Experimente zu den anderen beiden Dendrimeren beschränken
sich auf die qualitativen Stromantworten. Unterschieden wird zwischen den Blankmessungen
ohne Substrat und mit Substrat. Mit diesen Experimenten wird zusätzlich zu den SPR – Messungen
bewiesen, dass es eine Bindung von der modifizierten Oberfläche zu dem Enzym aufgebaut
werden konnte. Die Messungen erfolgen analog zu den in Kapitel Fehler! Verweisquelle
konnte nicht gefunden werden. beschriebenen Methoden. Im Falle einer Abweichung
111

Ergebnisse und Diskussion
zu den oben genannten Prozeduren sind die veränderten Bedingungen direkt bei dem jeweiligen
Experiment beschrieben.
Das zweite NTA – Viologen Dendrimer, welches hohe Oberflächenbedeckungen bei den
bisherigen Untersuchungen gezeigt hat, wurde erst mit Ni 2+ behandelt und anschließend mit
der 4 his FNR modifiziert. Zwischen der Chelatisierung des Metalls und der Enzymanbindung
wurde überprüft, ob sich das Dendrimer von der Oberfläche gelöst hat. Anhand des ZV’s
kann dies aber ausgeschlossen werden. Aus den bisherigen Messungen kann dies auch geschlossen
werden, da es zu katalytischen Strömen kommt, was mit der Theorie hinter den
Experimenten einhergeht.
100
0
i [nA]
-100
-200
-300
-400
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 57: Test des Dendrimers 2 als Enyzmelektrode und Redoxrelais.
Die Messungen sind zur Kontrolle auf katalytischen Strom über die Viologene des Dendrimers. Die rote Linie
zeigt die Blankmessung und die schwarze Linie die Messung mit 5 mM NADPH. Gemessen wurde mit 5 mV/s in entgastem
0.1 M KNO 3 , 0.05 M PB, pH 7.5.
In den elektrochemischen Messungen zur Kontrolle, ob das Enzym sich an die Elektrode
angelagert hat, kann ein Unterschied zwischen der Blankmessung und der eigentlichen Messung
festgestellt werden. Die Form des ZV’s lässt auf eine katalytische Reaktion des Enzyms
mit dem Substrat schließen. Gegen diese Beobachtung spricht der Strom, der lediglich am
Ende im positiven Bereich gemessen wird. Ursache hierfür kann die schlechte Beschichtung
112

Ergebnisse und Diskussion
der Elektrodenoberfläche sein, oder dieses Dendrimer ist nicht für die Anbindung von Enzymen
und/ oder den effektiven Elektronentransfer geeignet.
Zuletzt wird das dritte NTA – Viologen Dendrimer betrachtet, welches nach NMR Untersuchungen
die schlechtesten Voraussetzungen für eine effektive Enzymanbindung und den
Transport der Elektronen haben sollte. Die Anbindung des Dendrimers an die Elektrode konnte
trotz der geringen Oberflächenbedeckung mit aktiven Thiolen detektiert werden, ebenso die
Anbindung des Enzyms, sowie ein stabiler Verbleib an der Oberfläche.
50
i [nA]
0
-50
-100
-0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 58: Verwendung von Dendrimer 3 als Enzymelektrode und Redoxrelais.
Zyklische Voltammogramme mit (schwarze Linie) und ohne (rote Linie) NADPH an dem NTA – Viologen
Dendrimer 3. Die Messung wurde in entgastem 0.1 M KNO 3 , 0.05 M PB, pH 7.5, mit 5 mV/s durchgeführt.
Wie in Abbildung 58 zu sehen ist, gibt es kaum einen Unterschied zwischen der Blankmessung
und der Aktivitätsmessung, in der Substrat zu der Messlösung gegeben wurde. Es
lässt sich feststellen, dass die Oberfläche der Elektrode nicht homogen zu sein scheint, da es
keine grade Grundlinie gibt und sich nicht die zu erwartenden Redoxwellen einer immobilisierten
Spezies ausbilden. Ein katalytischer Strom wurde von dieser Messreihe auch nicht
erwartet, da die Ausbeute an Viologenen an dem Dendrimer sehr gering ist. Durch die SPR
Experimente konnte aber eine Anlagerung des Enzyms detektiert werden, weshalb es auch
mit elektrochemischen Methoden, sofern er nicht denaturiert, detektierbar sein muss. Aus
früheren Messungen mit dem Dendrimer und dem FNR Enzym ist bekannt, dass nicht alle
113

Ergebnisse und Diskussion
Redoxmediatoren für einen Transport der Elektronen zu gebrauchen sind. So ergab es sich,
dass das Ferrocenmethanol, welches in Kapitel 4.1.3 zur Quantifizierung der kinetischen Eigenschaften
der genetisch veränderten Enzyme verwendet wurde, in diesem Fall nicht zu gebrauchen
ist. Aus diesem Grund wird eine Lösung mit Hexacyanoferrat verwendet, damit ein
sauberes Signal detektiert werden kann.
400
300
i [nA]
200
100
0
-100
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 59: Katalytischer Nachweis der Bindung zwischen Dendrimer 3 und der 4 his – FNR.
Die rote Linie zeigt die Blankmessung ohne NADPH und die schwarze Linie die Messung mit NADPH. Gemessen
wurde in 0.1 M KNO 3 , 0.05 M PB, pH 7.5, 0.05 mM K 4 (CN) 6 mit einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von
5 mV/s.
In Abbildung 59 sind die Ergebnisse der Messungen mit einem diffussiblen Redoxmediator
zu sehen. In der Blankmessung ist eine ZV Messung mit einer Peakaufspaltung von
73.2 mV zu sehen, was einem quasireversiblen System entspricht. Wird das Substrat zu der
Elektrolytlösung gegeben und die Messung wiederholt, verändert sich die Form des ZV’s zu
einem singoiden ZV, was eindeutig auf eine katalytische Reaktion schließen lässt. Anhand
dieser Messung lassen sich zwei Dinge schlussfolgern. Erstens ist auch ein wenig modifiziertes
Dendrimer in der Lage, eine hinreichende Matrix auszubilden, die ein Enzym erfolgreich
an eine Oberfläche zu bindet, was mit der SPR – Spektroskopie gezeigt wurde und nun durch
die elektrochemische Analytik bestätigt wird. Zweitens ist eine Mindestmenge an Redoxme-
114

Ergebnisse und Diskussion
diatoren innerhalb der Matrix nötig, die, an verschiedene Dendrimere gebunden, „frei“ diffundieren
können, damit ein Elektronentransfer ermöglicht wird.
Für weitere Untersuchungen wäre es Interessant, das NTA – Viologen Dendrimer 2 auch
mit einem freidiffundierenden Redoxmediator zu untersuchen, damit geklärt werden kann, ob
sich das Enzym an die Matrix anlagert, wie es die SPR Messungen zeigen oder ob ein messtechnisches
Problem vorliegt, weshalb es keine sauberen katalytischen Signale im ZV gibt.
4.3.4 Stabilität des FNR Enzyms an der Oberfläche
Nachdem mit zwei unterschiedlichen Techniken gezeigt werden konnte, dass es möglich
ist, das FNR Enzym in seiner veränderten Struktur an intelligent komponierte Oberflächen zu
binden, soll nun untersucht werden, wie lange ein solches Enzym aktiv sein kann. Dabei werden
Langzeitmessungen durchgeführt und mittels Chronoamperometrie verfolgt.
Für diese Experimente wird wieder der diffusible Redoxmediator [Fe ll (CN) 6 ]/ [Fe lll (CN) 6 ]
verwendet. Für diese Messungen, sollte der Aufbau des Dendrimers für die Stabilität des Enzyms
in erster Näherung ohne Bedeutung sein, da schon in Kapitel 4.1 mit einer deutlich einfacheren
Oberfläche gezeigt werden konnte, dass das Enzym eine hohe Stabilität aufweist.
Nichtsdestoweniger muss auch bei diesen Arrangements überprüft werden wie lange das Enzym
in der Lage ist Elektronen zu liefern solange genug Substrat in der Lösung vorhanden ist.
115

