噬菌体phi29 DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及 ... - 生命科学

1124生 命 科 学第 23 卷换 到 正 电 位 即 导 致 双 链 DNA 转 运 停 止 ( 图 7G)。 同样 的 结 果 在 不 同 的 电 压 下 也 得 到 证 实 。4.3 多 通 道 条 件 下 定 量 分 析 DNA 转 运 频 率 所 检 测到 的 双 链 DNA 单 向 转 运由 于 双 链 DNA 只 从 一 个 方 向 穿 过 连 接 器 通 道 ,因 此 DNA 通 过 含 有 多 通 道 脂 双 层 的 转 运 率 会 受 到连 接 器 取 向 不 同 组 合 的 影 响 , 而 与 DNA 浓 度 无 关 。因 此 , 使 用 不 同 浓 度 的 双 链 DNA 在 -75 mV 恒 定 电位 下 进 行 了 实 验 ( 图 8)。 多 个 连 接 器 嵌 入 的 电 流 痕迹 反 映 了 DNA 转 运 事 件 频 率 的 变 化 ( 图 8 中 直 方图 展 示 )。 当 另 外 一 个 连 接 器 以 适 合 DNA 转 运 的 方向 嵌 入 时 ,DNA 转 运 频 率 便 会 增 加 ( 图 8A、C、D)。当 另 外 一 个 连 接 器 以 阻 碍 DNA 转 运 的 方 向 嵌 入 时 ,DNA 转 运 频 率 便 会 不 变 ( 图 8A、B)。4.4 使 用 靶 向 碳 端 — 多 聚 组 氨 酸 标 签 的 Ni-NTA 纳米 金 粒 子 来 检 测 连 接 器 的 取 向为 了 揭 示 连 接 器 在 脂 双 层 中 的 取 向 , 使 用 了 在连 接 器 宽 出 口 每 个 亚 基 碳 端 包 含 一 个 多 聚 组 氨 酸 标签 重 新 设 计 的 连 接 器 。 导 入 的 碳 端 多 聚 组 氨 酸 标 记并 不 影 响 连 接 器 通 道 的 折 叠 和 DNA 包 装 活 性 。 在不 对 称 离 子 条 件 下 , 进 行 了 电 导 实 验 ( 图 9) [49] 。 使用 1.8 nm 的 Ni-NTA 金 粒 子 来 结 合 碳 端 的 多 聚 组 氨酸 标 记 。 实 验 设 计 中 , 仅 在 腔 室 的 一 侧 将 纳 米 金 与溶 液 混 合 。 例 如 , 在 单 个 或 多 个 连 接 器 通 道 嵌 入 的条 件 下 , 如 果 纳 米 金 仅 在 反 式 腔 室 内 ( 图 9), 那 么其 仅 与 多 聚 组 氨 酸 标 记 的 碳 端 朝 向 反 式 腔 室 的 连 接器 结 合 ( 图 9C), 并 且 不 与 氮 端 朝 向 反 式 腔 室 的 连接 器 结 合 ( 图 9A)。 在 含 有 纳 米 金 的 条 件 下 , 在 一个 单 一 连 接 器 具 有 合 适 取 向 的 情 况 下 , 可 以 观 测 到该 连 接 器 电 导 的 逐 步 阻 塞 ( 图 9D)。 每 一 个 纳 米 金结 合 导 致 均 一 的 约 30% 的 电 流 阻 塞 ( 图 9D) ; 在 膜内 具 有 多 通 道 的 情 况 下 , 也 得 到 相 同 的 结 果 ( 数 据未 显 示 )。DNA 带 负 电 的 磷 酸 盐 骨 架 使 其 仅 从 负 电 势 转运 到 正 电 势 , 所 以 在 两 侧 腔 室 内 加 入 相 同 浓 度 的 双链 DNA, 以 协 助 检 测 DNA 转 运 方 向 的 评 估 。 根 据施 加 电 压 前 , 不 同 浓 度 的 DNA 预 先 混 合 在 两 个 腔 室 。 插 图 : 对 于 单 个 实 验 (A~D), 每 一 个 连 接 器 嵌 入 脂 双 层 后 ,DNA 转 运 速率 已 经 标 出 。 图 片 来 自 文 献 [44]。图 8 在 多 通 道 条 件 下 定 量 分 析 DNA 转 运 频 率 与 脂 双 层 中 连 接 器 取 向 的 关 系 , 验 证 双 链 DNA 单 向 转 运