噬菌体phi29 DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及 ... - 生命科学

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1117A, 包 含 连 接 器 的 巨 脂 质 体 (~ 50 μm) 的 荧 光 图 像 :(i)NBD-PE 标 记 的 脂 质 体 , 不 含 连 接 器 ;(ii) 含 有 FITC 标 记 的 连 接 器 的 蛋 白脂 质 体 ;(iii)FITC 标 记 连 接 器 与 脂 质 体 非 特 异 性 的 混 合 。B, 膜 过 滤 分 离 掉 大 部 分 游 离 的 连 接 器 。C, 使 用 蔗 糖 梯 度 沉 淀 分离 脂 质 体 / FITC 标 记 连 接 器 复 合 物 。 游 离 的 连 接 部 位 出 现 在 顶 部 , 而 在 蛋 白 脂 质 体 保 持 在 底 部 。 馏 分 #1-12 未 显 示 。D, 荧光 漂 白 恢 复 (FRAP) 实 验 证 实 荧 光 ( 红 色 ) 标 记 脂 双 层 的 流 动 性 , 漂 白 区 域 ( 黑 色 ) 的 荧 光 强 度 由 于 脂 质 扩 散 随 时 间 推 移 而 逐 渐 增加 。E, 通 过 囊 泡 融 合 , 连 接 器 嵌 入 到 平 面 脂 双 层 的 示 意 图 。 图 片 引 自 文 献 [42]。图 2 连 接 器 - 脂 质 体 嵌 合 体 的 图 像上 述 实 验 并 不 能 区 分 连 接 器 蛋 白 在 膜 表 面 简 单附 着 , 或 是 嵌 入 膜 内 形 成 一 个 通 道 。 蛋 白 通 道 是 否嵌 入 脂 质 体 膜 内 , 将 由 下 一 节 所 述 的 单 通 道 电 导 检测 方 法 确 认 。2 单 通 道 电 生 理 检 测 phi29 连 接 器 蛋 白 通 道2.1 连 接 器 蛋 白 嵌 入 平 面 脂 双 层用 于 单 通 道 电 生 理 测 量 的 装 置 , 由 水 平 脂 双 层腔 以 及 带 有 一 个 直 径 100~200 μm 孔 的 聚 四 氟 乙 烯薄 膜 组 成 。 该 膜 将 腔 分 为 顺 式 腔 室 ( 上 腔 ,250 μL容 量 ) 和 反 式 腔 室 ( 下 腔 ,2.5 mL 容 量 ) 两 部 分 。将 稀 释 的 连 接 器 蛋 白 脂 质 体 直 接 加 入 顺 式 腔 室 , 并等 待 嵌 入 脂 双 层 膜 。 电 流 放 大 器 的 首 级 信 号 采 集 片上 直 接 连 接 有 一 对 银 / 氯 化 银 电 极 , 用 于 测 量 通 过双 层 类 脂 膜 的 电 流 。 该 电 流 用 膜 片 钳 放 大 器 与 模 拟数 字 转 换 器 耦 合 。 数 据 由 软 件 收 集 并 分 析 。将 连 接 器 蛋 白 直 接 加 入 平 面 脂 质 双 层 , 或 将 脂质 体 加 入 平 面 脂 质 双 层 , 并 不 能 在 双 层 膜 上 形 成 通道 ( 图 3A)。 只 有 将 带 有 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 体 与 脂双 层 融 合 后 , 才 能 观 测 到 通 道 嵌 入 ( 原 理 见 图 2E)。如 连 续 电 流 跟 踪 ( 图 3B) 所 示 , 通 道 嵌 入 具 体 表 现为 电 导 的 分 步 增 加 ( 每 一 步 代 表 一 个 蛋 白 通 道 嵌入 )。 在 施 加 正 电 或 施 加 负 电 情 况 下 , 嵌 入 均 可 发生 ( 图 3C)。 嵌 入 到 膜 内 的 蛋 白 通 道 数 量 可 以 简 单地 通 过 电 流 增 加 步 数 来 计 算 。一 系 列 多 种 溶 液 条 件 下 的 实 验 证 实 , 每 个 蛋 白通 道 嵌 入 引 发 的 电 流 几 乎 完 全 相 同 ( 图 3E), 形 成一 个 较 窄 、 锋 利 的 高 斯 分 布 。 例 如 在 -75 mV、5mmol/L Tris、pH 值 7.9、1 mol/L 氯 化 钠 的 条 件 下 ,一 个 蛋 白 通 道 在 脂 双 层 膜 的 插 入 增 加 约 220 pA 的电 流 ( 相 当 于 ~3 nS)。 有 时 可 以 观 测 到 单 步 嵌 入 2个 和 3 个 蛋 白 通 道 , 其 几 率 大 约 分 别 为 5% 和 2%。2.2 单 一 ( 或 多 个 ) 蛋 白 通 道 的 电 流 电 压 关 系对 含 有 一 个 或 者 多 个 连 接 器 的 脂 双 层 膜 施 加 一个 从 -100 mV 到 +100 mV 的 斜 坡 电 压 (2.2 mV/s),电 流 - 电 压 曲 线 显 示 良 好 的 线 性 关 系 , 从 而 展 示了 该 通 道 性 能 稳 定 且 电 导 一 致 。 图 3D 展 示 了 在5 mmol/L Trips、2 mol/L 氯 化 钠 (pH 7.8) 溶 液 中 ,1个 、2 个 、3 个 连 接 器 嵌 入 的 电 流 轨 迹 。 连 接 器 增加 的 数 目 与 斜 率 的 增 加 相 关 , 但 每 个 通 道 的 电 导 相同 , 这 进 一 步 表 明 了 phi29 连 接 器 通 道 在 脂 双 层 膜中 的 统 一 尺 寸 和 稳 定 性 。除 连 接 器 通 道 的 数 量 , 电 导 还 取 决 于 离 子 浓 度和 离 子 种 类 ( 图 4)。 从 电 流 - 电 压 曲 线 中 可 以 得 出 ,在 0.5 、1.0 、1.5 和 2.0 mol/L 氯 化 钠 中 , 电 导 分 别测 定 为 1.75 ± 0.11 nS、3.03 ± 0.02 nS、4.07 ± 0.26