Ergebnisse und Diskussion
400
i [nA]
200
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
t [h]
Abbildung 60: Chronoamperometrische Langzeitmessung der 4 his – FNR mit Dendrimer 3.
Stromverlauf bei einem konstanten Potential von 0.3 V vs. Ag/AgCl über zwei Stunden. Gemessen wurde in
0.1 M PB, pH 7.5, 0.05 mM K 4 (CN) 6 .
In Abbildung 60 ist eine entsprechende Langzeitmessung zu sehen, in der das Enzym über
zwei Stunden einen konstanten Strom von ca. 190 nA produziert. Für dieses System liegt der
Wert von 190 nA in guter Übereistimmung mit den gewonnen Daten, wie sich aus Tabelle 10
ergibt.
Tabelle 10: Messwerte und Mittelwert der chronoamperometrischen Messungen mit Hexacyanoferrat als Redoxmediator
Messung 1 190 nA
Messung 2 217 nA
Messung 3 172 nA
Durchschnitt 193 nA
Somit kann davon ausgegangen werden, dass die 4 his – FNR an dieser Dendrimeroberfläche
in der Lage ist über einen langen Zeitraum stabile und reproduzierbare Ergebnisse zu
liefern.
In den Ausführungen in Kapitel 4.3- liegt die wichtigste Aussage der Arbeit. Die Kombination
der genetisch veränderten Enzyme mit den künstlichen Dendrimeren zur Synthese einer
Enzymelektrode. Die Herstellung und der Mechanismus konnte durch verschiedene Kon-
116

Ergebnisse und Diskussion
trollexperimente nachgewiesen werden. Die Anbindung der 4 his – FNR an drei verschiedene
Dendrimere wurde mit SPR Spektroskopie bestätigt und in zwei Fällen die Leitfähigkeit von
Elektronen über die Dendrimere zur Elektrode. Auch die Stabilität der Enzyme über einen
Zeitraum von zwei Stunden wurde durch chronoamperometrische Messungen gezeigt.
117

Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit, die Verbindung von den genetisch veränderten Enzymen mit den
speziell angepassten Dendrimeren, wurde erreicht. Hierzu wurde als erstes die katalytische
Aktivität der doppelt genetisch veränderten 4-his FNR mit der des nativen Enzyms und der
genetischen Zwischenstufe 2 his – FNR verglichen, um negative Einflüsse einer Mutation
auszuschließen.
Die Mutanten wurden mit dem Ziel generiert, in einer neuen „chelatartigen“ Anbindung in
optimaler Orientierung an eine Oberfläche zu binden. Die Stabilität der verschiedenen Enzyme
nach der Anbindung wurde untersucht. Anschließend konnte durch intelligentes Design
einer neuartigen Polymermatrix, basierend auf PAMAM-Dendrimeren, die neue Anbindung
der Enzyme demonstriert werden. Zudem wirkte die Immobilisierungsmatrix zusätzlich als
Redoxrelais zum Elektronentransfer zwischen Enzym und Elektrode.
Durch Vergleich der Kinetik der genetisch veränderten Enzyme mit dem nativen Enzym
konnte gezeigt werden, dass kaum Unterschiede in den Kinetikkonstanten erkennbar sind. Am
auffälligsten ist der vernachlässigbar kleine Unterschied (

Zusammenfassung
ten Enzyme eine höhere Aktivität aufweisen als die frei diffundierende Variante. Die weiteren
Parameter, die die globale Reaktionskinetik bestimmen, sind deutlich optimiert im Vergleich
zu den 4 his – FNR Messungen im gelösten Zustand. Dies ist mit seiner exakten Orientierung
vor der Oberfläche durch die gezielte Einbringung der Bindungsdomänen zu erklären. So
kann festgehalten werden, dass sich die Anbindung an die Oberfläche positiv auf die gesamte
enzymatisch katalysierte Reaktion auswirkt.
Nachdem das optimale Enzym für das angestrebte Ziel charakterisiert wurde, erfolgte die
Anpassung der Immobilisierungsmatrix. Die bisherige Matrix zeigte eine gute Affinität,
musste aber noch so modifiziert werden, dass sie einen Elektronentransport unterstützt. Hierfür
wurde das heterogene PAMAM – Dendrimer synthetisiert und charakterisiert, welches die
gewünschten Eigenschaften eines Redoxrelais aufweist.
Eine Adsorption des Enzyms konnte bei allen Varianten des Dendrimers sowohl elektrochemisch,
als auch via SPR-Spektroskopie nachgewiesen werden. So wurde der hypothetische
Mechanismus der Bindung des Enzyms durch die Metallionen in dem Dendrimer klar verifiziert.
Durch geschickte Wahl der Kontrollexperimente wurde auch eine Selektivität zu den
neuen 4 his – Mutanten nachgewiesen. Mit einem Dendrimer wurde das Enzym mit der Elektrode
durch einen diffusiblen Redoxmediator verbunden, der die Elektronen vom aktiven Zentrum
zur Oberfläche transportierte. Eine leitfähige Verbindung zwischen der Elektrode und
dem Enzym wurde mit einem anderen Dendrimer erzeugt, wodurch kein weiterer Mediator
nötig war. Die stromantworten des Enzyms waren mit 600 nA sehr hoch. Dies kommt durch
die feste Orientierung der 4 his – FNR an der Oberfläche. Die Redoxmediatoren des Dendrimers
sind so eingestellt, dass sie die Elektronen aus der bioelektrokatalytischen Reaktion direkt
abholen und zur Elektrode weitertransportieren können.
Damit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein neuartiges und genetisch verändertes
Enzym kaum Abweichungen in der katalytischen Aktivität im Vergleich zu seinem Wildtyp
aufweist. Zudem ermöglichte die strukturelle Veränderung eine bessere Immobilisierung
in einer definierten Orientierung auf Oberflächen, was eine drastische Verbesserung bisheriger
Immobilisierungstechniken darstellt. Durch geschicktes Design einer neuartigen Matrix,
die neben seiner Immobilisierungsfunktion auch den Elektronenmediator in sich trägt, konnte
die Handhabung der Immobilisierung von Enzymen vereinfacht werden.
Zukünftig könnte eine Verbesserung des Systems durch weitergehende Untersuchungen
der Dendrimer-Systeme erreicht werden, mit denen z.B. Redoxpotentiale für spezifische Anwendungen
angepasst werden oder weitere Enzyme immobilisiert werden können.
119

Experimentelle Durchführung
6 Experimentelle Durchführung
Das Kapitel sechs beschäftigt sich mit der Synthese der einzelnen Komponenten, die im
Laufe der Arbeit hergestellt wurden. Die Teilkapitel unterteilen sich dabei in die verschiedenen
Abschnitte in die die Arbeit unterteilt ist. Der erste Abschnitt beschreibt die Synthese der
Verbindungen, die benötigt wurden, um die kinetischen Untersuchungen zu dem oberflächengebundenen
FNR – Enzym durchzuführen. Der zweite Teil enthält die Synthesen, die notwendig
waren um die verschiedenen Dendrimere herzustellen. Der letzte Teil beschreibt die
elektrochemischen und SPR spektroskopischen Messungen zur Bestimmung der kinetischen
Parameter und der Anbindung.
6.1 Chemikalien und Geräte
6.1.1 Chemikalien
Alle Chemikalien wurden mit dem Reinheitsgrad p.a. verwendet, sofern nicht anders angegeben.
Aceton
J. T. Baker, Deventer, NLD
Acetonitril (trocken)
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Ameisensäure
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Argon (Ar, N46)
Air Liquide, Düsseldorf, DEU
4,4‘-Bipyridin-1-thioacetatopropyl-iod Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
N, N – bis(carboxymethyl) – lysin Hydrat Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Chloroform d-3
Deutero GmbH, Kastellaun, DEU
Deuteriumoxid (0.14 mmol Hydroxylamin) Deutero GmbH, Kastellaun, DEU
1,3- Dicyclohexylcarbodiimid Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Dieethylether
J. T. Baker, Deventer, NLD
Dikaliumhydrogenphosphat
Fisher Chemical, Loughborough, UK
Dimethylsulfoxid (trocken)
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
2,2'-(Ethylenedioxy)diethylamin
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Ethanol
J. T. Baker, Deventer, NLD
Ferrocenmethanol
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Glukose
AppliChem, Gatersleben, DEU
Heptan
J. T. Baker, Deventer, NLD
120

