Aus dem Tierärztlichen Institut der Universität Göttingen und

Aus dem Tierärztlichen Institut
der Universität Göttingen
und
dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Analyse der Struktur
des caninen γ-Sarkoglykangens,
einem Kandidatengen
für erbliche Muskeldystrophie beim Hund
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Kirsten Conrad
aus Göttingen
Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Tosso Leeb
1. Gutachter: Prof. Dr. Tosso Leeb
2. Gutachter: Prof. Dr. Ingo C. Reetz
Tag der mündlichen Prüfung: 26.11.2001

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 11
2 Literaturübersicht 12-38
2.1 Muskeldystrophie 12
2.1.1 Muskeldystrophie beim Menschen 12
2.1.1.1 Die Duchenne Muskeldystrophie 16
2.1.1.2 Die Becker Muskeldystrophie 17
2.1.1.3 Die x-chromosomale dilatative Kardiomyopathie 18
2.1.1.4 Die Limb-girdle Muskeldystrophien 19
2.1.2 Muskeldystrophie beim Hund 20
2.1.2.1 X-chromosomale erbliche Muskeldystrophie 21
2.1.2.1 Kongenitale Myotonie 22
2.1.2.3 Progressive Myotonie beim Rhodesian Ridgeback 22
2.1.2.4 Myotone Muskeldystrophie beim Boxer 23
2.1.2.5 Myopathie bei Rottweilern 24
2.1.2.6 Scotty Cramp 24
2.1.2.7 Dysphagie-assoziierte Muskeldystrophie beim Bouvier des Flandres 25
2.2 Der Dystrophin-assoziierte Glykoproteinkomplex 25
2.2.1 Der Sarkoglykankomplex 28
2.2.1.1 Allgemeines 28
2.2.1.2 Die Proteine des Sarkoglykankomplexes 29
2.2.1.3 Gene des Sarkoglykankomplexes 30
2.2.1.4 Mutationen der Gene des Sarkoglykankomplexes 30
2.2.1.5 Tiermodelle für den Sarkoglykanopathien 32
2.2.2 γ-Sarkoglykan 33
2.2.2.1 Das Protein 33
2.2.2.2 Das γ-Sarkoglykangen 34
2.2.2.3 Mutationen des γ-Sarkoglykangens 36
2.2.2.4 Das Tiermodell für das LGMD-2C 38

3 Material 39-47
3.1 Bakterien, Phagen, Plasmide und Genbanken 39
3.1.1 Bakterien 39
3.1.2 Phagen 39
3.1.3 Plasmide 39
3.1.4 Genbanken 39
3.2 Enzyme 40
3.3 Chemikalien und andere Materialien 40
3.4 Geräte 42
3.5 Probanden 44
3.6 Anamnese und Untersuchungsbefunde des Hundes "Gini" 45
4 Methoden 48-62
4.1 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA 48
4.1.1 Bakterienkultur 48
4.1.1.1 Flüssigkultur 48
4.1.1.2 Plattenkultur 48
4.1.2 Isolierung von Plasmiden aus E. coli 49
4.1.2.1 Herstellung transformationskompetenter E. coli XL 1-blue 49
4.1.2.2 Transformation kompetenter E. coli 50
4.1.2.3 Isolierung von Plasmiden mit dem Quiagen Plasmid Kit 51
4.2 DNA-Isolierung 53
4.2.1 Isolierung genomischer DNA aus Vollblut 53
4.2.2 Isolierung kleiner DNA-Fragmente (< 20 kb) aus Agarosegelen 53
4.2.3 Schnellaufschluß durch alkalische Lyse 54
4.2.4 Isolierung von BAC-DNA durch Schnellaufschluß 54
4.3 BAC-Genbankscreen 55

4.4 Analyse und enzymatische Behandlung von DNA 56
4.4.1 Phenolisierung und Ethanolfällung 56
4.4.2 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von kleinen
DNA-Fragmenten (< 20 kb) 57
4.4.3 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 58
4.4.4 Ligation von Plasmiden 58
4.4.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 59
4.4.6 Transfer von DNA auf Trägermembranen 59
4.4.7 Nichtradioaktive Hybridisierung mit dem ECL direct labeling system 60
4.4.8 Nichtradioaktive Sequenzierung doppelsträngiger DNA 61
4.4.9 Automatisches Sequenzieren 61
5 Ergebnisse 63-74
5.1 Physikalische Kartierung isolierter γ-Sarkoglykan-Klone 63
5.2 Sequenzierung der kodierenden Bereiche des caninen SGCG Gens 65
5.3 Genomstruktur des caninen γ-Sarkoglykangens 67
5.3.1 Exon 2 – 8 (Kodierender Bereich) 67
5.3.2 Exon 1 68
5.3.3 Eigenschaften der sequenzierten DNA 70
5.4 Chromosomale Lokalisation 71
5.5 Analyse der γ-Sarkoglykan cDNA 72
5.6 Analyse des caninen γ-Sarkoglykans 72
5.7 Analyse der Polymorphismen 73

6 Diskussion 75-80
6.1 Probanden 75
6.2 Untersuchung des caninen SGCG Gens 76
6.3 Exon 1 77
6.4 Polymorphismen des caninen SGCG Gens 79
6.5 Chromosomale Lokalisation 79
6.6 Das γ-Sarkoglykangen - ein Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie? 79
7 Zusammenfassung 81-82
8 Summary 83-84
9 Literaturverzeichnis 85-92
10 Anhang 93-104
10.1 Listing der analysierten Sequenzen (Exon 2 - 8) 93
10.2 Primer für die Mutationsanalysen 103
10.3 Primer für die humanen genomischen Sonden für Exon 1 und Exon 8 103
10.4 Sequenzprimer 104

Abkürzungsverzeichnis
Acc No Accession Number
AS Aminosäure
AST Aspartataminotransferase
BMD Becker Muskeldystrophie
bp Basenpaar
CFA canines Chromosom
CK Kreatininkinase
DAG Dystrophin-assoziiertes Glykoprotein
DAP Dystrophin-assoziiertes Protein
del Deletion
DGC Dystrophin-assoziierter Glykoproteinkomplex
DMD Duchenne Muskeldystrophie
DNA Deoxyribonucleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EKG Elektrokardiographie
EMG Elektromyographie
et al. et alii, und andere
FISH Fluoreszens in situ Hybridisierung
GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
HSA humanes Chromosom
INS Insertion
IPS Impulse pro Sekunde
kb 1000 bp
LDH Laktatdehydrogenase
LGMD Limb-girdle Muskeldystrophie
LINE long interspersed nucleotid element
M Molar
M. Musculus
MD Muskeldystrophie
Mm. Musculi
mM milli Molar
MMV murines Chromosom
n.d. not determine
OD optische Dichte (Absorption)
p Plasmid
PCR Polymerasekettenreaktion
RH Radiation Hybrid Mapping
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
SGC Sarkoglykankomplex
SGCA α-Sarkoglykangen
SGCB β-Sarkoglykangen
SGCD δ-Sarkoglykangen

SGCG γ-Sarkoglykangen
SINE short interspersed nucleotid element
SNP single nucleotid polymorphismus
Tris Trishydroxymethylaminomethan
u. und
U/l Units pro Liter
Upm Umdrehungen pro Minute
UTR Untranslatierter Bereich
v/v volume per volume
w/v weight per volume
XLDC X-Chromosomale dilatative Kardiomyopathie

1 Einleitung
11
Die Rolle des γ-Sarkoglykangens als Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie beim
Hund soll in der vorliegenden Arbeit durchleuchtet werden.
Der Begriff Muskeldystrophie wurde erstmals 1891 von ERB erwähnt. Beim Menschen sind
bis heute viele verschiedene Formen beschrieben. Über Muskeldystrophien beim Tier ist bis-
her wenig bekannt. Systematische Untersuchungen liegen nur für die Duchenne-ähnliche
Muskeldystrophie beim Hund vor, darüber hinaus existieren nur Fallberichte. Immer handelt
es sich um angeborene, vererbbare, progressiv verlaufende Veränderungen der Muskulatur.
In der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der Universität Göttingen wurde eine dreijährige
Dobermannhündin vorgestellt. Auffällig war eine Hypertrophie im Bereich der
Stamm- und proximalen Gliedmaßenmuskulatur sowie Konditionsschwäche. Anhand immunhistochemischer
Untersuchungen konnte eine reduzierte Expression des γ-Sarkoglykans und
des β-Dystroglykans festgestellt werden.
γ-Sarkoglykan ist ein Bestandteil des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplexes in der
Muskulatur. Der Komplex bildet dort eine strukturelle Verbindung zwischen dem Zytoskelett
und der extrazellulären Matrix.
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen sollten die Struktur des γ-Sarkoglykangens
aufgeklärt und das Gen auf Mutationen bei dem erkrankten Hund untersucht werden.
Zur Aufklärung der Muskeldystrophie des Menschen sind Studien am Tiermodell von großer
Bedeutung. Nicht immer ist das phänotypische Erscheinungsbild bei Mensch und Tier gleich.
Untersuchungen am Tier lassen aber teilweise Rückschlüsse auf Erkrankungen beim Menschen
zu.

2 Literaturübersicht
2.1 Muskeldystrophie
12
Muskeldystrophien sind angeborene, vererbbare, progressiv verlaufende Erkrankungen der
Muskulatur, die zur Zerstörung des Muskels führen. Die betroffenen Muskeln zeigen keine
Entzündungszeichen, und versorgende Nerven sind nicht mitbetroffen. Sowohl in der Humanwie
auch in der Veterinärmedizin ist die epidemiologische Bedeutung der Muskeldystrophien
gering.
Die am häufigsten beim Menschen vorkommende Form, die Duchenne Muskeldystrophie,
tritt beispielsweise mit einer Prävalenz von 3/100000 Neugeborenen auf (GARDNER-MEDWIN
1980). Aufgrund ihrer besonderen Ätiologie, Pathogenese und ihrer Prognose genießen die
Muskeldystrophien dennoch ein besonderes Interesse.
Um die Entstehung von Muskeldystrophien zu erklären, stellten die Wissenschaftler im Laufe
der Zeit verschiedene Theorien auf. Ursprünglich machte man Defekte oder Verluste einzelner
Zellenzyme dafür verantwortlich, Stoffwechselstörungen und dystrophische Veränderungen
der Muskulatur zu verursachen. 1961 stellte DEMOS die vasculäre Hypothese auf, nach
der Mikrozirkulationsstörungen im Muskel für die Dystrophie verantwortlich sein sollen.
Diese Hypothese wurde 1970 durch weitere Untersuchungen bestätigt (HATHAWAY et al.
1970). Die neurogene Hypothese (MCCOMAS et al. 1970) machte Störungen der versorgenden
Nerven für Muskeldystrophien verantwortlich. Nach der Membrantheorie führen Verluste einzelner
Zellmembranproteine oder von Proteinen des Zytoskeletts zu Muskeldystrophien. Erst
die Entwicklung der Immunhistochemie und die dadurch gewonnenen Erkenntnisse über die
Zellstruktur führten zur letzten Hypothese (WALTON 1980).
Der Verlauf und das histologische Bild der Muskeldystrophien sind ähnlich, auch wenn die
Ursachen sich unterscheiden und die Genese nicht vollständig geklärt ist.
Die pathologischen Veränderungen variieren stark im Krankheitsverlauf. Histologisch treten
in dystrophischer Muskulatur schon lange vor klinischer Manifestation der Erkrankung,
eventuell sogar schon während der Embryonalentwicklung, Zellnekrosen auf. Sie führen zu

13
frühzeitiger Erhöhung der Kreatininkinase. Nekrosen führen zu Phagozytose und an-
schließender Regeneration von Muskelfasern. Sekundär treten dann Veränderungen wie
Variation der Faserdiameter, Atrophie einzelner Muskelfasern, interne Nuklei und interstitielle
Bindegewebsproliferation auf. Im fortgeschrittenen Stadium kommt es zu Muskelfaserersatz
durch Binde- und Fettgewebe und zu Fibrose (CULLEN u. MASTAGLIA 1980; NONAKA
1998).
2.1.1 Muskeldystrophie beim Menschen
Der Begriff Muskeldystrophie wurde erstmals 1891 von ERB in einem historischen Kontext
verwandt, später in einer Reihe verschiedener Zusammenhänge. Alle bisher beschriebenen
Muskeldystrophien sind angeborene erbliche Erkrankungen der willkürlichen Muskulatur, die
mit fortschreitender Nekrose der betroffenen Muskeln einhergehen (GARDNER-MEDWIN
1980). Charakteristisch ist, daß von Anfang an nur bestimmte Muskelgruppen von den
Veränderungen betroffen sind. Diese Verteilungsmuster sind in erkrankten Familien konstant.
Zusammen mit der Progressionsrate und der Form der Erblichkeit ergeben sie eine effektive
Basis für die Klassifikation der Muskeldystrophien. Alle Muskeldystrophieformen gehen mit
Muskelschwäche einher. Der Zeitpunkt des Auftretens und die Progressionsrate variieren
stark zwischen den Muskeldystrophieformen. Neben klinischer Befunde findet man Hinweise
auf das Vorliegen einer Muskeldystrophie in der Erhöhung der Serumenzyme,
Kreatininkinase (CK) und Aldolase. Weitere Möglichkeiten der Diagnostik sind durch die
Elektromyographie oder die Biopsie gegeben. Die derzeitige Einteilung der
Muskeldystrophien beim Menschen kann Tabelle 1 entnommen werden (DEN DUNNEN u.
BAKKER 2000).

14
Tabelle 1: Muskeldystrophieformen beim Menschen
1. Dystrophinopathien (Dystrophingen, Xp21.2)
Krankheit Erbgang Abkürzung OMIM Nr. /
Literatur
Duchenne Muskeldystrophie x-chromosomal, rezessiv DMD 310200, MONACO
et al. 1989
Becker Muskeldystrophie x-chromosomal, rezessiv BMD 310200, MONACO
X-chromosomale dilatative
Kardiomyopathie
et al. 1989
x-chromosomal, rezessiv XLDC 302045, MUNTONI
et al. 1998
2. Limb-Girdle Muskeldystrophien (LGMD) (zur Übersicht: BUSHBY u. BECKMANN 1995)
Autosomal dominant vererbbare Erkrankungen (Typ 1)
Krankheit Gen Chromosom OMIM Nr. / Literatur
LGMD-1A Myotilin 5q22.3-q31.3 159000, SPEER et al. 1992
LGMD-1B Laminin A/2C 1q11-q21 159001,
VAN DER KOOI et al. 1997
LGMD-1C Caveolin-3 3p25 601253,
MINETTI et al. 1998
LGMD-1D unbekannt 7q 603511, SPEER et al. 1999

15
Autosomal rezessiv vererbbare Erkrankungen (Typ 2)
Krankheit Gen Chromosom OMIM Nr. / Literatur
LGMD-2A Calpain 15q15.1q21.1 253600, 114240
LGMD-2B Dysferlin 2p13.1-p13.3 253601,
Sarkoglykanopathien
RICHARD et al. 1995
BASHIR et al. 1996
Krankheit Gen Chromosom OMIM Nr. / Literatur
LGMD-2C = SCARMD γ-Sarkoglykan,
SGCG
LGMD-2D = ARMD α-Sarkoglykan,
SGCA
LGMD-2E = ARMD β-Sarkoglykan,
SGCB
LGMD-2F δ-Sarkoglykan,
SGCD
weitere LGMD
13q12-q13 253700, NOGUCHI et al.
1995
17q12-q21.33 600119, PICCOLO et al.
1995; ROBERDS et al. 1994
4q12 600900, LIM et al. 1995;
BONNEMANN et al. 1995
5q33-q34 601287, 601411, JUNG et
al. 1996 b
Krankheit Gen Chromosom OMIM Nr.
LGMD-2G Telethonin 17q11-q12 601954
LGMD-2H unbekannt 9q31-q33 254110
LGMD-2I unbekannt 19q13.3

3. andere Muskeldystrophien
Krankheit Gen Chromosom OMIM Nr.
FCMD Fukutin 9q31 253800
CMD Laminin α-2 6q22-q23 156225
XEMD Emerin Xq27.3-q28 310300, 310200
16
CMD = Congenital muscular dystrophy,
FCMD = Fukuyama congenital muscular dystrophy,
SCARMD = Severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy,
XEMD = Emery-Dreifuss muscular dystrophy
2.1.1.1 Die Duchenne Muskeldystrophie (DMD)
Die Duchenne Muskeldystrophie wurde erstmals 1852 von MERYON und 1868 von
DUCHENNE beschrieben (GARDNER-MEDWIN 1980). Sie ist die am besten untersuchte und
schwerste Muskeldystrophieform beim Menschen. Die DMD ist x-chromosomal rezessiv vererbbar
und rasch progredient. Die Veränderung ist auf dem Dystrophingen lokalisiert, dieses
liegt auf Chromosom Xp21.2. Die Krankheit tritt bei 1/3000-3500 männlichen Neugeborenen
auf. Da die Symptome anfangs noch undeutlich sind, wird die Diagnose häufig erst im
fortgeschrittenen Stadium gestellt. Hilfreich wäre die Bestimmung der Kreatininkinase bei
allen männlichen Säuglingen mit verzögerter psychomotorischer Entwicklung. Gerade vor
klinischer Manifestation der Erkrankung sind die Werte der Kreatininkinase bis zu 200fach
erhöht (PENNINGTON, 1980).
Die ersten Symptome treten meistens bereits vor dem 5. Lebensjahr auf. Klinisch zeigen die
Patienten progressive symmetrische Muskelschwäche der proximalen Gliedmaßenmuskulatur
und eine deutliche Hypertrophie der Waden. Anfangs ist besonders der Schultergürtel von
Muskelschwäche und Atrophie (M. brachioradialis, der kostale Ursprung des M. pectoralis
major, der M. latissimus dorsi, der M. biceps, M. triceps, M. iliopsoas, M. rectus femoris und
der mediale Kopf des M. quadriceps) betroffen. Später breitet sich die Muskelschwäche weiter
aus. Muskeln werden "pseudohypertroph" durch Ersatz der Muskelfasern durch Fett und
fibröses Gewebe. Gegen Ende der ersten Lebensdekade entwickeln sich Kontrakturen, diese

17
fallen besonders an der Wadenmuskulatur und den Mm. tensor fasciae latae auf und sind häufig
asymmetrisch. Mit 7 bis 14 Jahren werden die Kinder laufunfähig und sind auf fremde
Hilfe und den Rollstuhl angewiesen. Ein paar Jahre später treten starke Deformationen der
Wirbelsäule (Kyphose) auf. Schwäche der Paraspinalmuskeln kann zur Verdrehung des
Thorax führen, dieses ist meist der Auslöser für die Ateminsuffizienz, an der viele Patienten
bereits vor Erreichen des 20. Lebensjahres versterben.
Ab dem Alter von etwa 10 Jahren zeigen die meisten Patienten Veränderungen im EKG. Es
kommt zu Todesfällen durch Herzarrhythmien, jedoch führen meistens Infektionen des Respirationstraktes
oder Aspirationen zum Tode.
Die Diagnose DMD kann anhand des klinischen Bildes und der familären Vorgeschichte zusammen
mit der Bestimmung der CK und der Untersuchung einer Muskelbiopsie gestellt werden.
Der Serum-CK-Wert kann abhängig vom Krankheitsstadium 2-200 fach erhöht sein. In
der Muskelbiopsie fallen Variationen der Muskelfaserdurchmesser auf. Einzelne Muskelfasern
werden atrophisch oder hypertrophieren, Nekrose und Faserregeneration treten nebeneinander
auf. Die Einlagerung hyaliner Fasern sowie von Fett- und Bindegewebe fällt auf
(CULLEN u. MASTAGLIA 1980).
Dystrophin wurde 1986 kloniert, seitdem wurden viele Variationen des Gens beschrieben, die
zu Erkrankungen führen. Seit 1985 wurden Träger erkannt und pränatale Diagnostik mittels
Untersuchung mit polymorphen Markern auf Xp21 durchgeführt. Frameshift Mutationen oder
große Deletionen führen zum Funktionsverlust des Dystrophins (MONACO et al. 1989). Der
Verlust des Dystrophins führt sekundär auch zum Verlust oder verminderter Expression
anderer Proteine des Dystrophin-assoziierten Glykoproteinkomplex (DGC) (JENNEKENS et al.
2000).
2.1.1.2 Die Becker Muskeldystrophie (BMD)
Die Becker Muskeldystrophie wurde erstmals 1955 von BECKER und KIENER beschrieben. Sie
ist eine der häufigsten und am besten charakterisierten Muskeldystrophieformen. Die BMD ist
langsam progredient und kommt bei 3 bis 6 von 100000 Jungen vor.

18
Zwischen der DMD und der BMD besteht eine enge Verwandtschaft. Bei beiden Erkrankun-
gen werden die gleichen Muskeln hypertrophisch. Die schwach atrophischen Muskeln zeigen
das gleiche Verteilungsmuster. Schultergürtelschwäche wird vielleicht etwas häufiger bei der
BMD beobachtet.
Bei den Betroffenen erscheint das Gesicht mager, Wadenhypertrophie geht den anderen Veränderungen
einige Jahre voraus, oft fällt nur eine Schwäche des M. quadriceps auf. Muskelkrämpfe
nach Belastung sind häufig ein frühes Symptom. Auch Hohlfüße werden oft beschrieben.
Kontrakturen sind, außer in der Rollstuhlphase, eher ungewöhnlich. Selten treten
Skoliosen auf. Gelegentlich kommt es auch zu Kardiomyopathien, diese können zum Tod des
Patienten führen. Das Auftreten erster Symptome ist zeitlich sehr unterschiedlich, meistens
jedoch zwischen dem 5. und 15. Lebensjahr. Patienten mit BMD können jedoch ein fortgeschrittenes
Alter erreichen.
Durch EMG, CK-Bestimmung im Serum und die Muskelbiopsie läßt sich die BMD diagnostizieren.
Die Serum-CK ist anfangs 25-200fach erhöht und steigt mit dem Alter. Das EMG
kann Fibrillationspotentiale, positive Wellen und gelegentlich hochfrequente Entladungen
sowie kurzzeitige polyphasische Potentiale der motorischen Einheiten zeigen. Die Biopsie ist
nicht spezifisch, aber hypertrophe Fasern, zentrale Nuklei und Fibrosen sind charakteristisch.
Bei BMD liegen Punktmutationen oder sehr kleine in frame Deletionen im Dystrophingen
vor. Die Funktion des Dystrophins bleibt teilweise erhalten (MONACO et al. 1989; JENNEKENS
et al. 2000).
2.1.1.3 Die X-Chromosomale dilatative Kardiomyopathie (XLDC)
Bei der XLDC handelt es sich um eine Dystrophinopathie, die vor allem durch Veränderungen
der Herzmuskulatur ohne offensichtliche Veränderungen der Skelettmuskulatur charakterisiert
ist. Es ist eine familiär auftretende, letal verlaufende kongestive Myokarderkrankung
bei Knaben bis zur zweiten Lebensdekade.
Ursache sind Mutationen des Dystrophingens. Die CK bei den Patienten kann erhöht sein.
Histologisch zeigen sich leichteVeränderungen der Muskulatur (MUNTONI 1998).

19
2.1.1.4 Die Limb-girdle Muskeldystrophien (LGMD)
LGMD werden unter anderem durch Mutationen in Genen des Dystrophin-assoziierten
Glykoproteinkomplexes (DGC) verursacht. Sie sind eine genetisch und klinisch heterogene
Gruppe der Dystrophien, die autosomal dominant oder rezessiv vererbt werden. Die Progressionsrate
und die Schwere der Krankheit variieren. Allen LGMD ist gemeinsam, daß zunächst
die Schulter- und Beckenmuskulatur betroffen sind. Die Symptome von LGMD, BMD und
DMD sind sehr ähnlich. Bei dominant erblichen Erkrankungen kommt es häufig zu Muskelkontrakturen.
Wadenhypertrophie wie bei BMD und DMD wird ebenfalls beschrieben. Die
Krankheit kann in jedem Alter auftreten. Bei rezessivem Erbgang tritt sie häufig vor dem 20.
Lebensjahr auf und verläuft ähnlich wie die DMD. In dominant erblichen Fällen tritt die
Krankheit meist später auf und zeigt einen deutlich milderen Verlauf. Veränderungen am
Herzen werden nur selten beschrieben (BUSHBY 1999). Die Kreatininkinase ist bei dominant
erblichen Formen maximal bis 6fach erhöht, bei rezessiven Formen kann die CK bis 350fach
erhöht sein. Im EMG und in der Muskelbiopsie sind keine spezifischen Veränderungen feststellbar.
In der Computertomographie kann die Muskeldichte erhöht sein. Das Auftreten von
Dystrophinveränderungen und/oder ein x-chromosomaler Erbgang schließen die Diagnose
LGMD aus.
Die Sarkoglykanopathien stellen eine Gruppe der LGMD da. Sie werden durch Mutationen
der Sarkoglykangene verursacht. Hierauf wird an späterer Stelle genauer eingegangen. Für die
verschiedenen Formen gibt es klinische Charakteristika, die jedoch ohne Genanalysen keine
Differenzierung ermöglichen (BUSHBY 1999; DUGGAN u. HOFFMANN 1996).
α-Sarkoglykanopathien kommen am häufigsten vor und sind weltweit verbreitet. Die Patienten
zeigen Probleme beim Laufen und Treppensteigen, gelegentlich klagen sie über Muskelkrämpfe.
Häufig gehen sie auf der Fußspitze. Die CK ist oft massiv erhöht. Die Erkrankung
kann sich in der ersten Lebensdekade oder erst im Erwachsenenalter manifestieren. Schulter
und Beckenmuskulatur sind in fortschreitender Weise betroffen. Wadenhypertrophie wird
häufig beschrieben. Später kann es zu Herzmuskel- und Atemschwäche, Skoliose und Kontrakturen
kommen.

