TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DECOMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS.Laura Agudo Medinabiomedina@hotmail.com1.- RADICALES LIBRES Y COMPUESTOS ANTIOXIDANTESRadical libre (RL) es cualquier especie química capaz de existir de formaindependiente y que presenta uno o más electrones desapareados en su estructura.Como consecuencia, son altamente reactivos lo que hace que tengan una vida mediadel orden de milisegundos, aunque varía según el tipo de radical libre (Halliwell y col.,1992). Los radicales libres también son conocidos como especies reactivasoxigénicas o del oxígeno, ROS, y especies reactivas del nitrógeno, RNS.A bajas concentraciones los radicales libres son necesarios para el buenfuncionamiento celular pudiendo actuar como segundos mensajeros estimulando laproliferación celular y/o actuando como mediadores para la activación de las células.Sin embargo, un exceso de los mismos puede acumularse hasta niveles tóxicos dandocomo resultado que se produzcan diversas acciones sobre el metabolismo de losprincipios inmediatos, que pueden ser origen del daño celular (Davies, 1995).La capacidad que tenga cada radical libre para actuar como agente oxidante estádeterminada por factores como su reactividad, especificidad, selectividad ydifusibilidad. Son responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas comoel DNA, lípidos, carbohidratos y proteínas. Participan en los mecanismosfisiopatológicos de muchas enfermedades, como algunos tipo de cáncer, diabetes,patologías cardiovasculares, procesos reumáticos, patologías gastroentéricas,afecciones broncopulmonares o procesos neurodegenerativos. También estánimplicados en procesos fisiológicos como el envejecimiento, el daño causado por elejercicio físico agotador y otros.Aunque se produce un gran daño oxidativo, el organismo ha desarrollado unsistema de defensa antioxidante que intenta evitar o neutralizar la agresión. Unantioxidante es “cualquier sustancia que en presencia de un sustrato oxidable retrasao inhibe la oxidación del mismo” (Mataix y Battino, 2002). Se caracterizan por ser muyheterogéneos, pueden ser hidrosolubles y liposolubles, localizarse intra yextracelularmente, y proceder de diferentes fuentes ya que algunos son nutrientes oproceden de éstos y otros son productos del metabolismo.27

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©Los antioxidantes pueden actuar:A. Previniendo la formación de ROS.B. Interceptando el ataque de ROS.C. Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menosreactivas.D. Facilitando la reparación del daño causado por ROS.E. Manteniendo un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.F. Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de ROS.Según el modo de acción, los antioxidantes se clasifican en primarios, secundariosó terciarios: Primarios: Impiden la formación de radicales libres, frenan la reacción encadena de los radicales libres, especialmente de las especies reactivas del oxígeno(ROS) ó son quelantes de metales de transición. Se comportan como captadores deestos ROS. Secundarios: Interrumpen la reacción de propagación de los radicales libres ódesplazan las especies reactivas del oxígeno (ácido ascórbico, carotenoides, glutationy la mayoría de las enzimas antioxidantes). Terciarios: Reparan el daño causado a las moléculas por los radicales libres óeliminan aquéllas que se han estropeado.En el organismo humano los radicales libres están controlados mediante un amplioespectro de antioxidantes de origen endógeno (enzimas antioxidantes, glutatión,albúmina, transferrina, ácido úrico, bilirrubina) y exógenos a través de la dieta(vitamina E y C, carotenoides, selenio, compuestos fenólicos) (Gutteridge, 1995). Entrelos componentes del sistema antioxidante endógeno destacan las enzimasantioxidantes: catalasa, superóxido dismutasa (SOD) y glucosa fosfatodeshidrogenasa. La SOD es una enzima distribuida en todo el organismo. Hay dostipos intracelulares de SOD: la que está presente en la mitocondria, que contienemanganeso en su centro activo (Mn-SOD) y la del citosol, que tiene iones de cobre yzinc (Cu-Zn-SOD). La Catalasa es una enzima intracelular que se localiza en el interiorde los glóbulos rojos. El equilibrio entre la actividad de la Catalasa respecto de SOD esfundamental para mantener el balance REDOX. La GPx es un complejo enzimático,existen cuatro formas diferentes de esta enzima y todas ellas tienen selenio en sucentro activo (Holben DH y col., 1999).Cuando la agresión supera las defensas se habla de estrés oxidativo, es decir, elbalance oxidativo entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantesse rompe. Si esto ocurre las especies reactivas generadas pueden iniciar procesos28