Experimentelle Durchführung
Hexan
N-Hydroxysuccinimid
3-Isothiocyanat-1-brompropan
Kalium-di-hydogenphosphat
Kaliumchlorid
Kaliumhexacyanoferrat (III) K 3 [Fe(Cn) 6 ]
Kaliumhexacyanoferrat (II) 3 Hydrat
K 4 [Fe(Cn) 6 ]
Kaliumnitrat
Liponsäure
Natriumhydroxid
Natriumsulfat
Nickelsulfat
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
p-Nitrobenzoesäure
Methanol
Palladium (10%) auf Kohlenstoff
G3 PAMAM Dendrimer Lösung in Methanol
Sauerstoff
Schwefelsäure
TCEP
Tetrachlormethan
Tetrahydrofuran
Thiophosgen
Triethylamin
Toluol (trocken)
Wasserstoff
J. T. Baker, Deventer, NLD
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
VWR International GmbH, Haasrode,B
VWR International GmbH, Leuven, B
Riedel-de Haën, NLD
Riedel-de Haën, NLD
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
J. T. Baker, Deventer, NLD
J. T. Baker, Deventer, NLD
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
J. T. Baker, Deventer, NLD
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Air Liquide, Düsseldorf, DEU
J. T. Baker, Deventer, NLD
Tris(2-chlorethyl)phosphat, Sigma Aldrich,
Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
J. T. Baker, Deventer, NLD
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Fluka, Steinheim, DEU
Sigma Aldrich, Steinheim, DEU
Air Liquide, Düsseldorf, DEU
6.1.2 Biochemika
Die verwendeten Enzyme, wt-FNR, 2-his FNR und 4-his FNR wurden von der Fakultät
für Biologie von der AG Happe bezogen und in deren Laboren hergestellt, bzw. kultiviert.
121

Experimentelle Durchführung
6.1.3 Geräte
Ultraschallbad
Zentrifuge
Poliergerät Forcipol 1V
Minimate TFF
Trockenofen B-585
Reference-600 Potentiostat
Sonorex Schalltec GmbH, Mörefelden, D
Rotofix 32 A Hettich, Kirchlengern, D
Metkon, Bursa, TRF
Novodirect, Kehl/Rhein, D
Büchi, Essen, D
Gamry Instruments, USA
6.1.4 Verbrauchsmaterialien und Lösungen
Sofern nicht angegeben wurden alle Verbrauchsmaterialien von dem Chemikalienlager
der Fakultät Chemie bezogen.
Polierfilz
Polierpaste, Al2O3 (1 μm, 0.3 µm, 0.05 μm)
Polierpasten, Diamant (3 µm, 1 µm, 0.5 μm)
Sandpapier (P1500)
Heraeus Kulzer GmbH, Werheim, D
Leco Cooperation, St. Joseph, USA
Leco Cooperation, St. Joseph, USA
Gebo Werkzeuge GmbH, Hilden, D
NMR und MS
Alle in dieser Arbeit verwendeten deuterierten Lösungsmittel wurden von Deutero GmbH,
Kastellaun, D erhalten. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle NMR-Spektren auf den
Lösungsmittelpeak oder, falls dieser durch andere Signale überlagert wurde, auf Lösungsmittelpeaks
der in der Aufreinigung verwendeten Lösungsmittel geeicht. Als Referenz dienten
dafür die von Fulmer et al. publizierten Verschiebungen [116] . Zur Messung der 1 H-NMR und
13C-NMR Spektren wurde ein Bruker DPX 200, ein Bruker DPX 250 oder ein Bruker DPX
400 Spektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) genutzt. Zur Auswertung
der NMR Spektren wurde entweder die Software MestReNova v6.2.0 oder MestRec Lite
v4.59 (MestRec, Santiago de Compostela, Spanien) genutzt.
MS Spektren wurden entweder an einem Finnigan GCQ Iontrap (ESI), einem VG Intstruments
Autospec (FAB) oder einem Jeol AccuTOF GCv (EI) gemessen.
122

Experimentelle Durchführung
KCl-Lösung
Zur Auffüllung der Ag/AgCl Referenzelektrode wurde eine 3 M KCl Lösung mit Milli-Q-
Wasser angesetzt.
Phosphatpuffer (PB)
Für die Einstellung des 0.1 (0.5) M Phosphatpuffers wurde das Rezept des Buffer Calculator
von Rob Beynon verwendet. Im Anschluss wurde der pH-Wert von 7.5 über ein pH-Meter
überprüft.
123

Experimentelle Durchführung
6.2 Synthese der Monomere für die kinetischen Messungen des FNR Enzyms
Lit: Balland et.al [3]
6.2.1 N – (lipoyloxy) – succinimide
Liponsäure (1g, 5mmol) wird zusammen mit 0,6g N-Hydroxysuccinimid (5mmol) in einen
ausgeheizten Kolben mit Rührfisch gegeben und in 10ml entgastem THF gelöst. Die Reaktionsmischung
wird mit Eis gekühlt und man gibt langsam 1,1g (5,1mmol) DCC unter Rühren
hinzu [1] . Die Lösung wird noch drei Stunden bei 0°C und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Anschließend wird die Reaktionsmischung filtriert und das Lösungsmittel
vollständig im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird in Aceton/Hexan bei 50°C umkristallisiert
und heiß filtriert.
Man erhält 1g (3,45mmol, 69,7%) von N – (Lipoyloxy) – Succinimide.
Charakterisierung
1 H NMR (200 MHz, CDCl 3 ) δ = 3.72 – 3.41 (m, 1H), 3.21 – 3.02 (m, 2H), 2.90 – 2.72 (m,
4H), 2.61 (t, J=7.2, 2H), 2.45 (dd, J=12.4, 6.0, 1H), 2.07 – 1.41 (m, 7H).
13 C NMR (50 MHz, CDCl 3 ) δ = 169.21, 168.49, 56.19, 40.24, 38.61, 34.49, 30.88, 28.39,
25.69, 24.46.
6.2.2 N – [5 – (1,2 – dithiolan – 3 – ylpentanoylamino) – 1 – carboxypentyl] iminodiacetic
acid
124

Experimentelle Durchführung
N – (lipoyloxy) – succinimd (150mg, 0,495mmol) wird bei Raumtemperatur und N, N –
bis(carboxymethyl) – lysin Hydrat in einem mit Rührfisch ausgestattetem Rundkolben bei
100°C im Hochvakuum über Nacht getrocknet. Das getrocknete N, N – bis(carboxymethyl) –
lysin wird bei 70°C in 3ml DMSO gelöst und 484µl (0,353g, 3,5mmol, 7,1eq.)Triethylamin
werden im Argongegenstrom zu der Lösung gegeben und anschließend das trockene N – (lipoyloxy)
– succinimid. Die Lösung wird 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend
das Lösungsmittel mit Toluol koevaporiert bis nur noch ein klebriges Öl verbleibt.
Der Rückstand wird mehrere Stunden im Exsikkator (NaOH) getrocknet und anschließend in
2-3ml Ethanol/Wasser (1/1) aufgenommen und über Nacht im Kühlschrank gelagert. Die
Suspension wird zentrifugiert und die überstehende Lösung abpipettiert. Die kalte gelbliche
Lösung wird langsam mit verdünnter Ameisensäure versetzt bis sich ein Niederschlag bildet.
Anschließend wird die Lösung wieder für mehrere Stunden gekühlt und nach Zentrifugieren
die überstehende Lösung abdekantiert. Der verbleibende Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet
und im Exsikkator gelagert.
• Charakterisierung
1 H NMR (250 MHz, MeOD) δ = 3.79 – 3.51 (m, 5H), 3.46 (m, 1H), 3.28 – 3.03 (m, 4H), 2.46
(m, 1H), 2.20 (t, J=7.3, 2H), 2.01 – 1.25 (m, 13H).
13 C NMR (63 MHz, MeOD) δ 175.99, 175.92, 175.87, 171.84, 66.63, 57.56, 55.36, 50.02,
49.68, 49.34, 49.00, 48.66, 48.32, 47.98, 41.30, 40.42, 40.06, 39.33, 36.91, 35.70, 29.94,
29.86, 26.75, 26.49, 26.27, 24.75.
125

