Antibacterial Effect of Fatty Acid Extracted from Coconut Oil ... - CRDC

Agricultural Sci. J. 42(2)(Suppl.): 373-376 (2011) ว. วิทย์. กษ. 42(2)(พิเศษ): 373-376 (2554)ประสิทธิภาพของกรดไขมันสกัดจากนํามันมะพร้าวที มีต่อการยับยังการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคทางอาหารAntibacterial Effect of Fatty Acid Extracted from Coconut Oil Against Food-borne Bacterial Pathogensนันทิดา บรรณสาร 1 อุมาพร ทาไธสง 2 วิชมณี ยืนยงพุทธกาล 1 และ สิริมา ชินสาร 1Bannasan, N. 1 , Thathaisong, U. 2 , Yuenyongputtakal, W. 1 and Chinnasarn, S. 1AbstractThe aim of this study was to test antibacterial activity of fatty acid extracted from cold-pressand hot-press coconut oils by saponification reaction in growth inhibition of some food-borne bacterialpathogens including Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Vibrioparahaemolyticus, Escherichia coli and Salmonella Typhimurium by disc diffusion method. Resultsshowed that fatty acid extracted from both coconut oils could inhibit the growth of S. aureus, B. subtilis,B. cereus and V. parahaemolyticus (20 µl/disc (50% v/v)) with 7-10 mm in diameter of inhibition zone.Then, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by agar dilution method. Resultsrevealed that MIC of fatty acid extracted from both coconut oils against S. aureus and V.parahaemolyticus was 0.039% v/v whereas it was 0.019% v/v for B. cereus. In addition, MIC of fattyacid extracted from cold-press and hot-press coconut oils against B. subtilis was 0.019% v/v and0.039% v/v, respectively.คําสําคัญ: fatty acid, food-borne bacterial pathogens, antibacterial activityบทคัดย่องานวิจัยนี เป็ นการทดสอบประสิทธิภาพของกรดไขมันทีสกัดจากนํ ามันมะพร้ าวชนิดบีบเย็นและบีบร้ อนด้ วยปฏิกิริ ยา saponification ต่อการยับยั งการเจริ ญของแบคทีเรี ยก่อโรคทางอาหารบางชนิด ได้ แก่Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coliและ Salmonella Typhimurium ด้วยวิธี disc diffusion พบว่ากรดไขมันทีสกัดจากนํ ามันมะพร้ าวบีบเย็นและบีบร้ อน (20 ไมโครลิตรต่อดิสก์ (50% v/v)) สามารถยับยั ง S. aureus, B. subtilis, B. cereus และ V.parahaemolyticus ได้ โดยมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ Inhibition zone อยู ่ระหว่าง 7 ถึง 10 มิลลิเมตร เมือทําการทดสอบหาค่า Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ด้วยวิธี agar dilution พบว่า ค่า MIC ของกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้ าวบีบเย็นและบีบร้ อนต่อ S. aureus และ V. parahaemolyticus เท่ากับ 0.039% v/v ส่วนB. cereus เท่ากับ 0.019% v/v และค่า MIC ของกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้ าวบีบเย็นและบีบร้ อนต่อ B. subtilisเท่ากับ 0.019% v/v และ 0.039% v/v ตามลําดับคําสําคัญ: กรดไขมัน แบคทีเรียก่อโรคทางอาหาร ฤทธิ ยับยั งแบคทีเรียคํานํานํ ามันมะพร้าวเป็ นนํ ามันทีอุดมไปด้วยกรดไขมันขนาดกลาง (medium chain fatty acids หรือ MCFA) ทีดีต่อระบบการย่อยอาหาร ซึงเป็ นกรดไขมันทีอิมตัวกว่า 90 % (Marina และคณะ, 2009) กรดไขมันอิมตัวในนํ ามันมะพร้าวส่วนใหญ่ มีจํานวนอะตอมของคาร์บอน 8 – 14 ตัว กรดไขมันทีสําคัญได้แก่ caprylic acid, carpic acid, lauric acidและmyristic acid นอกจากนี นํ ามันมะพร้าวบริสุทธิ ยังประกอบไปด้วยกรดไขมันไม่อิมตัว (unsaturated fatty acid) 9 % ซึง1ภาควิชาวิทยาศาสตร์การอาหาร คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา ต. แสนสุข อ. เมือง จ. ชลบุรี 201311Department of Food Science, Faculty of Science, Burapha University, Sansuk, MungChonburi, Chon Buri, 201312ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา ต. แสนสุข อ. เมือง จ. ชลบุรี 201312Department of Microbiology, Faculty of Science, Burapha University, Sansuk, MungChonburi, Chon Buri, 20131

374 6 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตรแบ่งเป็ น 2 ประเภท คือ กรดไขมันไม่อิมตัวเชิงเดียว (mono unsaturated fatty acid) และกรดไขมันไม่อิมตัวเชิงซ้อน(polyunsaturated fatty acid) ได้แก่ กรดลิโนเลอิก (linoleic acid, C18) 2.3% และ กรดโอเลอิก (Oleic acid, C18) ซึงมีรายงานการศึกษาในปี 1970 ว่ากรดไขมันขนาดกลางสามารถยับยั งจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารได้ คือ Aspergillus niger,Candida utilis และ Saccharomyces cerevisiae โดยทําการเปรียบเทียบกับสารกันเสียทีใช้ในอุตสาหกรรมและมีขายทัวไปตามท้องตลาด พบว่าปริมาณทีน้อยทีสุดของ monolaurin และ monocaprin มีปริมาณใกล้เคียงหรือน้อยกว่าสารกันเสียทีใช้อยู ่โดยทัวไป (Kabara, 2000) ต่อมาได้มีผู ้ทําการศึกษาค้นคว้าพบว่า caprylic acid, carpic acid และ lauricacid ถูกนํามาทดลองเพือยับยั งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์โดยใช้ในลักษณะต่างๆ เช่น ใช้เติมลงไปในอาหารโดยตรง ใช้เป็ นส่วนผสมในบรรจุภัณฑ์ และใช้เป็ นสารตั งต้นในการทํานํ ายาทําความสะอาด ส่วน myristic acid ถูกใช้ในทางการแพทย์โดยอยู ่ในรูปของ myristylamine เพือใช้ฆ่าเชื อ Staphylococcus aureus ทีดื อยาเนืองจากประสิทธิภาพในการยับยั งเชื อจุลินทรีย์ ของกรดไขมันขนาดกลางมีประสิทธิภาพดี และพบในนํ ามันมะพร้าวเป็ นปริมาณมากโดยเฉพาะ lauric acid ดังนั นงานวิจัยนี จึงสนใจศึกษาประสิทธิภาพของกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้าวในการยับยั งเชื อจุลินทรีย์ทีก่อให้เกิดโรคในอาหารอุปกรณ์และวิธีการการสกัดกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้าว: นํ ามันมะพร้าวทีนํามาทําการทดลองมี 2 ชนิดคือ นํ ามันมะพร้าวชนิดบีบร้อน ซึงได้จากการสกัดโดยให้ความร้อน และนํ ามันมะพร้าวชนิดบีบเย็นโดยใช้ Lactobacillus plantarum ในการหมักกะทิจากนั นนํานํ ามันมะพร้าวมาทําการสกัดกรดไขมันด้วยใช้ปฏิกิริยา saponification (ปิ ยวรรณ, 2548) โดยนําโซเดียมไฮดรอกไซด์ 50 กรัม นํ า 1200 กรัม และนํ ามันมะพร้าว 350 กรัม ให้ความร้อนและกวนตลอดเวลา จนกว่าสารละลายจะใส ตั งทิ งไว้ให้เย็น เติมกรดไฮโดรคลอลิกเข้มข้นประมาณ 250 กรัม กวนสารละลายจนกว่าสารละลายจะแยกชั นและใส แยกสารทีอยู ่ชั นบนออกมา จากนั นล้างสารด้วยนํ ากลันจนกว่านํ าทีล้างละมีค่าเป็ นกลาง ทําการระเหยนํ าทีเหลือจากการล้างด้วยการให้ความร้อนตํา และทําการเก็บใส่ภาชนะทีมิดชิดเชื อแบคทีเรียทีใช้ในการทดสอบ: เชื อแบคทีเรียทีใช้ในการทดสอบทั งหมด 6 ชนิด ได้แก่ Staphylococcusaureus, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus และ Vibrioparahaemolyticus ซึงได้รับความอนุเคราะห์จากภาควิชาจุลชีววิทยา มหาวิทยาลัยบูรพา นําเชื อทีทดสอบมาทําการ steakลงบน Nutrient Agar (NA) นําไปบ่มทีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชัวโมง จากนั นใช้ลูปเขียโคโลนีเดียวของเชื อแต่ละชนิดจํานวน 4-6 โคโลนี ลงในอาหาร Tryptic