20
β-Sarkoglykanopathien treten meist in der ersten Lebensdekade auf. Es treten schwere und
milde Phänotypen auf, wobei bei den schweren Verlaufsformen die Patienten meist schon in
der zweiten Dekade an den Rollstuhl gefesselt sind (BONNEMANN et al. 1995).
γ-Sarkoglykanopathien sind weniger häufig und zeigen das gleiche Bild wie die α-Sarkogly-
kanopathien. Schwere und Zeitpunkt der Erkrankung variieren, jedoch überwiegen schwere
Krankheitsverläufe mit früher Erkrankung. Besonders der proximale untere Körpergürtel ist
von Muskelschwäche und Atrophie betroffen. Herzschwäche tritt nicht auf (ANGELINI et al.
1999).
δ-Sarkoglykanopathien zeichnen sich durch einen meist schweren Phänotyp und frühes Auf-
treten aus. Die Patienten haben eine Lebenserwartung von maximal 20 Jahren (JUNG et al.
1996 b; ANGELINI et al. 1999; LIM u. CHAMPBELL 1998).
2.1.2 Muskeldystrophie beim Hund
Beim Hund ist bisher nur wenig über erbliche Muskeldystrophien bekannt. Es gibt kaum
systematische Untersuchungen, lediglich die Duchenne-ähnliche Muskeldystrophie wird häu-
figer beobachtet. Von weiteren Formen existieren in der Regel nur Einzelfallbeschreibungen.
Eine Zusammenfassung der Muskelerkrankungen beim Hund bietet Tabelle 2.

Tabelle 2: Muskuläre Erbdefekte (nach NIEMAND u. SUTER 2001)
Krankheit Erbgang Betroffene Rassen
Myasthenia gravis AR viele Rassen
Congenitale Myotonie AR Chow Chow, Zwergschnauzer u.a.
Myopathie Typ II Fasermangel AR Labrador Retriever
21
Maligne Hyperthermie U Greyhound
Glykogenose Typ II AR Laplandhund
Hyperkalämische periodische Paralyse U Bullterrier
Scotty cramp AR Scottish Terrier
X-Chromosomale muskuläre Dystrophie XR Golden Retriever u.a.
Mitochondriale Myopathie M Bobtail
Spinale Muskelatrophie AD Brittany Spaniel
AR = autosomal rezessiv, U = unbekannt, XR = x-chromosomal rezessiv, AD = autosomal
dominant, M = mitochondrial
2.1.2.1 X-chromosomal erbliche Muskeldystrophie
Die bekannteste Erkrankung ist die Duchenne-ähnliche x-chromosomal erbliche Muskel-
dystrophie (VALENTINE et al. 1989). Sie ist durch progressive Degeneration der Skelettmus-
kulatur geprägt. Ursache ist ein erblicher Mangel an Muskelmembran-assoziiertem Dystro-
phin aufgrund einer Punktmutation im Intron 6, die zum Verlust des Exon 7 führt (BARTLETT
et al. 1996). Die Krankheit tritt beim Golden Retriever, Irish Terrier, Samojede und
Rottweiler auf. Sie wird x-chromosomal rezessiv vererbt, d.h., weibliche Tiere sind Träger,
während männliche Tiere erkranken. Die Symptome sind Muskelsteifheit mit Abduktion der
Vorderbeine und „bunny hopping“, Konditionsverlust, generalisierte Muskeldystrophie,
später Kontrakturen durch Fibrosierung, Trismus und Dysphagien. Auch Herz- und
Zwerchfellmuskulatur können betroffen sein. Bei Junghunden kommt es zu Aspirationspneumonien.
Neugeborene zeigen Schwäche und Probleme beim Saugen. Ein rascher Tod ist

22
möglich. Wenige Tiere erreichen ein Alter von 6-7 Jahren. Die Todesursachen sind meistens
Herz- oder Atemversagen.
Differentialdiagnostisch ist an Toxoplasmose oder Neosporose zu denken; auch Polyneuropathien,
Myopathien und Mißbildung des Rückenmarkes kommen in Frage. Über die Bestimmung
der CK (Normal: 20-350 U/l, hier z.T. auf über 10000 U/l erhöht), das EMG (typische
Veränderungen wie scharfe positive Entladungssequenzen) und die Untersuchung von
Muskelbiopsien läßt sich die Diagnose stellen. Bisher ist keine Therapie möglich.
Wegen der Parallelen zur Duchenne Muskeldystrophie des Menschen wurde eine Zucht erkrankter
Hunde aufgebaut, die als Tiermodell zur Aufklärung der Krankheit dienen soll
(VALENTINE et al. 1992).
2.1.2.2 Kongenitale Myotonie
Die kongenitale Myotonie tritt beim Chow Chow und Irish Terrier auf. Sie zeichnet sich
durch tonische Muskelkontraktionen und permanente Depolarisierung der Muskelmembran
aus. Die Muskelrelaxation ist stark verzögert. Ursache ist eine mangelnde Membranpermeabilität
für Natrium und Chlorid. Die Tiere zeigen progressive Steifheit der Muskeln nach Anstrengungen.
Die proximale Gliedmaßenmuskulatur und die Nackenmuskulatur hypertrophieren.
Beim Beklopfen ist eine Muskeldelle feststellbar. Die Diagnose läßt sich durch
Elektrodiagnostik und Biopsie stellen. Eine Therapie mit Procainamid ist möglich. Betroffene
Tiere haben eine normale Lebenserwartung (AMANN et al. 1985; FARROW u. MALIK 1981;
JONES et al. 1977).
2.1.2.3 Progressive Myotonie beim Rhodesian Ridgeback
Bei einer 33 Monate alten nicht kastrierten Rhodesian Ridgeback Hündin wurde eine progressive
Myotonie beschrieben (SIMPSON u. BRAUND 1985). Die Hündin wurde wegen Gewichtsverlust
nach einjähriger Phase fortschreitender Probleme vorgestellt. Sie zeigte starke Salivation
beim Fressen, die bis zur Dysphagie und zu respiratorischen Problemen führte. Unter-

23
suchungen ergaben Muskelschwäche im Larynxbereich und gesteigerten Tonus der Gliedmaßenmuskulatur.
Die CK-Aktivität war erhöht. Das EKG zeigte eine paroxysmale atriale
Tachycardie. Im EMG zeigten sich hochfrequente, bizarre Entladungen. Eine Muskelbiopsie
(M. biceps femoris, M. gastrocnemius) zeigte zentrale Nuklei, Nekrosen, multifokales Fasersplitting
und Phagozytose, moderate Faserdickenunterschiede sowie Atrophie der Typ II
Fasern. Es zeigten sich keine Entzündungserscheinungen, auch die Nerven erschienen normal.
2.1.2.4 Myotone Muskeldystrophie beim Boxer
1998 wurde ein Fall von myotoner Muskeldystrophie bei einem Boxer beschrieben (SMITH et
al. 1998). Der Hund war normal aufgewachsen und erstmals mit 28 Monaten wegen einer
wechselnden Lahmheit beim Tierarzt vorgestellt worden. Das Tier sprach anfangs auf Behandlungen
mit Prednisolon an. Innerhalb der nächsten sechs Monate wurde der Hund zusehend
steifer und weigerte sich, Treppen zu steigen. Hinzu kamen Inappetenz und Nasenausfluß.
Mit drei Jahren zeigte er Muskelschwäche im axialen Bereich und starke Salivation.
Eine Muskelbiopsie ergab milde Degeneration der Lumbalmuskeln und keine Veränderungen
im Vastus lateralis. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten Dystrophinveränderungen,
daher wurde die Muskeldystrophie als Duchenne-ähnlich eingeordnet. Der Hund
wurde mit drei Jahren und neun Monaten zu Untersuchungszwecken an die Auburn Universität
abgegeben. In den folgenden Jahren zeigte er Muskelschwund. Spinale Reflexe, Haltungs-
und Stellreaktionen sowie die Kopfnervenfunktionen waren normal. Nur eine Kontraktur
der Zunge, die sich nur schwer aus dem Maul ziehen ließ, war feststellbar. Das Blutbild
zeigte eine schwache regenerative Anämie, hohe CK-Werte und leicht erhöhte Leberenzyme,
vermutlich durch die langzeitige Kortisontherapie hervorgerufen. Im EMG zeigten
sich abnorme spontane Entladungen. Wegen fortschreitender Schwere der Veränderungen
wurde der Hund euthanasiert.
Histologische Muskeluntersuchungen zeigten unterschiedliche Faserdurchmesser, Atrophie
und Hypertrophie, Fasersplitting, interne Nuklei, Nekrosen und fettige Infiltrationen mit
Fibrose. Es fallen Parallelen zu dem oben beschriebenen Fall beim Rhodesian Ridgeback auf.

2.1.2.5 Myopathie bei Rottweilern
24
Eine Myopathie bei Rottweilern wurde bei zwei Wurfgeschwistern beschrieben (HANSON et
al. 1998). Die Hunde zeigten verminderte Aktivität und Haltungsanomalien, wie gespreizte
Zehen und Fußsohlengang. Neurologischen Störungen wurden nicht beobachtet. Im EMG
waren wenige Fibrillationspotentiale und positive scharfe Wellen zu sehen. Die motorische
Leitfähigkeit der Nerven war normal, hingegen waren die Aktionspotentiale der Mm. interossei
erhöht. Die Untersuchungen bestätigten das Vorliegen einer primären Myopathie. Zwei
weitere Hunde aus Würfen anderer Zuchtlinien zeigten das gleiche klinische Bild.
Histologische Muskeluntersuchungen bei allen vier Welpen zeigten Muskelfaseratrophie mit
schwach ausgeprägten Nekrosen, Fibrose des Endomysiums und Ersatz von Muskel- durch
Fettgewebe. Die Veränderungen waren in der distalen Muskulatur deutlicher ausgeprägt. Alle
Hunde zeigten erhöhte Plasmacarnitinwerte. Bei drei Welpen wurden auch erhöhte Muskelcarnitinkonzentrationen
festgestellt. Die Dystrophinexpression in der Muskulatur aller
Welpen war normal. Alle Welpen wurden wegen der Schwere der klinischen Symptome in
einem Alter zwischen 3 und 6 Monaten euthanasiert.
2.1.2.6 Scotty Cramp
Der Scotty Cramp (Schottenkrampf) ist eine anfallartige Bewegungsstörung, die bei Scottish
Terriern auftritt. Die erbliche Erkrankung ist vermutlich durch eine Transmitterstörung (Serotonin)
bedingt. Die Hunde zeigen ab der 6. Lebenswoche vor allem nach Anstrengung einen
steifen Gang. Es kommt zur Abduktion der Vordergliedmaßen. Durch Streckung der Hinterbeine
führen die Hunde katapultartige Bewegungen aus. Die Symptome verschwinden nach
Ruhe wieder. Zur Diagnose kann man die Krämpfe mit Methysergid (Serotoninantagonist)
auslösen. In schweren Fällen ist eine Therapie mit Acepromazinmaleat oder Diazepam angezeigt
(JOSHUA 1956).

2.1.2.7 Dysphagie-assoziierte Muskeldystrophie beim Bouvier des Flandres
25
Beim Bouvier des Flandres wurde eine mit Dysphagie-assoziierte Muskeldystrophie be-
schrieben (BRAUND 1990). Die Krankheit trat in zwei Familien auf. Erste Symptome zeigten
sich im Alter von 2 Jahren. Die Tiere litten unter Konditionsschwäche, Ataxie und Muskel-
atrophie. Durch dystrophische Veränderungen der pharyngealen und esophagealen Musku-
latur kam es zum Reurgitieren. Die CK bei erkrankten Tieren war mittelgradig erhöht (1000-
2000 U/l). Im EMG wurden hochfrequente bizarre Entladungen beschrieben. Die Diagnose
Muskeldystrophie ließ sich im histologischen Bild stellen. Die verwandtschaftliche Beziehung
zwischen betroffenen Bouviers wurde untersucht (PEETERS u. UBBINK 1994). Es handelte sich
um Nachkommen einer Zuchtlinie mit besonders hohem Inzuchtgrad. Ihr Erkrankungsrisiko
war 16mal höher als bei anderen Tieren derselben Rasse.
2.2 Der Dystrophin-assozierte Glykoproteinkomplex (DGC)
Der DGC ist ein großer oligomerischer Komplex sarkolemmaler Proteine und Glykoproteine.
Er spielt eine wichtige Rolle bei der Muskeldystrophie. Die Komponenten des Komplexes
wurden in ersten Beschreibungen als Dystrophin-assoziierte Proteine (DAP) und Glykoproteine
(DAG) bezeichnet. Die Proteine wurden nach ihrem Molekulargewicht 156 DAG,
59 DAP, 50 DAG, 43 DAG, 35 DAG und 25 DAP benannt (CAMPBELL u. KAHL 1989). In
späteren Beschreibungen wurden die Proteine desselben Komplexes mit A0, A1, A2, A3a/3b,
A4 und A5 bezeichnet (OZAWA et al. 1995) und in zwei Subkomplexe aufgeteilt, den Dystroglykankomplex
und den Sarkoglykankomplex (YOSHIDA et al. 1994).
Die Funktion des Komplexes ist nicht genau geklärt. Der DGC bildet eine mechanische
Brücke zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix. Ihm wird dort eine
Funktion bei der Kraftübertragung und Weiterleitung zugeschrieben. Außerdem scheint er die
Muskelmembran vor kontraktionbedingten Schäden zu schützen und für ihre Integrität verantwortlich
zu sein (ERVASTI u. CAMPBELL 1993, HOLT u. CAMPBELL 1998 b). Veränderungen
des DGC führen dazu, daß er seine Funktion in der Muskulatur nicht mehr ausüben

26
kann, es kommt zur Muskeldystrophie. Bestimmten Untereinheiten des DGC wird zusätzlich
eine Signalfunktion zugesprochen.
Sarkolemm
Laminin-2
Aktin
Integrin
Sarkoglykankomplex
Sarkospan
Dystrophin
Abbildung 1: Dystrophin-assoziierter Glycoproteinkomplex
Laminin-2
Dystrobrevin
extrazelluläre
Matrix
Dystroglykankomplex
Syntrophin
Carveolin-3
Die Komponenten des DGC werden schematisch dargestellt. Der SGC in Skelettmuskulatur wird durch α-, β-, γ-
und δ-Sarkoglykan repräsentiert, in glatter Muskulatur durch ε-, β-, γ- und δ-Sarkoglykan. ABD = Aktin Bin-
dungsdomäne, Cys = Cystein-reiche Region, COOH = Carboxy-Terminus
Der DGC setzt sich abhängig vom Gewebe, in dem er exprimiert wird, aus unterschiedlichen
Untereinheiten zusammen, die wiederum kleinere Subkomplexe ausbilden. Am besten sind
die Funktion und der Aufbau des DGC in quergestreifter Muskulatur untersucht. Die folgende

27
Aufstellung und die oben stehende Abbildung 1 geben einen Überblick über die zahlreichen
zytoplasmatischen Proteine und Transmembranproteine des DGC.
Aufstellung der zytoplasmatischen Proteine und Transmembranproteine des DGC
1) Glykoproteinkomplex
A) Dystroglykankomplex
- α-Dystroglykan (156 kD), großes extrazelluläres Glykoprotein
- β-Dystroglykan (43 kD, A3a), Transmembran-Glykoprotein
B) Sarkoglykankomplex
- α-Sarkoglykan (50 DAG, A2, Adhalin), Transmembran-Glykoprotein
- β-Sarkoglykan (43 DAG, A3b), Transmembran-Glykoprotein
- γ-Sarkoglykan (35 DAG, A4), Transmembran-Glykoprotein
- δ-Sarkoglykan (35 DAG, A4), Transmembran-Glykoprotein
2) Zytoplasmakomplex
A) Syntrophinkomplex
- α-Syntrophin (59 DAP), saures muskelspezifisches intrazelluläres Protein
- β1-Syntrophin (59 DAP), basisches Protein, ubiquitär
- β2-Syntrophin (59 DAP), basisches Protein, lokalisiert an der
neuromuskulären Verbindung
- γ1-Syntrophin
- γ2-Syntrophin
B) Dystrobrevin
- α-Dystrobrevin
- β-Dystrobrevin
3) weitere Proteine
- Dystrophin
- Sarcospan (A5, 25 DAP), Transmembran-Protein
- F-Aktin-bindendes, nicht klassifiziertes intrazelluläres Protein
- Caveolin 3
Dystrophin spielt eine wichtige Rolle bei der korrekten Formation und stabilen Präsenz des
DGC an der Plasmamembran (WORTON 1995; HACK et al. 2000 a). Verlust von Dystrophin

28
führt zu Erkrankungen wie DMD und BMD. Sekundär führt Dystrophinmangel zu Reduktion
oder Verlust anderer Proteine des DGC. Alle Proteine beeinflussen sich gegenseitig, das
Fehlen nur einer Untereinheit kann die Ausbildung des gesamten Komplexes verhindern
(HOLT et al. 1998 a u. b).
2.2.1 Der Sarkoglykankomplex (SGC)
2.2.1.1 Allgemeines
Der Sarkoglykankomplex bildet einen wichtigen Teil des DGC. Er wurde erstmals 1990 be-
schrieben (ERVASTI et al. 1990). Die Sarkoglykane sind N-glykolisierte Transmembran-
glykoproteine mit einer langen extrazellulären und einer kurzen intrazellulären Domäne. Der
C-Terminus mit mehreren Cystein-Resten befindet sich extrazellulär. Über Dystroglykan ist
der SGC am DGC fixiert, außerdem ist er eng an Sarcospan assoziiert. Die Zusammensetzung
des SGC variiert in verschiedenen Geweben. Bisher ging man davon aus, daß sich der SGC in
der glatten Muskulatur aus β-, δ- und ε-Sarkoglykan zusammensetzt. Neuere Untersuchungen
zeigen jedoch, daß auch γ-Sarkoglykan in der glatten Muskulatur exprimiert wird (BARRESI et
al. 2000). Die Existenz eines α-, β-, γ-, δ-Komplexes in quergestreifter Muskulatur und eines
ε-, β-, γ-, δ-Komplexes in glatter Muskulatur wurde an α-Sarkoglykan knock out Mäusen
untersucht (LIU u. ENGVALL 1999). Beide Komplexe werden an der Zelloberfläche exprimiert.
Dem SGC wird sowohl eine strukturelle Rolle wie auch eine Regulationsfunktion durch
Kopplung mechanischer und chemischer Signale zugeschrieben (HACK et al. 1999). Man
nimmt an, daß γ-Sarkoglykan direkten oder indirekten Einfluß auf die Kalzium-Kanäle hat
(HACK et al. 2000 a) und α-Sarkoglykan die extrazelluläre ATP-Konzentration mitreguliert
(YOSHIDA et al. 1998). Sarkoglykan-Verlust führt zu veränderter Membranpermeabilität und
Apoptosis.

Sarkolemm
29
α-SG ε-SG β-SG γ-SG δ-SG
62 % Homologie 69 % Homologie
Abbildung 2: Der Sarkoglykankomplex
Schematische Zeichnung der fünf Transmembranglykoproteine des SGC. α- und ε-Sarkoglykan sind Typ I
Transmembranproteine, während β-, γ- und δ- zum Typ II gehören. Cystein ist in der Zeichnung durch Pfeile
gekennzeichnet. Die Position der Cysteinreste zwischen α- und ε-Sarkoglykan ist völlig konserviert.
Die durch Veränderungen des Sarkoglykankomplex bedingten Erkrankungen werden als Sar-
koglykanopathien zusammengefaßt. Es handelt sich um rezessive autosomal erbliche Mus-
keldystrophien, deren Phänotyp stark variiert.
2.2.1.2 Die Proteine des SGC
Das humane α-Sarkoglykan, anfangs auch als Adhalin bezeichnet, ist ein 50 kD Typ I Trans-
membranprotein. Es hat eine schwache Bindung an den SGC. α-Sarkoglykan wird hauptsäch-
lich in Herz- und Skelettmuskulatur exprimiert, in geringen Mengen auch in der Lunge
(ETTINGER et al. 1997; DUCLOS et al. 1998). Das humane β-Sarkoglykan ist ein 43 kD Typ II
Transmembranprotein, charakterisiert durch konservierte geladene Reste vor der Transmem-
bran-Domäne (YOSHIDA et al. 1998). Das humane δ-Sarkoglykan ist ebenfalls ein

30
35 kD großes Typ II Transmembranglykoprotein. Es wurde durch Datenbank-Homologie-
analysen entdeckt, da es 58 % Homologie zu γ-Sarkoglykan aufweist (NIGRO et al. 1996). Es
hat eine starke Bindung an β-Dystroglykan und β-Sarkoglykan. δ-Sarkoglykan wird vor allem
in der Herzmuskulatur exprimiert (JUNG et al. 1996 b). Auf das humane γ-Sarkoglykan wird
an späterer Stelle gesondert eingegangen. Das humane ε-Sarkoglykan wurde erst spät durch
Datenbank-Homologieanalysen entdeckt und beschrieben (ETTINGER et al. 1997; MCNALLY
et al. 1998). Es zeigt eine hohe Homologie zu α-Sarkoglykan, dessen Rolle im SGC es zeit-
weise übernimmt. Es ist ein Typ I Transmembranprotein und wird in vielen verschiedenen
Geweben exprimiert.
2.2.1.3 Gene des Sarkoglykankomplexes
Das α-Sarkoglykangen (SGCA) wurde erstmals beim Kaninchen kloniert (ROBERDS et al.
1994). Beim Menschen liegt es auf Chromosom 17q21 (PICCOLO et al. 1995). Das mensch-
liche Gen besteht aus 10 Exons und erstreckt sich über 5,4 kb genomische DNA. Es wurde
eine alternativ gespleißte Form des α-Sarkoglykans beschrieben. Das β-Sarkoglykangen
(SGCB) mit Lokalisation auf Chromosom 4q12 ist ein 13,5 kb großes Gen. Es besteht aus
sechs Exons (BONNEMANN et al. 1995). Dem γ-Sarkoglykangen (SGCG) ist später ein
eigener Abschnitt gewidmet. Das δ-Sarkoglykangen (SGCD) liegt auf Chromosom
5q33-q34, ist über 100 kb groß und enthält 8 Exons. Es existiert eine alternativ gespleißte
Form in glatter Muskulatur (JUNG et al., 1996 b). ε-Sarkoglykangen (SGCE) besteht aus 12
Exons und erstreckt sich über 50-100 kb genomischer DNA. ε-Sarkoglykan ist beim Menschen
auf Chromosom 7q21-22 kartiert. Ein Pseudogen läßt sich dem Chromosom 2q22 zuordnen.
Die Genstruktur entspricht fast der des α-Sarkoglykangens (MCNALLY et al. 1998).
2.2.1.4 Mutationen der Gene des Sarkoglykankomplexes
Erste Beschreibungen von Sarkoglykanmutationen betrafen das α-Sarkoglykangen
(LGMD-2D) bei nordafrikanischen und europäischen Familien (ROBERDS et al. 1994). Unter-

