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_____________________________________________________________________Discusión
Si la industria requiriera la producción conjunta de 1-kestosa y 6-kestosa, el
mutante N228A/N21S reuniría las características adecuadas para tal fin.
Una vez seleccionadas las mejores enzimas mutantes, el siguiente
paso será sintetizarlas en S. cerevisiae, como organismo GRAS, aceptado
para la producción de aditivos alimentarios. Para tal fin, convendría utilizar un
vector de expresión con un promotor eficiente en S. cerevisiae (como el
promotor Suc1) (Gozalbo y del Castillo Agudo 1994) y fusionar la secuencia
codificante con un péptido señal que promueva la secreción de la enzima
(como la secuencia señal del gen STA1 o la propia de Suc2) (Marín-Navarro
et al. 2011). No se prevé que las variantes enzimáticas seleccionadas tengan
ningún problema para plegarse correctamente y mantener sus propiedades
enzimáticas en este sistema de expresión, al tratarse del organismo de
donde se extrajo el gen SUC2 nativo. Otra línea de investigación futura sería
intentar conseguir que esta enzima utilizara preferentemente la sacarosa
respecto a los FOS como sustrato donador del grupo fructosilo. De esta
forma disminuiría la hidrólisis de los FOS sintetizados, aumentando su tiempo
de vida medio e incrementando el rendimiento de producción. En el presente
trabajo no hemos profundizado en aspectos tales como la especificidad de
sustrato de los mutantes respecto a la enzima nativa. Sin duda sería
interesante analizarlo para conocer más detalles acerca de la implicación de
estos residuos en la afinidad de la enzima por un sustrato u otro. Con la
aparición de la estructura tridimensional de la fructosiltransferasa de A.
japonicus (Chuankhayan et al. 2010), se abren además, nuevas dianas de
mutagénesis ya que esta enzima a pesar de pertenecer a la misma familia
GH32, presenta grandes diferencias respecto a otras invertasas y
transferasas en motivos de secuencia que parecen claves para determinar la
capacidad transfructosilante de estas enzimas.
Hoy en día también se optimiza la producción de FOS incorporando
otro tipo de enzimas, como por ejemplo la glucosa-oxidasa o glucosaisomerasa,
para degradar o transformar los productos que actúan como
inhibidores de la reacción. Una alternativa quizás más provechosa sería
incorporar enzimas que fueran capaces de utilizar la glucosa y la fructosa
libre para sintetizar de nuevo sacarosa, como sería el caso de la sacarosasintasa,
reciclando de nuevo el sustrato para la reacción de
transfructosilación.
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