第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1121表 2 GP-10 连 接 器 和 α- 溶 血 素 的 单 通 道 电 导 的 比 较蛋 白 质 孔 直 径 (nm) 截 面 积 (nm 2 ) 电 导 (nS/ 孔 ) a0.5 mol/L 氯 化 钠 1 mol/L 氯 化 钾连 接 器 3.6 10.2 1.57 ± 0.16 4.84 ± 0.15α- 溶 血 素 1.5 [48] 1.8 0.31 ± 0.05 b 0.94 ± 0.01 c比 值 ( 连 接 器 /α-HL) 2.4 5.7 5.1 5.1a0.5 mol/L 氯 化 钠 及 1 mol/L 氯 化 钾 中 的 连 接 器 电 导 的 数 据 分 别 来 自 总 计 38 和 36 个 实 验 。0.5 mol/L 氯 化 钠 及 1 mol/L 氯 化 钾 中 的连 接 器 电 导 的 数 据 分 别 来 自 总 计 4 个 实 验 。b据 报 道 , 在 1 mol/L 氯 化 钠 条 件 下 ,α-HL 的 电 导 为 0.68 nS/ 孔 [66] 。c[67]据 报 道 , 在 1 mol/L 氯 化 钾 条 件 下 ,α-HL 的 电 导 为 0.80 nS/ 孔 或 1.0 nS/ 孔 [29] 。后 , 可 以 观 测 到 大 量 的 DNA 转 运 事 件 , 表 明 phi29通 道 仅 能 转 运 线 性 双 链 DNA( 图 5A、C、D)。在 多 个 通 道 存 在 的 情 况 下 , 偶 尔 可 以 观 测 到 一个 或 多 个 平 台 的 阻 断 事 件 , 显 示 了 通 过 多 个 通 道 的同 时 转 运 。 观 测 中 , 阻 断 事 件 的 发 生 概 率 随 DNA浓 度 增 加 及 电 压 升 高 而 增 长 , 这 与 预 期 相 符 。3.2 DNA 电 流 阻 断 事 件 的 表 征单 个 通 道 阻 断 事 件 的 一 个 参 数 为 电 流 阻 断 的 深度 , 使 用 电 流 阻 断 百 分 比 来 表 示 , 计 算 方 法 如 下 :DNA 转 运 产 生 的 电 流 阻 碍 除 以 单 个 连 接 器 嵌 入 所 产生 电 流 的 步 幅 。 在 双 链 DNA 存 在 的 情 况 下 , 通 道阻 断 的 中 值 为 ~32% ( 图 6A), 这 与 通 道 ( 最 窄 处 3.6nm) 和 双 链 DNA ( 直 径 ~2 nm) 的 尺 寸 相 一 致 。 也 就是 说 , 阻 断 % =[π·(2÷2) 2 /π·(3.6÷2) 2 ]×100。 此 外 ,观 察 到 的 每 一 个 瞬 间 电 流 阻 断 事 件 几 乎 相 同 , 呈 较窄 的 高 斯 分 布 ( 图 6A)。另 一 个 DNA 转 运 事 件 的 参 数 是 驻 留 时 间 (τp),它 代 表 DNA 通 过 通 道 转 运 所 需 的 时 间 ( 图 6B)。 驻留 时 间 分 布 呈 指 数 衰 减 函 数 。 峰 值 驻 留 时 间 代 表 最有 可 能 的 转 运 持 续 时 间 。 例 如 , 在 -75 mV 和 -40mV 下 ,5 kb 的 双 链 DNA 峰 值 驻 留 时 间 分 别 为 9.2ms 和 22.1 ms, 证 明 了 DNA 转 运 驻 留 时 间 受 到 外加 电 压 的 影 响 。 此 外 , 如 图 6B 所 示 ,35 bp 和 5 kb的 双 链 DNA 的 驻 留 时 间 相 比 , 长 度 较 短 的 DNA具 有 较 短 的 驻 留 时 间 。3.3 pH 值 对 连 接 器 通 道 稳 定 性 和 转 运 行 为 的 影 响在 极 端 pH 值 条 件 下 , 在 两 个 腔 室 加 入 20 bp的 双 链 DNA, 对 连 接 器 通 道 的 稳 定 性 进 行 了 测 试 。