31
suchungen zeigten, daß die meisten Mutationen im extrazellulären Bereich des Proteins lie-
gen, dieser wird vom 3. Exon kodiert. Die bedeutenste Mutation ist die Arg77Cys-Mutation
im Exon 3 des α-Sarkoglykangens (Piccolo et al. 1995). Auch bei den anderen Sarkoglykanen
liegen die Mutationen häufig im extrazellulären Bereich. Diese Lokalisation weist auf die
wichtige Rolle der extrazellulären Domäne hin. Die Arg77Cys-Mutation des α-Sarkoglykangens
liegt auf einem CpG Island (LIM u. CAMPBELL 1998). Man geht davon aus, daß sie in die
Regulation der Genexpression eingreift.
β-Sarkoglykanmutationen führen zu schweren und milderen Formen der LGMD-2E und zur
Instabilität des kompletten SGC (LIM et al. 1995; BONNEMANN et al. 1995). Meistens handelt
es sich um Deletionen.
δ-Sarkoglykanmutationen führen zur LGMD-2F, einer schweren Duchenne-ähnlichen Muskeldystrophieform.
Mutationen an den Cysteinresten sind kritisch und führen zu Muskeldystrophien
mit schweren phänotypischen Veränderungen. In der Muskelmembran werden
weder α-, β-, γ- noch δ-Sarkoglykan exprimiert, Dystrophin ist reduziert.
ε-Sarkoglykan-Sequenzvariationen wurden noch nicht beschrieben, es liegt jedoch in der
Kandidatengenregion für das split hand split foot deformity syndrome (SHSF).
556 Patienten mit Myopathien und normaler Dystrophin-Expression wurden auf Mutationen
im Sarkoglykankomplex untersucht (DUGGAN et al. 1997). Bei 54 Patienten war α-Sarkoglykan
vermindert. Eine α-Sarkoglykanmutation ließ sich bei 17 Patienten nachweisen, 8
Patienten zeigten eine β-Sarkoglykanmutation und 4 eine γ-Sarkoglykanmutation. Alle
Patienten zeigten Symptome einer schweren Duchenne-ähnlichen Muskeldystrophie oder
LGMD.
Die Untersuchung von Patienten mit Muskeldystrophie ungeklärter Ursache ergab in 20 % der
Fälle Mutationen in den Genen des SGC. Die Patienten mit α-Sarkoglykanmutationen zeigten
klinisch schwere und milde Phänotypen. Patienten mit β- und γ-Sarkoglykanmutationen
zeigen überwiegend schwere Phänotypen (ANGELINI et al. 1999).
Immunhistochemische Untersuchungen der α-, β-, γ- und δ-Sarkoglykanexpression bei
Patienten mit α-Sarkoglykanmutationen ergaben verminderter Expression von β-, γ- und

32
δ-Sarkoglykan und stark reduzierter α-Sarkoglykanexpression. Bei Patienten mit einer
γ-Sarkoglykanmutation war γ-Sarkoglykan stark reduziert und α- und β-Sarkoglykan partiell
vermindert. Die Sarkoglykanexpression zeigte keinen Zusammenhang zum klinischen Verlauf
(HIGUCHI et al. 1998).
Es wurden nach und nach zahlreiche unterschiedliche Mutationen in Sarkoglykan-Genen fest-
gestellt und beschrieben, dieses ist sehr bedeutend für die Diagnostik der Krankheit (NOGUCHI
et al. 1995; MCNALLY et al. 1996 a; DUGGAN u. HOFFMAN 1996; DUGGAN et al. 1997; VAN
DER KOOI et al. 1998; TODOROVA et al. 1999; MERLINI et al. 2000).
2.2.1.5 Tiermodelle für Sarkoglykanopathien
Tiermodelle bieten eine ausgezeichnete Möglichkeit, um Einblicke in die Physiologie und
Molekularbiologie des SGC zu bekommen. Die Untersuchung, zum Beispiel genthera-
peutischer Methoden, am Tiermodell ist von großer wissenschaftlicher Bedeutung. Es sind
knock out-Mäuse für die Untersuchung der Sarkoglykanopathien erstellt worden.
α-Sarkoglykan-defiziente Mäuse zeigen progressive Muskelnekrosen, Verlust der Integrität
des Sarkolemm und Kraftverlust (DUCLOS et al. 1998). Der α-Sarkoglykanverlust beeinflußt
die Stabilität des gesamten SGC, nur ε-Sarkoglykan bleibt unbeeinflußt.
Mäuse ohne β-Sarkoglykan zeigen progressive Muskeldystrophie mit extensiver De- und
Regeneration, Kardiomyopathie und abnorme Gefäßsystemreaktionen (ARAISHI et al. 1999).
Eine Deletion in der Promotorregion des δ-Sarkoglykan, die zum Integritätsverlust des Sar-
kolemms führt und eine schwere Kardiomyopathie beim BIO 14.6 Hamster verursacht wurde
beschrieben (NIGRO et al, 1996). Genau wie der Hamster leiden auch δ-Sarkoglykan-defi-
ziente Mäuse an Kardiomyopathien, Muskeldystrophie und Integritätsverlust des Sarkolemms.
Der primäre Defekt des δ-Sarkoglykan verursacht den kompletten Verlust oder die
Reduktion von α-, β- und γ-Sarkoglykan. Überexpression von δ-Sarkoglykan führt zur

33
Rückkehr der anderen SGC-Untereinheiten an die Plasmamembran. Die Defekte des Sarko-
lemms führen zu erhöhten Kalziumspiegeln in der Muskulatur (HOLT et al. 1998 b; STRAUB et
al. 1998)
2.2.2 γ-Sarkoglykan
2.2.2.1 Das Protein
Das humane γ-Sarkoglykan ist ein 35 kD an Dystrophin assoziiertes Typ II Transmembran-
protein. Es besteht aus 291 AS, 35 AS bilden den intrazellulären Amino-Terminus, 25 AS die
Transmembrandomäne (AS 36-60) und 231 AS den extrazellulären C-Terminus. γ-Sarko-
glykan fehlt eine N-terminale Signalsequenz, es hat geladene Reste bei AS 32 bis 34 (RKR).
Die extrazelluläre Domäne hat eine mögliche Glykosylierungsstelle am Aspargin 110.
Die extrazelluläre Domäne beinhaltet fünf konservierte Cystein-Reste (Cys 243, 265, 267,
282, 290). Das Protein hat eine Masse von 32350 Dalton, und der isoelektrische Punkt liegt
bei 5.
γ-Sarkoglykan wurde erstmals 1990 beschrieben (ERVASTI et al. 1990). Monoklonale Anti-
körper (MA 4-2) wurden eingesetzt, um das Protein zu lokalisieren und das Gen zu isolieren.
Der Bezug zum Chromosom 13 bei einer tunesischen Familie mit dystrophischen Muskelver-
änderungen wurde hergestellt (NOGUCHI et al. 1995).
Die γ-Sarkoglykan-Sequenzen von Menschen, Maus, Hamster, Kaninchen und Drosophila
melanogaster sind bekannt (NOGUCHI et al. 1995; HANADA et al. 1997; GREENER u. ROBERTS
2000). Bei der Untersuchung der Femoralismuskulatur von Ratten und Mäusen wurde die
Lokalisation des Proteins in den terminalen Zysternen und im Sarkoplasmatischen Retikulum
über den I-Banden festgestellt. Das γ-Sarkoglykan weist Immunoelektromikroskopisch eine
Streifung auf, die der des δ-Sarkoglykans sehr ähnlich ist (UEDA et al. 2001).

34
Das menschliche und das Kaninchen γ-Sarkoglykan sind mit einer Identität von 89 % auf AS-
Basis stark homolog. Zu δ-Sarkoglykan besteht eine Identität von 55 %, zu β-Sarkoglykan
immerhin noch 23 % Identität, und auch zu C. elegans-Klonen (F07H5.2.1) besteht eine
Homologie. Eine schwache Homologie wurde auch zu dem sogenannten EGF-ähnlichen
Cystein haltigen Repeat von Proteinen wie dem LDL-Rezeptor, Laminin α1 und Fibrillin be-
schrieben (MCNALLY et al. 1998; CHAN et al. 1998; HACK et al. 2000 b).
Die Expression von γ-Sarkoglykan in quergestreifter Herz- und Skelettmuskulatur sowie in
glatter Muskulatur wurde von mehreren Arbeitsgruppen gezeigt. Auch die schwache Expres-
sion von γ-Sarkoglykan in Gehirn, Augapfel, Rückenmark, Haut, Lunge, Aorta und Hoden-
gewebe wurde nachgewiesen (NOGUCHI et al. 2001; BARRESI et al. 2000).
Bei LGMD-2C-Patienten zeigt sich in der Muskelmembran keine Expression von
γ-Sarkoglykan, α- und β-Sarkoglykan sind vermindert.
2.2.2.2 Das γ-Sarkoglykangen (SGCG)
Das humane γ-Sarkoglykangen ist auf Chromosom 13q12 lokalisiert, es erstreckt sich über
100 kb genomischer DNA und enthält 8 Exons. Exon 1 gehört komplett zum 5´UTR, 174 bp
des Exon 8 sind kodierend, der Rest ist 3´UTR. Das Start-Codon ATG beginnt an Position 1
des 2. Exons. Intron 7 ist 2,5 kb groß, die anderen Introns über 15 kb. Die Transmembranregion
wird vom 2. Exon kodiert. Das 4. Exon kodiert für eine mögliche Aspargin-N-Glykosylierungsstelle
(MCNALLY et al. 1996 b). Die Genstruktur wird in Tabelle 3 noch einmal
verdeutlicht.
Noguchi klonierte die γ-Sarkoglykan-cDNA und stellte einen Bezug zur LGMD-2C
(SCARMD) her (NOGUCHI et al. 1995).
Bei Untersuchungen der Promotorregion des murinen SGCG Gens wurden eine Basalpromotorregion
und zwei differenzierungsabhängige Promotorregionen isoliert. Während der
Myotubenformation zeigt das SGCG Gen eine deutliche Transkriptionsaktivität. A/T-reiche

35
und E-Box-Elemente sind für die Transkription des SGCG Gens essentiell (WAKABAYASHI-
TAKAI et al. 2001).
Bei den Untersuchungen wurde festgestellt, daß das murine γ-Sarkoglykangen ein alternativ
gespleißtes erstes Exon besitzt. Exon 1a wird sowohl in glatter wie auch in Skelettmuskulatur
exprimiert, Exon 1b ausschließlich in Skelettmuskulatur. Da das erste Exon komplett im
5´UTR liegt, verursacht das alternative Spleißen keine Veränderung an der Proteinsequenz.
Tabelle 3: Genstruktur des humanen γ-Sarkoglykangens
Exon Größe (bp) Intron Größe (kb) Phase Bemerkungen
1 124 > 15 5´ UTR
2 195 > 15 0
3 102 ~ 16 0
4 88 > 15 1
5 120 > 15 1
6 73 > 15 2
7 124 2,5 2
8 805 / - 174 bp kodierend, 3´UTR
Untersuchungen an transgenen Mäusen mit einem Reportergen aus dem 5´UTR wurden zur
Aufklärung der Promotorfunktion durchgeführt. Das Reportergen wurde ausschließlich in
quergestreifter Muskulatur exprimiert. Das zeitliche und räumliche Transskriptionssmuster
von γ-Sarkoglykan während der Skelett- und Muskelentwicklung wurde untersucht. Unterschiede
zwischen der Expression des Reportergens und des endogenen γ-Sarkoglykans legten
die Existenz eines weiteren Promotorelements nahe. Durch RNA-Analysen wurde ein
weiteres Exon mit Promotor in nichtmuskulären Gewebe gefunden. (NOGUCHI et al. 2001)
Untersuchungen zum Therapieansatz mit viraler Genersatzstrategie zeigten, daß vermehrte
γ-Sarkoglykanexpression bei Mäusen zu schwerer Muskeldystrophie mit stark reduzierter
Muskelmasse und prämaturer Letalität führt. Es kommt zur Ausbildung von zytoplasma-

36
tischen Aggregaten und zur höher Regulation von α- und β-Sarkoglykan. Diese Unter-
suchungen machten deutlich, daß für eine mögliche Gentherapie die Expressionshöhe des
SGCG Gens genau reguliert werden muß, da eine Überexpression ähnlich schädlich wie eine
fehlende Expression ist (ZHU et al. 2001).
2.2.2.3 Mutationen des γ-Sarkoglykangens
Die ersten Variationen im γ-Sarkoglykan wurden von NOGUCHI beschrieben (NOGUCHI et al.
1995). Die Patienten litten unter der Severe childhood autosomal recessive muscular
dystrophy (SCARMD). Die häufigste Variation 525delT befindet sich auf dem 122 bp PCR-
Produkt von D13S232 (MCNALLY et al. 1996 a). Die Mutation führt zur Instabilität des
Proteins und sekundär zur Instabilität der anderen Sarkoglykanuntereinheiten. Frameshift
Mutationen, die die konservierten Cysteinreste am Carboxyterminus betreffen, führen auch
zur Instabilität des Sarkoglykankomplexes. Einen Überblick über die bisher beschriebenen
Polymorphismen gibt Tabelle 4.
Ein AS-Austausch der vom 7. Exon kodiert wird, führte bei einer holländischen Familie zu
einer milden Form langsam fortschreitender Muskeldystrophie mit früher klinischer Manifestation.
Immunhistochemisch war ausschließlich eine Reduktion von γ-Sarkoglykan festzustellen.
(VAN DER KOOI et al. 1998)
Die Untersuchung von fünfzig MD-Patienten offenbarte vier verschiedene γ-Sarkoglykanmutationen,
eine Insertion, eine Frameshift Mutation und zwei Deletionen. Teilweise hatten
die Mutationen den Abbruch des Carboxyl-Terminus zur Folge. Die α- und β-Sarkoglykanexpression
war reduziert, und γ-Sarkoglykan fehlte. Die Dystrophinexpression war wie bei
allen LGMD normal (MCNALLY et al. 1996 a).

Tabelle 4: Mutationen im γ-Sarkoglykangen (MCNALLY et al. 1996 a)
Lokalisation AS Protein Phänotyp
Exon 2 87/88insT Gly30Trpfs-1x59 Frameshift DMD-like
Exon 2 114T/C Leu/Leu38 normal
Exon 2 195+5del LGMD-2C
Exon 3 206G/C Gly69Asp LGMD-2C
Exon 3 297+6A/T LGMD-2C
Exon 3 228T/C Asp/Asp77 normal
Exon 4 312G/T Leu/Leu104 normal
Exon 4 347G/A Arg/His116 normal
Exon 6 506-578del Gly169Asp fs x194 LGMD-2C
Exon 6 525delT Phe175Leufs+1x194 Frameshift LGMD-2C/
DMDlike
Exon 6 519delT Frameshift LGMD-2C
Exon 7 581T/C Leu193Ser LGMD-2C
Exon 7 582insA Frameshift LGMD-2C
Exon 7 IVS6-30A/G normal
Exon 7 645-649delT Frameshift
Exon 7 705C/T Leu/Ser
Exon 8 848G/A Cys283Tyr LGMD-2C
Exon 8 793/794delT/G Frameshift DMD-like
Exon 8 801/802delTC Cys267fs+2x317 Frameshift DMD-like
Exon 8 ivs702-718insT normal
Exon 8 830T/C Leu/Leu235Ser/Asn287 normal
37
Exon 8, 3´UTR 923/924delTG schwere LGMD
Exon 8, 3´UTR 860G/A Ser287Asn normal
Exon 8, 3´UTR 889C/T normal
Exon 8, 3´UTR 911/912insG normal
Exon 8, 3´UTR 940G/A normal
Exon 8, 3´UTR 942C/G normal

2.2.2.4 Das Tiermodell für LGMD-2C
38
Durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen wurden γ-Sarkoglykan knock-
out Mäuse hergestellt (HACK et al. 1998). Mäuse ohne γ-Sarkoglykan zeigten bereits zu
Lebensbeginn deutlich dystrophische Muskelveränderungen. Mit 20 Wochen entwickelten die
Mäuse eine Kardiomyopathie und verstarben. Der Verlust von γ-Sarkoglykan führt zu sekundärer
Reduktion von β- und δ-Sarkoglykan, α- und ε-Sarkoglykan werden teilweise reduziert.
Daraus kann man schlußfolgern, daß β-, γ- und δ-Sarkoglykan als eine Einheit funktionieren
(CHAN et al. 1998; HACK et al. 1998). Dystrophin war bei der Maus in normaler Menge und
Lokalisation vorhanden. Dies demonstriert, daß Muskelfaserdegenerationen unabhängig von
Dystrophinveränderungen vorhanden sein können. Außerdem blieben auch β-Dystroglykan
und Laminin intakt. Das läßt annehmen, daß der mechanische Zusammenhang Dystrophin-
Dystroglykan-Laminin durch γ-Sarkoglykandefizienz unberührt bleibt.
Viele apoptopische Nuklei in der Skelettmuskulatur der knock out-Mäuse zeigen, daß programmierter
Zelltod zu Muskelfaserdegeneration führt. Vital staining-Untersuchungen mit
Evansblau zeigen, daß γ-Sarkoglykan-Verlust zu Muskelmembranzerstörungen führt, genau
wie bei dystrophindefizienten Mäusen. Die γ-Sarkoglykandefizienten Mäuse zeigen fast den
gleichen Phänotyp wie Menschen mit LGMD (HACK et al. 2000 b). Untersuchungen ergaben,
daß γ-Sarkoglykan für die Integrität des Sarkolemms nicht notwendig ist. Die Muskeln zeigen
keine Tendenz, schneller zu ermüden, und weisen normale Widerstandskraft gegen mechanische
Verletzungen durch exzentrische Muskelkontraktionen auf. Hieraus läßt sich die nichtmechanische
Funktion des γ-Sarkoglykans ableiten (HACK et al. 1999).
Sarkoglykandefizienz scheint ein Grund für Veränderungen der Membranpermeabilität zu
sein. Die terminalen Zisternen sind eine wichtige Struktur des Kalzium-Stoffwechsels der
Zellen, dieser ist bedeutend für die Muskelkontraktion. Es wird vermutet, daß β-, δ- und
γ-Sarkoglykan hier eine Signalfunktion ausüben (HACK et al., 2000 a).

3 Material
39
3.1 Bakterien, Phagen, Plasmide und Genbanken
3.1.1 Bakterien
Stratagene, Heidelberg:
E. coli XL1-Blue rec-a1m endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, rellA1, lac, [F´proAB,
lacIqZ∆M15, Tn10(tetI)]
E. coli XL1 Blue MRA (P2) ∆(mcrA) 183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173, end A1, supE44,
thi-1, gyrA96, tellA1, lac, [F´proAB, lacIqZ∆M15, Tn10 (tetI)], P2 lysogen
3.1.2 Phagen
Stratagene, Heidelberg:
λFIX®II
λsbhlλ1°, Aam, Bam, b189 < Polylinker (XbaI, SacI, NotI, SacI, SalI, XhoI, EcoRI), int29,
ninL44, bio, cI857, trpE, (EcoRI, XbaI) Polylinker > KH54, chiC, srIλ4°, nin5, srIλ5°
3.1.3 Plasmide
Promega Bio Tec, Madison, WI, USA:
pGEM-4Z
3.1.4 Genbanken
RPC I – 81, canine BAC-Genbank [Internet URL: http://www.chori.org/bacpac/]

3.2 Enzyme
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg:
Thermosequenase Kit, ECL-Kit
New England Biolabs, Schwalbach:
T4-DNA-Ligase, Restriktionsenzyme
Quiagen GmbH, Hilden:
Taq-DNA-Polymerase
40
Roche diagnostics GmbH, Molecular Biochemicals, Mannheim:
alkalische Phosphatase, DNAse I, RNAse A, Restriktionsenzyme
3.3 Chemikalien und andere Materialien
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg:
Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7 – deaza – dGTP,
α-[ 32 P]-dCTP, Desoxynucleotidtriphosphate, ECL direct nucleic acid labelling and detection
system, Hybond N + -Nylonmembranen, PCR Product Direct Sequencing Kit
Biorad Laboratories, Richmond, California, USA:
Agarose (Molecular Biology Certified und Pulsed Field Certified)
Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf:
SequaGel XR – solution + buffer reagent
C. Roth, Karlsruhe:
Agar-Agar, 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal), Dimidiumbromid,
EDTA (Dinatriumsalz Dihydrat) Titrierkomplex III, Glycerin, Hefeextrakt, Kaliumacetat,

41
Natriumchlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), Pepton aus Casein (Trypton), Phenol, Gel-
Blotting-Papier, Tris (Hydroxymethylaminomethan)
E. Merck AG, Darmstadt:
Acrylamid, Ammoniumperoxodisulfat, Ampicillin, Borsäure, Bromphenolblau, Calcium-
chlorid, N,N-Dimethylformanid, Dinatriumhydrogenphosphat, Essigsäure, Ethanol p.A.,
Ethidiumbromid, Ethylen-Diamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA), Harnstoff, Iso-
amylalkohol, Isopropanol, Lithiumchlorid, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangan-
chlorid, Natriumacetat, Natriumchlorid, Natriumcitrat, Paraffinöl, Salzsäure, N,N,N´,N´-
Tetrametylethylendiamin (TEMED), Triton X-100, Xylencyanol
Eastman Kodak Company, Rochester, New York, USA:
Röntgenfilme biomax MR, X-OMAT AS und X-OMAT AR
Eppendorf Gerätebau, Hamburg:
Reaktionsgefäße 1.5 ml, 1.5 ml Safe-lock, 0.5 ml Safe-lock, 1.5 ml mit Dichtung und
Schraubverschluß
GibcoBRL Life Technologies, Heidelberg:
Agarose (Ultra Pure)
Greiner GmbH, Nürtingen:
Ppn-Röhrchen 10 ml und 50 ml
Krannich GmbH & Co KG, Göttingen:
Glaswaren
MWG – Biotech AG, Ebersberg:
64 er Haifischkamm, Spacer, 41 cm, 0,25 mm, Glasplatten, 41 cm

Nunc GmbH, Wiesbaden:
Inokulotionsnadeln, Mikrotiterplatten, Plastikpetrischalen, Zellkulturröhrchen 10 ml
Quiagen GmbH, Hilden:
Quiagen Plasmid Kits, Quiaex II Kit
O. Aldag, Hamburg:
NZ-Amine A
Riedel de Haёn GmbH, Seelze:
Essigsäure, Ethanol p.A.
42
Roche Diagnostic GmbH, Molecular Biochemicals, Mannheim:
Adenosintriphosphat
Schütt Labortechnik, Göttingen:
Glaswaren
Sigma Chemie, München:
APS (Ammoniumperoxidsulfat p.A.), DMSO (Dimethylsulfoxid), LB Agar, LB Broth, 3-(N-
Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), Tetracyclin, Ficoll 400
Stratagene, Heidelberg:
Mikrotiterplatten für Robocycler 96 - well, Robocycler 96 - well
Whatman Limited, Springfield Mill Maidstone, Kentucky, USA:
3MM-Chromatographiepapier
3.4 Geräte
Agfa-Gevaert AG, Leverkusen:

Entwicklermaschine Gevamatic 110
Bachhofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen:
43
Vacuum Concentrator BA-VC-300-H, UV Schirm 366 nm
Bender & Hobein, Zürich, Schweiz:
Vortex Genie 2
Biorad Laboratories, Richmond, California, USA:
Elektrophoresekammern für Agarosegele, PowerPac 3000, Power Supply Model 200/2.0
DuPont und Sorvall Instuments, Bad Nauheim:
Zentrifuge RC-5B
Eppendorf Gerätebau, Hamburg:
Tischzentrifuge 5415, Kühlzentrifuge, Heizblock
Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel:
Wasserbad 1002, Wasserbad mit Schütteleinsatz 1083
Heraeus Christ, Osterode:
Biofuge 13, Biofuge 28 RS, Minifuge RF
Infors AG, Bottmingen, Schweiz:
Schüttelinkubator RKF-125
Hybaid Limited, Teddington, Großbritannien:
Elektrophoresekammern für Agarosegele, Hybridisierungsrollen, Rollhybridisierungsgerät,
Janke & Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen i. Br.:
Magnetrührer Ikamag RCT, Magnetrührer KM02 electronic, Ultra-Turrax ® T25