Experimentelle Durchführung
6.3 Synthese der Dendrimere, inkl. Monomerendarstellung
6.3.1.1 Synthese von
In einem ausgeheiztem Dreihalskolben mit Schutzgasatmosphäre und Magnetrührstab
werden 260 mg (0.65 mmol) 4,4‘-Bipyridin-1-thioacetatopropyl-iod in 20 mL trockenem
Acetonitril gelöst. Nach Zugabe von 180 mg (1 mmol) 3-Isothiocyanat-1-brompropan wird
die Reaktionsmischung zwei Tage refluxiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird der
entstandene orangene Feststoff abfiltreiert und mit Acetonitril gewaschen. Der verbleibende
Feststoff wurde am Vakuum getrocknet und 76 mg (0.13 mmol, 20 %) eines orangenen Pulvers
werden erhalten.
1 H NMR (200 MHz, D 2 O) δ 9.29 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 9.22 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.67 (t, J =
6.8 Hz, 4H), 5.00 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.88 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.93 (dd, J = 6.8, 5.2 Hz, 2H),
3.06 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.67 – 2.39 (m, 2H), 2.46 (s, 3H).
126

Experimentelle Durchführung
6.3.1.2 Synthese von p-Nitrobenzoesäuresuccinimid
Lit: Blankespoor et.al. [19]
In einem ausgeheizten Rundkolben mit trockenem THF und Schutzgasatmosphäre werden
4 g (24 mmol) p-Nitrobenzoesäure, 5.44 g (26.4 mmol) 1,3- Dicyclohexylcarbodiimid unter
Rühren zugegeben. Zu der Reaktionsmischung werden 3.04 g (13.2 mmol, 0.165 mol/L) N-
Hydroxysuccinimid hinzugefügt. Die Lösung wird über Nacht gerührt und danach in einem
Eisbad abgekühlt und mit reduziertem Druck abfiltriert. Der fahl weiße Feststoff wird 20 Minuten
in 100 mL Wasser gerührt und mit reduziertem Druck abfiltriert. Danach wird das Rohprodukt
30 Minuten in heißem Aceton gerührt und mit reduziertem Druck abfiltriert. Das Filtrat
wird bis zur Trockenheit einkonzentriert und der verbleibende Feststoff in Heptan/Toluol
umkristallisiert. Es werden 3.1 g (11.7 mmol, 88 %) hellgelber Plättchen erhalten.
1 H NMR (200 MHz, DMSO) δ = 8.49 – 8.30 (m, 4H), 2.92 (s, 4H).
13 C NMR (50 MHz, DMSO) δ = 170.06, 160.63, 151.44, 131.64, 129.74, 124.56, 39.52,
25.59.
127

Experimentelle Durchführung
6.3.1.3 Synthese von (S)-N-(p-Nitrobenzoylamido)-1-carboxypentyl]iminodiessigsäure
Lit: es wird in Teilen von der Vorschrift von Blankespoor et.al. [19] abgewichen
In einem ausgeheizten Rundkolben mit trockenem DMSO und einem Magnetrührstab
werden 1 g (3.81 mmol, 0.15 mol/L) des NTAs vorgelegt. Zu der Suspension werden 1.1 g
(4.19 mmol) von Verbindung 6.3.1.2 und 2.68 g (26.7 mmol) Triethylamin zugegeben und
über Nacht bei 100 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wird unter Hochvakuum bei 50 °C
getrocknet und der verbleibende Sumpf in Wasser/Ethanol (25:2) aufgenommen und über
Nacht bei 4 °C gelagert. Das Rohprodukt fällt als gelbes viskoses Öl aus. Der Schritt wird
wiederholt bis das reine Produkt vorliegt. Es werden 1.984 g (4.82 mmol, 126.6 %) eines
hochviskosen gelben Öls erhalten.
1 H NMR (250 MHz, MeOD) δ = 8.31 (d, J=8.8, 2H), 8.02 (d, J=8.8, 2H), 3.69 – 3.35 (m,
7H), 1.93 – 1.45 (m, 6H).
13 C NMR (50 MHz, MeOD) δ = 175.95, 175.91, 174.95, 168.23, 150.97, 141.67, 130.06,
129.77, 66.68, 55.43, 40.46, 29.88, 24.85.
128

Experimentelle Durchführung
6.3.1.4 Synthese von 2,2'-((5-(4-Aminobenzamido)-1-carboxypentyl)azanediyl)diessigsäure
Lit: Blankespoor et.al. [19]
Zu einer Lösung von 1 g (2.4 mmol) von 6.3.1.3 in 90 mL Methanol werden 0.1 g 10 %
Pd-Katalysator auf Kohlenstoff gegeben und eine Stunde mit Wasserstoff (3 bar) geschüttelt.
Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockenheit einkonzentriert. Es werden
730 mg (1.9 mmol, 80 %) eines weißen viskosen Feststoffes erhalten.
1 H NMR (200 MHz, MeOD) δ = 7.60 (d, 2H), 6.67 (d, 2H), 3.63 (s, 4H), 3.49 (t, 1 H), 3.35
(s, 4H), 1.66 (m, 7H).
13 C NMR (63 MHz, MeOD) δ = 170.84, 169.38, 134.87, 132.75, 128.89, 123.49, 67.02,
54.23, 39.31, 28.72, 27.88, 26.62, 22.90.
129

Experimentelle Durchführung
6.3.1.5 Synthese von 2,2'-((1-carboxy-5-(4-isothiocyanatobenzamido)pentyl)azanediyl)diessigsäure
6.3.1.4 (150 mg, 0.393 mmol) wurde in Wasser (10 mL) gelöst und CCl 4 (7.5 mL) wurde
zugegeben. SCCl 2 (750 µL, 9.784 mmol) wurde unter heftigem Rühren langsam zugetropft.
Die Reaktionsmischung wurde bis zum nächsten Tag gerührt und anschließend von allen
flüchtigen Bestandteilen mittels Hochvakuum befreit. Es wurde ein weißer Feststoff erhalten
(165 mg, quantitativ).
1 H NMR (200 MHz, MeOD) δ = 7.83 (d, 2H), 7.39 (d, 2H), 4.40 (m, 5H), 3.41 (d, 2H), 2.08
(d, 2H), 1.70 (d, 4H).
NMR ( 13 C, MeOD, 63 MHz): δ 174.91, 170.31, 168.86, 138.74, 135.57, 134.50, 130.07,
126.74, 68.25, 55.11, 40.23, 29.99, 27.88, 26.34, 24.67
130

