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____________________________________________________________Materiales y métodos
Figura 21. Esquema que se siguió para el aislamiento de levaduras a partir de tierra
asociada a raíces de Allium sativum y Allium cepa.
La caracterización bioquímica se llevó a cabo siguiendo las
recomendaciones descritas en Yarrow (1998).
4 CITOMETRÍA DE FLUJO
Se incubaron los cultivos de levadura por triplicado en 1 ml de YPD
durante 38 h a 30ºC y posteriormente 6 h a 4ºC. Se hizo una dilución del
cultivo 1/20 en 1 litro de PBS estéril (130 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM
Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) y se añadió SDS 0.5%. Tras centrifugar 5
min a 4000 rpm, se disolvió el sedimento en 1 ml de etanol 70% a -20ºC y se
incubó 30 min a -20ºC. El sedimento resultante tras centrifugar 5 min a 4000
rpm se lavó con 1 ml de PBS y tras una nueva centrifugación, se resuspendió
en 250 μl de PBS con RNasa 0.1 mg/ml, manteniéndose 12 h a 37ºC. De
nuevo se centrifugó 5 min a 4000 rpm y el sedimento se resuspendió en 500
μl de tampón PBS. Las células se sonicaron a máxima potencia durante 10 s
comprobándose al microscopio óptico (40x) que no había células agregadas.
Se añadieron 5 μl de yoduro de propidio 50 μg/ml incubándose a 37ºC
durante 20 minutos en oscuridad. Las muestras se analizaron en un citómetro
de flujo EPICS® XL-MCL (Beckman Coulter) con un voltaje de 1039 V y una
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