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©patológicos graves como diabetes, cáncer, enfermedades cardiovasculares,envejecimiento.2.- BENEFICIOS QUE SE OBTIENEN DE UNA DIETA RICA EN POLIFENOLES.Son numerosos los estudios que han mostrado que los polifenoles poseenpropiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando radicaleslibres hidroxilo, supéroxido y alcoxi (Sichel et al., 1991). Protegen de la oxidación a laslipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel clave en la prevenciónde la aterosclerosis. También pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregaciónplaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Son consideradosreguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a lamodulación del metabolismo del ácido araquidónico, reduciendo los niveles detromboxano. Modulan la actividad enzimática de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa,fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la acción de la angiotensina convertasa,mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa(que produce los radicales superóxido). Hay que destacar el potencialanticarcinógeno, ya que pueden estimular el bombeo de ciertos agentes cancerígenoshacia el exterior de las células o bien activar a las enzimas de detoxificación (Mazza,2000).3.- EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DE LOS ALIMENTOSLos compuestos antioxidantes de los alimentos se extraen con disolventes dediferentes polaridades de acuerdo con el carácter hidrofílico o lipofílico de loscompuestos que se desean evaluar. El disolvente más comúnmente utilizado en laobtención de extractos lipofílicos es el hexano. También se han utilizado el eterdietílico y cloruro de metileno entre otros. Para la extracción de compuestos concarácter hidrofílico se han utilizado metanol, etanol, mezclas de etanol/agua,acetona/agua y metanol/agua así como extracción en medio ácido (pH=2) conmetanol/agua, seguida de acetona/agua y agua/acetonitrilo en medio ácido, todos ellosensayados en diferentes proporciones. Recientemente se ha observado que el tipo dedisolvente y la polaridad puede afectar a la transferencia del electrón singlete y a la delátomo de hidrogeno, los cuales son esenciales en la medida de la capacidadantioxidante. Asimismo, la presencia de compuestos no antioxidantes (ciertosaminoácidos y ácidos uránicos) en los extractos ensayados, también pueden afectar aestos resultados. Esto sugiere que la comparación de resultados sea solo llevada acabo en muestras en las que se utiliza el mismo método y el mismo disolvente deextracción y que las sustancias interferentes deben ser comprobadas. (Pérez Jimenezy col, 2006).3.1. Técnicas para la determinación de la actividad antioxidanteLa determinación de la actividad antioxidante de los alimentos es importante parapredecir el potencial antioxidante in vitro de los mismos antes de ser ingeridos; asímismo, nos permite determinar la protección frente a la oxidación y el deterioro delalimento que disminuye su calidad y valor nutricional.29