soy broth (TSB) บ่มที 37 องศาเซลเซียสเป็ นเวลา 4 ชัวโมง นํามาทําการปรับให้ได้ความเข้มข้นเท่ากับ McFarland เบอร์ 0.5 (มีจํานวนเชื อประมาณ 1.5x10 6 cfu/ml)การทดสอบประสิทธิภาพของกรดไขมันสกัดจากนํ ามันมะพร้าวด้วยวิธี Disc diffusion (Collins, Lyne, Grangeและ Falkinham, 2004) ทําได้โดยนําไม้พันสําลีทีฆ่าเชื อแล้วจุ ่มเชื อทีเตรียมไว้ แล้วนํามาป้ ายลงบน Muller-Hinton Agar(MHA)ให้ทัว จากนั นทําการวางดิสก์ทีหยดกรดไขมันทีมีความเข้มข้น 50% v/v ปริมาตร 20 ไมโครลิตรต่อดิสก์ และวางดิสก์ยา Tetracycline ความเข้มข้น 30 ไมโครกรัมต่อดิสก์เพือเป็ น positive control และดิสก์บรรจุ DMSO เป็ น negative controlจากนั นนําจานเพาะเชื อไปบ่มที 37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 24 ชัวโมง แล้ววัดขนาด Inhibition zone ทําการทดลองทังหมด3 ซํ าการทดสอบหาค่า Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ด้วยวิธี agar dilution โดยทําการเจือจางกรดไขมัน ด้วย DMSO ให้มีความเข้มข้น 75%, 60%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.563%, 0.782%, 0.390% และ0.195% (v/v) ผสมกรดไขมันแต่ละความเข้มข้นปริมาตร 1 มิลลิลิตร กับ Muller-Hinton Agar หลอมเหลว 19 มิลลิลิตรแล้วเทลงในจานเพาะเชื อ จะได้ความเข้มข้นสุดท้ายเป็ น 3.75%, 3.0%, 2.5%, 1.25%, 0.625%, 0.3125%, 0.1563%,0.078%, 0.039%, 0.019% และ 0.01% (v/v) ตามลําดับ นําเชื อทีปรับความเข้มข้นให้ได้ประมาณ 10 6 cfu/ml ปริมาตร 10ไมโครลิตร (มีเชื อ ประมาณ 10 4 cfu) หยดลงบนอาหารทีผสมกรดไขมันทีความเข้มข้นต่างๆ และชุดควบคุม (Tetracyclineและ DMSO) จากนั นนําไปบ่มที 37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 24 ชัวโมง ทําการอ่านผล ทําการทดลองทั งหมด 3 ซํ าผลและวิจารณ์ผลการทดลองจากการทดสอบประสิทธิภาพของกรดไขมันทีสกัดจากนํ ามันมะพร้าวบีบร้อนและบีบเย็น ในการยับยั งแบคทีเรียก่อโรคทางอาหารจํานวน 6 ชนิด ด้วยวิธี disc diffusion ที พบว่าทีความเข้มข้นของกรดไขมัน 50% v/v ปริมาตร 20

ว. วิทยาศาสตร์เกษตร ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 375ไมโครกรัมต่อดิสก์ สามารถยับยั งเชื อแบทีเรียก่อโรคทางอาหารบางนิด ซึงได้แก่ S. aureus, B. subtilis, B. cereus และV. parahaemo -lyticus โดยมีขนาด inhibition zone อยู ่ระหว่าง 7-10 มิลลิเมตร แต่ไม่สามารถยับยั งการเจริญของ S.Typhimurium และ E. coli ได้ ดังแสดงไว้ใน Table 1Table 1 Inhibition zone of food-born pathogen by 50% fatty acid extract from coconut oil.Diameter of Inhibition zone (mm.)(+SD)BacteriaFHP50% v/v 20 µl/discFCP50% v/v 20 µl/discTetracycline30 µg/discDMSO20 µg/discStaphylococcus aureus 10.00+0.00 10.00+0.00 26.73+0.40 NZSalmonella Typhimurium NZ NZ 25.00+0.00 NZEscherichia coli NZ NZ 20.10+0.10 NZBacillus subtilis 7.00+0.01 7.00+0.01 20.01+0.17 NZBacillus cereus 9.99+0.17 10.01+0.01 30.01+0.38 NZVibrio parahaemolyticus 9.99+0.01 9.99+0.23 29.99+0.17 NZFHP: Fatty acids extracted from hot-press coconut oilsFCP: Fatty acids extracted from cold-press coconut oilsNZ : Non inhibition ZoneTable 2 MIC of Fatty acid from coconut oil against 6 food-borne pathogens.MIC (% v/v)BacteriaFHPFCPStaphylococcus aureus 0.039 0.039Salmonella Typhimurium >3 >3Escherichia coli >3 >3Bacillu subtilis 0.039 0.019Bacillus cereus 0.019 0.019Vibrio parahaemolyticus 0.039 0.039FHP: Fatty acids extracted