噬菌体phi29 DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及 ... - 生命科学

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1127闭[60] 。 完 全 包 装 和 部 分 留 在 原 壳 体 内 的 双 链 DNA,在 高 梯 度 离 心 力 ( 例 如 ,149 000 g) 的 测 试 下 都 没有 退 出[60-61] 。 这 与 在 DNA 包 装 中 间 体 中 所 观 测到 的 双 链 DNA 停 留 在 通 道 内 并 不 弹 出 的 现 象 一致[19,21,60] 。 马 达 包 装 DNA 是 需 要 克 服 势 能 的 过 程 ,需 要 ATP 水 解 过 程 中 产 生 的 化 学 能 来 用 于 DNA 转运[19,62] 。 随 着 越 来 越 长 的 DNA 被 包 装 , 在 原 壳 体内 空 穴 的 体 积 越 来 越 小 , 病 毒 原 壳 体 内 的 压 力 逐 渐增 大[19,21,60,63] 。为 了 论 证 在 具 有 生 物 活 性 的 phi29 马 达 内 DNA包 装 通 道 的 单 向 交 通 性 质 , 并 排 除 pRNA、gp16 和/ 或 γ-S-ATP 的 贡 献 , 本 课 题 组 对 其 进 行 了 沉 降 检 测 。使 用 DNase I 和 / 或 核 糖 核 酸 酶 A (RNase A) 对 完 全包 装 的 DNA 和 DNA 包 装 中 间 体 分 别 单 独 和 联 合进 行 处 理 。DNase I 处 理 排 除 任 何 可 能 抑 制 双 链DNA 退 出 的 与 马 达 组 件 的 接 触 , 而 RNase A 消 化排 除 了 pRNA 及 gp16 接 触 并 托 住 DNA 的 可 能 。 由于 pRNA 起 了 马 达 与 gp16 之 间 的 桥 梁 作 用[20] ,RNaseA 消 化 会 消 除 pRNA 和 gp16 对 双 链 DNA 的 可 能 的力 的 作 用 支 点 。 当 分 别 或 一 起 使 用 DNase I 和RNase A 处 理 DNA 包 装 中 间 体 ( 部 分 双 链 DNA 在通 道 内 、 部 分 双 链 DNA 在 通 道 外 ) 时 , 部 分 包 装的 双 链 DNA 停 留 在 原 壳 体 内 , 且 在 最 高 力 梯 度 离心 下 并 不 滑 出 。 这 些 数 据 强 烈 支 持 这 样 的 结 论 : 在主 动 马 达 中 , 通 道 也 展 现 单 向 交 通 的 性 质 。模 型这 些 研 究 给 Guo 和 Lee 的 “ 推 动 ” 或 “ 阀 门 ”[9]提 供 了 直 接 证 据 。 在 此 模 型 中 , 连 接 器 保 持静 止 ;DNA 转 运 由 DNA 包 装 酶 或 末 端 酶 诱 导 , 该酶 推 动 一 定 长 度 的 DNA 进 入 原 壳 体 , 随 后 转 换 结合 到 DNA 远 端 , 推 动 另 外 一 端 DNA 进 入 。 该 模型 不 排 除 由 酶 推 动 的 插 槽 — 扳 手 的 旋 转 。 单 向 交通 的 性 质 使 得 D​NA 进 入 原 壳 体 后 并 不 退 出 , 类 似于 血 液 泵 入 心 脏 及 阀 门 控 制 血 流 的 作 用 。6.2 基 于 纳 米 孔 的 随 机 单 分 子 检 测基 于 纳 米 孔 的 随 机 单 分 子 检 测 是 一 个 新 兴 的 分析 技 术 , 可 在 单 分 子 水 平 测 量 分 析 物 。 当 一 个 被 测分 子 通 过 通 道 时 , 通 过 孔 的 粒 子 电 流 将 反 映 所 得 阻断 事 件 的 幅 度 、 持 续 时 间 和 速 率 。 通 过 统 计 分 析 ,可 以 得 到 分 子 浓 度 和 种 类 的 信 息 。phi29 连 接 器 的DNA 转 运 试 验 , 揭 示 了 其 纳 米 孔 分 析 的 潜 在 应 用 。