Untersuchung topographischer Strukturen verschiedener - OPUS ...

3 Material und Methode
eine bestimmte Menge des Isotons verdrängt, dadurch verändert sich der
Widerstand und lässt so eine Berechnung der Zellzahl zu.
An Tag 3, 5 und 7 nach Aussaat fand eine Zellzählung statt. Hierzu wurde das
Medium aus den Wells abgezogen und die adhärenten Zellen zweimal mit je 1
ml PBS-Puffer gewaschen. Zum Ablösen der Zellen wurden 500 µl Accutase
hinzupipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 7 min wurde der Vorgang mit
500 µl Medium gestoppt. Die Vereinzelung der Zellen erfolgte durch 20-maliges
Auf- und Abpipettieren der Suspension in jeder Vertiefung des Wells. Zur
Zählung wurden 100 µl in 10 ml isotone Lösung in das Messgefäß des CASY-1
überführt.
3.4.4 Immunhistochemische Untersuchung
In diesem Teil der Arbeit wurden einzelne Zellproteine mittels indirekter
Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Hierzu mussten die Zellen mit
Ethanol und Aceton fixiert werden. Anschließend wurden separat Antikörper
gegen Vinkulin und Tubulin aufgebracht. Die nicht gebundenen Überschüsse
dieser Antikörper wurden durch Waschen entfernt und die Proben mit dem
fluoreszenzfarbstoffgekoppelten Antikörper versehen.
Versuchsdurchführung indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie
Auf den Proben (unbearbeitet, poliert, geätzt) und zur Referenz auf
Deckgläschen wurden die schon zuvor verwendeten Fibroblasten über 5 Tage
kultiviert. Die Probenplättchen wurden in PBS in einem Präparatständer
gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgte für 10 min bei -20°C in Methanol
und anschließend in Aceton bei -20°C. Abschließend wurden die Proben mit
der Zellseite nach oben 30 min lang auf einem Filterpapier luftgetrocknet. Die
fixierten Präparate wurden in einer Feuchtkammer mit dem primären Antikörper,
welcher zuvor nach Angaben des Datenblattes mit PBS verdünnt wurde, 30 min
bis 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Auf jede Probe kamen 50 µl bis
100 µl des Antikörpers. Zum Waschen wurde der Präparatständer in eine mit
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