Gebr. Liebisch, Bielefeld:
Heatblock 2099-DA
MWG–Biotech AG, Ebersberg:
Li–Cor Sequenzer Modell 4000L, Hybaid Omni Gene Thermocycler
Stratagene, Heidelberg:
EagleEye II
Vacubrand GmbH & Co, Wertheim:
44
Chemie-Hybrid-Pumpe RC4, Membranpumpe M72C
3.5 Probanden
Das γ-Sarkoglykangen wurde bei vier Hunden vergleichend untersucht:
1. Gini, Dobermann mit Muskelveränderung, weiblich, 3 Jahre
2. Broscha, Dobermann, Halbbruder von Gini, klinisch unauffällig
3. Lea, Dobermann, Mutter von Gini, klinisch unauffällig
4. Jule, Französische Bracke, nicht verwandt mit 1. bis 3., klinisch unauffällig
Des weiteren wurden zur SNP-Analyse Proben weiterer 16 Hunde zur Untersuchung heran
gezogen:
1. Irish Setter, Larry of Wildfire (1001384)
2. Retriever (1001358)
3. Gadis (1001306)
4. Irish Setter, Dubliner (1001269)
5. Irish Setter, Alysha (1001270)
6. Deutscher Schäferhund, Langhaar (1001096)
7. Hund (1001093)
8. Yorkshire Terrier (100902)

9. Deutsche Dogge (100875)
10. Dalmatiner (100773)
11. Deutsch Drahthaar (100712)
12. Irish Red Setter (100550)
13. Hund, Thea (100526)
14. Hund, Hobby (100527)
15. Hund, Earl (100461)
16. Hund (100456)
Die Nummern in Klammern sind fortlaufende Untersuchungsnummern des Labors.
45
3.6 Anamnese und Untersuchungsbefunde des Hundes "Gini"
Die Dobermannhündin Gini wurde im März 1995 in Polen geboren. Im September 1998
wurde sie erstmals zur Untersuchung in der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der
Universität Göttingen vorgestellt. Gini fiel durch Bewegungsunlust und einen steifen Gang
auf. Eine Hypertrophie der Schulter- und Rumpfmuskulatur war festzustellen, dieses ist in
Abbildung 3 deutlich zu sehen. Die Besitzer berichteten, daß Ginis Vater ähnliche Veränderungen
gezeigt hat und deshalb euthanasiert wurde. Auch Wurfgeschwister sollen wegen Veränderungen
der Muskulatur aufgefallen sein.
Laboruntersuchungen ergaben eine Erhöhung der muskelspezifischen Enzyme und eine Leukozytose
(LDH 216 U/l (

46
Histologisch war eine starke Hypertrophie der Typ1-Muskelfasern zu sehen. Immunhisto-
chemische Untersuchungen mit spezifische Antikörpern ergaben einen partiellen Verlust der
Dystrophin Rod-Domäne (DYS 1-AK) mit abgeschwächter Expression. Am Carboxy-Terminus
(DYS 2-AK) waren keine Veränderungen festzustellen, und der Amino-Terminus (DYS
3-AK) zeigte keine sichere Veränderung. Auch Spektrin, Merosin, Laminin und Adhalin
zeigten keine sichere Veränderung. Ein partieller Verlust der γ-Sarkoglykanexpression war
feststellbar. In größeren Anteilen des Querschnitts war die γ-Sarkoglykanexpression negativ,
nur einzelne Felder und membranständige Einzelfasern waren partiell positiv. Ein subtotaler
Verlust der β-Dystroglykanexpression war feststellbar. Im kritischen Bericht sprach der
Pathologe von ausgeprägten, chronischen, myopathischen Veränderungen mit einem
partiellen Verlust von Dystrophin 1 sowie der Dystrophin-assoziierten Glykoproteine γ-
Sarkoglykan und β-Dystroglykan. Somit handelte es sich um eine Muskeldystrophie.
Beim Hund ist über die Expressionsmuster der Muskelproteine bisher nur sehr wenig bekannt.
Das Bild von Gini entsprach keinem Expressionsmuster, das vom Menschen bekannt ist, und
konnte somit keinem bestimmten MD-Typ zugeordnet werden.
Muskelmyographische Untersuchungen sind beim Hund nur bedingt durchführbar. Man hat
bisher nur wenig Erfahrung, wie die Ergebnisse beim Hund auszuwerten sind. In der Elektromyographie
(EMG) zeigte die Muskulatur gute Entspannung. Geringe pathologische
Spontanaktivität mit pseudomyotonen und myotonen Serienentladungen war im M. triceps,
mäßige im M. latissimus dorsi und ausgeprägte im M. glutaeus feststellbar. Die Willküraktivität
des M. latissimus dorsi war erhöht. Sie zeigte teilweise erhöhte Phasenzahl mit sehr
steilen kurzen Peaks. Dies ist ein Zeichen für myogene Umbauvorgänge.
Gini wurde mit Cortison, Vitamin E und Anabolika behandelt. Ihr Zustand besserte sich. 1999
verstarb Gini an einem Leberkarzinom.

Abbildung 3: Dobermann Gini
47
Die Hypertrophie der Schultermuskulatur ist deutlich zu sehen.

4 Methoden
48
4.1 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA
4.1.1 Bakterienkultur (AUSUBEL et al. 1990)
4.1.1.1 Flüssigkultur
Autoklaviertes L-Broth Medium (LB-Medium) wurde, gegebenenfalls nach Zugabe der ent-
sprechenden Antibiotika, mit Bakterien einer Plattenkultur oder einer anderen Flüssigkultur
angeimpft. Die Flüssigkulturen wurden bei 37 °C im Schüttler inkubiert.
LB-Medium: 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
H2O bidest. ad 1000 ml, autoklavieren
Die Antibiotika wurden den Medien nach dem Autoklavieren und Abkühlen in folgenden
Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin 50 µg/ml, 1000x Ampicillin-Stammlösung: 50 mg/ml
in H2O, Tetracyclin 12.5 µg/ml, 1000x Tetracyclin-Stammlösung: 12.5 mg/ml in 70 %
Ethanol, gelagert bei –20 °C (lichtempfindlich).
Flüssigkulturen wurden bei 4 °C kurzfristig, maximal 2 Wochen, aufbewahrt.
4.1.1.2 Plattenkultur
LB-Agar wurde autoklaviert und auf ca. 55 °C abgekühlt, je nach Selektionsanforderung mit
Ampicillin (50 µg/ml), Tetracyclin (12.5 µg/ml) und X-Gal (40 µg/ml) versetzt und ca. 5 mm
hoch in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Erstarren wurden die Platten offen für
40 Minuten zum Trocknen in eine sterile Laminarhaube gelegt. Nach dem Trocknen wurden

49
die Agarplatten steril verpackt bei 4 °C für mehrere Wochen aufbewahrt. Mittels einer sterilen
Pipette wurden 50–800 µl Flüssigkultur auf eine Platte gegeben und mit einem sterilen
Drygalski-Spatel ausgestrichen. Die Platten wurden dann für 16–24 Stunden bei 37 °C
inkubiert.
LB-Agar: 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
15 g Agar-Agar
H2O bidest. ad 1000 ml, autoklavieren
1000x X-Gal-Stammlösung: 40 mg/ml in N,N-Dimethylformamid (DMF), gelagert bei
– 20 °C.
4.1.2 Isolierung von Plasmiden aus Escherichia coli (HANAHAN 1983)
4.1.2.1 Herstellung transformationskompetenter E. coli XL1-Blue
20 ml TYM-Medium, das 12.5 µg/ml Tetracyclin enthielt, wurden in einem 250 ml-Kolben
mit E. coli XL1-Blue angeimpft und unter Schütteln bei 37 °C inkubiert, bis die Bakterien
eine OD600 von 0.5–0.8 erreicht hatten. Die Kultur wurde mit weiterem TYM/tet-Medium auf
100 ml verdünnt und in einem 2000 ml Kolben erneut bis zu einer OD600 von 0.5–0.8
vermehrt. Es wurde auf 500 ml verdünnt und bis zu einer OD600 von 0.6 inkubiert. Die Bakterienkultur
wurde durch vorsichtiges Schütteln in einem NaCl/Eiswasserbad rasch auf 0 °C
abgekühlt und bei 4000 Upm und 2 °C für 10 Minuten im GSA-Rotor abzentrifugiert. Das
Bakterienpellet wurde vorsichtig in 100 ml 0 °C kaltem TfB I resuspendiert und erneut wie
oben abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 ml 0 °C kaltem TfB II resuspendiert. 200 µl
Aliquots wurden in vorgekühlte Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert und sofort in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Die kompetenten Bakterien wurden bei - 80 °C aufbewahrt.

TYM-Medium: 20 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
50
2 g MgSO4 x 7 H2O
H2O bidest. ad 1000 ml, autoklavieren
TfB I: 30 mM KOAc (pH 6.5)
50 mM MnCl2
100 mM KCl
10 mM CaCl2
15 % (v/v) Glycerin
TfB II: 10 mM Na-MOPS (pH 7.0)
75 mM CaCl2
10 mM KCl
15 % (v/v) Glycerin
4.1.2.2 Transformation kompetenter E. coli
200 µl kompetente E. coli XL1-Blue wurden auf Eis aufgetaut und zu 30 µl DNA-Lösung, die
im allgemeinen ca. 50–200 ng ligierte Plasmid-DNA oder 10–50 ng supercoiled Plasmid-
DNA enthielt, pipettiert. Der Ansatz wurde für 20–40 Minuten bei 0 °C inkubiert, dann für
115 Sekunden bei 42 °C gehalten und wieder auf Eis abgekühlt. Dem Transformationsansatz
wurden 250 µl NZCYM-Medium (Raumtemperatur) zugesetzt. Der Ansatz wurde 45 Minuten
im Schüttler bei 37 °C inkubiert. 50–300µl dieses Ansatzes wurden dann auf LB/amp/tet/X-
Gal-Platten ausplattiert und 12 bis 16 Stunden bei 37 °C inkubiert.

NZCYM-Medium: 10 g NZ-Amine A
5 g Hefeextrakt
51
1 g Casaminoacids
5 g NaCl
2 g MgSO4 x 7 H2O
H2O bidest. ad 1000 ml, autoklavieren
4.1.2.3 Isolierung von Plasmiden mit dem Quiagen Plasmid Kit
Um größere Mengen hochreiner Plasmide zu isolieren, werden Quiagen Plasmid Kits verwendet.
Die Bakterien werden dabei durch eine NaOH/SDS-Behandlung lysiert. Proteine und
assoziierte genomische DNA werden durch KOAc gefällt. Die weitere Reinigung der Plasmid-DNA
geschieht durch Ionenaustauschchromatographie.
20-500 ml Bakterienkultur wurden für 15 Minuten bei 5500 Upm und 4 °C abzentrifugiert.
Das Bakterienpellet wurde in einer entsprechenden Menge Puffer P1 resuspendiert. Zur Lyse
der Bakterien wurde das gleiche Volumen Puffer P2 zugegeben, vorsichtig gemischt und für
5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde ein weiteres Volumen Puffer P3
zugegeben und kräftig geschüttelt, so daß die ausfallenden Proteine relativ kleine Partikel
bildeten. Der Niederschlag wurde für 30 Minuten bei 6000 Upm und 4 °C abzentrifugiert. Der
Überstand wurde auf eine mit Puffer QBT äquilibrierte Quiagen-Säule gegeben. Nachdem mit
Puffer QC gewaschen worden war, wurde die Plasmid-DNA mit Puffer QF eluiert. Die DNA
wurde durch Zugabe von 0.7 Volumen Isopropanol über Nacht bei 4 °C gefällt. Die DNA
wurde für 30 Minuten bei 6000 Upm und 4 °C abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit –20 °C
kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. die DNA wurde in einem
entsprechenden Volumen TE (10/1) gelöst und die Konzentration durch Messung der
optischen Dichte bei 260 nm im Spektralphotometer bestimmt.

52
Puffer P1: 50 mM Tris/HCl pH 8.0
10 mM EDTA
100 µg/ml RNAse A, gelagert bei 4 °C
RNAse A Stocklösung: 10 mg/ml in H2O bidest., zur Inaktivierung von DNAsen für 15
Puffer P2: 200 mM NaOH
Minuten auf 100 °C erwärmt, gelagert bei –20 °C
1 % SDS
Puffer P3: 3 M KOAc, pH 5.5
Puffer QBT: 750 mM NaCl
Puffer QC: 1 M NaCl
50 mM Na-MOPS pH 7.0
15 % (v/v) Isopropanol
0.15 % (v/v) Triton X-100
50 mM Na-MOPS pH 7.0
15 % (v/v) Isopropanol
Puffer QF: 1.25 M NaCl
50 mM Na-MOPS pH 8.5
15 % (v/v) Isopropanol
TE (10/1): 10 mM Tris/HCl pH 8.0
1 mM EDTA

4.2 DNA-Isolierung (AUSUBEL et al. 1990)
53
4.2.1 Isolierung genomischer DNA aus Vollblut
3–5 ml Blut wurden mit 10 ml 1 x SSC versetzt und gut gemischt. Die Probe wurde daraufhin
bei 10000x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Das Leukozytenpellet wurde wiederum in 10 ml 1x SSC resuspendiert und abzentrifugiert.
Dieser Schritt wurde so oft wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Leukozyten wurden
anschließend in 5 ml 0.2 M Na-Acetat, pH 7.0 resuspendiert und es wurden 5 ml 10 (v/v) SDS
zugegeben. Nach vorsichtigem Schwenken wurden 5 ml Phenol/CIA zupipettiert, und der
Ansatz wurde gut gemischt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation bei 10000x g 10
Minuten bei Raumtemperatur getrennt. Die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen
überführt und mit 5 ml CIA gut gemischt und erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand
wurde wieder in ein neues Röhrchen überführt. Zum Fällen der DNA wurden 5 ml Isopropanol
zugegeben. Die ausgefallene DNA konnte mit einer Pasteurpipette gefischt werden. Sie
wurde mit 70 %igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die DNA wurde anschließend
über mehrere Stunden in einem adäquaten Volumen TE gelöst.
1 x SSC: 150 mM NaCl
15 mM Na3-Citrat
Phenol/CIA: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol wurden im Verhältnis 25:24:1 gemischt
CIA: Chloroform und Isoamylalkohol wurden im Verhältnis 24:1 gemischt
4.2.2 Isolierung kleiner DNA-Fragmente (< 20 kb) aus Agarosegelen
Nach Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese wurde die zu isolierende DNA-Bande
auf einem UV-Leuchttisch (366 nm) ausgeschnitten und in ein 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt.

54
Entweder konnte eine für die Ligation ausreichende Menge durch Abzentrifugieren der
Agarosestücke gewonnen werden (10 Minuten bei RT), der Überstand wurde dann direkt in
den Ligationsansatz eingesetzt, oder die DNA wurde mit dem Quiaex II-Kit eluiert. Dazu
wurden die Agarosestückchen nach dem Ausschneiden ausgewogen, in Eppendorftubes überführt
und mit drei Volumina Puffer QX 1 und 10–12 µl Quiaex II versetzt. Der Ansatz wurde
10 Minuten bei 50 °C inkubiert und dabei alle 2 Minuten geschüttelt. Danach wurde die Probe
30 Sekunden zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde mit QX 1 gewaschen,
zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dann wurde das Pellet noch zweimal mit PE
gewaschen und anschließend 15 Minuten getrocknet. Zum Schluß wurde es in TE eluiert.
4.2.3 Schnellaufschluß durch alkalische Lyse
Eine 5 ml LB/amp/tet-Kultur wurde mit einer einzelnen Kolonie von einer Platte angeimpft
und bei 37 °C 8-20 Stunden geschüttelt. Die Kultur wurde bei 5000 Upm für 7 Minuten bei
Raumtemperatur abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 150 µl Puffer P1 resuspendiert und in
ein 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 150 µl Puffer P2 zugegeben und
für ca. 5 Minuten bis zur vollständigen Lyse der Bakterien inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl
Puffer P3 wurde der Ansatz gemischt und bei 20000 Upm für 15 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert.
Das Pellet wurde mit 1 ml –20 °C kaltem, 70 %igem Ethanol gewaschen und im
Vakuum für 5 Minuten getrocknet.
4.2.4 Isolierung von BAC-DNA durch Schnellaufschluß
BAC-Stichkulturen wurden auf LB-Platten mit 20 µg/ml Chloramphenicol ausplattiert und
12 Stunden bei 37 °C inkubiert. Einzelkolonien wurden in 5 ml LB mit Chloramphenicol
angeimpft und 16 Stunden bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Die Kultur wurde 10 Minuten bei
5000 Upm zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde in 0.3 ml P1 resuspendiert.
Es wurden 0.3 ml P2 zugegeben und vorsichtig gemischt, dann wurde der Ansatz
kurz bei Raumtemperatur stehengelassen, ehe 0.3 ml P3 zugegeben wurden. Der Ansatz

55
wurde kurz auf Eis inkubiert. Anschließend wurde 15 Minuten bei 22000 Upm und
4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in 0.8 ml Isopropanol bei –20 °C überführt und kurz
auf Eis inkubiert. Dann wurde erneut 15 Minuten bei 4 °C und 22000 Upm zentrifugiert. Der
Überstand wurde entfernt und das Pellet mit 1 ml EtOH 70 % gewaschen. Zum Schluß wurde
das Pellet an der Luft getrocknet und in 40 µl TE resuspendiert.
4.3 BAC-Genbankscreen (AUSUBEL et al. 1990)
Für den Genbankscreen wurden die 9 BAC-Filter kurz in Hybridisierungslösung geschwenkt
und danach bei 65 °C in großen Röhren mit 50 ml Hybridisierungslösung prähybridisiert.
Eine spezifische Sonde wurde mit dem Life Technologie (Gibco) Random Primers DNA
labeling system markiert. Dazu wurden 25 ng DNA in H2O 3 Minuten im Wasserbad bei
100 °C denturiert und danach 1–3 Minuten auf Eis abgeschreckt. Je 1 µl dATP, dGTP und
dTTP wurden mit 20 µl 2.5x Random Primer Puffer vermischt. Im Isotopenlabor wurden 5 µl
α [ 32 P] dCTP und 1 µl Klenow Polymerase zugegeben. Der Ansatz wurde für 60 Minuten bei
37 °C inkubiert. Eine Sephadex G 50-Filtersäule wurde mit TE äquilibriert. Dazu wurden
zuerst 50 µl Markierungsansatz, dann 350 µl TE und 2x 500 µl TE auf die Säule gegeben. Die
ersten 400 µl wurden verworfen, danach wurden 500 µl markierte Sonde (> 50000 IPS)
aufgefangen. Die Sonde wurde vorsichtig in die Hybridisierungsröhren gegeben, und die
Röhren wurden für 12-16 Stunden bei 65 °C hybridisiert. Danach wurden die Filter zweimal
in Low stringency-Waschpuffer gewaschen und dann in einer Schale mit Low stringency-
Waschpuffer geschwenkt. Zum Schluß wurden sie noch einmal in High stringency-
Waschpuffer bei Raumtemperatur und einmal 5 Minuten bei 50 °C geschwenkt. Die
Strahlung der Filter wurde zwischendurch gemessen. Im Endergebnis sollte die Strahlung
< 200 IPS betragen. Bei Bedarf mußte der Waschvorgang wiederholt werden. Die Filter
wurden auf beschichtetem Papier, mit der DNA nach oben, luftblasenfrei in Frischhaltefolie
eingewickelt. In einer Röntgenkassette mit Verstärkerscreen wurde ein Film 4-5 Stunden bei
-80 °C exponiert. Anschließend wurde er 20 Minuten aufgetaut und entwickelt. Bei
undeutlichen, schwachen Signalen wurde der Film für 16 Stunden bei -80 °C exponiert.
Anhand der Auswertebögen wurden die positiven Klone identifiziert.

Hybridisierungslösung: 1 % kristallines BSA (Fraktion V)
56
(Church-Puffer) 1 mM EDTA
0.5 M "Na HPO4" , pH 7.2
7 % SDS
Low Stringency-Waschpuffer II: 0.5 % BSA (Fraktion V)
40 mM "Na HPO4", pH 7.2
1 mM Na2 EDTA
5 % SDS
High Stringency-Waschpuffer II: 1 mM Na2 EDTA
40 mM "Na HPO4", pH 7.2
1 % SDS
1 M "Na HPO4", pH 7.2 134 g Na2HPO4 7 H2O
4 ml 85% H3PO4
H2O bidest. ad 1000 ml
4.4 Analyse und enzymatische Behandlung von DNA (modifiziert nach AUSUBEL et al.
1990)
4.4.1 Phenolisierung und Ethanolfällung
Um DNA von Proteinen nach Enzymreaktionen zu reinigen, wurde sie phenolisiert und ge-
fällt. Die DNA in wässriger Lösung wurde mit dem gleichen Volumen Phenol/CIA versetzt
und 15 Sekunden geschüttelt. Das Gemisch wurde für 5 Minuten bei 13000 Upm und Raumtemperatur
zentrifugiert. Falls die Probe größere Mengen Proteine enthielt, bildeten diese eine
Interphase, die ebenso wie die untere Phase verworfen wurde. Die obere Phase wurde zur
Entfernung von Phenolresten mit einem Volumen CIA versetzt und erneut 15 Sekunden geschüttelt.
Es wurde wie oben zentrifugiert und die obere Phase abgenommen. Sie wurde zur

57
Fällung der DNA mit 0.1 Volumen 3 M NaOAc pH 4.8 und 2.5 Volumen -20 °C kaltem
100 %igem Ethanol vermischt. Zur vollständigen Präzipitation vor allem kürzerer DNA-
Fragmente und DNA in niedriger Konzentration wurde mindestens 30 Minuten bei -80 °C
inkubiert. Bei größeren DNA-Fragmenten und höheren DNA-Konzentrationen wurde die
Fällung bei -20 °C oder bei 4 °C durchgeführt. Die DNA wurde für 30 Minuten bei
20000 Upm und 4 °C abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 1 ml -20 °C kaltem
70 %igem Ethanol gewaschen und im Vakuum für 5 Minuten getrocknet. Anschließend
wurde die DNA in einem geeigneten Volumen TE (10/1) gelöst.
4.4.2 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von kleinen DNA-Fragmenten
(< 20 kb)
Es wurden horizontale Agarose-Gele von ca. 5–12 mm Dicke und 5–28 cm Länge verwendet.
Je nach Größe der zu untersuchenden DNA wurden Agarosekonzentrationen von 0.6–2.0 %
gewählt. Die jeweilige Menge Agarose wurde in einem Erlenmeyer-Kolben eingewogen und
im entsprechenden Volumen 1 x TBE-Laufpuffer aufgeschlämmt. Die Suspension wurde im
Mikrowellenherd aufgekocht und solange gerührt, bis eine homogene Lösung entstanden war.
Die Lösung wurde auf ca. 50 – 60 °C abgekühlt und mit Dimidiumbromid-Lösung (12 mg/ml
in H2O bidest.) auf eine Dimidiumkonzentration von 0.4 µg/ml eingestellt. Die Lösung wurde
in eine Gelform mit dem gewünschten Kamm gegossen und bis zum Erstarren der Agarose
stehengelassen. Der Kamm wurde vorsichtig gezogen und das Gel in einer
Elektrophoresekammer mit 1x TBE-Laufpuffer bedeckt. Die DNA-Lösung wurde mit 0.1
Volumen 10x Auftragspuffer versetzt und in eine Tasche des Gels pipettiert. Die Elektrophorese
erfolgte bei Feldstärken von 1–20 V/cm. Die DNA-Fragmente wurden durch
Fluoreszenz des in die DNA interkalierten Dimidiumbromids bei 366 nm oder 312 nm sichtbar
gemacht. Zur Dokumentation wurden die Gele mit einer CCD-Kamera aufgenommen und
die Bilder über einen Videoprinter ausgedruckt.

