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____________________________________________________________________Resultados
2.5 Estudio comparativo de la actividad transfructosilante de Suc2
frente a otras enzimas de la familia GH32
En la bibliografía hay descritas una serie de enzimas pertenecientes a
la familia GH32 que incluyen invertasas, inulinasas y transferasas que
presentan distinta capacidad transfructosilante (Goosen et al. 2007, Hidaka et
al. 1988, L'Hocine et al. 2000, Nguyen et al. 1999, Rehm et al. 1998, Wang y
Rakshit 2000). Nos propusimos comparar la capacidad transfructosilante de
la invertasa Suc2 (código UniProt P00724) de S. cerevisiae con algunas
enzimas de esta familia bajo las mismas condiciones de reacción. Para tal fin
seleccionamos la invertasa de W. navarrensis (capítulo I de la presente tesis
doctoral), la inulinasa de K. marxianus (P28999) y la exo-inulinasa de A. niger
(A2R0E0). Esta última, presenta una secuencia de aminoácidos 100%
idéntica a una proteína de A. foetidus clasificada como fructosiltransferasa
por su capacidad para formar fructooligosacáridos (Rehm et al. 1998). Como
control negativo se ensayó un mutante inactivo (D22N) de la invertasa Suc2
de S. cerevisiae.
El análisis del extracto celular soluble tras la inducción con IPTG por
SDS-PAGE y tinción Coomassie no mostró ninguna banda diferencial del
tamaño esperado (60 kDa) para la invertasa de W. navarrensis, comparado
con el patrón de proteínas de una cepa no transformada (Figura 43A). Sin
embargo, la expresión de esta proteína sí fue detectable por western-blot
(inmunodetección) (Figura 44B). Por el contrario, el análisis de la expresión
de la proteína mutante de Suc2 D22N, la inulinasa de K. marxianus y la exoinulinasa
de A. niger sí mostró una banda diferencial del tamaño esperado
(alrededor de 60 kDa en todos los casos) (Figura 44 C, D y E). Asimismo se
confirmó que todas las proteínas producidas en E. coli a excepción de Suc2
D22N, tenían actividad invertasa (Tabla 22).
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