在 1mol/L NaCl 溶 液 中 , 在 不 同 pH 值 条 件 下 , 纪录 恒 定 电 压 下 的 电 流 踪 迹 。 电 导 值 分 别 为 :pH = 2(5 mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 ) 时 为 2.50 ± 0.11 nS (6 例 ),pH = 7 (5 mmol/L Na 2 HPO 4 缓 冲 液 ) 时 为 2.73 ± 0.07nS (6 例 ),pH = 12 (5 mmol/L Na 2 HPO 4·7H 2 O 缓 冲 )时 为 2.78 ± 0.12 nS。 极 端 pH 下 的 通 道 仍 然 打 开 ,并 且 具 有 一 致 的 通 道 电 导 。 此 外 , 也 观 测 到 了 DNA转 运 事 件 。 在 pH = 2 时 , 嘌 呤 酸 形 成 , 导 致 较 短 阻断 事 件 的 发 生 。 虽 然 DNA 的 结 构 受 到 极 端 pH 条件 的 影 响 , 但 phi29 连 接 器 通 道 在 强 酸 性 或 碱 性 条件 下 仍 然 稳 定 。3.4 电 流 信 号 中 可 能 的 信 号 失 真随 机 噪 声 可 能 产 生 失 真 。 连 接 器 通 道 本 身 非 常稳 定 , 其 电 导 均 一 , 且 在 -150 mV 到 +150 mV 范围 内 不 显 示 电 压 门 控 。 有 时 能 观 测 到 与 采 样 频 率 极限 时 间 接 近 的 非 特 异 性 阻 断 事 件 。 因 为 在 未 加 入DNA 时 , 这 些 事 件 也 同 样 出 现 , 因 此 归 因 于 包 含连 接 器 的 脂 质 体 与 平 面 脂 双 层 膜 相 互 作 用 的 结 果 。此 外 , 在 向 腔 室 中 加 入 更 多 脂 质 体 后 其 出 现 频 率 增加 。 可 以 通 过 稀 释 含 有 连 接 器 的 脂 质 体 来 减 小 此 类事 件 的 发 生 。DNA 也 可 与 通 道 碰 撞 , 而 实 际 上 不 被 转 运 通过 。 这 也 增 加 了 非 特 异 性 阻 断 事 件 。 较 长 的 DNA尤 其 容 易 发 生 该 现 象 , 因 为 在 转 运 开 始 前 需 要 一 个最 佳 的 构 象 。 然 而 , 一 旦 转 运 开 始 ,DNA 逆 向 电场 梯 度 的 向 回 扩 散 是 很 难 发 生 的 。3.5 定 量 PCR 验 证 双 链 DNA 的 转 运为 验 证 电 流 阻 断 事 件 确 为 双 链 DNA 转 运 通 过连 接 器 通 道 , 用 荧 光 染 料 试 剂 盒 (SYBR Green, Bio-Rad) 进 行 定 量 PCR, 以 量 化 在 恒 定 电 压 下 DNA 的转 运 ( 图 6C, 上 )。 在 反 式 腔 室 加 入 141 bp 的 DNA,并 每 隔 30 min 从 顺 式 腔 室 取 样 用 于 定 量 。 在 顺 式 腔室 里 的 DNA 分 子 数 目 随 着 时 间 的 增 加 而 增 加 (9 例实 验 ), 并 且 DNA 转 运 的 速 率 受 到 嵌 入 连 接 器 的 数目 影 响 。 为 了 便 于 比 较 , 在 没 有 连 接 器 的 条 件 下 进行 了 对 照 实 验 ( 图 6C, 下 )。 在 对 照 条 件 下 , 顺 式腔 室 内 的 DNA 分 子 数 目 在 90 min 内 均 在 可 检 测 范围 (4 例 实 验 )。 此 外 还 观 测 到 , 电 流 踪 迹 的 阻 断 事件 数 目 与 Q-PCR 检 测 的 转 运 通 过 通 道 的 DNA 数 目( 图 6D) 呈 正 相 关 。