from hot-press coconut oilsFCP: Fatty acids extracted from cold-press coconut oilsเมือทําการทดสอบหาค่า MIC ทีระดับความเข้มข้นต่างๆ ของกรดไขมันทั งสกัดนํ ามันมะพร้าวบีบร้อนและนํ ามันมะพร้าวบีบเย็นมีประสิทธิภาพในการยับยั ง B. cereus ได้ดีทีสุด รองลงมาคือ S. aureus และ V. parahaemolyticus โดยมีค่า MICเท่ากับ 0.019 % v/v และ 0.039 % v/v ตามลําดับ ส่วนค่า MIC ของกรดไขมันชนิดบีบร้อนและบีบเย็นต่อ B.subtilis เท่ากับ 0.039 และ 0.019 % v/v ตามลําดับ ดังแสดงไว้ใน Table 2 ซึงรายงานก่อนหน้านี พบว่ากรดไขมันอิมตัวทีมีคาร์บอนอะตอมตั งแต่ 6-12 อะตอม สามารถยับยั งแบคทีเรียแกรมบวกได้ดี (Kabara, 1978) ซึงพบมากในกรดไขมันทีสกัดได้จากนํ ามันมะพร้าว นอกจากนี กรดไขมันยังสามารถยับยั ง S. Typhimurium และ E. coli แต่ต้องใช้ในปริมาณทีสูงขึ นจึงจะสามารถยับยั งการเจริญได้ จะเห็นได้ว่าแบคทีเรียแกรมบวกจะมีความไวต่อกรดไขมันมากกว่าแบคทีเรียแกรมลบเนืองจาก แบคทีเรียแกรมลบจะมีผนังเซลล์ด้านนอก ( outer membrane) ซึงเป็ นสารประกอบในกลุ ่มLipopolysaccharide จึงทําให้เซลล์แบคทีเรียแกรมลบมีความแข็งแรงมากกว่าแบคทีเรียแกรมบวก (ปทุม, 2550) ซึงกรดไขมันส่วนมากทีสามารถยับยั งแบคทีเรียแกรมลบจะเป็ นกรดไขมันไม่อิมตัวสายยาว (long-chain unsaturated fatty acid)เช่น Oleic acid, Palmitoleic acid และ Linoleic acid แต่โดยส่วนมากกรดไขมันจะมีความไวต่อแบคทีเรียแกรมลบใน

374 376 6 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตรระดับตํา นอกจากนี แบคทีเรียแกรมลบเช่น E. coli และ Salmonella spp. บางสายพันธุ ์ต้านทานต่อ antibacterial lipidsจากธรรมชาติ (Thormar และ Hilmarsson, 2007)สรุปผลการทดสอบประสิทธิภาพของกรดไขมันสกัดจากนํ ามันมะพร้าวบีบร้อนและนํ ามันมะพร้าวบีบเย็นในการยับยั งเชื อแบคทีเรียก่อโรคทางอาหาร กรดไขมันทั งสองชนิดสามารถยับยั งเชื อแบคทีเรียก่อโรคทีนํามาทดสอบมีประสิทธิภาพไม่แตกต่างกัน โดยมี ค่า MIC ของกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้าวบีบเย็นและบีบร้อนต่อ E. coli และ S. Typhimuriumน้อยกว่า 3% v/v ต่อ S. aureus และ V. parahaemolyticus เท่ากับ 0.039% v/v ส่วน B. cereus เท่ากับ 0.019%v/v ยกเว้นค่า MIC ของกรดไขมันจากนํ ามันมะพร้าวบีบเย็นและบีบร้อนต่อ B. subtilis เท่ากับ 0.019% v/v และ0.039% v/v ตามลําดับเอกสารอ้างอิงปิ ยวรรณ กฤชเศรษฐสกุล, 2548, การสังเคราะห์กรดไขมันจานํ ามันปาล์มดิบด้วยโซดาไฟ, วิทยานิพนธ์การศึกษามหาบัณฑิตสาขาวิชาวิศวกรรมเคมี, วิศวกรรมศาสตร์, จุฬาลงกรณ์ มหาวิทยาลัย, 74 หน้าปทุม อรุณวัชรินทร์, 2550, การยับยั งจุลินทรีย์ก่อโรคและจุลินทรีย์ทีทําให้อาหารเน่าเสียของนํ ามันหอมระเหยจากสมุนไพรไทย,การประชุมทางวิชาการ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, 45: 508-515Collin, C.H., Lyne, P.M., Grang, J.M. and Falkinham, J.O., 2004, Collins and Lyne’s Microbiological methods,London: Arnold.Kabara, J.J., 1978, Fatty Acids and Derivative as Antimicrobial Agents, The American Oil Chemists’ Society.Champaign, IL, USA, 1-14.Kabara, J.J., 2000, Health Oils the Tree of life (Nutritional and health aspects of coconut oil)[Online],Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/medline [January 12, 2010] .Thormar, H. and Hilmarsson, H., 2007, The Role of Microbicidal Lipids in Host Defense Against Pathogens andtheir Potential as Therapeutic Agents, Chemistry and Physics of lipids, 150: 1-11.