噬菌体phi29 DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及 ... - 生命科学

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1115双 链 DNA 噬 菌 体[1] 、 腺 病 毒[3] 、 痘 病 毒[4] 、 人 巨细 胞 病 毒[5] 、 单 纯 疱 疹 病 毒[6]和 双 链 RNA 噬 菌 体都 具 有 一 个 共 同 的 特 点 , 即 其 基 因 组 被 包 装 到 一 个预 先 形 成 的 原 壳 体 中 。 这 个 克 服 能 量 阻 力 的 过 程 ,由 从 ATP 水 解 获 得 能 量 的 包 装 马 达 完 成[1,8-10] 。 一个 DNA 包 装 的 有 趣 例 子 是 枯 草 杆 菌 (Bacillus subtilis)噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 , 其 在 包 装 过 程 中 涉 及了 蛋 白 质 、RNA 和 DNA [9,11-14] 。噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 包 括 一 个 由 12 个gp10 亚 基 组 成 的 连 接 器[15-16] ,6 个 与 ATP 结 合 的DNA 包 装 RNA(pRNA) [11,17-18] , 以 及 提 供 DNA 转 运所 需 化 学 能 的 ATP 酶 蛋 白 gp16 [19-20] ( 图 1A、B)。这 些 纯 化 组 分 可 在 体 外 结 合 并 组 装 成 为 迄 今 发 现 的最 有 力 的 纳 米 器 件 之 一[21] 。 连 接 器 由 12 个 gp10 亚基 组 成 , 各 含 有 3 个 α- 螺 旋 , 共 同 形 成 一 个 中 央通 道 , 宽 端 开 口 直 径 6.0 nm, 窄 端 3.6 nm( 图 1C、D)。该 通 道 宽 端 的 横 截 面 积 为 28 nm 2 , 窄 端 为 10 nm 2 。连 接 器 嵌 入 病 毒 衣 壳 及 定 位 是 由 疏 水 区 及 蛋 白 质 相互 作 用 调 节 的 。 许 多 病 毒 的 门 户 蛋 白 具 有 相 似 形 态 ,及 DNA 转 运 的 类 似 特 征 , 但 在 序 列 同 源 性 和 相 对分 子 质 量 上 具 有 较 大 差 异[22] 。高 度 敏 感 的 检 测 系 统 的 开 发 在 许 多 领 域 具 有 重要 性 , 例 如 病 原 鉴 定 、 疾 病 诊 断 、 环 境 监 测 和 国 家安 全 等 。 电 生 理 测 量 用 于 检 测 许 多 物 质 的 转 运 过 程 ,例 如 DNA、RNA、 多 肽 、 蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 ,及 无 机 物 小 分 子 和 药 剂 等[23-27] 。 利 用 金 黄 色 葡 萄 球菌 的 α- 溶 血 素 通 道 , 可 以 测 定 单 链 RNA 或 DNA的 长 度[28] 。 随 后 , 发 夹 DNA 分 子 被 用 于 降 低 通 过 α-溶 血 素 的 转 运 速 率 , 表 明 纳 米 孔 可 以 区 分 单 核 苷 酸多 态 性[29] 。 一 种 由 DNA 寡 核 苷 酸 共 价 结 合 至 纳 米孔 内 腔 开 发 出 的 杂 交 传 感 器 被 用 于 检 测 单 碱 基 对 的差 异[30] 。 也 有 关 于 检 测 纳 米 孔 内 碱 基 对 堆 积 和 链方 向 的 报 道[31] 。 其 他 研 究 的 蛋 白 质 通 道 包 括 用 于检 测 聚 乙 二 醇 的 丙 甲 菌 素[32] , 以 及 耻 垢 分 枝 杆 菌(Mycobacterium smegmatis) 中 转 运 单 链 DNA 的 细胞 外 膜 孔 道 蛋 白 A [33] 等 。由 于 纳 米 孔 尺 寸 的 限 制 , 迄 今 为 止 大 部 分 的 研究 都 集 中 于 单 链 DNA 的 转 运 。 其 他 一 些 研 究 虽 然已 经 显 示 了 双 链 DNA 转 运 的 证 据[34-36] , 但 其 因 电压 门 控 和 信 号 波 动 而 在 传 感 用 途 上 应 用 有 限 。 于 是一 些 研 究 人 员 转 向 人 工 合 成 纳 米 孔 用 于 双 链 DNA测 序[37-39] 。 