10x TBE-Laufpuffer: 121 g Tris
51.4 g Borsäure
3.72 g EDTA
58
H2O bidest. ad 1000 ml
10x Auftragspuffer: 20 % (w/v) Ficoll 400
0.1 M EDTA pH 8.0
0.25 % (w/v) Bromphenolblau
0.25 % (w/v) Xylencyanol
H2O bidest. ad 10 ml
4.4.3 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Gereinigte DNA wurde mit kommerziell erhältlichen Restriktionsenzymen gespalten. Die
Reaktionsbedingungen wurden entsprechend den Herstellerangaben eingestellt. Die DNA
wurde je nach Reinheitsgrad mit 1 bis 5 units Enzym pro µg DNA für mindestens 1 Stunde
bei 37 °C inkubiert.
4.4.4 Ligation von Plasmiden
Um zwei DNA-Enden kovalent zu verbinden, müssen mit Hilfe von Ligase Phosphodiesterbindungen
geknüpft werden. Dazu ist es nötig, daß mindestens ein DNA-Ende eine 5´-Phosphatgruppe
trägt. Folgender Ansatz wurde verwendet:
50 ng Vektor-DNA
x ng Insert-DNA (molares Verhältnis Insert : Vektor = 1 : 1)
3 µl 10x Reaktionspuffer des Herstellers
1 µl T4-DNA-Ligase (400 U/µl)
H2O bidest. ad 30 µl

59
Der Ansatz wurde über Nacht bei 16 °C inkubiert. Alternativ wurde für 2–3 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Vektor und Insert-DNA wurden entweder durch Phenolisierung
und Fällung gereinigt oder einfach aus Agarosegelen zentrifugiert.
4.4.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Geeignete Primerpaare wurden mit dem Programm OSP Version 1.1 (Macintosh) ermittelt
(HILLIER u. GREEN 1991). Ein Standardansatz enthielt in 100 µl Gesamtvolumen ca. 100 ng
Matrizen-DNA, 10 µl 10x Taq-Puffer des Herstellers, je 100 µM Primer, 200 µM Desoxy-
ribonucleosidtriphosphate und 2.5 units Taq-DNA-Polymerase. Die Komponenten des An-
satzes wurden auf Eis zusammen pipettiert, gemischt und in einen auf 95 °C vorgeheizten
Omnigene Thermocycler gestellt. Nach fünfminütigem Denaturieren bei 94 °C wurden
30-32 Zyklen mit 1 Minute Denaturierung bei 94 °C, 1 Minute Annealing bei der jeweiligen
Annealingtemperatur des Primerpaares und 1 Minute Polymerisation bei 72 °C durchgeführt.
Nach dem Ende der Reaktion wurden die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese
auf 1 %igen Gelen analysiert.
4.4.6 Transfer von DNA auf Trägermembranen (REED u. MANN 1985)
Die DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt. Falls Fragmente, die größer als 20 kb
waren, auf die Membran übertragen werden sollten, wurde das Gel für 20 Minuten in 0.25 M
HCl geschwenkt. Das Gel wurde zur Denaturierung der DNA zweimal je 15 Minuten in
0.4 M NaOH geschwenkt. Das Gel wurde anschließend auf eine Frischhaltefolie gelegt und
luftblasenfrei mit der Nylonmembran (Hybond N + ) bedeckt. Auf die Membran wurden zwei
Lagen mit 0.4 M NaOH befeuchtetes 3 MM Whatmanpapier und ein ca. 10–15 cm hoher
Stapel Zellstoff gelegt. Der Zellstoff wurde mit einem Gewicht von ca. 1–2 kg beschwert und
über Nacht stehengelassen. Durch Kapillarwirkung des Zellstoffs wurde die Flüssigkeit aus
dem Agarosegel aufgesogen. Die DNA wurde dabei zu der Membran transportiert, wo sie
gebunden wurde. Da der Transfer der DNA unter alkalischen Bedingungen stattgefunden

60
hatte, war eine zusätzliche Fixierung der DNA auf der Membran nicht notwendig. Die Mem-
bran wurde zur Neutralisation für 1 Minute in 2x SSC geschwenkt und an der Luft auf 3 MM
Whatmanpapier getrocknet. Auf diese Weise erhaltene Membranen wurden in Hybridisierungen
mit dem ECL direct labeling system eingesetzt.
2x SSC: 300 mM NaCl
30 mM Natriumcitrat
4.4.7 Nichtradioaktive Hybridisierung mit dem ECL direct labeling system
(WHITEHEAD et al. 1983)
Die getrocknete Nylonmembran wurde in der vorbereiteten Hybridisierungslösung 1 Stunde
bei 42 °C vorhybridisiert. Zur Markierung der spezifischen Sonde wurden 10 ng DNA/ml
Hybridisierungslösung in einer Konzentration von 10 ng/µl in einem verschraubbaren 1.5 ml
Reaktionsgefäß für 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und sofort im Eiswasserbad
abgekühlt. Anschließend wurden 1 Volumen Glutaraldehyd und 1 Volumen labeling
reagent zugegeben und gut gemischt. Der Reaktionsansatz wurde für 10 Minuten bei 37 °C
inkubiert. Die Sonde wurde unmittelbar danach zur Hybridisierlösung pipettiert. Die Hybridisierung
erfolgte bei 42 °C über Nacht (mindestens für 4 Stunden). Zur Detektion wurde die
Membran 2 x 5 Minuten bei 55 °C mit Waschpuffer I und 2 x 5 Minuten bei Raumtemperatur
mit 2x SSC gewaschen. Die Membran wurde zum Trocknen auf Whatmanpapier gelegt und in
einer Schale für 1 Minute mit den Detektionsreagenzien inkubiert (5 ml Detektionslösung
1 + 5 ml Detektionslösung 2 für 100 cm² Membran). Die Membran wurde auf 3 MM
Whatmanpapier gelegt, mit Frischhaltefolie bedeckt und für 20 Sekunden bis 12 Stunden auf
einem für Chemielumineszenz geeigneten Röntgenfilm exponiert. Danach wurden die Filme
in der Entwicklermaschine entwickelt.
Hybridisierungslösung: 0.87 g NaCl + 1.5 g blocking reagent
Waschpuffer I: 0.4 % SDS + 0.5x SSC

4.4.8 Nichtradioaktive Sequenzierung doppelsträngiger DNA (SANGER et al. 1977)
61
Sequenzreaktionen wurden mit dem Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Cycle
Sequencing Kit durchgeführt. 200 ng Plasmid-DNA pro kb Insert wurden mit 2 pmol
IRD 800 markiertem Primer und 1 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt und mit H2O bidest.
auf 25 µl aufgefüllt. Je 6 µl dieses Ansatzes wurden zu je 2 µl der unterschiedlichen Termi-
nationsmixe pipettiert, mit Mineralöl überschichtet und der Sequenzreaktion zugeführt. Die
Sequenzreaktion wurde auf einem RoboCycler® Gradient 2000 für 25 Zyklen mit jeweils 45
Sekunden Denaturierung bei 94 °C, 45 Sekunden Annealing bei 58 °C und 45 Sekunden
Extension bei 68 °C inkubiert. Um unspezifische Kettenabbrüche an 7-deaza-dGTPs zu
vermeiden, wurden 5 µl Auftragpuffer erst nach der PCR zugegeben.
Auftragspuffer: 97.5 % deionisiertes Formamid
10 mM EDTA pH 8.0
0.1 % Bromphenolblau
Für die Sequenzierung mit pGEM-4Z-Plasmiden wurden folgende Primer (Standard Oligos,
IRD 800) verwendet:
SP6 Promoter Primer: 5´-CGA TTT AGG TGA CAC TAT AG-3´, 20-mer, Ta 56 °C
T7 Promoter Primer: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´, 20-mer, Ta 56 °C
M 13 Universal Primer: 5´TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3´, 18-mer, Ta 57 °C
M 13 Reverse Primer: 5´CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3´, 18-mer, Ta 57 °C
4.4.9 Automatisches Sequenzieren
Für die Auftrennung von nichtradioaktiven Sequenzreaktionen wurden das LI-COR Modell
4000L und die Steuersoftware BaseImageIR v 2.30 verwendet. Als Gelmatrix für die Auftrennung
bis zu ca. 850 bp (Einzelbasenpaarauftrennung bis ca. 650 bp) wurde Sequagel XR
unter Zusatz von 1 % DMSO zwischen 41 cm langen Glasplatten verwendet. Die Auftrennung
erfolgte bei 1500 V, 35 mA und 31 Watt für ca. 12–14 Stunden. Als Laufpuffer wurde

62
1x TBE Standard verwendet. Größere Leseweiten wurden mit LongRanger Fertiggellösung
erreicht. Die entgaste 4 %ige Gellösung wurde in 66 cm Glasplatten gegossen. Die
Auftrennung erfolgte bei 2000 V, 25 mA und 45 Watt für 20 Stunden. Als Laufpuffer wurden
an der Kathode 0.8x TBE und an der Anode 1.4x TBE verwendet. Im Idealfall konnte bis zu
1000 bp in einem Lauf gelesen werden. Nach dem Gellauf wurden die Sequenzen mit
BaseImage Analysis v 2.30 automatisch gelesen, korrigiert und in das SCF-Dateiformat
(sequence chromatogram file) umgewandelt. Die Sequenzen wurden mit dem Programm
Sequencher 3.0 weiter bearbeitet und ausgewertet.
6 % SequaGel XR, 41 cm: 24 ml SequaGel XR
6 ml SequaGel buffer
350 µl DMSO
10 µl TEMED
350 ml APS (10 %)
4.6 % LongRanger, 66 cm: 4.6 ml LongRanger Sol. (50%)
21 g Urea
5.0 ml 10x TBE Long Run
30 ml H2O bidest.
500 µl DMSO
50 µl TEMED
350 µl APS (10 %)
10x TBE: 107.8 g Tris
55 g Borsäure
7.6 g EDTA
H2O ad 1000 ml

5 Ergebnisse
63
5.1 Physikalische Kartierung isolierter γ-Sarkoglykan-Klone
Für die Isolierung des caninen SGCG Gens wurde eine rekombinante Phagen-Genbank mit
einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde des murinen SGCG Gens durchmustert. Zur
Erzeugung der Sonde wurde das Insert des IMAGE cDNA-Klons IMAGp998H192919 durch
Spaltung mit NotI und EcoRI isoliert. Dabei wurden vier überlappende Phagen isoliert. Auf
dem Phagen λ1 konnte der Bereich des 4. und 5. Exons gefunden werden, Phage λ2 lag im
Bereich des 2. und 3. Exons und auf Phagen λ3 und λ4 befand sich das Exon 4 des caninen
SGCG Gens. Da die Phagen nicht alle Exons enthielten, wurde noch eine canine BAC-
Genbank mit der murinen cDNA-Sonde durchmustert. Hier wurden fünf überlappende Klone
gefunden. Einen Überblick über die Lage der BAC-Klone und λ-Phagen gibt Abbildung 4.
Der etwa 110 kb große BAC Klon RPCI-81_405H01 beinhaltete die komplette kodierende
Region des caninen SGCG Gens. Er wurde für die folgenden Sequenzanalysen eingesetzt.
Basierend auf Restriktionskartierung, liegen die 7 Exons, die von großen Intronbereichen
getrennt werden, verteilt auf etwa 70 kb genomischer DNA.

2 3 4 5 6 7 8
ATG
λ1
λ2
λ3
λ4
BAC RPCI-81_34N1
BAC RPCI-81_38P22
BAC RPCI-81_9I12
64
BAC RPCI-81_24P12
p15.7
4.8 kb
p15.10
1.5 kb
p15.9
3.4 kb
p15.11
6.8 kb
p15.6
2.5 kb
p15.8
1.8 kb
Abbildung 4: Kartierung der Phagen und BAC-Klone
Auf der Karte ist die Lage der BAC-Klone (grün) und -Phagen (blau) und Plasmide (rot) in Bezug zu den Exons des -Sarkoglykangens zu sehen.
Die Exons sind durch Balken, Introns durch Linien dargestellt. Der weiße Balken stellt den 3´UTR dar. BAC RPCI-81_38P22 weist vermutlich eine
Deletion im Bereich des 2. Exons auf.
λ γ

5.2 Sequenzierung der kodierenden Bereiche des caninen SGCG Gens
65
Wegen der großen Introns war es nicht sinnvoll, alle Klone komplett zu sequenzieren. Zur
Identifizierung exonhaltiger Fragmente wurden Hybridisierungen mit der murinen cDNA-
Sonde durchgeführt. Zunächst wurde ein bereits vorhandener Plasmidsubklon des Phagen λ4
mit EcoRI, KpnI, SacI, AvaI, SmaI, BamHI, AccI, HincII, PstI, HindIII und SphI gespalten,
dieses ist in Abbildung 5 zu sehen. Danach wurden die vier Fragmente aus der EcoRI- und die
drei Fragmente aus der BamHI-Spaltung in pGEM-4Z kloniert, Plasmid-DNA isoliert und
ansequenziert. Auf diese Weise konnte die Sequenz des 4. Exons erhalten werden.
0
Abbildung 5: Spaltung des Plasmidsubklon p4.2(x) aus dem Phagen λ4.
Jeweils 4 µg Plasmid-DNA wurden mit den im Bild oben angegebenen Restriktionsenzymen
gespalten und auf einem 0,7 %igem Agarosegel aufgetrennt. In der ersten Spalte ist eine 1 kb
Leiter als Größenstandard aufgetragen.
Zur Identifizierung weiterer exonhaltiger Fragmente wurden die Phagen λ1 und λ2 mit XbaI,
SacI, BamHI und EcoRI gespalten. Es wurde wiederum eine Hybridisierung mit der murinen
cDNA-Sonde durchgeführt. Dieses ist in Abbildung 6 dargestellt. Bei λ1 ergaben sich in der
XbaI-, SacI-, BamHI- und EcoRI-Spaltung zwei positive Fragmente. Bei λ2 ergaben sich je

66
zwei positive Fragmente in der SacI-, XbaI- und BamHI-Spaltung und ein positives Fragment
in der EcoRI-Spaltung.
8 kb
7 kb
6 kb
5 kb
4 kb
3 kb
XbaI SacI BamHI EcoRI
λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2
p1.2X 8.5 kb
p1.1X 5.8 kb
p 2.2X
4.5 kb
p 2.1X
3.8 kb
XbaI SacI BamHI EcoRI
λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2 λ1 λ2
Abbildung 6: Spaltung und Hybridisierung der Phagen λ1und λ2.
Jeweils 10 µg Phagen-DNA wurden mit XbaI, SacI, BamHI und EcoRI gespalten und auf einem 0,7 %igem Gel
bei 40 V 12 Stunden lang aufgetrennt. Eine 1 kb Leiter ist in der linken Spur als Größenstandard aufgetragen.
Das rechte Bild zeigt die positiven Signale nach Hybridisierung mit der murinen γ-Sarkoglykan cDNA-Sonde.
Die Detektion wurde mit ECL durchgeführt. Die Exposition erfolgte für 2 Minuten.
Die Klone p1.1X (5,8 kb), p1.2X (8,5 kb), p2.1X (3,8 kb) und p2.2X (4,5 kb) (die
Bezeichnungen lassen sich aus Abbildung 6 entnehmen) wurden wiederum mit verschiedenen
Enzymen gespalten. Durch Hybridisierung mit der murinen cDNA-Sonde wurden die Exon-
haltigen Fragmente identifiziert. Diese wurden wiederum kloniert, die DNA isoliert und
sequenziert. Die Klone enthielten die kodierenden Bereiche von Exon 3, 4 und 5.
Um die restlichen kodierenden Bereiche zu erhalten, wurde BAC RPCI-81_405H01 ver-
wendet. Der BAC-Klon wurde mit XbaI gespalten und mit der murinen cDNA-Sonde
hybridisiert. Es wurden 10 Fragmente isoliert, in pGEM-4Z kloniert und von den Rändern
ansequenziert. Die Subklone wurden wiederum mit PstI gespalten und hybridisiert. Sieben
der 10 Subklone waren in der Hybridisierung letztendlich positiv. Sie wurden mit B 15.6 bis
B 15.11 fortlaufend bezeichnet, isoliert, kloniert und ansequenziert. Um die Sequenzen der
Exons und flankierenden Introns zu vervollständigen, wurden weitere Subklone hergestellt
und Sequenzprimer bestellt, um bestehende Lücken zu schließen. Auf B 15.6 wurde das Exon

67
3 gefunden, auf B 15.7 das Exon 7, auf B 15.8 Exon 2, auf B 15.9 Exon 5, auf B 15.10 Exon 6
und auf B 15.11 Exon 4.
Obwohl bei den Hybridisierungen zur Identifizierung exonhaltiger Fragmente eine Vollänge
cDNA-Sonde der Maus eingesetzt worden war, konnten keine genomischen Hunde-DNA-
Fragmente mit Exon 1 oder Exon 8 identifiziert werden. Auch Hybridisierungen mit einer
spezifischen murinen Sonde für das erste und achte Exon ergaben keine positiven Signale. Da
die Sequenzhomologien zwischen Mensch und Hund bei den bereits gefundenen Exons
größer waren als zwischen Maus und Hund, wurde, um eine noch spezifischere
Hybridisierung zu erreichen, für das Exon 8 eine humane Hybridisierungssonde hergestellt.
Die humane Exon-8-Sonde wurde durch PCR auf humaner genomischer DNA hergestellt. Die
Primer hierzu wurden aus der bekannten humanen SGCG-Sequenz (Acc.No. U63395) so
abgeleitet, daß ein etwa 300 bp großes PCR-Produkt entstand.
Die aus dem BAC-Genbankscreen isolierten caninen BAC-Klone wurden mit PstI gespalten
und mit der neuen Sonde hybridisiert. Dabei gab es ein positives Signal auf RPCI-
81_405H01. Auf RPCI-81_38P22 und 24P12 gab es schwache unspezifische Signale, dieses
läßt sich durch die Wahl einer heterologen Sonde erklären. Eine erneute Spaltung des BAC
RPCI-81_405H01 mit verschiedenen Enzymen und anschließende Hybridisierung mit der
humanen Sonde für das 8. Exon führten zur Isolierung eines etwa 4000 bp großen EcoRI-
Fragments und eines etwa 1000 bp großen XbaI-Fragments. Das EcoRI-Fragment wurde mit
HindIII subkloniert und die DNA sequenziert. Bei der Sequenzierung stellte sich heraus, daß
die klonierten Fragmente mit bereits isolierten Klonen des Exon 7 überlappten. Daher konnte
zusätzlich zu dem neu klonierten Exon 8 auch das vollständige Intron 7 sequenziert werden.
5.3 Genomstruktur des caninen γ-Sarkoglykangens
5.3.1 Exon 2-8 (kodierender Bereich)
Aufgrund bekannter Daten der humanen und murinen SGCG Gene, wurde davon ausgegangen,
daß sich auch das canine SGCG Gen aus mindestens acht Exons zusammensetzt. Das 1.

68
Exon konnte jedoch bisher nicht sequenziert werden. Die Exons sind durch lange Intronsequenzen
voneinander getrennt. Das Intron 7 besteht aus 2543 bp, während die anderen
Introns alle noch wesentlich größer sind. Die Intron/Exon-Übergänge im kodierenden Bereich
sind zwischen Mensch, Maus und Hund komplett konserviert. Sie entsprechen den allgemeinen
Konsensussequenzen eukaryontischer Gene für Spleißakzeptor- bzw. Spleißdonorstellen.
Jedes Intron beginnt mit dem Dinucleotid GT und endet mit dem Dinucleotid AG.
Tabelle 5 soll dieses noch einmal verdeutlichen.
Tabelle 5: Exon-Intron Übergänge im caninen SGCG Gen
3´Spleißstelle Exon 5´Spleißstelle Phase
cctactccgtggcagATGGTC... (Exon 2, 195 bp) ...TCCCCAgtaagtagcttcctt 0
tcctctttttaacagACAGGA... (Exon 3, 102 bp) ...AGAGTGgtaagaaaatgatga 0
taaatgccttcctagGACTCA... (Exon 4, 88 bp) ...AAGTGGgtgagtctgatttca 1
taatgaattgttcagGTCCCA... (Exon 5, 120 bp) ...TAACTGgtatgtgataacttt 1
tctggttttgtttagGCCCCG... (Exon 6, 73 bp) ...CCTGAGgtaagaattttgttc 2
tttccctcatttcagATTAGA... (Exon 7, 124 bp) ...GGAATGgtgagttcagtgtta 0
ttttctcccaaacagCTTGTG... (Exon 8,>719 bp) ...TCAAGGAATAAATTATACAAA 1)
1) Am Ende des Exon 8 ist statt einer Spleißstelle das Polyadenylierungssignal unterstrichen dargestellt.
5.3.2 Exon 1
Da mit der murinen cDNA-Sonde kein Bereich gefunden wurde, der dem 1. Exon entspricht,
wurde, um eine spezifischere Hybridisierung zu erreichen, auch für das 1. Exon eine humane
genomische Hybridisierungssonde hergestellt. Dazu wurde in einer PCR mit zwei spezifischen
Primern ein Produkt mit Exon 1 von humaner genomischer DNA amplifiziert. Mit der
Sonde wurden die vorhandenen Filter mit der PstI-Spaltung der verschiedenen BAC-Klone
hybridisiert. Es gab positive Signale bei RPCI-81_24P12, 38P22 und 9I12, jedoch nicht bei
dem bisher untersuchten BAC-Klon RPCI-81_405H01. Abbildung 7 zeigt die Spaltung und
Hybridisierung der BAC-Klone. RPCI-81_24P12 und 38P22 wurden mit BamHI, EcoRI, PstI

69
und SacI gespalten. Es wurde wiederum eine Hybridisierung mit der humanen Sonde für das
1. Exon durchgeführt. Dabei hybridisierte in der BamHI-Spaltung ein etwa 7000 bp großes
Fragment, in der EcoRI-Spaltung ein 8000 bp großes Fragment, in der PstI-Spaltung ein
knapp 3000 bp großes Fragment und in der SacI-Spaltung ein fast 4000 bp großes Fragment.
Das Fragment aus der RPC-81_24P12 PstI-Spaltung wurde isoliert, kloniert und
ansequenziert, danach wurde es noch einmal mit XbaI gespalten, und die Subklone wurden
sequenziert. Es wurde ein Bereich gefunden, der in der flankierenden Region zum humanen
Exon 1 eine hohe Homologie zeigt, im kodierenden Bereich des eigentlichen Exons jedoch
nicht besonders gut konserviert war.
Es wurde versucht, das 5´Ende der caninen cDNA durch 5´RACE-PCR bzw. durch RT-PCR
zu finden, bislang jedoch ohne Ergebnis. Zur Abklärung des Vorhandenseins und der Sequenz
des ersten Exons wären noch weitere Experimente notwendig.
1 kb
34N1
8N6
8N7
38P22
96C1
9I12
24P12
405H01
Sonde
1 kb
34N1
8N6
8N7
38P22
96C1
9I12
24P12
405H01
Abbildung 7: Hybridisierung der BAC-Klone mit einer humanen Sonde für Exon 1.
Linkes Bild: je 10 µg BAC-DNA wurden mit PstI gespalten und auf einem 0,8 %igem Gel aufgetrennt. Die
Namen der BAC-Klone sind in der oberen Zeile angegeben. Das Bild rechts zeigt die Hybridisierung mit der
humanen Sonde für Exon 1. Bei RPCI-81_24P12, 38P22 und 9I12 gab es positive Signale.
Sonde

5.3.3 Eigenschaft der sequenzierten DNA
70
Es wurden mehrere repetitive Elemente gefunden. Der Gehalt an repetitiven Elementen in den
sequenzierten Bereichen betrug 11,3 %. Ihre Art, Größe und Position kann man der folgenden
Tabelle 6 entnehmen. Drei kleinere Mikrosatelliten im Bereich des Intron 4 wurden ebenfalls
sequenziert, sie sind in Tabelle 7 aufgelistet.
Der GC-Gehalt der sequenzierten DNA beträgt im Durchschnitt 35,5 %. Die Werte zwischen
den einzelnen Bereichen schwanken zwischen 28 und 38 %.
Tabelle 6: Repetitive Elemente
Element Position Orientierung
SINE B2 Mv Intron 2, 1401 – 1560 -
SINE B2 Mv Intron 4 1033 – 1216 +
SINE B2 Mv Intron 5, 9 – 158 +
SINE B2 Mv Intron 7, 4610 – 4729 +
SINE B2 Mv Intron 7, 4891 - 4993 +
LINE L2 Intron 2, 597 – 850 -
LINE L1 Intron 4, 895 – 1016 +
LINE L1 Intron 5, 1706 – 1968 -
LINE L1 Intron 5, 1323 – 1382 -
LINE L1 Intron 6, 124 – 303 -
LTR/MaLR Intron 3, 1014 – 1150 +
DNA/MER Intron 4, 1300 – 1333 -
Tabelle 7: Mikrosatelliten
Position Sequenz
Intron 4, 1300 - 1333 (TC)17
Intron 4, 1337 - 1372 (TAAA)9
Intron 4, 1417 - 1456 (TC)20

5.4 Chromosomale Lokalisation
71
Die chromosomale Lokalisation des caninen SGCG Gens wurde mittels Fluoreszenz in situ
Hybridisierung untersucht. Dazu wurde der Phage λ4 als Sonde auf Metaphasechromosomen
des Hundes eingesetzt. Doppelte positive Signale machten die Zuordnung des Klons zu CFA
25q21–23 möglich. Dieses ist in Abbildung 8 zu sehen. Die Zuordnung zu CFA 25 wurde
durch ein "Chromosome Painting" Experiment mit einer CFA 25 spezifischen Sonde be-
stätigt.
Abbildung 8: Chromosomale Lokalisierung des caninen SGCG Gens
Fluoreszenz in situ Hybridisierung des Phagen λ4 auf Metaphasechromosomen des Hundes. Auf beiden
Chromosomen 25 in der Region q21-q23 sind doppelte Signale sichtbar. Die FISH wurde von Matthew Breen
(Animal Health Trust, Suffolk, U.K.) durchgeführt.
Mittels Radiation Hybrid Mapping wurde das canine SGCG Gen zwischen den Mikrosatelli-
ten FH2324 und FH2318 in der syntänischen Gruppe 10 kartiert (mit Lods von 21.087 und
16.237). Durch die Untersuchung konnte geklärt werden, daß die syntänische Gruppe 10 mit

72
CFA 25 korrespondiert. Das RH Mapping wurde von Catherine André (Génétique et
Dévelopement, Faculté de Medecine, Rennes, France) durchgeführt.
5.5 Analyse der γ-Sarkoglykan cDNA
Das canine SGCG Gen hat einen offenen Leserahmen von 876 bp. Es beginnt mit dem Start-
Codon ATG am Anfang des 2. Exons. Hinter dem Stop-Codon folgt ein 528 bp großer 3´UTR
bis zum ersten Polyadenylierungssignal (AATAAA), ein zweites Polyadenylierungssignal
folgt nach weiteren 50 bp.
Die canine cDNA ist zu 76 % homolog zur humanen cDNA und zu 78 % zur cDNA des Kaninchens.
Zur murinen cDNA besteht in den untersuchten Abschnitten eine Homologie von
75 %.
5.6 Analyse des caninen γ-Sarkoglykans
Das Protein besteht aus 291 AS. Das canine γ-Sarkoglykan weist 93 % Identität zum
orthologen humanen, 89 % zum γ-Sarakoglykan des Kaninchens, 85 % Identität zum murinen
und 83 % Identität zum γ-Sarkoglykan des Goldhamsters auf. Dieses wird in Abbildung 9
dargestellt. Analog zum humanen γ-Sarkoglykan weist es eine kurze (AS 1-35) intrazelluläre
Domäne mit Amino-Terminus, eine kurze Transmembranregion (AS 36-60) und einen langen
extrazellulären Carboxyl-Terminus auf. Das Protein besitzt geladene Reste bei AS 32-34 und
extrazellulär fünf konservierte Cystein-Reste bei AS 243, 265, 267, 283, 290.