O
HOOC
O
S
S
N
HOOC
HOOC
HOOC
COOH
COOH
N
N
O
COOH
COOH
COOH
HN
HOOC
S
O
O
HOOC
S
N
O
H 2N
H2N
H 2 N
O
H2N
H2N
H 2 N
COOH
HN
S
S
NH
S
NH
NH
HN
NH
S
HN
HN
O
H
N
HN
N
H
S
O
O
NH
O
S
NH
H
N
S
N
H
NH
O
O
N
H
H
N
O
S
HN
O
HN
HN
O
NH
N
HN
S
N
HN
N
H
HN
O
O
NH
SCN
H 2N
H
N
H2N
O
O
N
H
S
N
O
O
N
O
H
N
O
N
N
S
NH
H
N
HN
S
O
O
NH
HN
O
HN
O
HN
NH
HN
O
HN
N
O
N
O
NH
H
N
O
N
H
O
O
N
S
N
O
HN
N
NH
HN
O
S
O
HN
O
N
NH
HN
O
O
O
O
NH
NH2
O
O
H
N
NH
O
N
H
N
N
H
N
H 2 N
O
N
HOOC
O
H2N
HN
N
HN
COOH
O
O
N
O
S
NH
O
HOOC
HN
N
NH
S
N
HN
O
NH
HOOC
NH
H
N
NH
O
HN
NH
O
HN
S
N
O
N
HN
O
S
N
N
O
O
O
N
HOOC
HN
COOH
O
O
N
O
NH
NH
HN
N
HN
HN
NH
NH
HN
HN
HN
NH
COOH
HN
HN
N
HN
N
N
O
O
O
O
O
O
COOH
N
O
O
N
O
COOH
HN
N
NH2
HN
HN
HN
O
S
O
O
N +
NH
O
HN
N +
N +
C
NH
N +
NH
N
N
H2N
H2N
N
S
S
O
S
S
O
O
O
O
O
HN
N +
N +
S
NH
NH
N
NH
NH
HN
HN
N + N+
S
HN
S
O
O
O
O
O
O
N
O
N
O
N
N
S
NH
NH
NH
NH
O
HN
HN
O
NH
NH
S
NH
NH
N
HN
N
O
O
O
O
O
N
N
O
O
O
N
NH2
N
O
O
NH
NH
NH
N
H
HN
H
N
HN
HN
O
O
H2N
O
H 2 N
HOOC
HN
NH
NH
NH
N
NH
NH
N
O
O
O
HOOC
NH
N
NH
NH
O
N
N
S
O
N
N
H
N
H
N
S
O
O
HN
HN
O
COOH
O
S
HN
O
HN
S
COOH
O
HOOC
N
O
HN
HN
NH
N
NH
O
NH
O
NH
N
H
N
COOH
O
O
N
N
O
O
N
H
H
N
O
N +
N +
O
O
N
N
NH2
NH2
HN
HN
O
NH
O
NH
O
O
S
S
NH
NH
H 2 N
N
H2N
N +
N +
N
H
H
N
N
O
O
O
N
O
HN
O
NH
N
O
O
N
H
NH
NH
O
O
N +
O
S
NH
NH
S
HN
N
HN
NH
NH
N
NH
O
NH
NH
N +
O
S
S
O
H
N
O
N
H
O
HN
O
NH2
NH2
N
H
HOOC
NH2
S
NH
NH
NH
NH
H
N
O
N
H
HN
N
N +
PH
NH
HN
H
N
H
N
NH
N
H
S
S
S
HN
HN
HN
COOH
COOH
NH
N +
S
S
S
O
HOOC
H
N
N +
N +
N +
S
N
HOOC
N +
HN
O
O
COOH
HOOC
O
HOOC
N
S
N +
HOOC
N +
N
COOH
O
COOH
COOH
N
COOH
COOH
O
S
S
COOH
O
Experimentelle Durchführung
6.3.1.6 Thioacetate protected G3 PAMAM-Viologen-NTA dendrimer synthesis
N
H
12 + 36
Chemical Formula: C 18H 21N 3O 7S
Molecular Weight: 423.44
2+
Chemical Formula: C 19H 23N 3OS 2
Molecular Weight: 373.53
NH 2
NH 2
NH 2
H
N
NH 2
N
H
N
H
NH 2
Chemical Formula: C 302 H 608 N 122 O 60
Molecular Weight: 6908.98
NH 2
NH 2
NH 2
N + N +
N + N +
N + N +
N + N +
H
N
N + N +
N + N +
H
N
H
N
H
N
N + N +
N + N +
N + N +
N
H
H
N
Chemical Formula: C 897H 1319N 218O 169PS 51
38+
Molecular Weight: 19526.79
G3 PAMAM Dendrimer Lösung in Methanol (25.19 g, 0.0036 mmol) werden in einem
Schlenkrohr mit Magnetrührstab mit Hochvakuum getrocknet und mehrfach mit Argon nachgespült.
Der verbleibende Feststoff wird in trockenem DMSO (0.912 mmol/L) aufgenommen
und entgast. Verbindung 6.3.1.1 und 6.3.1.5 werden in dem gewünschten Verhältnis (Σ 1.5-
131

Experimentelle Durchführung
faches Molenverhältnis in Bezug auf die freien Amine des Dendrimers 17 ) zu dem vorgelegten
Dendrimer gegeben. Die Lösung wird fünf Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung
wird in 150 mL 0.1 M KNO 3 Lösung gegossen und mit einer TFF-Einheit von nicht abreagierten
Edukten (MWCO 5 kD, 3.5 mL/min) getrennt. Das Wasser wird durch lyophilisieren
entfernt und 50 mg eines gelben Feststoffs werden erhalten.
1 H NMR (200 MHz, D 2 O) δ = 9.29 – 8.22 (m, 155 H), 7.55 (m, 39 H), 2.36 (m, 1070 H).
6.3.1.7 Entschützung von Verbindung 6.3.1.6
Verbindung 6.3.1.6 (10 mg, 0.43 mmol) wird in einer 0.1 M D 2 O-Lösung (0.14 mmol
Hydroxylamin) für 16 h gerührt. Die Entschützung kann mit NMR-Spektroskopie verfolgt
werden. Das schwere Wasser wird am Rotationsverdampfer entfernt und man erhält einen
gelben Film. Das Rohprodukt wird dreimal mit Ethanol im Ultraschallbad behandelt, um restliches
Hydroxylamin zu entfernen. Es werden 8.9 mg (quantitativ) eines gelben Feststoffs
erhalten.
17 Faktor 48
132

Experimentelle Durchführung
6.4 Elektrochemische Messungen
6.4.1 Vorbereitung der Elektroden; polieren und elektrochemisches Reinigen
Zuerst wurden die Goldelektroden mit drei verschiedenen Diamantsuspensionen poliert.
Die Korngrößen der Diamantkörner waren 3 µm, 1 µm und 0.5 µm. Jede Elektrode wurde mit
jeder Korngröße fünf Minuten poliert. Anschließend wurde die Elektrode in einer eins zu eins
Lösung aus Wasser und Ethanol zehn Minuten im Ultraschallbad behandelt. Die vorbehandelte
Elektrode wurde elektrochemisch in 2 M Schwefelsäure weiter gereinigt. Dabei wurden
jeweils 20 Zyklen von -0.2 mV bis 1.75 mV gefahren. Die Spannungsvorschubsgeschwindigkeit
betrug 0.1 mV/s. danach wurde die Elektrode mit dest. Wasser gespült und in 0.1 M PB,
pH 7.5, gelagert.
6.4.2 Messung von k 2 und K M
Die Messungen zu dem K M – und k 2 Wert erfolgten nach der folgenden allgemeinen
Durchführung.
Im zweiten Schritt wurde eine Stammlösung von Ferrocenmethanol, Konzentration
0.5 mM, in PB 0.1 M, pH 7.5,hergestellt. Das Ferrocenmethanol wurde im Ultraschallbad bei
ca. 4°C gelöst.
Im dritten Schritt wird die genaue Konzentration des Enzyms durch UV/VIS Spektroskopie
bestimmt. Dafür wird erst mit der Ferrocenmethanolstammlösung der Hintergrund bestimmt
und dann das Enzym (1-2 µl) zugegeben. Von dieser konzentrierten Lösung wird dann
auf 2.15 ml und eine Enzymkonzentration von 0.2 µM, 0.1 M PB, pH 7.5, 0.5 mM Ferrocenmethanol,verdünnt.
Von dieser Messlösung werden dann 150 ml abgenommen und das Substrat
darin gelöst. Es wird so viel NADPH gelöst damit eine Endkonzentration von 3 mM erreicht
wird, wenn das gesamte Volumen von 150 ml ausgetauscht wurde.
Vor jeder Messung wird die Lösung 20 s gerührt und danach 7 s ruhen gelassen. Die Messungen
wurden in einem Drei-Elektroden-Aufbau durchgeführt mit der vorher gereinigten
Goldarbeitselektrode, einem frisch erhitzen Platindraht als Gegenelektrode und einer
Ag/AgCl – Referenzelektrode. Zuerst wird eine Leermessung bei 5 mV/s in der Enzym-
Ferrocenmethanolstammlösung von (-0.1 mV - 0.35 mV) vs Ag/AgCl durchgeführt. Diese
Einstellungen werden für alle weiteren Messungen beibehalten. Für die weiteren Messungen
wurde zuerst das Volumen an Lösung entfernt, das danach von der Substratlösung hinzugege-
133

Experimentelle Durchführung
ben wurde. Die Konzentrationen und Zugaben für die Messung können aus der folgenden
Tabelle 11 entnommen werden.
Level
Tabelle 11 gibt die Zugaben für die Substratlösung an
Ziel C NADPH /
mM
V ges an Substratlösung/
µl
V ini in der Lösung/
µl
Benötigtes Volumen an
Substratlösung/
µl
1 0,050 2,50 0,00 2,50
2 0,100 5,00 2,50 2,50
3 0,150 7,50 5,00 2,50
4 0,200 10,00 7,50 2,50
5 0,400 20,00 10,00 10,00
6 0,600 30,00 20,00 10,00
7 0,800 40,00 30,00 10,00
8 1,000 50,00 40,00 10,00
9 2,000 100,00 50,00 50,00
10 3,000 150,00 100,00 50,00
6.4.3 Messung von k 3
Die Elektroden wurden wie unter 6.4.1 beschrieben gereinigt und gelagert. Das Enzym
wird mit UV/VIS – Spektroskopie untersucht, um die Konzentration zu ermitteln. Dafür wird
zuerst eine Stammlösung mit 0.1M PB, pH 7.5, als Hintergrund vermessen und dann mit der
Enzymlösung (1-2 µL) vermischt. Mit dieser Stammlösung wird eine Messzelle mit 0.5 µM
Enzym, 0.1 M, pH 7.5 und 5 mM NADPH und einer Dreielektrodenanordnung mit der gereinigten
Goldelektrode als WE, einem frisch abgebrannten Pt-Draht als CE und einer Ag/AgCl
RE. Von dieser Messlösung werden ZV's aufgenommen von (-0.1 V – 0.35 V) vs. Ag/AgCl.
Die unterschiedlichen Spannungsvorschubgeschwindigkeiten sind (2, 5, 7.5, 10, 15, 20, 50,
100, 250, 500, 750, 1000) mV/s.
Eine 2 mM Ferrocenmethanolstammlösung mit 0.1 M PB, pH 7.5, wird hergestellt. Es
werden 25 µl von der Messlösung mit der Ferrocenmethanolstammlösung ausgetauscht und
die ZV's unter den gleichen Bedingungen und Spannungsvorschubgeschwindigkeiten gemessen.
6.4.4 Generelle Anbindung eines Dendrimers
Die Anbindung der Dendrimere an Goldelektroden wurde elektrochemisch verfolgt. Ein
100 µl Aliquot mit Dendrimerlösung wird aufgetaut und mit 5 µl TCEP vermischt. Die
Dendrimerlösung wird in 1.9 ml entgasten 0.05 M BP, 0.1 mM KNO 3 , pH 7.5, unter Ar At-
134