在 纳 米 尺 度 内 , 合 成 纳 米 孔 大 小 很 难 一致 , 并 且 较 难 进 行 生 物 化 学 修 饰 或 结 合 。 因 此 , 研究 人 员 仍 不 断 探 索 其 他 合 适 的 纳 米 孔 。[7]phi29 连 接 器 马 达 通 道 的 最 大 优 势 是 孔 道 大 ,故 可 允 许 双 链 DNA 通 过 。 本 文 将 论 述 脂 质 内 嵌phi29 纳 米 孔 的 各 种 用 途 。 由 于 phi29 连 接 器 蛋 白 晶体 结 构 已 知 , 所 以 对 其 进 行 重 组 较 为 容 易[40-41] 。 研 究人 员 已 经 通 过 修 饰 phi29 连 接 器 蛋 白 , 将 其 嵌 入 脂质 双 层 膜[42] 。 这 是 第 一 例 膜 蛋 白 和 离 子 通 道 之 外 嵌入 人 工 质 膜 的 蛋 白 质 。 结 合 电 生 理 膜 片 钳 技 术 , 可以 实 时 观 测 并 记 录 单 个 蛋 白 嵌 入 脂 质 双 层 膜 的 过 程以 及 通 过 纳 米 孔 的 电 流 。 在 双 层 脂 膜 中 , 每 个 孔 中的 电 导 几 乎 完 全 相 同 , 并 完 全 符 合 与 外 加 电 压 的 线性 关 系 。 电 压 驱 动 下 ,DNA 可 以 被 转 运 通 过 通 道 ,并 且 产 生 瞬 时 电 流 阻 断 信 号 。 这 些 电 流 阻 断 与 通 过单 个 孔 道 峰 值 电 流 的 比 例 , 与 DNA 和 孔 道 内 腔 横截 面 积 的 比 值 相 符 。 此 外 , 在 包 括 极 端 酸 碱 度 和 高盐 等 多 种 实 验 条 件 下 , 该 连 接 器 通 道 也 极 为 稳 定[43] 。基 于 连 接 器 纳 米 孔 的 稳 定 性 能 , 可 以 开 发 一 种 简 单 、可 重 复 的 纳 米 孔 数 量 测 定 技 术[43] 。 最 近 , 本 课 题 组研 究 表 明 双 链 DNA 通 过 phi29 连 接 器 通 道 的 转 运是 单 向 性 的[44] 。 这 个 系 统 与 其 他 系 统 相 比 较 为 显 著的 优 势 在 于 较 大 的 通 道 , 并 且 允 许 双 链 和 单 链 DNA通 过 。 较 大 的 孔 径 也 使 其 更 容 易 通 过 插 入 或 结 合 化学 基 团 进 行 通 道 修 饰 以 增 强 传 感 应 用 。 这 些 发 现 具有 重 要 意 义 , 因 为 对 于 DNA 包 装 马 达 的 人 工 膜 结构 研 究 , 有 利 于 详 细 研 究 马 达 的 操 作 机 制 以 及 未 来治 疗 用 途 DNA 的 包 装 、 测 序 、 采 样 和 投 递 。1 phi29 连 接 器 的 重 组 、 表 达 、 纯 化 及 包 含 重组 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 囊 泡 的 制 备1.1 phi29 连 接 器 的 重 组 、 表 达 及 纯 化表 达 连 接 器 蛋 白 及 其 十 二 聚 体 组 装 的 质 粒 已被 构 建[41] , 关 于 连 接 器 蛋 白 末 端 的 修 改 也 有 研究[40,45-46] 。 简 言 之 , 对 质 粒 的 修 改 可 通 过 两 步 聚合 酶 链 式 反 应 实 现 。 将 表 达 质 粒 转 化 到 大 肠 杆 菌(Escherichia coli) HMS174(DE3) 菌 株 中 以 表 达 蛋 白 。链 球 菌 肽 标 记 连 接 器 蛋 白 , 可 使 用 带 有 Streptactin(IBA, St. Louis, MO) 的 亲 和 色 谱 柱 纯 化 。1.2 包 含 重 组 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 囊 泡 的 制 备将 连 接 器 蛋 白 直 接 嵌 入 双 层 脂 膜 平 面 作 为 纳 米孔 的 尝 试 均 告 失 败 , 因 此 采 用 了 一 个 两 步 间 接 策 略 :首 先 将 重 组 连 接 器 蛋 白 结 合 在 脂 质 囊 泡 中 , 其 次 通过 囊 泡 融 合 将 连 接 器 间 接 嵌 入 到 双 层 脂 膜 中[42] 。连 接 器 蛋 白 的 表 面 电 荷 分 析 表 明 , 其 中 心 表 面与 两 侧 的 宽 端 和 窄 端 相 比 具 有 轻 微 疏 水 区 域 ( 图1C) [15-16] 。 连 接 器 的 碳 端 位 于 较 宽 开 口 一 侧 , 并 嵌 入