catá logo de servicios diagnóstico molecular en hematologí a

RED NACIONAL DE CENTROS DE CÁNCERPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO DEL CÁNCERSUBPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICASCATÁLOGO DE SERVICIOSI. INFORMACIÓN GENERAL:HOSPITAL CLÍNIC-IDIBAPS- Nombre de la Unidad: Unidad de Hematopatología- Centro de la Red: IDIBAPS- Responsable general de la Unidad: Dr. Elías Campo- Teléfono de contacto: 93 227 54 50- E-mail de contacto: ecampo@clinic.ub.es- Responsable directo de la Unidad: Dra. Dolors Colomer- Nombre de la persona de contacto: Dra. Mireia Camós- E-mail de contacto: mcamos@clinic.ub.es, dcolomer@clinic.ub.es- Teléfono de contacto: 93 227 55 72 / 93 227 54 00 ext 3368- Fax de contacto: 93 227 55 72- Dirección para facturación:• Nombre: Emili Bargalló (ebargallo@clinic.ub.es)• Institución: Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS)• Calle: C/ Villarroel 170• Código postal: 08036• Localidad: Barcelona- Dirección para el envío de muestras:• Nombre: Dolors Colomer / Mireia Camós. Unidad de Hematopatología• Institución: IDIBAPS• Calle: C/ Villarroel 170, Hospital Clínic, esc. 2 5ª planta• Código postal: 08036• Localidad: Barcelona

HOSPITAL CLÍNICO SALAMANCAI. INFORMACIÓN GENERAL:- Nombre de la Unidad: Unidad de Biología Molecular/HLA- Centro de la Red: Servicio de Hematología. Hospital Clínico Universitario deSalamanca- Responsable general de la Unidad: Prof. Jesús San Miguel- Teléfono de contacto: 923 291 384- E-mail de contacto: sanmigiz@usal.es- Responsable directo de la Unidad: Dr. Marcos González Díaz- Nombre de la persona de contacto: Dr. Marcos González Díaz/ Ramón García Sanz- E-mail de contacto: margondi@usal.es; rgarcias@usal.es.- Teléfono de contacto: 923 291 629 / 923 291 384- Fax de contacto: 923 29 46 24- Dirección para facturación:• Nombre: Antonio Mata (amata@usal.es).• Institución: Centro de Investigación del Cáncer (CIC) (Tel: 923-29 47 20)• Calle: Avenida Universidad de Coimbra, Campus Universitario Miguel Unamuno.• Código postal: 37007• Localidad: Salamanca- Dirección para el envío de muestras:• Nombre: Marcos González Díaz. Unidad de Biología Molecular/HLA. Servicio deHematología• Institución: Hospital Clínico Universitario Salamanca• Calle: C/ Paseo San Vicente 58-182,• Código postal: 37007• Localidad: Salamanca

HOSPITAL LA FE- VALENCIAI. INFORMACIÓN GENERAL:Laboratorio de Biologia Molecular(Servicio Biopatología Clínica)- Nombre de la Unidad: Laboratorio de Biología Molecular (Servicio de BiopatologíaClínica)- Centro de la Red: HULaFe- Responsable general de la Unidad: Dr. José Maria Barrio Zabalza- Teléfono de contacto: 9619762714- E-mail de contacto: barrio_jos@gva.es-- Responsable directo de la Unidad: Dr. Pascual Bolufer Gilabert- Nombre de la persona de contacto: Dra. Eva Barragán González- E-mail de contacto: barragán_eva@gva.es ; bolufer_pas@gva.es- Teléfono de contacto: 961973160 o 961973351- Fax de contacto: 961973160Laboratorio de Citogenética y Biología Molecular (Servicio de Hematología)- Nombre de la Unidad: Laboratorio de Citogenética y Biología Molecular(Servicio deHematología)- Centro de la Red: HULaFe- Responsable general de la Unidad: Dr. Miguel A. Sanz Alonso- Teléfono de contacto: 961973057- E-mail de contacto: sanz_mig@gva.es- Responsable directo de la Unidad: Dr. Jose Cervera y Dra. Mª Leonor Senent- Nombre de la persona de contacto: Dra. Mª Leonor Senent- E-mail de contacto: senent_leo@gva.es, cervera_jos@gva.es- Teléfono de contacto: 963862700 ext.50869- Fax de contacto: 961973281Dirección para facturación:• Nombre: Fundación Investigación H. La Fe (www.fundacionlafe.org)• Institución: Escuela de enfermería 6ª planta, hab. 619• Calle: Avda Campanar 21• Código postal: 46009• Localidad: ValenciaDirección para el envío de muestras:• Nombre: Eva Barragan / Pascual Bolufer. Laboratorio de Biología Molecular• Institución: Escuela de Enfermería 7ª planta, Hospital Universitario La Fe• Calle: Avda. Campanar 21• Código postal: 46009• Localidad: Valencia