73
Hund MVREQYTTTTEGTHIQRPENQCVYKIGIYGWRKRCLYLFVLLLLIILLVNFALTIWILKV 60
Mensch MVREQYTTATEGICIERPENQYVYKIGIYGWRKRCLYLFVLLLLIILVVNLALTIWILKV 60
Kaninchen MAGEQYLTATEGTHIERPENQCVYKIGIYGWRKRCLYLLVLLLLIILVVNLALTIWILKV 60
Maus MVREQYTTVTEGTHIERPENQHIYKIGIYGWRKRCLYLFVLLLLAILVVNLALTIWILKV 60
Hamster MAREQYTTVTEGTHIERPESQLVHRIGIYGWRKRCLYLFVLLLLIILVVNLALTIWILKV 60
* *** * *** * *** * ************* ***** ** ** *********
Hund MWFSPTGMGHLRVTKDGLRLEGESEFLFPLYAKEIHSRVDSSLLLQSTQNVTVNARNSEG 120
Mensch MWFSPAGMGHLCVTKDGLRLEGESEFLFPLYAKEIHSRVDSSLLLQSTQNVTVNARNSEG 120
Kaninchen MWFSPTGMGHLHVTKDGLRLEGESEFLFPLYAKEIHSRVDSSLLLQSTQNVTVNARNSDG 120
Maus MWFSPIGMGHLHVTADGLRLEGESEFLFPLYAKEIRSRVDSSLLLQSTQNVTVSARNSEG 120
Hamster MWFSPIGMGHLHVTQDGLRLEGESEFLFPLYVKEIRSRVDSSLLLQSTQNVTVNARNSEG 120
***** ***** ** **************** *** ***************** **** *
Hund EVTGRLKVGPKMVEVQSQQFQINSKDGKPLFTVDEKEVVVGTDKLRVTGPEGALFEHSVE 180
Mensch EVTGRLKVGPKMVEVQNQQFQINSNDGKPLFTVDEKEVVVGTDKLRVTGPEGALFEHSVE 180
Kaninchen EVTGRLKVGPQMVEVQSQQFQINSREGKSLFTVDEEEVVVGTDRLRVTGPEGALFEHSVE 180
Maus EVTGRVKVGAQMVEVQSQHFQINSEDGKPLFSAEEQDVVVGTGRLRVTGPEGALFEHSVE 180
Hamster EVTGRVKVGAQMVEVQSQHFQIRSEDGKPLFTAEERGVMVDTGRLRVTGPEGAIFEHSVE 180
***** *** ***** * *** * ** ** * * * * ********* ******
Hund TPLVRADPFQDLRLESPTRSLSMDAPKGVHIKAHAGKIEALSQMDIIFQSSDGMLVLDAE 240
Mensch TPLVRADPFQDLRLESPTRSLSMDAPRGVHIQAHAGKIEALSQMDILFHSSDGMLVLDAE 240
Kaninchen TPLVTADPFQDLRLESPTRSLSMDAPRGVHIEAHAGEVEALSQMDIVLHSSDGTLVLDAE 240
Maus TPLVRADPFQDLRLESPTRSLSMDAPRGVHVKANAGKLEALSQMDIILQSSEGVLVLDAE 240
Hamster TPLVRADPFEDLRLESPTRSLSMDAPRGVHIKAHTGKMEALSQMDIILQSSDGVLVLDAE 240
**** **** **************** *** * * ******** ** * ******
Hund TVCLPKLVQGTQGPAGSSQRLYEICVCPDGKLYLSVAGVGTTCHEHSHICL 291
Mensch TVCLPKLVQGTWGPSGSSQSLYEICVCPDGKLYLSVAGVSTTCQEHSHICL 291
Kaninchen TVCLPKLLQGTQAASGSSQGLYEICVCPDGKLYLSVAGAGTTCQEHSHICL 291
Maus TVGLTKLKQGTQGPAGSSNGFYEICACPDGKLYLSMAGEVTTCEEHSHVCL 291
Hamster TVGLPELEQGTPGPSGSSKGFYEICVCPDGKLYLSAADEATTCEEHSHICL 291
** * * *** *** **** ********* * *** **** **
Abbildung 9: Aminosäure-Alignment.
Die Abbildung zeigt das Alignment der AS-Sequenzen von Hund, Mensch (Acc.No. Q13326), Maus (Acc.No.
P82348), Kaninchen (Acc.No. I46539) und Goldhamster (Acc.No. JC5541). Die * stellen Übereinstimmung
zwischen allen fünf Spezies dar. Die Homologie zwischen Hund und Mensch beträgt 93 %, zwischen Hund und
Kaninchen 89 %, zwischen Hund und Maus 85 % und zwischen Hund und Hamster 83 %.
5.7 Analyse der Polymorphismen
Für die Mutationsanalyse wurde die genomische DNA von Gini, Broscha, Lea und Jule untersucht.
Bei Exon 1, 2, 3 und 7 wurde noch die DNA weiterer Hunde zur Untersuchumg eingesetzt.
Für jedes Exon wurden PCR-Produkte mit dem gesamten kodierenden Bereich und den
Exon/Intron-Übergängen amplifiziert und direkt sequenziert. Die Sequenzen wurden im

74
Sequencher® 3.0 verglichen. Im kodierenden Bereich konnten keine Polymorphismen
gefunden werden. In den Exon-flankierenden Intronbereichen fielen vier SNP auf. Ein
einzelner Basenaustausch im Intronbereich hat vermutlich keinen Effekt auf die Funktion des
Gens. In keinem Fall hatte der erkrankte Hund Gini eine Mutation, die bei keinem
Kontrollhund auftrat.
Im restlichen sequenzierten Bereich fielen außerdem mehrere Polymorphismen zwischen
BAC und Phagen DNA auf. Die genauen Positionen der Veränderungen kann man der
Tabelle 8 entnehmen.
Tabelle 8: Polymorphismen im caninen SGCG Gen
Position Polymorphismus Allel-Frequenz
Intron 1, 406 G/T 0,6 : 0,4
Intron 2, 1599 G/T 0,3 : 0,7
Intron 3, 1735 A/T 0,7 : 0,3
Intron 7, 2645 A/C 0,25 : 0,75
Intron 2, 1550 G/A 1) n.d.
Intron 3, 1854 C/G 1) n.d.
Intron 4, 753 G/A 1) n.d.
Intron 4, 1045 INS G 1) n.d.
Intron 4, 1193 – 1194 INS TA 1) n.d.
Intron 4, 1334 INS TCTC 1) n.d.
Intron 4, 1217 INS A 1) n.d.
Intron 5, 1686 C/T 1) n.d.
1) Diese Polymorphismen wurden durch Vergleich der DNA-Sequenzen von BAC RPCI-81_405H01 und den
Phagen λ 1, 2, 3 und 4 ermittelt.

6 Disskussion
75
Das Thema der Arbeit war die Analyse der Genomstruktur des caninen γ-Sarkoglykangens
und die Untersuchung seiner Rolle als Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie beim
Hund. In der Humanmedizin ist das SGCG Gen charakterisiert (MCNALLY et al. 1996 a).
Mutationen des SGCG Gens führen zur Limb-girdle Muskeldystrophie-2C (MCNALLY et al.
1996 a; PICCOLO et al. 1995; NOGUCHI et al. 1995). Das Krankheitsbild der Dobermann-
hündin Gini und immunhistochemische Untersuchungen, die eine verminderte Expression des
SGCG Gens ergaben, veranlaßten zu der Untersuchung des SGCG Gens des Hundes.
6.1 Probanden
Zur Untersuchung stand ausschließlich Dobermannhündin Gini zur Verfügung. Sie stammte
aus einer Zucht in Polen und zeigte deutliche dystrophische Muskelveränderungen. Vorberichtlich
war bekannt, daß der Vater der Hündin unter einer Muskelerkrankung gelitten hat
und deshalb euthanasiert worden war. Auch Wurfgeschwister von Gini sollen wegen Problemen
mit dem Bewegungsapparat auffällig geworden sein. Diese Aussagen konnten jedoch
nicht durch Untersuchungen nachgewiesen und bestätigt werden. Aus der Familie von Gini
konnten noch DNA-Proben von Lea, der Mutter von Gini, klinisch unauffällig, und von
Broscha, dem ebenfalls klinisch unauffälligen Halbbruder, gewonnen werden. Als Kontrollhund
wurde die Französische Bracke Jule eingesetzt.
Für eine wissenschaftliche Untersuchung wäre es wünschenswert, noch weitere Hunde aus
der Familie zur Verfügung zu haben, um die erbliche Genese der Erkrankung sicher abzuklären.
Dies war jedoch nicht möglich, denn die jeweiligen Besitzer zeigten nur geringes
Interesse an der Aufklärung der Krankheit und waren nicht bereit, ihre Hunde zu Untersuchungszwecken
zur Verfügung zu stellen. Hunde werden, anders als Nutztiere, als Familienmitglieder
betrachtet. Den Besitzern geht das Wohl des Einzeltieres vor. Auch die Kooperation
mit dem Züchter war nicht sehr erfolgreich. Finanzielle Aspekte spielten natürlich eine
Rolle. Hätte man zum Beispiel eine Zuchtlinie aufbauen wollen, wäre das mit hohen Kosten
und viel Zeit verbunden gewesen.

76
Untersuchungen von Gini ergaben starke chronische myopathische Veränderungen der Muskulatur,
einen partiellen Verlust von Dystrophin 1 sowie von γ-Sarkoglykan und β-Dystroglykan.
Dieses spricht für das Vorliegen einer schweren Form von Muskeldystrophie. In der
Humanmedizin sind Muskeldystrophien schon gut untersucht. Die Muskeldystrophie von Gini
läßt sich jedoch nicht eindeutig einer in der Humanmedizin bekannten Form zuordnen.
Die Sarkoglykanopathien (LGMD) des Menschen sind autosomal rezessiv vererbbare Muskeldystrophien.
Sie variieren stark in Progressionsrate und Schweregrad. Anfangs sind vor
allem Becken- und Schultergürtelmuskulatur betroffen. Ursache für Sarkoglykanopathien sind
Mutationen der Gene des Sarkoglykankomplexes (BUSHBY 2000). Da die Proteine des SGC
eng miteinander verbunden sind, führen Mutationen auf einem Gen des Koplexes meist
sekundär zu veränderter Expression der anderen SGC-Untereinheiten (PICCOLO et al.1995).
Bei Gini war die γ-Sarkoglykan Expression verändert, während die Expression der anderen
SGC-Untereinheiten nicht untersucht werden konnte, da keine Antikörper gegen die entsprechenden
caninen Proteine existieren. Die Dystrophinexpression ist bei Patienten mit
Sarkoglykanopathien nicht verändert.
Eine fehlende oder reduzierte Dystrophinexpression deutet in der Humanmedizin auf Dystrophinopathien
wie Duchenne oder Becker Muskeldystrophie hin (GARDNER-MEDWIN 1980).
Sekundär kann es hier auch zu veränderter Expression anderer Untereinheiten des DGC
kommen. Veränderungen des β-Dystroglykans sind beim Menschen als Ursache von
Muskeldystrophie noch nicht beschrieben worden. Untersuchungen des caninen Dystroglykangens
am Tierärztlichen Institut in Göttingen ergaben keine Hinweise auf Mutationen
des Gens im kodierenden Bereich, die als Ursache der Muskeldystrophie bei Gini in Frage
kommen würden (LEEB et al. 2000).
6.2 Untersuchung des caninen SGCG Gens
Die Genomstruktur des SGCG Gens ist in der Literatur bereits beim Menschen und der Maus
vollständig beschrieben, über das Kaninchen und den Goldhamster liegen teilweise auch Beschreibungen
vor. Beim Menschen besteht das Gen aus 8 Exons, die von großen Introns
getrennt werden (MCNALLY et al. 1996 a). Bei der Maus wurden 9 Exons beschrieben
(BARRESI et al. 2000).

77
Das canine SGCG Gen wurde aus BAC-Klonen und λ-Phagen mit Hilfe von Hybridisierungen
mit murinen und humanen cDNA-Sonden isoliert. Der BAC-Klon RPCI-81_405H01 enthielt
den kompletten kodierenden Bereich des caninen SGCG Gens. Die Untersuchungen beim
Hund ergaben eine hohe Homologie mit den SGCG Genen bisher beschriebener Spezies im
kodierenden Bereich (Exon 2-8). Die Sequenzen an den Exon/Intron–Übergängen
entsprechen den allgemeinen Konsensussequenzen eukaryontischer Gene für Spleißakzeptorbzw.
Spleißdonorstellen. Jedes Intron beginnt mit dem Dinucleotid GT und endet mit dem
Dinucleotid AG. Die Exongrenzen im Protein kodierenden Bereich des SGCG Gens sind zwischen
Mensch, Maus und Hund streng konserviert. Die Exonlängen sind mit denen des
humanen SGCG Gens identisch. Die Intronbereiche wurden aufgrund ihrer Größe nur in den
flankierenden Bereichen der Exons untersucht. Auch beim Menschen werden die Exons von
großen Introns getrennt.
6.3 Exon 1
Das 1. Exon wurde beim Menschen und bei der Maus beschrieben. Da das canine SGCG Gen
eine hohe Homologie zum humanen und murinen orthologen Gen zeigt, wurde davon ausgegangen,
daß es im 5´UTR des caninen SGCG Gen auch noch ein weiteres Exon gibt. Die
bisherigen Untersuchungen ergaben einen Bereich, der hohe Homologie zu den Sequenzen im
5´und 3´ Bereich des humanen Exon 1 zeigte. Der Bereich des eigentlichen Exons war jedoch
nicht besonders hoch konserviert (Abbildung 10). Es kann daher nicht mit Sicherheit
ausgeschlossen werden, daß es sich bei der Sequenz um einen konservierten Bereich handelt,
der beim Hund nicht transkribiert wird.
Es ist möglich, daß das erste Exon des Hundes mit der Promotorregion keine Homologie zum
Exon 1 des Menschen aufweist. Auch der 5´UTR der Maus ist mit dem humanen Exon 1 nicht
homolog. Hier wurden zwei Exons gefunden, die je nach Gewebe unterschiedlich exprimiert
werden (BARRESI et al. 2000). Im allgemeinen liegen im UTR etwas schwierigere Untersuchungsverhältnisse
vor als im kodierenden Bereich, da die Bereiche häufig zwischen verschieden
Spezies nicht so streng konserviert sind.

78
Auffällig ist, das auf dem bisher untersuchten BAC-Klon RPCI-81_405H01 keine positiven
Hybridisierungssignale waren. Dies macht wiederum deutlich, daß es sich bei dem caninen
SGCG Gen um ein außergewöhnlich großes Gen handelt, da es selbst aus einer BAC-Genbank
nicht in einem Stück isoliert werden kann.
Um sicher die Sequenz des 1. Exons und der Promotorregion des caninen SGCG Gens ermitteln
zu können, müßte zunächst eine vollständige canine SGCG cDNA Sequenz ermittelt
werden. Im Bereich des 1. Exons würde sich dann beim Vergleich der genomischen DNA mit
der homologen cDNA eine 100 %ige Übereinstimmung ergeben, womit die Lokalisierung des
Exons eindeutig wäre.
Hund aagttataattacataagactatcatgattcaggatttaaatgttggttttgtaagaa-- 60
|| | || | | || | || || ||||||||||||||||
Mensch -----------ctatcatgctttagggtttaaatgttggaaagttggttttgtaagaaga 60
Hund ----ttttatggcccccccccccctcccctttggcccactt-----------agagctgt 120
||| | | | | ||||| || ||||||||
Mensch agagtttggtttcttgtttgcttgtttgttttggtttgtttttggcatgcgaagagctgt 120
Hund gtcctggaattg-tgcccaaacaatcttaagtgtggtatgagctgtttatgtcactgagy 180
|||||||||||| ||||| ||| ||||||||||||||| |||||||||||||||||
Mensch gtcctggaattggtgccccccaaattttaagtgtggtatgaactgtttatgtcactgagt 180
Hund aaaatyagatacgcctgttgctaataggaggg-atgaaacatgagacaaggccaaacacg 240
||||| ||| ||| ||||||||||| ||||| ||||||||||||||| ||| |||| ||
Mensch aaaattagacacgtctgttgctaatgtgaggggatgaaacatgagacagggcgaaactcg 240
Hund tgagagccttctctvgcaggcatagTC-CTGAAACCTCAAATCCTTCACTCATTCTGCAA 300
|||||||| | ||| |||| | ||| ||||| | ||| | | ||||||||| ||
Mensch tgagagccctttctc-cagggacagTTGCTGAAGCTTCATCCTTTGCTCTCATTCTGTAA 300
Transskriptionsstart
Hund ATAAGGGGAAAGTHTGAGACATTTTGTCTCTGAAAGAGCTGGAGTTGATTGTAGCTACTT 360
| | | ||||| ||| ||||| ||||| || |||||||| | ||||| | ||
Mensch GTCATAGAAAAGTTTGAAACATTCTGTCTGTGGTAGAGCTCGGGCCAGCTGTAGTTCATT 360
Hund TTCCAGTGGGCHTHTTATAC-ATCTAAGgtaagttatcagttttaacttgga 412
|||||| || | | || ||||||||||||| ||||||||||||| ||
Mensch CGCCAGTGTGCTTTTCTTAATATCTAAGgtaagtgctcagttttaacttaga 412
Abbildung 10: Alignment Exon 1
Alignment des 1. Exons des humanen SGCG Gens (Acc.No. U63388) mit der gefundenen caninen Sequenz. Das
humane Exon 1 fängt bei Position 266 an und endet bei Position 388 und ist mit Großbuchstaben dargestellt. Die
Bereiche 5´und 3´ des Exons weisen eine höhere Homologie zur gefundenen caninen Sequenz auf als das
eigentliche Exon.

79
6.4 Polymorphismen des caninen SGCG Gens
Die im caninen SGCG Gen auftretenden Polymorphismen führen zu keinem Aminosäureaus-
tausch im Genprodukt. Dies wurde durch die Untersuchung verschiedener Hunde gezeigt. Da
die gefundenen Polymorphismen auch bei klinisch gesunden Hunden auftraten, kann
krankheitsspezifisches Vorkommen der Nucleotidaustausche ausgeschlossen werden. Die
beschriebenen SNP können in Zukunft als polymorphe Marker für Kopplungsanalysen in
Hundefamilien mit erblichen Muskeldystrophien und für genetische Kartierungen des caninen
Genoms eingesetzt werden.
6.5 Chromosomale Lokalisation
Das canine SGCG Gen liegt auf CFA 25q21-q23. Das menschliche Gen liegt auf HSA 13q12
(NOGUCHI et al. 1995). Das murine SGCG Gen wurde noch keinem Chromosom zugeordnet.
Laut der vergleichenden Mensch-Maus-Genkarte des NCBI liegt es auf MMU 14.
In der neuesten Version der caninen RH-Karte wurde das SGCG Gen der syntänischen
Gruppe 10 im Bereich zwischen den Mikrosatelliten FH 2324 und FH 2318 zugeordnet. Diese
Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die syntänische Gruppe 10, die bisher keinem Chromosom
zugeordnet werden konnte, dem Chromosom 25 des Hundes entspricht.
6.6 Das γ-Sarkolglykangen - ein Kandidatengen für erbliche Muskeldystrophie?
Durch die vorliegenden Untersuchungen konnte bisher kein Anhaltspunkt dafür gefunden
werden, daß eine Mutation des SGCG Gens die Ursache für die Muskeldystrophie von Gini
ist. Es muß jedoch bedacht werden, daß die Intronbereiche und der 5´UTR mit dem Promotor
nicht untersucht wurden. Auch in diesen Bereichen könnten Mutationen vorliegen, die zu der
Muskeldystrophie führen.

80
Auch das Dystroglykangen wurde als Kandidatengen untersucht. Die in diesem Gen gefun-
denen Polymorphismen kamen jedoch ebenfalls nicht als Erkrankungsursache bei Gini in
Frage (LEEB et al. 2000).
Ein weiterer Ansatzpunkt wäre die Untersuchung der anderen Sarkoglykangene. Da bei den
menschlichen Sarkoglykanopathien Mutationen in einem Sarkoglykangen häufig eine Verringerung
aller vier Sarkoglykan-Untereinheiten in der Zellmembran zu Folge haben, wäre es
durchaus denkbar, daß die verminderte γ-Sarkoglykanexpression bei Gini eine Folge eines
anderen Sarkoglykandefekts ist. Leider stehen gegenwärtig keine geeigneten Antikörper zur
Verfügung, um die Expression der anderen Sarkoglykane bei Gini immunhistochemisch untersuchen
zu können.
Ob überhaupt ein genetischer Defekt für die Erkrankung verantwortlich ist, kann nicht sicher
bestätigt werden. Der Fall Gini ist eine Einzelfallbeschreibung, sichere Aussagen und Befunde
über Erkrankungen anderer Familienmitglieder existieren nicht. Die Hündin sprach auf
die Therapie gut an, und die klinischen Symptome verschwanden. Daher kann eine ernährungbedingte
Muskelveränderung oder Stoffwechselstörungen als Ursache für die
Muskeldystrophie nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden.
Die Erkenntnisse aus der Untersuchung des SGCG Gens können sicherlich für Untersuchungen
bei anderen Hunden mit Muskeldystrophie von Nutzen sein. Auch wenn in diesem
Fall das SGCG Gen wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, können bei anderen Fällen
durchaus Mutationen im SGCG Gen gefunden werden.