Experimentelle Durchführung
mosphäre gegeben. Durch diese Elektrolytlösung werden eine Goldelektrode (WE), eine Platinelektrode
(CE) und eine Ag/AgCl RE miteinander verbunden und eine wiederkehrende
Dreiecksspannung angelegt. Gemessen wurde so lange bis der maximale Strom nicht mehr
steigt, aber mindestens 200 Zyklen von -0.2 V vs Ag/AgCl bis -0.6 V vs Ag/AgCl mit einer
Spannungsvorschubsgeschwindigkeit von 200 mV/s.
6.4.5 Generelle Anbindung eines veränderten FNR Enzyms an ein Dendrimer
Eine Oberfläche, die mit einem Dendrimer beschichtet wurde, wird 20 Minuten mit einer
0.025 M NiSO 4 , 0.1 M KNO 3 und 0.05 M PB, pH 7.5, behandelt und danach dreimal mit
0.1 M PB, 0.1 M KNO 3 , pH 7.5, gespült. Über die mit Nickel beschichtete Oberfläche wird
eine 500 nM Enzymlösung, 0.1 M PB, pH 7.5, 0.1 M KNO 3 , gespült, bzw. gelagert. Der Anlagerung
des Enzyms kann mit SPR – Spektroskopie bzw. elektrochemisch gefolgt werden.
6.5 SPR Messungen
Die Experimente zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten werden mit einem Autolab
Twingle durchgeführt. Die goldbeschichteten Objektträger wurden von ssens bestellt und haben
den gleichen Brechungsindex wie das Prisma des Autolab Twingle. Alle weiteren Reagenzien
waren im Labor vorhanden, bzw. die Synthese des Ankers wurde in Kapitel 4.1.1.1
beschrieben.
6.5.1 FNR Anbindung an NTA – Liponsäureoberflächen
Die Oberfläche des Sensorchips wurde über Nacht mit einer methanolischen Lösung des
Liponsäure –NTA – Linkers (1 mg/ml) bedeckt. Der Chip wird anschließend mit Methanol
und Wasser abgespült und trocken geblasen. Der Chip wird in das SPR Spektrometer eingebaut
und die Oberfläche mit Laufpuffer gespült bis ein stabiles Signal gemessen wird. Danach
wird in der Software ein Assoziationsprogramm gestartet und die Zeiten für Assoziations- und
Dissoziationsphasen eingestellt. Nach Start der Methode wird die Oberfläche mit dem Laufpuffer
stabilisiert und eine 20 mM Nickelsulfatlösung für 15 Minuten über die Oberfläche
gespült, damit das Ankermolekül das Metall chelatisieren kann. Damit sind die Vorbereitungen
für das eigentliche Experiment abgeschlossen und die FNR kann für die eingestellte Zeit
über die Oberfläche mit dem komplexierten Metall gespült werden. Anschließend wird die
Dissoziation des Moleküls gemessen.
135

Experimentelle Durchführung
6.5.2 Dendrimeranbindung
Die Sensoroberfläche wird mit Laufpuffer (0.05 M BP, 0.1 mM KNO 3 , pH 7.5, sauerstofffrei)
gespült bis das Signal konstant ist. Danach wird das Assoziationsprogramm gestartet und
die Zeiten für die Assoziation des Dendrimers eingestellt. Bei Aufforderung wird ein 100 µl
Aliquot mit Dendrimerlösung mit 5 µl TCEP unter die Pipettenspitzen gehalten. Die Messung
wird fortgesetzt. Die Assoziation und die Dissoziation kann auf dem Bildschirm verfolgt werden.
136

Literaturverzeichnis
7 Literaturverzeichnis
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139

Anhang
8 Anhang
8.1 Graphen zur kinetischen Untersuchung der FNR
8.1.1 Bestimmung des k 2 – Wertes
i [nA]
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
i [nA]
1200
1000
800
600
400
200
0
-200
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
2000
1500
1600
1400
1200
1000
i [nA]
1000
i [nA]
800
600
500
400
200
0
0
-200
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
2000
1400
1200
1500
1000
800
i [nA]
1000
i [nA]
600
500
400
200
0
0
-200
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
Abbildung 61: drei Messungen zur Bestimmung der k 2 Werte der 4 his – FNR. Die Substratkonzentrationen sind
0.05 µM, 0.1 µM, 0.15 µM, 0.2 µM, 04 µM, 0.6 µM, 0.8 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM.
i

Anhang
1800
i [nA]
2500
2000
1500
1000
500
0
i [nA]
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
2500
1600
2000
1400
1200
1500
1000
i [nA]
1000
i [nA]
800
600
500
400
200
0
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
2000
1400
1200
1500
1000
i [nA]
1000
i [nA]
800
600
500
400
200
0
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
Abbildung 62: die Graphen zur Bestimmung der k 2 Werte für die 2 his FNR inkl. der Hintergrundkorrektur. Die
Substratkonzentrationen sind 0.05 µM, 0.1 µM, 0.15 µM, 0.2 µM, 04 µM, 0.6 µM, 0.8 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM.
ii

Anhang
2000
1500
i [nA]
1000
500
i [nA]
0
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
i [nA]
i [nA]
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
2500
2000
1500
1000
500
0
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
i [nA]
i [nA]
2500
2000
1500
1000
500
0
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-200
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
E [V vs Ag/AgCl]
Abbildung 63: Die drei Messungen zur Bestimmung der k 2 Werte für die WT – FNR. Die Substratkonzentrationen
sind 0.05 µM, 0.1 µM, 0.15 µM, 0.2 µM, 04 µM, 0.6 µM, 0.8 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM.
8.2 NMR Spektren der Dendrimersynthese
iii

Anhang
130.89
132.36
1016.75
9.21
8.65
8.62
4.79 Deuterium Oxide
2.43
2.01
1.95
Abbildung 64: NMR des Dendrimers nachdem es mit Viologen modifiziert wurde. Die Signale der sp 2 – Protonen
gehören zu den aromatischen Ringen der Viologene und alle sp 3 – Signale sind Überlagerungen des Dendrimergrundgerüstes
und der Alkylketten mit denen das Viologen modifiziert wurde (Y=100 %, 25468 g/mol).
Abbildung 65: Kernresonanzspektrum des heterogen modifizierten Dendrimers (1/3) in D 2 O. Die Integration der
Signale zwischen dem Viologen und dem NTA – Liganden ergibt ein Verhältnis von 33.28 % für den NTA – Liganden
und 66. 72 % für das Viologen. Insgesamt ergibt sich eine Ausbeute von 92.3 % (29.7 modifizierte NH 2 – Gruppen,
22422.4 g/mol)
iv

