TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS

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Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta ©Debido a que el potencial redox del Fe 3+ -TPTZ es comparable con el del ABTS sepueden analizar compuestos similares con ambos métodos aunque las condiciones de lareacción sean distintas. El mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, adiferencia de otros métodos donde se produce captura de radicales libres, según esto, elFRAP puede ser útil, en combinación con otros métodos, en la determinación de lacapacidad antioxidante de productos que contengan distintos tipos de antioxidantes.Preparación de reactivos:- Ácido clorhídrico (HCl) 40mM. Diluir 535 µl de HCl (37%) en 100 ml de agua destilada.- Solución TPTZ 10 mM. Pesar 0,0312 g del reactivo TPTZ y disolverlos en un matraz de 10ml con HCl 40 mM.- Solución FeCl 3 -6H 2 O 20 mM. Disolver 0,1352 g de FeCl 3 -6H2O en 25 ml de agua destilada.- Tampón acetato 0,3 mM pH 3,6. Para 250 ml, disolver 0,0061 g de acetato sódico (NaAc)en 200 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 3,6 utilizando HCl 40mM, y completar hasta los250 con agua destilada.- Solución de trabajo diario FRAP: Esta solución de trabajo deberá de prepararse a diario.Mezclar 2,5 ml de solución TPTZ con 2,5 ml de solución FeCl3-6H2O 20 mM y 25 ml de tampónacetato. Esta preparación debe mantenerse durante todo el proceso en el baño a 37ºC. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5ml de agua destilada. A partir de estasolución se hacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unasconcentraciones de 79, 119, 159, 199, 239, 279, 319, 359 y 399 µM.3.1.3.- Método ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity).El fundamento del método ORAC se basa en la habilidad que tienen loscompuestos antioxidantes para bloquear radicales libres por donación de un átomo dehidrógeno:X + AHXH + A ●En este método, el radical artificial AAPH (2,2’-Azobis-(2-aminopropano)-dihidrocloruro) oxida a la fluoresceína de forma que esta pierde su fluorescencia. Deesta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir delalimento disminuirían dicha pérdida de fluorescencia.Preparación de soluciones Disolución reguladora de fosfato 75mM pH 7,4. Para 1000 ml, disolver 10,35 g deNaH 2 PO 4 , H 2 O en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 y completar hasta 1 litro. Solución de AAPH 300 mM. Para 10 ml, disolver 0,8136 g de dihidrocloruro de 2,2´azobis-2-amidinopropanoen 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4.32
Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. – Laura Agudo Medina –ISSN: 1989-9041, Autodidacta © Solución de fluoresceina patrón 7,0 mM. Para 10 ml, disolver 0,0263 g de fluoresceinaen 10 ml de disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4. Solución diaria de trabajo de fluoresceina 70 mM. Para 50 ml, diluir 10 µl de lasolución patrón en disolución reguladora de fosfato 75 mM pH=7,4 y completar hasta 10 ml.De aquí se toman 500 µl y se llevan hasta 50 ml con la misma disolución reguladora. Recta de calibración con la disolución de TROLOX. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de Trolox en 5 ml de metanol y 5 ml de agua destilada. A partir de esta sehacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 µM.Método Folin-CiocalteauLa medida del contenido de fenoles totales se realiza utilizando el método de Folin–Ciocalteau (Singleton, y col., 1999), que determina la capacidad que tienen los polifenoles parareducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal reacción, el reactivo de color amarilloadquiere un intenso color azul que se mide con el espectrofotómetro.Preparación de reactivos:Reactivo de Folin-Ciocalteau (Sigma- Aldrich) Reactivo de Carbonato sódico al 10%. Disolver 10g de Na 2 CO 3 en 100ml de aguabidestilada. Recta de calibración con la disolución de Ácido gálico. La solución madre se preparadisolviendo 0,01g de ácido gálico en 10ml de agua bidestilada. A partir de esta solución sehacen diluciones que serán los distintos puntos de la recta, con unas concentraciones de 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 ppm.BIBLIOGRAFÍA Belitz y Grosch. (1988) Química de los alimentos. Ed. Acribia. España, Zaragoza. Christopher Isaac Escamilla Jiménez, Elvis Yane Cuevas Martínez, JorgeGuevara Fonseca. (2009) Flavonoides y sus acciones antioxidantes. Rev Fac MedUNAM Vol. 52 No. 2 Marzo-Abril. Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jimenez L. (2004) Polyphenols.Food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr; 79: 727-47. Martínez-Valverde I., Periago M.J., Ros G. (2000) Significado nutricional de loscompuestos fenólicos de la dieta. Arch. Latinoamer. Nutr. 50, 5-18. Mazza. Alimentos funcionales. (2000) Aspectos bioquímicos y de procesados.Zaragoza, Acribia. Muñoz Jáuregui A.M y Ramos Escudero F. (2007) Componentes fenólicos de ladieta y sus propiedades biomedicinales. Revista horizonte médico. Vol 7, nº 1. Junio. O´Brien, J., Morrissey, P.A. (1989) Nutritional and toxicological aspects of theMaillard browning reaction in foods. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 28, 211-248.33
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