7 Zusammenfassung
81
Die Charakterisierung des caninen γ-Sarkoglykangens und seine Rolle als Kandidatengen für
erbliche Muskeldystrophie beim Hund war das Thema der Arbeit.
Ausgangspunkt der Untersuchung war die an Muskeldystrophie erkrankte Dobermannhündin
"Gini". Es wurde von einer erblichen Genese der Erkrankung ausgegangen, da bereits der
Vater wegen ähnlicher Symptome euthanasiert worden war und Wurfgeschwister wegen
Muskelveränderungen auffällig geworden sind.
Zur Charakterisierung des caninen γ-Sarkoglykangens wurden zunächst rekombinante geno-
mische Phagenklone eingesetzt. Da die Phagenklone nicht das gesamte Gen enthielten, wurde
eine genomische Hunde-BAC-Genbank mit einer murinen cDNA-Sonde durchmustert, wobei
ein BAC-Kontig aus insgesamt 5 Klonen isoliert werden konnte. Der 110 kb große BAC-Klon
RPCI-81_405H01 enthielt den gesamten proteinkodierenden Bereich des caninen γ-Sarkogly-
kangens und wurde für die weitere Charakterisierung verwendet.
Hybridisierungen mit γ-Sarkoglykan-cDNA-Sonden ermöglichten die Identifizierung von Re-
striktionsfragmenten des BAC-Klons, die die Exons 2–8 des caninen γ-Sarkoglykangens ent-
hielten. Diese Restriktionsfragmente wurden in Plasmide kloniert und dienten zur Sequenzierung
der Exons 2 – 8 sowie der flankierenden Bereiche dieser Exons. Es konnten insgesamt
mehr als 15 kb DNA-Sequenz ermittelt werden, die unter den Accession-Nummern
AJ306895–AJ306900 bei den Genbank/EMBL/DDBJ-Nucleotiddatenbanken hinterlegt wurden.
Durch Vergleich der caninen genomischen DNA-Sequenz mit bekannten humanen
γ-Sarkoglykan-DNA-Sequenzen konnte die Genomstruktur des caninen γ-Sarkoglykangens
im Bereich der Exons 2–8 vollständig aufgeklärt werden. Die Exon/Intron-Grenzen sind dabei
völlig konserviert zwischen Hund, Mensch und Maus.
Der untersuchte Genabschnitt enthielt den gesamten proteinkodierenden Bereich, da im cani-
nen γ-Sarkoglykangen ähnlich wie bei Maus und Mensch das Startcodon am Anfang des
Exon 2 lokalisiert ist, während das bislang noch nicht charakterisierte 1. Exon vermutlich
vollständig untranslatiert bleibt. Die abgeleitete canine γ-Sarkoglykan-cDNA enthält einen

82
offenen Leserahmen von 876 bp, der für ein Protein von 291 Aminosäuren kodiert. Das
γ-Sarkoglykan des Hundes weist 93 % Identität zum menschlichen γ-Sarkoglykan und 85 %
Identität zum γ-Sarkolglykan der Maus auf.
Durch FISH-Analyse wurde das γ-Sarkoglykangen auf Chromosom CFA 25q21-q23 lokali-
siert und mittels RH-Mapping wurde es der syntänischen Gruppe 10 zugeordnet.
Um die Rolle als Kandidatengen für die Muskeldystrophie zu überprüfen, wurden PCR-Produkte
der Exons und flankierender Bereiche mit DNA von Gini, ihrer Mutter, ihrem Halbbruder
und einem nicht verwandten Kontrollhund amplifiziert und auf Mutationen analysiert.
Im kompletten kodierenden Bereich konnten keine Mutationen gefunden werden. Im flankierenden
Bereich fielen einige SNP auf, die jedoch als Ursache der Erkrankung ausgeschlossen
werden konnten. Es ist daher äußerst unwahrscheinlich, daß eine Mutation im caninen
γ-Sarkoglykangen verantwortlich für die Erkrankung von Gini ist. Eine derartige Mutation
könnte allenfalls in regulatorisch wichtigen Bereichen des Gens, wie z.B. dem Promotor oder
dem nicht-kodierenden 1. Exon lokalisiert sein.

Kirsten Conrad
83
Analysis of the genomic structure of the canine γ-sarcoglycan gene – a candidate gene for
hereditary muscular dystrophy in dogs.
8 Summary
The characterization of the canine γ-sarcoglycan gene and its role as a candidate gene for
hereditary muscular dystrophy in dogs is the topic of this thesis. Starting point of the
investigation was the female Doberman Pinscher "Gini" affected with muscular dystrophy. It
was assumed that the disease was heritable as the father and several littermates showed the
same phenotype.
For the characterization of the canine γ-sarcoglycan gene recombinant genomic phage clones
were used. As these phage clones did not harbor the complete gene, a genomic canine BAC
library was screened radioactively with a murine full-length cDNA as probe. A contig of five
BAC clones was isolated. The BAC clone RPCI-81_405H01 with a length of 110 kb
contained the complete protein coding region of the γ-sarcoglycan gene and was used for the
investigations.
Hybridizations with the murine probe allowed the identification of restriction fragments of the
BAC clone which contained exon 2–8. The restriction fragments were cloned in plasmids and
used for the sequencing of exon 2–8 and flanking intronic regions.
All together more than 15 kb of DNA sequences were determined and deposited in the
Genbank/EMBL/DDBJ–nucleotide databases with the accession numbers AJ306895–
AJ306900.
The genomic structure of the canine γ-sarcoglycan gene was elucidated by comparison of the
canine genomic DNA sequence with the known human γ-sarcoglycan DNA sequence. The
exon/intron boundaries between dog, human and mouse were conserved.
The investigated recombinant clones contained the complete protein coding region. Similar to
the murine and human γ-sarcoglycan gene the translation initiation codon ATG was localized
at the beginning of exon 2.

84
The canine γ-sarcoglycan gene harbored an open reading frame of 876 bp coding for 291
amino acids. The canine γ-sarcoglycan showed an identity of 93 % to the human γ-
sarcoglycan, and of 85 % to the murine γ-sarcoglycan.
The γ-sarcoglycan gene was physically mapped by fluorescence in situ hybridization to
chromosome CFA 25q21-q23 and also assigned by radiation hybrid mapping to syntenic
group 10.
In order to check the role of the SGCG gene as candidate gene for muscular dystrophy, PCR
products of the exons with flanking intronic regions were amplified from genomic DNA of
Gini, her mother, her half brother and a control dog. Sequence results of the PCR-products did
not show any nucleotide changes that would have resulted in amino acid alterations. Four
SNP in the introns were detected. However it is unlikely that these polymorphismen in the
canine γ-sarcoglycan gene are responsible for the muscular dystrophy of Gini. It can not be
excluded at this time that a disease causing mutation of the canine SGCG gene exists in an
important regulatory region like for example the promoter region.

9 Literaturverzeichnis
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Myotonia in a Chow Chow.
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The clinical spectrum of sarcoglycanopathies.
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85
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Current Protocols in Molecular biology.
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10 Anhang
93
10.1 Listing der analysierten Sequenzen (Exon 2 - 8)
Ermittelte DNA-Sequenzen, die bei der EMBL Datenbank unter den Accesion Nummern
AJ306895 – AJ306900 hinterlegt wurden.
Exons sind fett geschrieben, Start- und Stop-Codon und Polyadenylierungssignal sind
unterstrichen
Exon 2 (Acc.No. AJ306895)
CTGCAGAATT TTGCAAGTTG TCTCTATATA CTTATTGATT AAAATCTGAA AATATGGTCA 60
CTGGATTTCA GATGGATTGG CCATATCTAA ACTATTTTGA ATGATAGATT ACTCACACTC 120
TGTGTTTGAA ATGGTGATGT GTTTCAAAGT AATATTCAAT TCTTTTTAAA AATCATCTTA 180
ATTTTGGAAA TTTATTATTG AGGTAAAAAG TGTTATTTTG TCAGACTTTT AGTAAATCAG 240
TATTGACAAA TTCTCTGTTT CTATCTCTGT GCCCCTCCCT CTTTCTTCTC TCTCCCTCCT 300
TCCTTTCCTC TCTCTCACTC TATCTCTCCA CACCTCTTCT CTCCCTTTCT CTCTCCTTCT 360
CTGTGTCTCT CTCTGGCCCT TCCTCTCTCT CTCAACCCCT CCCTGTCCCT TCTCCCACCC 420
TGCCCCTACT CCGTGGCAGA TGGTCCGCGA ACAGTACACT ACAACCACAG AAGGTACCCA 480
Start
CATACAGAGG CCAGAGAACC AGTGTGTCTA CAAAATTGGC ATTTATGGCT GGAGAAAGCG 540
TTGCCTATAC TTATTTGTTC TTCTTCTACT CATCATCCTC CTTGTGAATT TTGCTCTTAC 600
GATTTGGATT CTTAAAGTGA TGTGGTTTTC CCCAGTAAGT AGCTTCCTTT CCTGGTAAGC 660
ATGTTTTTGC TTGTTGTATC ACATCATCCA TATTGTATTG GTAGAAACCT CTTTTAATGT 720
AATTAATGTT TGTTTTCTGT CCAGATCAAA ACAATCAGTA GCAAAATAGT CATACATTTA 780
TTTTTTCTCA ATTTCACTAT GAACTATAGG GTGTTGGGGT TTGTTTGCTT TTCTATTGCA 840
ATTTTTTATG TTAGTCATTA CCTCTGCACG TGGGAAAATT GTAACCATTT TGAGTTTGGG 900
GTTGACTGCA TCAAAATTGA GTAATGACTA TTTAATCCAT TAATTTGTAA AATTCTATAA 960
ATTATGTTTT CCTAATCTCA TTAATCCACT AATACTAACT GCCTAGATGC TTTCTCATTT 1020
TTTAGAATTT CACTTTAATA TACAATAAAT TCATGTCCAT GCGTCAACAT TTAACAAAAG 1080
ATTTAGTAGA TAAAATACTA GTAGTCAAAA GGAATTCATA GTCTGTTTTA AACATCCTCA 1140
TGTTTTCAGG ATGGCTGGGT AATTTTATAT GCTCTGATAA TATTTTGTAT ACTTTTTGAA 1200
AAAATATATT CATTTAATAT AAAAATGTCC TAATTTTGCT AGATAGTCAT AGTGAGAAAA 1260
ATAGCACATG TACATCACAG GTAGGTCAAT CTGTTCCTTC CTTGCATCTT GAAGATGTGA 1320

94
TATAGGTACA GGCTCTTTCC AAGAACAATA GTTGTAGCAA TCAGTCTGAA ATGCCTTCCT 1380
TTGATGAGTC TCCTTCACTT TTTTTTTTTA AGATTTTATT TATTTATTCA TGAGAAACAC 1440
AGAGAGAGAG GCAGAGACAC AGGCAGAGAG AGGAGAAGCA GGCTCCATAC AAGGAGCCTG 1500
ATGTGGCACT CGATCCCAGG AATCCGGGAT CACACCCTGA GCCAAAGGCA GATGCTCGAC 1560
CGCTGAACCA CCCAGGCATC CCATCTCCTT CACTTTCTAT GCAAATATTT CTTTTCTGCC 1620
TTTGCTCAAT AGCCAGTAGG TACATTATTT ATTTTGTTGA CATAAATATT TTCTGATATT 1680
CAAAGAGGTA AATACCAATC AAGTCAAAAT ATACCTTAAA AGGTGTTACT TAATATAATA 1740
TAACATATGT TATAAATTGA TACTATAAAT TATATTTAAA TACTATAAAT TTATGTATTT 1800
ATGCTATAAA TACATAAGTA TATTTTAATT AGCAAGTGGA AGTATGCTTC CTCCTTAAAA 1860
TTT 1863
Exon 3 (Acc.No. AJ306896)
AACTCTAGGG CAAAAATTCC TGATAGAATT GTTTCCTAAA AATTGGTTTA TTATACATAA 60
TTAAAGCCAA CATTAGCAAT ATTATATATG CTAATGTTGG CTTAATTTTG TAAACTGTGC 120
CTTACAATTC ATGGTTAGAT TTTGTGAGAA ATTGTAGAAT AGTAGTTGTC AACTTTTTAG 180
ATTTTGAACC CATTCTTCAA ACTAAGCTCT ACACTGAGTC ATGTATAAGA GAGACTCAGG 240
AGAGCTGCTC TGCCTGTGGT GGGGATTGAC CCAAACTCAG CAGCATTGAG AGACTTCCAT 300
TAAGCACAGT TGCAATATCC ACTGCTCCCA CACCTAAGTT TGAGAAGAGG ACCATAATGG 360
TGGTTCACAG ACAGATAACC AGCAGAGTAA TTCAAGATTG AATCTGGTTC TTGTTAATGG 420
GGCTTATCAA CCAGTGGAGT TCTTGAAGAG AGAAATCTAT GGCATTCAGT TCGGAGTACC 480
ATATCTCTGT CCCAGAAATC ACCTATCACC CTATAAAACG GCCCTTAATG TTTTTGTTTC 540
ATTTTCCTGA ACATTCTGCT CTCCCCTTTT TAAATCTACC TCTATCTTGG AGGGGAGAGA 600
GCAAAGATCA GAACTTAAGT TTGTTATATT TAGGTGCTCC CAAGATATTC AAAAGGGAAA 660
GAGAGATAGA CAGTTGTATA TATGGGTATG GAGATCAAAA GAAAGAATGT AAACTGCAAA 720
TAAAAACACG TGAGAATTTC CACACTGAGA TGGTGATTGA AGCTGAGGGC GTGGCCAGGG 780
AGGGATCATA GAAAAGTGCC TGACTGAGCT TGTGAAGGCC AGCAGTCAGA GGCTGGGTAG 840
AGGGGATGAA TATGTGTGGA TGCCAAGGAG AAAAGCTAGG AGACCGTGGT ATCCCAGAAA 900
CCAGGTGAGG ATAGTGTTCC AACAAGAAAG AGATCCAGTG CTGAATTCTG AGAAAACAAA 960
GGGAATGAAG TTTAAAAATG TCTACCAGAT TTAACAGCTC TGATAGCACC AATAATCACC 1020

95
AGAATTAAGT CTTCTATCCT TTGTGATCAT TCTTAATGAC TGAAAATTCC TTGGGAACAG 1080
ACACATTGAA TAGAGATTCA CTTCCTGCAA TATTGCTTTT CACTTAAGAA ATGGCCAATA 1140
AACAGTTGCT ATATTGTAAA CTTACCAGAT ACACTTGAAA GCTTTAAGGT ATGGTAGCGG 1200
GTGGTGGTGA AAGAATGTCA TGTACCCCGT GTATGGTTAA AACTCATAGA ACTATACACC 1260
TCAAAATGGT CTGTTTTATT GCATCTTAAT TTTTTTAAAT GTTTTTAAAT AGTAATGGTA 1320
AGAACCTTTT TCTTAGGTCA TGGTGGGCTC TTGGGTGTTT ATTATACATT GACTCTTTAA 1380
ATCTAATATG TATTTCTTAA ATAGTCCTTT GTATTACACA AGAGTTAATG AAATACTGAC 1440
AATTGAATAA AAACAACTAA AGTTTTAAAT AGAGTAGTAT TTAAGAGAAA TATAGAAAAG 1500
TGCCAATAGA AAATTTGTGA AAATGCATCT GTAATCCCAG TTGACACTAA AAGAAGGGGA 1560
AAAGAAAGCA ATAATAAAAT CTCTATTGTC TCCTCTTTTT AACAGACAGG AATGGGTCAT 1620
TTGCGTGTTA CAAAAGATGG TCTTCGCCTA GAAGGAGAAT CAGAATTTTT ATTCCCGTTG 1680
TATGCCAAGG AAATACACTC CAGAGTGGTA AGAAAATGAT GAAACATTTA AATAATTTGT 1740
GTTTTCTGAA AAATAATCAT TAAGCACAGA AATTCAACGT ATCTCAGAAG AGGTTCTTAG 1800
AATGTATACA TATACACACA TTGCTGTTAC ACTCTTTATA AAAAGCTTGG CTACAAGGTT 1860
GTAAAACACA TTTCTGATAT TACATTCTAA AAAGGTTCCT TTTTCATGTG CTTCAGATCT 1920
GAATTTTGTG GCTTCAGTAA TTTAGACCAT AATAAAAAAG GTTTGTTAAT TAAAACCTTT 1980
ATCA 1984
Exon 4 (Acc.No. AJ306897)
GATCTTCACT TTGAGAACTA ATGTGGTATG TTGTGGCTAG TGCACATAAG CAGCAGAAAC 60
CCAAAAGAAA AAAAAAGAAA CCCAAAAGAG TATTATAATT TATTTTTTTA AATGTTAGGA 120
CATCTACAGC AACAAGGAAA TGAATTTTGC CACCAACCAC ATGAGCTTAG AAGATCTTGA 180
GCTTGGAATG AAACCTCAGC TCTGCCATCC CCTTGAGACC CTGAACTTAG AACCAGGGTT 240
GACTCTTCCT GGACTCCTGA CCCACAAAAA ATTATGACAT AATAAATATG TATTGTTTTA 300
AACTTTGGGG GGAAAGTACA TTCATTTACT GTTTCATGTA ATATAATCCA GGATTTTAAA 360
ATACTGTATA GGGTCACAGG ATCTGTGACT ATGGAGAAAT TATCTCATAT AAATCCTAAG 420
TTTATGAATG AATATAAAGA TACAGTCATT TTAAATAGTA TGTATTTGTC AAATTTTATA 480
AATGCCTTCC TAGGACTCAT CTCTGCTTCT GCAGTCAACT CAGAATGTGA CGGTCAATGC 540
ACGCAACTCT GAAGGAGAGG TCACAGGCAG ATTAAAAGTG GGTGAGTCTG ATTTCACAGT 600

96
GCTTGGCATG TAATTGTTCC ATGGGGAGCT GTGCTGGATG GATACATTTT TTTCTCTTCT 660
AAAAAATTCA GAGTTATTTA TGGACAGTTA AATTATGAGT TTTCTAAATA TCATACTATG 720
TTGACCACAG AGAATAGTTG GCATCACAGG GAGACAGTCT GAAGTATTCT AATTAAAATT 780
ATTTTGATTC TAAGAAATAG AGGACCATTC AAGGTAGTAA AAGAAACAAT GATTATTACA 840
GAATGCAAAA GAATCTGATC TGAGACCAAA GGAACCAAAG TAGTTTTTTT TTTAATGTGT 900
TAACTAATGT TATTATGGTA ATCATTTCAC AATATATACA AATATCAAAT TATCAAATTG 960
TATGCCTTAA ACTTACAGAA TGTTTCTGTC AATTACCTCC AATAAAGCTA GGGAAATCCT 1020
CAATATATAT TAAATAAAAT ATCCTTACCC AGAAACATAC ATAAAACAAA AACGAAGTTA 1080
TGTATTGATC AGTTGGTGAA AATGTGAAAA GAGACTCACA GGCACCTAAA CCTTTATTTC 1140
CCCTAGAAGC CTGGGGAGGC GCCTGGGTGT CTTACTCGTT TAAACACCTG ACTCTTTATT 1200
TTGGTAATGT TGTGATCTCA GGGTCATGGG AATGAGCCCA AGTCAGGATC CATGCTCAAT 1260
GAGGAGTCTG CTTGTCCTTC TCCCTACCAC ACTTGCATTT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT 1320
CTCTCTCTCT CTCAAATAAA TAAATAAATA AATAAATAAA TAAATAAATA AAATCTTAAA 1380
AAAAAAAAAA AGAACCAGGG CTAAGAGCCA AAAGATTCTC TCTCTCTCTC TCTCTCTCTC 1440
TCTCTCTCTC TCTCTCCCAA CCTCCTCCTT CTCCCTTCCT TTCTTCTCTC CCACATAACC 1500
CTCCTTTCCA ATGTATCTTT GCCCATTGTT TTCACTTAGC TGCATCAGTT CTAACTCTGT 1560
AGGCCCTACA GGACCTCTCT GGTTCTTCAC CTGATTGGCT GTAGTTCTCA ACACCAACCA 1620
CCTTAGTTTT CAATTGCACA AATTCTAAAT TCACAACAAA CTACTCTTAT TGGTTCACCT 1680
AATATGTTTA ACCAGCTGCC CTTGGGTCAG CAGTTCACAC CCATCCAACC AGCTAAAACC 1740
AAAGAATAAT CTCACCAAGG AGTGAGATCC CATGGAATCT CACGTGGTGA TATGATAACA 1800
AGGATTAGAG AGAAAGACCG TAGATGGAAA AAATGACAAA AGAGGAAACC ACCCAGTGAA 1860
TGGAATACGT ACCCATTCTC TATACTATCA GCAGTCTATA GATGTGCCAA GTCCAAAAAA 1920
TTGTGTGGCC CTTTGGATTA TGGGAAGACA GGTGAATTGT GTCCTGCCAA CACAAACTAG 1980
TAACTTTCAG TGTCTCTTTT CTAATGGCTG TTTTTACAAA ACAGAATAAT GTTACATTGG 2040
AACCTACTGC CATATAATTA ACCTAATGGT ACCTTTTTAT CATACTAATA CAAGAGTTCC 2100
ATATTATATG TTCTTCTTTA ATCTTTATAA CTTATTCCTA ATAATGAATA TATCTCTTGC 2160
TTAAAAGTTT GTTTGATCAC TAAGTTCAGT GAAATTCTCA GTGGGTGTAG AGATAAATCT 2220
GAGTTTATCC AGCATACATG GTCTTGAAAC TTATCTAAAT CAAATCGTAT TTTCTTAATG 2280
AATTATGTAG TATCATGATT TATCTTTCAC CTTTATTTCA TAAAATTCTT TGACTGTAGC 2340

97
TTTTAAGTGT TTGAGGGATT TT 2362
Exon 5 (Acc.No. AJ306898)
GAGCTCGGTA CCCGACCATA TCCAAAACTG TTTAATGTAT TCTTTGAAGA GCTTCTATTT 60
CATTTCTGGT TAGGTATCCA TCAACTTTAA TGAGTACTAG GAAGGATACA GGGACACACA 120
CATAAAAACT CTAAGACATC CATTCATTTT CTCAGTATCT CTCCCAGATA AGACTATAAA 180
GCTAACACAC AAAAGAATTA GGAAACACAT GTAGTTCCTT GTGCAAATGC TGAGAGCTGC 240
ATTCTGGAGA GATTAATCCA TTATGCTGCC AGGGTTAGAA AGACTGGAAG CACAAAGATG 300
AATTAGGAAA CATGAAACGA TGAACACCTG AGAGTAGACA AGGGTCACAT ATGTTCTTGG 360
GGACACAGTA TCCCCAGTGC CCATCACATG GGAGTATCCA CTAAATCTTT GCTGAGTAAA 420
TAATGAGTTG GCAGGCAATG AGTCTAAAGC TCATCTGATG AGATGAAACT TGGAGGGGAA 480
AGGGGAAAGT GATACCTCTG TCACTGAAAT ATAAAGAAGG AAGGCATGAA CAAAAATGAC 540
ATAGGGGAAG GGAAAGGACA GAAACCTGAA AGCATTTTTC CACGGTGATG TCTGTTTCCT 600
CCAGCGTGTA ACAGGTGAGG ACTTCTCCCA AGAATAAGGG CACAGGAGGA AATCTGATAT 660
GATTCATCTT CTGGGTTGAC ATTGGTCATT GAAGTGAGCC ATTCATAATA TGGTCTTTCA 720
CAAATCTCAC ATTTTCAGAA TACAAAATCC TTAGTTGGTT AATATTCCAA AGATTACAAA 780
TTTCAATAAT CTTCAACAGA AGAAATATGT TATTTTAGGC AAGTTGTAAA GTTGAAAAAA 840
CCTTTGGATA ACGTGTCCAT TCATAAATTT GATCTAGATC GACACATTTA TTTAGTTTTG 900
TTTTTTAATT TTTTTATTTG AGTTTAGTTG ACACACATGT TACATTCATT TCAGGTGTAC 960
AGCATAGTGA TTCAGCATCT CTATACATTA TGCTTTATAG ATTTAAGCTT AGAACTTAAA 1020
AAAATTGGGA TCCCTGGGTG GCGCACGGTT TGGCGCCTGC CTTTGGCCCA GGGCGCGATC 1080
CTGGAGACCC GGGATCGAAT CCCACGTCAG GCTCCCGGTG CATGGAGCCT GCTTCTCCCT 1140
CTGCCTGTGT CTCTGCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTGT GACTATCATA AATAAAAAAA 1200
AAAAAATTAA AAAAAAAGAA CTTAAAAAAA TTAATCATAG AATTAAAAAG AACTATTGGT 1260
AACAGATTTT ATATATTTAG TAATTTGGTA TTGCTGGGTG ATATGACATG TAAACATAGA 1320
GATTTCTGAC ACTACATATA GTAAACACTT CATAATAAAC TATTTTAATG AATTGTTCAG 1380
GTCCCAAAAT GGTAGAGGTC CAGAGTCAAC AGTTTCAGAT CAACTCCAAG GATGGCAAGC 1440
CACTGTTTAC TGTGGATGAA AAGGAAGTTG TGGTTGGTAC AGATAAACTT CGAGTAACTG 1500
GTATGTGATA ACTTTTCTTA AAATTGAGAT GTAATTAACA TAATATTCAA TTAGTTTCAG 1560