与 其 他 一 些 已 知 的 通 道 ( 例 如 直 径 1.4 nm 仅 能通 过 单 链 DNA 的 α- 溶 血 素 通 道 ) 相 比 , 连 接 器 具有 较 大 的 直 径 ( 最 窄 处 ~3.6 nm)。 更 重 要 的 是 , 对于 发 展 基 于 连 接 器 的 靶 向 选 择 性 随 机 传 感 器 ,phi29连 接 器 较 大 的 通 道 可 以 在 通 道 内 结 合 的 共 价 键 配 体的 选 择 上 更 灵 活 。 由 于 其 晶 体 结 构 已 知 , 可 以 使 用系 统 性 、 基 于 工 程 的 方 法 来 开 发 具 有 增 强 分 析 能 力的 系 统 。有 许 多 细 菌 外 膜 孔 蛋 白 具 有 较 大 的 孔 隙 , 有 用作 随 机 传 感 器 的 潜 力 。 然 而 , 由 于 电 压 或 质 子 、 阴离 子 或 阳 离 子 等 溶 液 条 件 所 引 发 的 这 些 蛋 白 通 道 的门 控 , 可 能 会 在 单 通 道 记 录 中 产 生 干 扰 分 析 物 检 测的 瞬 变 电 流 阻 断 。 例 如 ,OmpG 孔 蛋 白 在 ± 40 mV下 会 有 自 发 门 控[64] 。 与 此 相 反 ,phi29 连 接 通 道在 -100 mV 至 +100 mV 电 压 范 围 内 , 乃 至 在 极 端pH 的 条 件 下 , 也 保 持 稳 定 的 通 道 特 性 。 因 此 ,phi29 连 接 通 道 将 成 为 生 物 孔 随 机 传 感 器 的 出 色 选择 。6.3 基 于 纳 米 孔 的 DNA 测 序纳 米 孔 的 DNA 测 序 应 用 有 很 大 前 途 , 可 用 于人 类 个 体 基 因 组 的 序 列 测 定 以 鉴 定 遗 传 疾 病 的 各 种病 因 借 以 设 计 治 疗 。 同 时 , 可 以 用 于 植 物 基 因 组 的鉴 定 以 作 品 种 改 良 , 也 可 促 进 细 菌 、 真 菌 的 改 造 ,而 且 比 传 统 方 法 更 快 , 成 本 更 低 。 此 外 , 这 是 一 个无 标 记 、 单 分 子 识 别 的 方 法 , 不 需 样 品 制 备 或 放 大 。迄 今 为 止 , 已 有 一 些 使 用 蛋 白 质 孔 或 固 态 纳 米 孔 进行 核 酸 分 析 的 探 索[23-26,28-31,65] 。 不 过 , 纳 米 孔 DNA测 序 技 术 的 一 个 瓶 颈 是 DNA 穿 过 孔 的 速 率 过 快 ,超 过 了 现 有 光 学 和 电 子 技 术 的 检 测 分 辨 率 , 影 响 单个 核 苷 酸 检 测 的 灵 敏 度 和 可 信 度 。 因 此 , 关 键 的 挑战 是 能 够 以 可 控 的 速 度 减 慢 DNA 通 过 孔 道 , 同 时保 持 精 确 区 分 碱 基 对 的 高 信 号 信 噪 比 。phi29 连 接器 较 大 的 通 道 给 修 饰 、 结 合 及 放 置 障 碍 物 以 获 得 更佳 检 测 信 号 提 供 了 空 间 。7 结 论在 此 , 经 改 造 的 phi29 连 接 器 被 嵌 入 到 脂 双 层中 , 形 成 了 高 导 电 纳 米 孔 。 此 外 , 连 接 器 是 非 常 容易 重 复 制 备 且 易 于 改 造 的 生 物 孔 , 使 其 可 理 想 的 用于 未 来 生 物 医 学 中 。phi29 连 接 器 孔 径 较 大 、 尺 寸均 一 且 性 质 稳 定 , 使 这 个 病 毒 组 件 可 能 成 为 新 一 代纳 米 材 料 或 纳 米 级 的 构 造 单 元 。致 谢 : 感 谢 萧 枫 博 士 、 蔡 颖 博 士 、 方 华 明 和 张 乐 构建 重 组 连 接 器 蛋 白 , 景 鹏 博 士 和 Farzin Haque 博 士进 行 脂 双 层 电 导 实 验 , 以 及 舒 丹 博 士 进 行 体 外 包 装检 测 。 同 时 中 国 国 家 纳 米 科 学 中 心 梁 兴 杰 研 究 员 、清 华 大 学 李 景 虹 教 授 和 中 国 科 学 院 高 能 物 理 研 究 所