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©Los métodos de determinación de la actividad antioxidante se basan en distintossistemas generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionarían con lamuestra y en virtud de la capacidad antioxidante de esta se inhibiría la generación delos primeros. Así, lo que se determina realmente es el efecto antioxidante ya que laactividad antioxidante no se puede medir de forma directa. Lo ideal seria medir laactividad antioxidante de cada componente de la muestra por separado, sin embargo,y sobre todo en el caso de muestras naturales, es muy difícil determinar el número yconcentración de los compuestos antioxidantes presentes en la muestra.En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidación, no existe unmétodo que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto,es bueno trabajar con varios métodos para facilitar la comparación e interpretación delos resultados. Las características “ideales” que debe reunir un método dedeterminación de capacidad antioxidante son: sencillez, mecanismo químico definido ypunto final fijo, reproducibilidad, adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidrofílicas ylipofílicas y elevado rendimiento de análisis.Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dosestrategias distintas, en función de la información que se desea obtener (Sánchez-Moreno, 2002):● Determinación directa: El radical se emplea como un factor de cuantificación(produce una señal analítica). La adición del antioxidante, antes o después de lageneración del radical, provoca una disminución de la señal. En el ensayo de postadiciónse forma el radical en ausencia de la muestra y así, cuando se añade lasustancia antioxidante se produce un descenso en la señal debido a la disminución dela concentración del radical. En ensayos de inhibición, la muestra se añade a lossustratos de oxidación antes que sea generado el radical, La reacción comienza con laadición del oxidante (ABTS ●+ , DPPH, etc). Determinación indirecta: La presencia de radicales libres produce la pérdida oaparición de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca elaumento o disminución de la señal (métodos, ORAC, FRAP, etc).3. 1. 1.- Método del ABTS ●+ (Ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-sulfónico).El radical ABTS ●+ se genera a partir de su precursor el Ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolín)-6-sulfónico (ABTS), ver figura 11 (Ronald L. Prior, 2005). El radicalcatiónico obtenido es un compuesto de color verde-azulado, estable y con un espectrode absorción en el UV-visible.Es un radical artificial que no mimetiza bien la situación in vivo,termodinámicamente puede ser reducido por compuestos que tengan un potencialredox menor que el del ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchoscompuestos fenólicos con un potencial más bajo. El punto final de la reacción lo marcala sustancia antioxidante empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados quepueden interferir en los resultados finales, lo cual, es un inconveniente.La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolublescomo liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.Existen varios métodos de generación del radical ABTS ●+ :30

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©- Enzimáticamente (mioglobina, peroxidasa de rábano).- Químicamente (Dióxido de manganeso, persulfato potásico, radicales peroxilo).- Electroquímicamente.En el presente estudio, se ha realizado el método ABTS ●+químicamente utilizando persulfato potásico.generando el radicalLa oxidación con persulfato potásico se lleva a cabo a temperatura ambiente, enausencia de luz, en un tiempo de 12 a 16 h. El persulfato potásico y el ABTSreaccionan estequiométricamente (1:0.5). Una vez generado el radical la medida serealiza mediante un ensayo de post-adición. Este método se aplica en ladeterminación de la actividad antioxidante de frutas, verduras, bebidas estimulantes.Preparación de reactivos:- ABTS 7mM. Para 10 ml Disolver 0,0384 g de sal amónica cristalizada de ABTS en 10 ml deagua destilada.- Solución persulfato potásico 2,45mM. Para 100 ml Disolver 0,0662 g del reactivo en 100ml de agua destilada.-Etanol al 96 % v/v.- Preparación radical ABTS*. Mezclar a partes iguales la solución de ABTS 7mM y la depersulfato pototásico 2,45mM. La mezcla se mantiene en oscuridad a temperatura ambientedurante 16 horas para la formación del radical. Esta solución es estable durante dos días. Lasolución de ABTS* se diluye con etanol para obtener una absorbancia de 0,8 730 nm. Esto seconsigue mezclando 2,5 ml de la solución del radical con aproximadamente 100 ml de etanol. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01gr de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de estasolución se hacen las diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unasconcentraciones de 19, 39, 59, 79, 99, 119, 159 y 199 µM.3.1.2.- Método FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).Benzi y strain,1996; Pulido y col; 2000En este método se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basaen el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe 3+ a Fe 2+ que esmenos antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro esreducido al complejo ferroso coloreado.Se trata de un método espectrofotométrico ya que se mide la absorbancia del Fe 2+ .Así, cuanto más antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reduccióny mayor la concentración de Fe 2+ y más alta la señal de absorbancia. El complejo va apoder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencialredox del Fe 3+ -TPTZ).31