II. CATÁLOGO DE SERVICIOS OFERTADOS:1.Servicio ofertadoExtracción de ADN de:- Sangre periférica- Médula ósea- Material fijado e incluido en parafina- Material congeladoHOSPITALCLINICBarcelonaXXXXHOSPITALCLINICOSalamancaXXXXHOSPITAL LAFEValenciaXX-X2. Extracción de ARN de:- Sangre periférica- Médula ósea- Material fijado e incluido en parafina- Material congelado3. Análisis de productos de PCRmediante Genescan X X XSÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS4. Reordenamiento de Ig(análisis de región FR1 de la cadena pesadade las inmunoglobulinas)5. Reordenamiento de Ig(análisis de región FR2 de la cadena pesadade las inmunoglobulinas)6. Reordenamiento de Ig(análisis de región FR3 de la cadena pesadade las inmunoglobulinas)XXXXXXXXX X XX X XX X X7. Reordenamiento del TCR(cadena gamma del receptor de células T) X X X8. Reordenamiento del TCR(cadena beta del receptor de células T) X X X9. Estudio mutacional del gen de lasinmunoglobulinas X X -10. Reordenamiento IgH-BCL1(región MTC) mediante PCR X X X11. Sobreexpresión de ciclina D1mediante PCR a tiempo real X X -12. Reordenamiento IgH-BCL2(región MBR) mediante PCR X X X13. Reordenamiento IgH-BCL2(regiones mcr y 5’mcr) mediante PCR X X X14. Reordenamiento API2-MALT1t(11;18)(q21;q21) mediante RT-PCR X - -15. Detección del virus Epstein Barr (EBV)mediante PCR X - -XX-X

16. Detección del virus Herpes 8 (HHV-8)mediante PCR X - -17. Gen de fusión NPM-ALKt(2;5)(p23;q35)mediante RT-PCRSINDROMES MIELOPROLIFERATIVOSX - -18. Mutación V617F del gen JAK2mediante PCR alelo-específica X X X19. Gen de fusión BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)mediante RT-PCRX X X20. Cuantificación del gen BCR-ABLMediante PCR a tiempo real X X X21. Mutaciones del gen BCR-ABLmediante secuenciación directa X X -22. Mutación T315I del gen ABLmediante PCR específica X X -23. Gen de fusión FIP1L1-PDGFRαmediante RT-PCR X X XLEUCEMIAS AGUDAS24. Gen de fusión PML-RARα(LMA-t(15;17)(q22;q21) mediante RT-PCR X X X25. Cuantificación del gen PML-RARα(LMA-t(15;17)(q22;q21) mediante PCR atiempo real26. Gen de fusión RUNX1-RUNX1T1(AML1-ETO) (LMA-t(8;21)(q22;q22))mediante RT-PCR27. Cuantificación del gen RUNX1-RUNX1T1 mediante PCR a tiempo real(enfermedad mínima residual)X X XX X XX X X28. Gen de fusión CBFβ-MYH11(LMA-inv(16)(p13q22))mediante RT-PCR X X X29. Cuantificación del gen CBFβ-MYH11mediante PCR a tiempo real (enfermedadmínima residual)30. Gen de fusión ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) LLA t(12;21)(p13;q22) mediante RT-PCR31. Cuantificación del gen ETV6-RUNX1(TEL-AML1) LLA t(12;21)(p13;q22)mediante PCR a tiempo real (enfermedadmínima residual)X X XX X XX X X32. Gen de fusión E2A-PBX1LLA t(1;19)(q23;p13) mediante RT-PCR X X -

33. Cuantificación del gen E2A-PBX1LLA t(1;19)(q23;p13) mediante PCR a tiemporeal (enfermedad mínima residual)34.Mutación D816 del gen KITmediante PCR y sondas de hibridaciónX X -- X X35. Gen de fusión MYST3-CREBBP(LMA-t(8;16)(p11;p13)) mediante RT-PCR X - -36. Estudio de Duplicación Interna enTándem del gen FLT3 (ITD) mediantePCR o RT-PCRX X X37. Mutaciones puntuales del gen FLT3mediante PCR o RT-PCR X X X38. Mutaciones en el exón 12 del genNucleofosmina (NPM)mediante PCR o RT-PCRX X X39. Expresión de WT1RT-PCR cuantitativa - X X40. Expresión de EVI1RT-PCR cuantitativa - X X41. Gen de Fusión MLL-AF4(LLA- t(4,11) (q21 ;q23) mediante RT-PCR - X X42. Duplicaciones parciales en tandem(DPT) de MLLRT-PCRTRASPLANTE- X X43. Estudio de quimerismomediante PCR (análisis STR) y genescan X X X44. Estudio de quimerismo con separaciónde poblaciones celularesmediante PCR (análisis STR) y genescanX X X

III. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS SERVICIOS OFERTADOS:Los principales protocolos de los servicios ofertados se encuentran detallados en losdocumentos adjuntos en la dirección http://www.rticcc.org/1. Servicio de extracción de DNA y RNALa Unidad dispone de protocolos de extracción de DNA y RNA tanto de muestrasprocedentes de sangre periférica y médula ósea como de material fijado e incluido enparafina o material congelado.Posteriormente a la extracción se procede a la determinación de la concentración deDNA y RNA mediante la lectura por espectrofotometría.2. Servicio de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)Se dispone de protocolos para amplificación de DNA genómico mediante PCR y de cDNAtras realizar la técnica de retrotranscripción del RNA.2.1. PCR estándar (cualitativa)2.1.1. Detección de genes de fusión:2.1.1.1. Leucemia mieloide aguda (LMA):• RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO), LMA- t(8;21)(q22;q22)• CBFβ-MYH11, LMA-inv(16)(p13q22), tránscritos A, D y E• PML-RARα, LMA- t(15;17)(q22;q21), tránscritos BCR1, BCR2, BCR3• MYST3-CREBBP, LMA-t(8;16)(p11;p13)2.1.1.2. Leucemia linfoide aguda (LLA):• BCR-ABL, t(9;22)(q34;q11), tránscritos e2A2, B3A2, B2A2• ETV6-RUNX1 (TEL-AML1), LLA t(12;21)(p13;q22)• E2A-PBX1, LLA t(1;19)(q23;p13)• AF4-MLL, LLA t(4 ;11)(q21;q23)2.1.1.3. Síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC):• Leucemia mieloide crónica (LMC): BCR-ABL, t(9;22)(q34;q11),tránscritos B2A2, B3A2, E2A3• Síndrome hipereosinofílico: FIP1L1-PDGFRα2.1.1.4. Síndromes linfoproliferativos:• Linfoma MALT: API2-MALT1 t(11;18)(q21;q21)• Linfoma anaplásico: NPM-ALK t(2;5)(p23;q35)

2.1.2. Estudios de clonalidad en síndromes linfoproliferativosLos estudios de clonalidad en síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC) seanalizan según el protocolo del grupo BIOMED-2 (Leukemia 2003; 17:2257-2317).2.1.2.1. Reordenamiento de la cadena pesada del gen de las inmunoglobulinas:• Se analiza a petición del usuario el reordenamiento VH-JHestudiando las regiones FR1, FR2 o FR3 de la región VH de la cadenapesada de las inmunoglobulinas.2.1.2.2. Reordenamiento del receptor de células T (TCR):• TCR beta: se analiza el reordenamiento Vβ-Jβ.• TCR gamma: se analiza el reordenamiento Vγ-Jγ.2.1.2.3. Reordenamiento BCL1-IgH, t(11;14)(q13;q32):Se analiza el reordenamiento entre la región MTC (major translocationcluster) del gen BCL1 y la región JH del gen de las Ig.2.1.2.4. Reordenamiento BCL2-IgH, t(14;18)(q32;q21):• Región MBR (major breakpoint region)• Regiones mcr (minor breakpoint region) y 5’mcr2.1.3. Estudio de mutaciones2.1.3.1. Mutación V617F del gen JAK2 en SMPC:Se realiza una PCR alelo-específica o bien una PCR mediante sondas dehibridación (Taqman®).2.1.3.2. Mutación T315I del gen ABL:Se realiza una RT-PCR alelo-específica.2.1.3.3. Mutación D816 del gen KIT:Se realiza una PCR con sondas de hibridación específicas.2.1.3.4. Duplicación interna en tándem del gen FLT3 en LMA:Se realiza una PCR o RT-PCR y análisis mediante gel de agarosa olectura por Genescan. Cálculo de la ratio alelo mutado/germinal.2.1.3.5. Mutaciones puntuales del gen FLT3:Se realiza una PCR y posterior digestión del producto amplificado conuna enzima de restricción (Eco V).

2.1.3.6. Mutaciones en el exón 12 del gen Nucleofosmina:Se realiza una PCR o RT-PCR y análisis mediante Genescan.2.1.3.7. Duplicaciones parciales en tandem de MLL:Se realiza una RT-PCR y electroforesis en gel de agarosa.2.2. PCR a tiempo real (cuantitativa)2.2.1. Monitorización de enfermedad mínima residual:2.2.1.1. Cuantificación en LMA de:• Gen PML-RARα• Gen RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO)• Gen CBFB-MYH11• Expresión de WT1• Expresión de EVI12.2.1.2. Cuantificación en LLA de:• Gen ETV6-RUNX1 (TEL-AML1)• Gen E2A-PBX1• Gen AF4-MLL2.2.1.3. Cuantificación en LMC:• Gen BCR-ABL (p190 y p210)2.2.2. Determinación de los niveles de expresión de Ciclina D1 (mRNA) en síndromeslinfoproliferativos2.2.3. Determinación de niveles de expresión de diversos genes (mRNA) empleandolos assays de Applied Biosystems2.3. Estudios de secuenciación2.3.1. Estudio mutacional del gen de las inmunoglobulinas:Se realiza una PCR y posterior secuenciación directa del producto amplificadoutilizando el kit Big Dye v3.1 y comparación con la secuencia germinal en ladirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ o http://imgt.cines.fr2.3.3. Estudio de mutaciones del gen ABLSe realiza una PCR y posterior secuenciación directa del producto amplificadoutilizando Big Dye v3.1 y comparación con la secuencia germinal en el programahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi

2.4. Análisis por Genescan2.5. Análisis de short tandem repeats (STR) para estudio de quimerismo