98
GTATACAACA TAATGATTTG ATATCTATAT CTATTGTGAA ATCATCACTA CAGTAAATCT 1620
AGTTAACATC AATCACCACA CACAGTAGCA GATTTTTTCT TATGATGAGA ACTTTTTTTA 1680
ATTGCYGTGT AGTTAATACA CAGTGTTGTA TTAGTTTCAA GATCTATTCT CATAGCCACT 1740
TTCAAATATA CAATGCAGTA TTGTTAACTA TAGTTACCAT GCTGTACATG ACATCCCCAG 1800
GACTTATTTA GAAGTTTGTA CCTTTTGACT CCCTTTACCC ATTTTGCCCA GGCCCACCCC 1860
CAACCTTTGG CAACCACCAA TTTGTTCTCT GTATCTATGA GTTTGACTTT TTTTTTTATA 1920
TTCCACATAT AAGTGAGATC ACACAGTATT TATCTTTCTC TGACTTAT 1968
Exon 6 (Acc.No. AJ306899)
TTTGGCGCCT GCCTTTGGCC CAGGGCGCGA TCCTGGAGAC CCAGGATCGA ATCCCACATC 60
GGGCTCCCTG CATGGAGACT GCTTCTCCCT CTGCCTGTGT CTCTGCCTCT CTCTCTCTCT 120
CTGTGAGACT ATCATAAATA AATAAAAATT AAAAAAAAAA ATTAAAAAAA AAAAAAGAAA 180
GAAAATGACC AGACGATTTA CTATATCTAA TCTTGGCGAT ACATTCTTTA AAAACAAAGT 240
TAACATTGCA AGACTGGACT TTTTTATTAT TATACTCTCA TTATACAAAT AATATTTATA 300
CAGGATCATG TTTTACAGTT ATTTAAGTGC ATTATCTACA TAATGATATT TTATAATGGA 360
ACTTTTTTCC CTAAAATTTA GATTATATGA CCACAATAAT ATGTTTCTAT TTTCATTGAT 420
GTTACACCAA TTATATATTT TTATATAATC ATAGTTGGGA ATATCAAATA TGAATGCATA 480
CATAAGGGAA ATATAGTTAC TCTGAAAATC AATAATTTAT TAAGAGTTAT TTTTATAAAA 540
CCATTTATTA AGAATCTATT TTAATATATG CAAATAGATT CTGAGGAATA TTTACTTTGA 600
GGCCAAATAG CAATAATAAA AGTAAGATCG TATAATTTGA ACACTGACAA TTTCAATGAT 660
AGAGAAATTG CTGCTTTTAT GTAACGATAA TACGTATTAG ATTATAAGCT TTATGCCTGC 720
CTTGTACTTA TGTGCATTAC AATTATCACG TGTCACTATA ATATCGCTAA CTGGTTAAGT 780
AATTGTCATA CTTTTAAAAA CTAATTATAA AGTTATAGTT CCTTACAAAA GAGTTCCACT 840
GACACCCTTA GAGTAATTTC AGCTTACCAT AAAAGTTTAA AATCCTATAT ATTAGTTCCT 900
ATATATCAGT TATGTTTTCT TACATCTGTA CAAATTCAGC CACAAGTTCT AAATCTACTT 960
GCGCTTTAAT ATATAGACTA AATATTTAAT AGTTTGATGT CATTTGTTTT ACTTTTGTAA 1020
AGTGATGCAC CTCTGGTTTT GTTTAGGCCC CGAAGGTGCT CTTTTTGAAC ATTCAGTGGA 1080
GACCCCCCTC GTAAGAGCTG ACCCATTTCA GGACCTGAGG TAAGAATTTT GTTCAGATAC 1140
AAACTTTCTT ATGGATGATA CCTGGATATA TGTGGAATAA TATCTTAGCA GTCATTACCA 1200

99
GATCATGTCT TATTCCATTA ATTATCTTTA TTCTCATGTT CCACTTATTA ACTAGTCAAT 1260
ACTTACTAAA ATCCAAAGGA AGTAAAAAGT GGTACTGACT CCCTATGTTT AATCCACCCA 1320
AAACAGAAAA TTTACCATCT TAACTACTTT TAAATGTACA GTTCAAAAGT ATTAAGTACA 1380
TTA 1383
Exon 7 und 8 (Acc.No. AJ306900)
CTGCAGGGGG CACTGTTCTG AAGCCTGTGT TCCTAGATAT TTCTCTTGTT GGTTTTATAA 60
ACTGCCTGAA TAGGGTGTGG ATTTGGATTC CACACTAATG CATGATTTAA GACTTTCTCT 120
TCGCATCCCA GAATGAGCAG CCTACTTTAG GGCTGTTATC ATACTGTGTT TCATTTCCCT 180
TCTGTATGCC CAAAGCGCAT TTCCAAACAC TCCTCCCCTG CCCCCCACAG CTGGCCACAA 240
CTCCTTCCCT GTAGAGATGG AAAATACCAA CCCACAAGGC ATTTATCTGC CCATAAACTC 300
CAAGGGCTCC AGCCTTTCAG CACCCACTCA TCACTCTGGC TAGGAGTTTC TTCTGTTTCT 360
GGCACTATGA AAATGCCTTT GTCTTTCTGG GTTGTTTTTT GGTTTTGTTT GTTTTGTTTT 420
TGCCTAGTAT GTGTTTTAAT AATTTTGATC GTATTTTAAC CAGCATTTAT ATGTAATTGC 480
TGGCTGAGGG CAGAGCTGTG CTGCTCATCT GTCTTGACCA GAATTTATAG AGTGATATTT 540
TTTAAAGCAA AAATGGAATC TTGTCATTCC TCTGCTTACA TTCTTTAAGC TGCTTGAATG 600
CTAGGTTTTA AAGGCAAGCA GCTCATCTGC CTTGTTTGCT ACTGTTTTTA TACTGTGTAT 660
ACCATATACA TATGCATATA TGTACACACA CAGCTTACTT ATTTGGTAAA TTTCTGAATC 720
AGTGCTCAAA ACTTTTTGTT CCTCATATAA GTCATGAGTA AATATATATT CACATATTTG 780
AAGAAAGGGG TAGATATTTA ACTAGCAAAC TAAAATATAA CAAAAGAGAA AATAATGGAG 840
TTATTTTATA TCTGACTACT GTTAATTGTG TTCATGGAAA TGTATGCTTC AGGACATTGT 900
AATCACAGAC TTTTTTGGTA AAATGTGTTT TTACTTGTGC TGAACGGACA TATTTCATCT 960
CGAGGGCTAG AAACAATGCA AAGGGGAAGA AATTTCCTAT TCCAGAAGCA GTATATTGTA 1020
ACATGGTTAA AAACTAGTAA TTGGTCCTGT TGAGGTCATT TTGTTGTTTG ATGAGAAACA 1080
AACTCACCTT CACTAGGATC TTCAGGATCA CAAATGGATT ACCTGAAATG GACCAGACAT 1140
CTAAAGTTGC TTACATGTCT TCCTTCCATT CCTTCCCCAC CACCTCCCCC TTTCTATCAA 1200
TCCGGACAGG ACAAATGTAG ACGATTAGCA GATGTAAAAT AGCAAAATGG GCAGGCAGTC 1260
AGCCGACCAA ATCATCTGGA TGTATCCAAG TGTTTCCCTA TAACCTAAGC TTAACATAAT 1320
TTGACTAATA AATTCTATGA ATGTCTCTGT TTCCTTGTAC TCAAGGTAAA TATAAACTTC 1380

100
AAAATGTGTA ACGGATCAAA TATTACATAT TGAATGTACA CAAGAAAATA AAACTTTGTT 1440
TTCTATAACA AAGAATGGTA GACAAAAAAA CTTGCCAATT AAAGGCAGCA ATTCATCTGA 1500
GTTAAACATC CACCGAATAA AAAAGAATAA AAAAGAATAA AAAAAAAAAA AAAAAAACAT 1560
CCACCGAATA AATACTCAGT TCAAATGCAA TTAATGACCC AAGTACTTCT CTCCTCTGGA 1620
GCCACTCCCC TTTCTCTTTG ATACCCATGC CTACACGGAT ATTACCCTGC TGTGGGAGGA 1680
TTACAGACTG GTTTGGATCC TGTTCTACTT CTCACTTATC TTGAAACATT TCAATCCATT 1740
CAGCCTTTTG GACTTTTGGG TTGATTTAGG TTGGGTTTCA AATGATCATG TTATGCCACC 1800
TGGTGGAAAT TTAGTATTTT TTCAGGCAGA GGCAAATAGA ATTTCTCTGG TCCATATGTT 1860
CATTCCTGGT TCTGTTTGAC TTTAACACAG GAGATTCTGA TAAATTATAA AATAAACAAA 1920
GCTAGCTAAA GCCAGTCTCT ATTCTGTCTA TCAACCCTAC CAGTTCAGAA TTTTCACAAA 1980
AGAAATCTTC ACATCTGCCC TGTAATCCTC CTAAATTAAA AACAACATGC AAACAAAACC 2040
TAATAAGTTT ACATTCTATT TTATGAGCAG GTAGCAAATG AACATGTTAC CGTTAAGTTT 2100
GTCCTTTTTC CCCAAACAAG TTTGTGTTTT CATTAAAGAA ATAGCTTTAC AAAGTTATTC 2160
ACAAATAGCA TTTTCTTCTA GTGTGATATG CAGAGTGCTT AACCCTGCCA TCTGAAACTA 2220
CTATGTACGG GTGGAGCTGT GTAATCTTTT TATGTTTTTA GAGGATATTA ATTTTGTAGA 2280
CTCATTAATG GGAAGTTAAT TTCTTCATTG CACATTATTT CTGGATTTGT CAATAAAGAA 2340
TGTACACTAC AAAAAAATGA CAATGATACT ATATACTTTA TTATTTGTAG TTTCTATACA 2400
AATCCATTCA ATGAGGGATT CCTGGGGTGA CTTTTTTTAA TACTATTTTT TGTTGTTTCT 2460
TTCCCTCATT TCAGATTAGA GTCCCCCACA CGGAGTCTAA GCATGGATGC CCCAAAGGGT 2520
GTTCATATTA AAGCTCATGC TGGGAAAATC GAAGCTCTTT CTCAAATGGA TATCATTTTT 2580
CAAAGTAGTG ATGGAATGGT GAGTTCAGTG TTATGAAGCT CCTGTTGTAT GTCCTGATGA 2640
CTTTAAGAGC TGACAGAGAA TATCAGTTCT GCCATTACCT GCTATTAATC CAACTTCTCT 2700
CAATATAGTG GTCACTAGGA GTTACCTGTA GATGATGGCC ATAATCGGTT GTTGCCTTGA 2760
GCGCTATGCT TGCTCACATC ATATTATGTT TAAATGAAAA TTAAATATGA AAAATAAAAG 2820
CTTTAAAAGT CAACCACAAT AAGGATAAAA TCTGAAACTT CAGGTCCAGA AATAAAAGAT 2880
CATTGATACA AACCAAAGTC ATAATGAAGC AGTAGAGCAC TCACTACCCA GTATTGATTG 2940
TTCTAGCACT AGATCAATTC ATTAATTACC TGTTTGAGTT CAGGAAAGTT AACAGGCCTC 3000
TCCACACCTG GACCTATCTT CTCATTTGTC AAATAGGAAA AATAATATTT GCTTAACTAT 3060
GTCACAGAGT TATGAGATAC CAATGTGGTG ATATAGGTGG TAATGTTTGA AATTACATTC 3120

101
ACTTACTATT AAAAGGAAGG TGTGATTGAG GCAGCAAATG GAGACCATGA GAGGCAGCTC 3180
ATAAGTGTGG ACAGGACCCA TCCAATGGCA GCCTGCTAGT GTAATATAAA AGACATCCAG 3240
TGAAGCCCCT TTAAGTTGTA ACTTAAAATG TTATGATGCC AAGAGCAGAT AAATGCCAAA 3300
ATGGAAGTCA AGAATTCTGG AATCTCATTA CTAAATTATA ATGTCATTAC ATACTTAAGA 3360
TGTATTATTT TGAAAAAATA CTAATTTTAA TTTTGAAATA ATAACCACTT ATTTCCACAA 3420
ATAAGGTATC ATTTTTATAG TAGCACACAG CCTGACTCAT AATTAAAGTT GATATCCCTT 3480
ATTACTGGGA GCTAGTTCAA AGTGTGGGGG TGGCTGGTCT CCCACAAGAT ATATTCCCAT 3540
AAAGATAAAG GAAGGTGAGC AGGGATGCAG TATGTGGACT GCCAGTGATG ACAGTTTGCT 3600
AGAAGAGCAG GAAAAAAATA ACAACTAGAA AAAAATTCAC TGATTAACCA TAATAAGGGA 3660
GAGCAGAGAA GCCAACAAGG AAAAGCTAAC ACACATTAGG GAAGACTAGG TAGCCACAAA 3720
TCCAAAGCAT CAGACAATAG CCTAAGTAGG TTCCGTGTTG AAAAAAAAAT AGATTTAATT 3780
TCTTTTACTC TAACTGTGTC CCAGACCACA AGGTAAATAA AGCTCTGCTT CTATTACTGT 3840
TCCACCCATG GCTTCACATG GCAGTGGTCA ACTTCCCCAG GGGGAGTACA GATGGCAAAC 3900
ATCAGTTTAT GAAAAGAGTA GAGTTCGTGG GTGAGAGTAT ATAAAATAAA GGAAGAGTCC 3960
AACCTTGTTT GTGGGGGGAA AAACATGTGC GTCCATGACA TACTTCAATT CCTTCTAACA 4020
AGTGGGTGCG CCCTGGAGTG GGTAAGGTTA GAGTACCCGG TGTGACAGTC TTTACTTCCC 4080
CAAAAGATTT CCAAACCCCA ATTAAGGGCC ATTTGTTTAC ATTTCAGTTT AATTAAACCA 4140
TAGGAGGAAC AAAAATCCCA ATAGCTTCCA TTTAACCGTA GTTGGCTGTA GTCCGGGTGT 4200
CTACTGCTTT TCCACATCTA AGAGAAGGCA GCTGAGTTTC AAATAATATT TTAGAAGTTA 4260
GGGAAATGGT AGCTAATGAT GAAGTCAATC ACCTCTCACA GGAAAAGAAA ACCAACTGAA 4320
ATTCCAACAT TCACAGGTAA AAATTATTAA GATGACTGTA TTTCTGTGAC TTGTACTTTA 4380
CCCTAATGAG GTAGAGGTGA TTTAGCATAA AGTCAAAGTA AATCACAAAA TAAATGTGAA 4440
TCAAAAGAGT TTTTTGCAGG TAATTCTGAA AGGTATTTCT GGGAGTGTAG CATCATAAAT 4500
GTTCCTAGCT CAACTAGCAC AATGGGTTTT TTTTTTTAAG ATTTTATTTT ATTTATTCAT 4560
GAGAGACACA CAGAGAGGGG AGAGAGAGAC AGAGAGAGAG AGGCAGAGAC ACAGGCAGAG 4620
GCAGAAGCAG GCTCCATGCA GGGAGCCTGA CATGGGACTC GATCCCAGGT CTCCAGGATC 4680
AGGCCCTGGA CTGAAGGCTG CGCTAAACCG CTGAGCCACC CGGGCTGCCT GAGCACAATG 4740
GGTTTAAAAG AAAAAAAAAA AAACACTTCA GTTTGGAGAA GGAATTATTA AGCCTCTACC 4800
TAGAAATTCT AGAAAACTAG AAATAGGCTT TATTTTTTTT AAGATTTCGT TTATTTATTC 4860

102
ATAAGAGACA CAGAGAAAGG CAGAGAGAGA AGGCTCCATG CAGGAAGCCC AATGTGGGAC 4920
TCGATCCCAT GACCCAGGGA TCACGACCTA AGCCAAAGGC AGACGCTCAA CCACTGAGCC 4980
ACCCAGGTGC CCCTAGAAAT AAGCTTTAAA AGAATCTGAT CATTATGACC TAAGTCAGGT 5040
GCCTGTTTCA TTTTCTATGC AGAAAGAAAC CAACCTGTCT GGAGCATTTT GAGATAGGAG 5100
TTTCACACTA CCGTGTTCCT TTCTACCACT TCATCTCTCC TTTTCTCCCA AACAGCTTGT 5160
GCTTGATGCT GAAACTGTGT GTTTACCCAA GTTGGTTCAG GGGACTCAGG GTCCCGCCGG 5220
CAGCTCACAG AGACTCTATG AAATTTGTGT GTGTCCAGAT GGGAAGCTAT ACCTGTCCGT 5280
GGCTGGCGTG GGTACCACAT GCCATGAACA CAGTCACATC TGCCTCTAAA CCACCTGCAT 5340
Stop
CTGCCATGGA GCACCTGCCT CATTTCAGTG AGCTTTACAT TGCTGACCTC AAGCCTTCAC 5400
ACTGAGCTAC TTGACATCCT GGTGAATGGT GGACAGTGGA TGGGAAGTAG GAGGTCACAC 5460
TTTCAAAAGG AACTCAGAAA AATAGGCCAG TGAAGGTGTT CTGATGAAAA TACATGATCT 5520
CAGAATGGTG TGCACATTAT TAGACACAAA AGCCTAGCAA TAGCAAAAAA GGGGGGGGGA 5580
GGTATTCCAC TAGGTTTATT TTCCTCAGAA CCATTGTGAC TTTTTTCTTT CTTGTGAATA 5640
ATCAATCTAC AATGAAATAC TGAATCGCGT GTGGAATTAA TTAATGCTGT TCAGCCATGA 5700
CTAACTTCCC ATAAAAAGTA GCATTGATCA ATAATACATT GCCCCTCCAA AGGTGTTCCC 5760
AGTCAGACCC ACAAGTTCTC CCTTTTAATG CAAAGTGTGT CAAGTTTCAG AAGAAATCTT 5820
CAGGTTTCTA GAGGACTTGA GTTGATCTGA ATTTCAGTGT TGTCAAGGAA TAAATTATAC 5880
poly-A
AAAAATTAAT CATGTTTTCT TTACACGTAG TCAATAAGCA ATAAAAAACC AACCAACATT 5940
poly-A
TTTCACAAAC TTGTTTGTCT TTGCTTCCTT TAATCCCCAC GACAGTGCTT TGAGGTAGGT 6000
ATTATGTTTC CCCCAAGTTA TGGGATGATT TTAAAAGGTT CAGCTAGGAC AAGTCAGAAG 6060
GTCATACAGT AGCTAGTGAA ATTAATCTGA AATATGACCC TCCATGTGAG CAGCTGTTTT 6120
CACTTTGAAA AACTCTGGTA TGTTGTCTCA CTTTATCCAA TGCCAGCCTA TGTGCTAATT 6180
GTGTAAATGG GATTATATTC GTTTGACAAG TAAGGAAACC AGAGTCCAAA GGGGTTTTGT 6240
CATCCACCAG GACCAAGCAG CTAGTAGGTG GTGGGACTCA ACCGCCCAGC CTGTGCATTT 6300
ACCTCTTAAC ACAGTATAAC AGACTGGATG TTTCTATGAA GCTT 6344

10.2 Primer für die Mutationsanalysen
Primer
Ex2_fw
Ex2_re
Ex3_fw
Ex3_re
Ex4_fw
Ex4_re
Ex5_fw
Ex5_re
Ex6_fw
Ex6_re
Ex7_fw
Ex7_re
Ex8_fw
Ex8_re
103
Tabelle: PCR Primersequenzen für die Amplifikation der Exons des caninen SGCG
Gens
Sequenz TM Länge
TCT CTC TCA CTC TAT CTC
AAA GCA AAC AAA CCC CAA C
TTC TTA GGT CAT GGT GGG
CCT TGT AGC CAA GCT TTT
TCT TCC TGG ACT CCT GAC C
TCC CCA TGG AAC AAT TAC A
GGT ATT GCT GGG TGA TAT G
CTG TGT GTG GTG ATT GAT G
CCA CAA GTT CTA AAT CTA C
GAC TGC TAA GAT ATT ATT CC
CAC ATT ATT TCT GGA TTT GTC
TTC TGG ACC TGA AGT TTC
TTC TAT GCA GAA AGA AAC C
TTG TCC TAG CTG AAC CTT
51 °C 523 bp
54 °C 529 bp
54 °C 384 bp
56 °C 359 bp
51 °C 254 bp
52 °C 561 bp
52 °C 1000 bp
10.3 Primer für die humanen genomischen Sonden für Exon 1 und Exon 8
Primer Sequenz TM
SG 1.Exon-Mensch_fw TGT GTC CTG GAA TTG GTG 54 °C
SG 1.Exon-Mensch_rev AAG AAA AGC ACA CTG GCG 54 °C
SG 8.Exon-Mensch_fw TCT TCG TCT CCC ATC TTC 52 °C
SG 8.Exon-Mensch_rev GCG TTT ACT TCC CAT CC 52 °C

10.4 Sequenzprimer: IRD 800 markiert
Primer
104
Orientierung Sequenz TM
SG 1 - GCA GAA GGC ATG AGG GAG 58
SG 2 - TTA GCA TAA TTA GTA CAG AAC C 53
SG 3 + ACC TCT CTG GTT CTT CAC C 57
SG 4 + CAC CTG TCT TCC CAT AAT CC 57
SG 7/8 + TTC CTA GCT CAA CTA GCA C 55
SG Exon 6 - AAA TGG AAG GTG GTG ATG G 55
SG Exon 7/1 + CTA GAA GAA AAT GCT ATT TGT G 53
SG Exon 7/2 + TAG TTT CTA TAC AAA TCC ATT C 51
SG Exon 8.1 - CCT TGA CAA CAC TGA AAT TCA 57
SG 85 + CAT TTA ACC GTA GTT GGC TG 56
SG 86 + ACA CTT CAG TTT GGA GAA GG 56
SG Intr. 7/8 - CAT CAT TAG CTA CCA TTT CC 54
SG Intr. 6/7 a - TCT GGT CAA GAC AGA TGA G 55
SG Intr. 6/7 b + GGG GTA GAT ATT TAA CTA GC 54

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
CONRAD, K., A. DEPPE, S. NEUMANN, M. BREEN, P. QUIGNON, C. ANDRÉ, B. BRENIG, T.
LEEB: Characterization and chromosomal assignment of the canine γ-sarcoglycan gene
(SGCG) to CFA 25q21-23. Zur Veröffentlichung angenommen bei Cytogenet. Cell Genet.

Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1998 bis August 2001 in der Abteilung
Molekularbiologie des Tierärztlichen Institutes der Universität Göttingen angefertigt.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Tosso Leeb für die Überlassung des Themas und die
wissenschaftliche Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig möchte ich für die fachliche Beratung und die ausgezeichneten
Arbeitsbedingungen im Labor danken.
Alex Deppe gilt mein Dank für die nervenraubenden Sequenzierarbeiten, das endlose Radiogedudel
und Handyklingeln.
Ein großes Dankeschön auch an Sonja Kierstein für die unendliche Geduld bei allen Fragen
und für die Durchsicht des Manuskripts.
Ferner möchte ich mich bei der gesamten Labormannschaft, besonders bei Christoph, Brigitte,
Gerold, Ulli, Reza, Fr. Friedrichs, Marcello und Kirsten, bedanken, die mich mit super
Arbeitsatmosphäre, aufbauenden Worten, leckeren Keksen und zuverlässiger Hilfe durch die
drei Jahre begleitet haben.
Auch dem Team der Kleintierklinik mit allen Azubis, Helferinnen, Tierärzten und Hunden,
besonders aber Herrn Dr. Stephan Neumann, gilt mein Dank. Ohne den Bezug zum
wirklichen Leben als Tierarzt hätte ich die drei Jahren sicher nicht durchgehalten. In der
Klinik habe ich alles das gelernt, was ich für meine berufliche Zukunft brauche.
Meinen Mitdoktoranden Uta, Schorse und Bettina danke ich für das anregende Miteinander.
Die Nächte mit den Magendrehungen im OP waren doch eigentlich immer eine willkommene
Abwechslung.
Außerdem möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir Studium und Dissertation
ermöglicht haben, und bei meinem Snuckel für die Liebe, Geduld und Motivation und nächtelange
Hilfe am Computer in der heißen Phase.