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©Debido a que el potencial redox del Fe 3+ -TPTZ es comparable con el del ABTS sepueden analizar compuestos similares con ambos métodos aunque las condiciones de lareacción sean distintas. El mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, adiferencia de otros métodos donde se produce captura de radicales libres, según esto, elFRAP puede ser útil, en combinación con otros métodos, en la determinación de lacapacidad antioxidante de productos que contengan distintos tipos de antioxidantes.Preparación de reactivos:- Ácido clorhídrico (HCl) 40mM. Diluir 535 µl de HCl (37%) en 100 ml de agua destilada.- Solución TPTZ 10 mM. Pesar 0,0312 g del reactivo TPTZ y disolverlos en un matraz de 10ml con HCl 40 mM.- Solución FeCl 3 -6H 2 O 20 mM. Disolver 0,1352 g de FeCl 3 -6H2O en 25 ml de agua destilada.- Tampón acetato 0,3 mM pH 3,6. Para 250 ml, disolver 0,0061 g de acetato sódico (NaAc)en 200 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 3,6 utilizando HCl 40mM, y completar hasta los250 con agua destilada.- Solución de trabajo diario FRAP: Esta solución de trabajo deberá de prepararse a diario.Mezclar 2,5 ml de solución TPTZ con 2,5 ml de solución FeCl3-6H2O 20 mM y 25 ml de tampónacetato. Esta preparación debe mantenerse durante todo el proceso en el baño a 37ºC. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de estasolución se hacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unasconcentraciones de 79, 119, 159, 199, 239, 279, 319, 359 y 399 µM.3.1.3.- Método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity).El fundamento del método ORAC se basa en la habilidad que tienen loscompuestos antioxidantes para bloquear radicales libres por donación de un átomo dehidrógeno:X + AHXH + A ●En este método, el radical artificial AAPH (2,2’-Azobis-(2-aminopropano)-dihidrocloruro) oxida a la fluoresceína de forma que esta pierde su fluorescencia. Deesta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir delalimento disminuirían dicha pérdida de fluorescencia.Preparación de soluciones Disolución reguladora de fosfato 75mM pH 7,4. Para 1000 ml, disolver 10,35 g deNaH 2 PO 4 , H 2 O en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 y completar hasta 1 litro. Solución de AAPH 300 mM. Para 10 ml, disolver 0,8136 g de dihidrocloruro de 2,2´azobis-2-amidinopropanoen 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.32

Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta © Solución de fluoresceina patrón 7,0 mM. Para 10 ml, disolver 0,0263 g de fluoresceinaen 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4. Solución diaria de trabajo de fluoresceina 70 mM. Para 50 ml, diluir 10 µl de lasolución patrón en disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4 y completar hasta 10 ml.De aquí se toman 500 µl y se llevan hasta 50 ml con la misma disolución reguladora. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5 ml de agua destilada. A partir de esta sehacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 µM.Método Folin-CiocalteauLa medida del contenido de fenoles totales se realiza utilizando el método de Folin–Ciocalteau (Singleton, y col., 1999), que determina la capacidad que tienen los polifenoles parareducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal reacción, el reactivo de color amarilloadquiere un intenso color azul que se mide con el espectrofotómetro.Preparación de reactivos:Reactivo de Folin-Ciocalteau (Sigma- Aldrich) Reactivo de Carbonato sódico al 10%. Disolver 10g de Na 2 CO 3 en 100ml de aguabidestilada. Recta de calibración con la disolución de Ácido gálico. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de ácido gálico en 10ml de agua bidestilada. A partir de esta solución sehacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ppm.BIBLIOGRAFÍA Belitz y Grosch. (1988) Química de los alimentos. Ed. Acribia. España, Zaragoza. Christopher Isaac Escamilla Jiménez, Elvis Yane Cuevas Martínez, JorgeGuevara Fonseca. (2009) Flavonoides y sus acciones antioxidantes. Rev Fac MedUNAM Vol. 52 No. 2 Marzo-Abril. Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jimenez L. (2004) Polyphenols.Food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr; 79: 727-47. Martínez-Valverde I., Periago M.J., Ros G. (2000) Significado nutricional de loscompuestos fenólicos de la dieta. Arch. Latinoamer. Nutr. 50, 5-18. Mazza. Alimentos funcionales. (2000) Aspectos bioquímicos y de procesados.Zaragoza, Acribia. Muñoz Jáuregui A.M y Ramos Escudero F. (2007) Componentes fenólicos de ladieta y sus propiedades biomedicinales. Revista horizonte médico. Vol 7, nº 1. Junio. O´Brien, J., Morrissey, P.A. (1989) Nutritional and toxicological aspects of theMaillard browning reaction in foods. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 28, 211-248.33

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