Anhang
187.16
19.69
1045.95
9.15
9.13
8.58
8.55
7.71
7.45
4.79 Deuterium Oxide
3.49
3.42
3.19
3.16
3.10
3.01
2.97
2.94
2.72
2.58
2.37
2.16
1.95
1.65
Abbildung 66: Kernresonanzspektrum des heterogen modifizierten Dendrimers (1/1) in D 2 O. Die Integration der
Signale zwischen dem Viologen und dem NTA – Liganden ergibt ein Verhältnis von 17.4 % für den NTA – Liganden
und 82.6 % für das Viologen. Insgesamt ergibt sich eine Ausbeute von 88.95 % (28.5 modifizierte NH 2 – Gruppen). Es
ergibt sich ein Molgewicht von 19122.5.
Abbildung 67 zeigt das Kernresonanzspektrum des heterogen modifizierten Dendrimers (3/1) in D 2 O. Die Integration
der Signale zwischen dem Viologen und dem NTA – Liganden ergibt ein Verhältnis von 83.6 % für den
NTA – Liganden und 16.4 % für das Viologen. Insgesamt ergibt sich eine Ausbeute von 43.6 % (14 modifizierte NH 2 –
Gruppen, davon 2.3 Viologene und 11.7 NTA - Liganden). Es ergibt sich ein Molgewicht von 13191.1 g/mol.
v

Anhang
125.78
46.51
1123.11
9.19
8.62
8.60
7.32
7.23
4.79 Deuterium Oxide
3.63
3.55
3.41
3.32
3.28
3.22
3.20
3.17
3.04
3.01
2.77
2.74
2.55
2.42
2.15
2.13
2.04
2.00
Abbildung 68: Kernresonanzspektrum des heterogen modifizierten Dendrimers in D 2 O. Die Integration der Signale
zwischen dem Viologen und dem TACN – Liganden ergibt ein Verhältnis von 42.5 % für den TACN – Liganden
und 57.5 % für das Viologen. Insgesamt ergibt sich eine Ausbeute von 85.5 % (27.4 modifizierte NH 2 – Gruppen). Es
ergibt sich ein Molgewicht von 20426 g/mol.
8.3 Messung der Dendrimere an Elektrodenoberflächen
6
zeitliche Projektion der Maxima und Minimaströme
CV's während der Anbindung der Dendrimere an die
Elektrodenoberfläche.
4
2
i [µA]
0
-2
-4
0 10 20
t [min]
-0,6 -0,4 -0,2
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 69a) Projektion der Maxima und Minimaströme im zeitlichen Verlauf.
b) Das CV zeigt in dem Messbereich von (-0.6) – (-0.2) V vs. Ag/AgCl den gemessenen Strom einer PB/ KNO 3 –
Lösung mit freiem Dendrimer. Über die Zeit nimmt die Stromantwort im Bereich des Formalpotentials des verwendeten
Viologens zu. Die Form der anodischen und kathodischen Redoxwellen zeigt sowohl einen gleichmäßigen Anstieg,
als auch Abfall. Die Aufspaltung der zusammengehörenden Redoxwellen, zeigt einen Unterschied von 6 mV, was einer
frei diffundierenden Redoxspezies widerspricht. Das Formalpotential der Dendrimere liegt bei -0.455 V vs. Ag/AgCl.
vi

Anhang
Die Ladungen, die in dem letzten CV übertragen werden betragen 1.65 µAs für die Oxidation
und 1.36 µAs für die Reduktion. Das ergibt für die Viologene eine Oberflächenkonzentration
von Γ ox, V = 5.46 pmol/mm 2 bzw. Γ red, V = 4.49 pmol/mm 2 . Daraus kann man für die
Dendrimere einen Wert von Γ ox, D = 0.275 pmol/mm 2 bzw. Γ red, D = 0.227 pmol/mm 2 erhalten.
Die Gesamtzahl der Dendrimere beträgt dementsprechend (16.5 – 13.62) ∗ 10 O . Da sich die
Größe der Dendrimere im Vergleich zu den vorherigen nicht geändert hat, kann auch hier mit
einem Radius von 2 nm eine Bedeckung der Elektrodenoberfläche von 54.51 – 66.03 % ermittelt
werden.
3
Entwicklung des Viologensignals der Viologene über die Zeit
CVs während der Anbndung der Dendrimere an die
Elektrodenoberfläche
2
i [µA]
1
0
-1
-2
0 5 10 15 20 25 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0
t [min]
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 70: a) Entwicklung des Stromsignals über die Zeit; b) Strom – Spannungskurven zur Überprüfung
der Anbindung an die Goldoberfläche. Die kontinuierliche Zunahme bestätigt die Anbindung des 1 – 1 modifizierten
Dendrimers; 200 mV/s, 200 Zyklen, 0.05 M PB, 0.1 M KNO 3 , pH 7.5, 0 mV – (-0.6 mV). In den ersten Zyklen ist ein
Anstieg der Grundlinie im anodischen Teil der CV’s zu sehen, was eine quantitative Untersuchung des Assoziationsverhaltens
erschwert.
8.3.1.1 NTA – Viologen Dendrimer 2
Das zweite Dendrimer, welches auch mit Viologen und NTA modifiziert wurde sollte analoge
Eigenschaften aufweisen, wie die oben beschriebenen Dendrimere. Das eingangs gewählte
Verhältnis zwischen Viologen und NTA von 1/1 spiegelt sich in der oben diskutierten
Auswertung bei Abbildung 66 mit 23.5 Viologenen wieder. In Abbildung 70 a) ist die zeitliche
Entwicklung des Maximums bzw. des Minimums der Redoxwellen zu sehen. Im kathodi-
vii

Anhang
schen Teil kann man eine gleichmäßige Entwicklung des Signales sehen, das im ersten Drittel
schnell ansteigt und sich dann langsam in eine Sättigung begibt. In dem anodischen Teil der
CV’s wird erst ein Anstieg ausgemacht, der nicht mit der vorher verwendeten Erklärung einhergeht.
Der Grund für diesen Anstieg ist in der Vorbereitung der Messung zu suchen. Eine
mögliche Erklärung für dieses Verhalten können Spuren von Sauerstoff im Puffer sein, die
das Signal, bzw. die Grundlinie zu negativeren Werten verschiebt. Während der ersten Messungen
wird der restliche Sauerstoff elektrochemisch verbraucht und somit steigt die Grundlinie
schneller an, als sich das Dendrimer an der Elektrodenoberfläche anlagern kann. Eine qualitative
Anlagerung des Dendrimers im anodischen Teil der Strom – Zeit –Kurven kann erkannt
werden, wenn der restliche Sauerstoff in der Lösung vollständig verbraucht ist und die
Reduktion der Viologene deutlich zu sehen ist und auch über die Zeit zunimmt.
Für die weiteren Untersuchungen zu dem NTA/Viologen – Dendrimer 2 sollte dem kathodischen
Teil des CV’s weniger Beachtung geschenkt werden als dem anodischen, aus dem
oben beschriebenen Grund. Die Auswertung der übertragenen Ladungen aus dem letzten Zyklus
ergibt 0.155 µAs für die Oxidation der Viologene und lediglich 0.085 µAs für die Reduktion.
In der weiteren Betrachtung werden nur die Werte für die Oxidation betrachtet, da die
Grundlinie in den durchgeführten Messungen weniger anfällig für Störungen war. Nach Gleichung
( 17 ) ergibt sich eine Oberflächenbedeckung mit Viologenen von Γ ox,
V = 2.56 pmol/mm 2 und unter Verwendung der Anzahl der Viologene pro Dendrimer ein Γ ox,
D = 0.109 pmol/mm 2 . Folglich konnte mit NTA/Viologen – Dendrimer 2 26.17 % der gesamten
Elektrodenoberfläche bedeckt werden. Dieser Wert ist deutlich niedriger als bei dem
NTA/Viologen – Dendrimer 1.
Die Aufspaltung der Redoxwellen für dieses Dendrimer ergibt einen Wert von 7.75 mV,
was in einem guten Bereich liegt für eine oberflächengebundene Spezies. Eine geringe Aufspaltung
kann durch die Diffusion der Elektronen von den weiter entfernten Viologenen erklärt
werden. Da der Abstand zwischen den am weitesten entfernten Viologenen in einer Monolage
bis zu 4 nm betragen kann, was bedeutet, dass der Übergang der Elektronen nicht
durch einen direkten Elektronentransfer erfolgt. Daher müssen die Viologene, die bereits ihre
Ladung geändert haben, die Elektronen von den anderen Viologenen zur Elektrodenoberfläche
transportieren, was einem klassischen Seegras – oder Shuttle Mechanismus entspricht.
Das Formalpotential des NTA – Viologen Dendrimer 2 liegt bei E° = -0.462 V. Damit ist es
ca. 0.04 V geringer als das des reinen Viologendendrimers.
viii