1122生 命 科 学第 23 卷A, 在 -75 mV 恒 定 电 压 下 ,1 mol/L 氯 化 钠 ,pH 值 7.8 的 溶 液 中 , 线 性 双 链 DNA(2 kb) 引 起 的 电 流 阻 断 事 件 的 直 方 图 ( 总 计 3 264个 事 件 )。B,38 bp 和 5 500 bp 双 链 DNA 转 运 事 件 驻 留 时 间 的 比 较 。C~D, 定 量 PCR 分 析 DNA 转 运 事 件 。C, 定 量 分 析 DNA 通过 脂 双 层 中 的 连 接 器 从 反 式 腔 室 转 运 到 顺 式 腔 室 ( 顶 部 ) 的 总 数 量 。 在 同 样 条 件 但 没 有 连 接 器 的 情 况 下 , 进 行 了 阴 性 对 照 ( 底部 ) 实 验 。 误 差 线 代 表 9 个 独 立 实 验 和 4 个 阴 性 对 照 实 验 的 平 均 值 的 标 准 偏 差 。D, 两 组 独 立 试 验 中 比 较 通 过 两 种 方 法 测 量 的DNA 转 运 拷 贝 数 : 定 量 PCR 和 从 记 录 电 流 踪 迹 中 阻 断 事 件 的 计 数 。 误 差 线 代 表 3 个 独 立 定 量 PCR 的 标 准 差 。 图 片 A 和 D 引 自 文献 [43], 图 片 B 和 C 引 自 文 献 [42]。图 6 定 量 分 析 DNA 的 转 运 时 间 及 数 目为 了 排 除 顺 式 腔 室 中 DNA 数 目 增 加 可 能 由 膜泄 漏 导 致 , 在 脂 双 层 或 隔 膜 泄 漏 的 情 形 下 , 进 行 了另 外 三 组 实 验 。 当 泄 漏 发 生 时 , 在 顺 式 腔 室 中 每 微升 溶 液 中 的 DNA 拷 贝 数 目 大 约 比 没 有 泄 漏 的 实 验高 10 4 ~10 5 倍 。4 phi29 分 子 马 达 通 道 的 单 向 DNA 转 运 机 制通 过 斜 坡 电 压 、 电 流 方 向 切 换 以 及 沉 降 力 实 验 ,证 实 了 该 连 接 器 通 道 对 于 双 链 DNA 显 示 单 向 转 运机 制 , 即 从 氮 端 ( 窄 端 ) 入 口 到 碳 端 ( 宽 端 ) 出 口 。这 是 第 一 个 针 对 DNA 转 运 展 现 整 流 行 为 的 野 生 型蛋 白 通 道 的 例 子 。 但 该 连 接 器 通 道 对 离 子 仍 展 现 双向 转 运 性 质 , 即 在 正 负 跨 膜 电 压 下 的 电 导 相 同 。4.1 对 单 一 通 道 施 加 斜 坡 电 压 展 示 的 双 链 DNA 的单 向 转 运如 前 所 述 , 连 接 器 通 道 通 过 脂 质 体 / 连 接 器 复合 物 与 平 面 磷 脂 膜 的 融 合 而 嵌 入 脂 双 层 。 因 此 , 连接 器 通 道 在 脂 双 层 中 的 方 向 是 随 机 的 , 即 碳 端 朝 向顺 式 腔 室 , 或 氮 端 朝 向 顺 式 腔 室 。对 包 含 单 个 连 接 器 的 脂 双 层 施 加 -100 mV 到+100 mV 斜 坡 电 压 (2.2 mV/s), 揭 示 了 双 链 DNA 的单 向 转 运 ( 图 7A~C)。 由 于 DNA 的 磷 酸 骨 架 带 负电 荷 , 所 以 DNA 倾 向 于 从 负 电 势 迁 移 到 正 电 势 。图 7A 展 示 了 未 加 DNA 的 对 照 实 验 。 双 链 DNA 在顺 式 和 反 式 两 个 腔 室 中 预 先 混 合 为 同 样 浓 度 , 并 根据 脂 双 层 内 连 接 器 的 取 向 施 加 负 电 压 ( 图 7B) 或 正
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