Anhang
0,8
Dendrimer (1-3) in 0.05 M PB, 0.1 M KNO 3
, pH 7.5
0,6
0,4
0,2
i [µA]
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1
E [V vs. Ag/AgCl]
Abbildung 71 zeigt CV’s während der Anbindung von NTA - Viologen Dendrimer 3. Das Formalpotential der
Redoxwellen ist im Vergleich zu den anderen drei Dendrimeren zu negativen Werten verschoben. 200 mV/s, 200
Zyklen, 0.05 M PB, 0.1 M KNO 3 , pH 7.5, 0 mV – (-0.7 mV).
8.4 Messungen zur Anlagerung der drei Dendrimere an die SPR Oberfläche
8.4.1 Dendrimer 1 (1 – 3)
700
600
500
Signal [m°]
400
300
200
100
0
Dendrimeranbindung 1 (N1-V ++ 3)
Dendrimeranbindung 2 (N1-V ++ 3)
Dendrimeranbindung 3 (N1-V ++ 3)
Dendrimeranbindung 4 (N1-V ++ 3)
Übersicht der verschiedenen Messungen
-100
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
t [h]
Abbildung 72: verschiedene Messungen mit dem NTA – Viologen Dendrimer 1. Die Assoziationsphase betrug
30 Minuten und die Signale zeigen keine deutlichen Änderungen der Werte. Gemessen wurde ein einem 0.05 M PB,
0.1 M KNO 3 , pH 7.5, 0.0523 mM Dendrimer auf einer blanken Goldoberfläche.
ix

Anhang
Tabelle 12: Übersicht der R Max und k a Werte des NTA – Viologen Dendrimers 1 aus den SPR - Untersuchungen
Messung Assoziation k*c k
1 448,9 0,60 11,47
2 479,0 0,64 12,24
3 540,8 0,60 11,47
4 431,0 0,35 6,69
Durchschnitt 474,9 0,55 10,5
Abweichung 41,7 0,11 2,2
Anlaerung des Dendrimers 1
Fit der Messdaten zum bestimmen der Kinetikkonstanten
Anlaerung des Dendrimers 2
Fit der Messdaten zum bestimmen der Kinetikkonstanten
500
500
Winkeländerung [m°]
400
300
200
100
Winkeländerung [m°]
400
300
200
100
0
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
600
Anlaerung des Dendrimers 3
Fit der Messdaten zum bestimmen der Kinetikkonstanten
500
Anlaerung des Dendrimers 4
Fit der Messdaten zum bestimmen der Kinetikkonstanten
500
400
Winkeländerung [m°]
400
300
200
Winkeländerung [m°]
300
200
100
100
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
Abbildung 73: Einzelmessungen mit dem mathematischen Fit zur Bestimmung der Assoziationskonstanten (vgl.
Tabelle 12)
x

Anhang
8.4.2 Dendrimer 2 (1 – 1)
1000
Winkeländerung [m°]
800
600
400
200
Dendrimeranbindung 1 (V++1-NTA1)
Dendrimeranbindung 2 (V++1-NTA1)
Dendrimeranbindung 3 (V++1-NTA1)
Dendrimeranbindung 4 (V++1-NTA1)
0
0 20 40 60 80 100 120
Zeit [Min]
Abbildung 74: Übersicht der vier Messungen zur Bestimmung der mittleren Kinetikkonstanten. Gemessen wurde
ein einem 0.05 M PB, 0.1 M KNO 3 , pH 7.5, 0.0523 mM Dendrimer auf einer blanken Goldoberfläche.
Tabelle 13: Bestimmung der maximalen Bedeckung und der Kinetikkonstanten (c=0.0523 mM)
Messung Assoziation k*c k/ mM -1 min -1
1 732,9 0,25 4,78
2 945,7 0,32 6,12
3 838,8 0,25 4,78
4 838,8 0,28 5,35
Durchschnitt 839,1 0,28 5,26
Abweichung 86,9 0,03 0,63
800
1 Anlagerung des Dendrimers
Fit der Messdaten zur Ermittlung der Kinetikkonstanten
2 Anlagerung des Dendrimers
Fit der Messdaten zur Ermittlung der Kinetikkonstanten
700
1000
Winkeländerung [m°]
600
500
400
300
200
100
Winkeländerung [m°]
800
600
400
200
0
-100
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit [min]
0
0 20 40 60
Zeit [min]
xi

Anhang
1000
3 Anlagerung des Dendrimers
Fit der Messdaten zur Ermittlung der Kinetikkonstanten
1000
4 Anlagerung des Dendrimers
Fit der Messdaten zur Ermittlung der Kinetikkonstanten
800
800
Winkeländerung [m°]
600
400
200
Winkeländerung [m°]
600
400
200
0
0
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit [min]
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
Zeit [min]
Abbildung 75: Einzelmessungen mit dem mathematischen Fit zur Bestimmung der Assoziationskonstanten (vgl.
Tabelle 13: Bestimmung der maximalen Bedeckung und der Kinetikkonstanten (c=0.0523 mM))
8.4.3 Dendrimer 3 (3 – 1)
1000
900
800
response [m°]
700
600
500
400
300
200
100
0
Dendrimeranbindung 1 (N3-V ++ 1)
Dendrimeranbindung 2 (N3-V ++ 1)
Dendrimeranbindung 3 (N3-V ++ 1)
drei typische Messungen zur Anbindung der
Dendrimere an Goldoberflächen
-100
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
time [min]
Abbildung 76 zeigt drei typische Messungen des dritten NTA – Viologen Dendrimers. Die einzelnen Assoziationsexperimente
dauerten jeweils eine Stunde und zeigen einen exponentiellen Anstieg, der sich asymptotisch an einen
Grenzwert angleicht. Nachdem die Assoziationslösung mit dem gelösten Dendrimer gegen Laufpuffer ausgetauscht
wurde, fällt das Signal etwas ab, was durch die Änderung des Brechungsindex zu erklären ist, und verlaufen dann in
einer nahezu graden Linie, die zeigt, dass das Dendrimer nicht von der Oberfläche dissoziiert. Ein leichter Anstieg im
Signal ist durch Hintergrundeffekte zu erklären.
xii

Anhang
1 Anlagerung des Denrimers
Fit der Messdaten zur Bestimmung der Kinetikkonstanten
2 Anlagerung des Denrimers
Fit der Messdaten zur Bestimmung der Kinetikkonstanten
800
800
700
700
Winkeländerung [m°]
600
500
400
300
200
Winkeländerung [m°]
600
500
400
300
200
100
100
0
0
-100
0 20 40 60
Zeit [min]
-100
0 20 40 60
Zeit [min]
800
3 Anlagerung des Denrimers
Fit der Messdaten zur Bestimmung der Kinetikkonstanten
1000
4 Anlagerung des Denrimers
Fit der Messdaten zur Bestimmung der Kinetikkonstanten
700
Winkeländerung [m°]
600
500
400
300
200
100
Winkeländerung [m°]
800
600
400
200
0
0
-100
0 20 40 60
Zeit [min]
0 20 40 60
Zeit [min]
1200
1000
Anbindung des Dendrimers mit einem
Verhältniss von NTA zu Vioogen von 3 zu 1
Mathematischer Fit der Daten zur
Bestimmung der Kinetikkonstanten
Winkeländerung [m°]
800
600
400
200
0
0 20 40 60
Zeit [min]
Abbildung 77: Einzelmessungen mit dem mathematischen Fit zur Bestimmung der Assoziationskonstanten
(Tabelle 14)
Tabelle 14: Bestimmung der maximalen Bedeckung und der Kinetikkonstanten (c=0.0523 mM) des dritten NTA
– Viologen Dendrimers
Messung Assoziation k*c k
1 755,8 0,21 4,08
2 768,0 0,22 4,14
3 766,2 0,25 4,85
4 903,5 0,27 5,10
5 909,4 0,30 5,72
Durchschnitt 820,6 0,25 4,78
Abweichung 73,2 0,04 0,76
xiii

Anhang
250
25 nM 4-his- FNR
250 nM 4-his- FNR
500 nM 4-his- FNR
200
response [m°]
150
100
50
0
-50
1 2 3 4 5
t [h]
Abbildung 78 zeigt die vollständige Messung, aus der die Gleichgewichtswerte für die Anlagerung der 4 his FNR
entnommen wurden, vgl. Kapitel 4.3.3.1
xiv