Identificación bioquímica de los bacilos Gram-negativos Capítulo 9

2Hoja de Reporte de Desconocidos

Bacilos gram negativosIdentificación de bacterias:• Morfología de colonias• Pruebas bioquímicas en tubos• Sistema de identificación rápidos• Sistema de identificación automatizados• Ensayos de biología molecular3

Pruebas bioquímicasUtilización de hidratos de carbono:• Fermentación de lactosa: glucosa + galactosa:• galactoside permeasa – enzima trasportadora• galactosidasa – hidrolisa lactosa• Se utiliza la glucosa mediante glucólisis (Figura 9.1)• Bacterias congalactosidasa solamente son fermentadores lentos.• El uso de los carbohidratos puede ser mediante oxidación (aeróbicamente) ofermentación (anaeróbicamente).• MacConkey4

Pruebas bioquímicasPrueba de oxidación – fermentación (OF):• Se usa para diferenciar la familia Enterobacteriaceae (fermentadores) de lospseudomonads y organismos similares (no fermentadores).• Contiene 1% de carbohidratos y 0.2% de peptonas.• Indicador azul de bromotimol (Figura 9.2):• Verde – medio sin inocular• Amarillo – medio ácido• Azul – medio alcalino• Se inoculan dos tubos:• Aeróbico• Anaeróbico – se cubre con aceite mineral5

Pruebas bioquímicasTripple Sugar Iron Agar (TSI) & Kliger’s Iron Agar (KIA) – Figura 9.3:• Útiles en la identificación de patógenos intestinales.• TSI contiene:• Glucosa 0.1%• Lactosa 1.0%• Sacarosa 1.0%• Sulfato ferroso• Tiosulfato de sodio (H 2 S)• Peptona• Rojo fenol (pH 7.4) –indicador amarillo bajo 6.8• KIA sólo tiene glucosa y lactosa.6• Inoculación, incubación y lectura de resultados – página 216:

Pruebas bioquímicasOrtho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):• Se utiliza para diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa lentos,de los NO fermentadores.• Se usan discos con ONPG, estructura similar a lactosa.• ONPG entra rápidamente al interior de la célula bacteriana, sin la necesidad deutilizar la -galactósido permeasa.• Es metabolizado por la galactosidasa y libera galactosa y o-nitro-fenolgenerando un color amarillo.• Bacterias que producen pigmentos amarillos NO se deben probar.7• Es similar a p-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (PNPG).

Pruebas bioquímicasOrtho-nitrophenyl- -D-galactopyranoside (ONPG):• Se puede hacer preparando una suspensión de bacterias en salina y añadiendo undisco comercial o tableta de ONPG.• Se incuba a 37 °C y se examina a las 6 horas.• Dado que lagalactosidasa es una encima inducible:• El gen sólo se expresa si hay lactosa o un sustrato similar• La bacteria debe obtenerse de un medio que contenga lactosa8

Pruebas bioquímicasMethyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):• Se usa para clasificar las Enterobacterias.• La glucosa en el medio puede ser metabolizada por los microorganismos através de distintas vías metabólicas.• Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácidoacético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).• Con la adición de un indicador como rojo de metilo (MR) se puede detectar lapresencia de productos ácido (Figura 9.5).• Glucosa ácido pirúvico fermentación ácido-mixta (pH 4.4)9Color rojo con el indicador rojo metilo

Pruebas bioquímicasMethyl Red, Voges-Proskauer (MR-VP) (IMViC):• Mediante la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio (VP) se puedeevidenciar la presencia de productos finales neutros (Figura 9.5).• Glucosa ácido pirúvico acetoina Diacetyl + KOH +naftol• Algunas bacterias son negativas para ambas pruebas.Color rojo en presencia de 2-3 Butanediol10

Pruebas bioquímicasDecarboxylation Test:• Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de las Enterobacterias.• Se usan comúnmente dos aminoácidos: lisina, ornitina y arginina.• Cuando los aminoácidos pierden el grupo carboxilo, se convierten en aminasque incrementan el pH del medio y el indicador (bromocresol púrpura) cambiaa violeta.• Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina oarginina al 1% y un indicador de pH (bromocresol púrpura).11

Pruebas bioquímicasDeaminase Test (Figura 9.6):• Las desaminasas catalizan la pérdida de NH 3 en un aminoácido originando unácido carboxílico.• Se inoculan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina.• Después de la incubación se añade una solución de cloruro férrico al 10%, elcual reacciona con el acido y se torna oscuro.12

Pruebas bioquímicasUtilización de citrato (IMViC) (Figura 9.7):• Se usa para clasificar las Enterobacterias.• Se basa en la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energíaya que el medio contiene:• Citrato de sodio única fuente de carbono.• Fosfato monoamónico única fuente de nitrógeno.• El azul de bromotimol es el indicador de pH, que cambia a color azul en medioalcalino.• El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citratopermeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico.13

Pruebas bioquímicasDNasa:• Las DNasas son endonucleasas querompen los enlaces fosfodiester delDNA generando unidadespequeñas.• Algunas bacterias producen DNasasextracelulares:• Staphylococcus aureus• Serratia marcescens14

Pruebas bioquímicasDNasa:• El medio contiene DNA al 0.2%.• Se hace un inóculo pesado en línea recta.• Se incuba a 35 °C y se examina a las 18-24 horas.• Se añade HCl y se evalúa la formación de un precipitado negro.• DNA no hidrolizado es insoluble en HCl y se precipita.• Oligonucleótidos se disuelven en el HCl y se ve un área clara.15

Pruebas bioquímicasDNasa:• También se puede utilizar AgarDNasa, el cual es un medio diferencial .• Contiene nutrientes, DNA y verde demetilo como indicador, el cual se une alDNA cargado negativamente.• Cuando el DNA se rompe, ya no se uneal verde de metilo y se aparece un haloclaro alrededor del organismo:• Staphylococcus aureus – negativo• Serratia marcescens – positivo16

Pruebas bioquímicasLicuefacción de la gelatina:• La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportadosdentro de las células.• Las bacterias secretan enzimas extracelulares que hidrolizan los polímeros ytransportan los monómeros al interior de la célula.• La producción de proteasas, como la gelatinasa, es evaluada incorporando unaproteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa.• La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.17

Pruebas bioquímicasProducción de indol (IMViC):• Detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano.• La liberación de indol se debe a la degradación del aminoácido triptófano, unaminoácido constituyente de muchas peptonas, mediante la enzima triptofanasa.• Su usa un caldo de triptona, NaCl al 0.5% y el reactivo de Kovacs.• Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir el reactivo de Kovacs almedio, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la pruebaserá considerada positiva.• Si da negativo a las 24 horas, se repite a las 48 horas.18

Pruebas bioquímicasUtilización de malonato:• Se hace para determinar lacapacidad de utilizar malonato desodio como fuente de carbono.• El caldo de malonato tiene azul debromotimol como indicador de pH.• Las bacterias que usan malonatotambién sulfato de amonio comofuente de N 2 .19• Positivo por aumento en alcalinidadal usar sulfato de amonio, cambiaindicador de verde a azul (Figura 9-10).

Pruebas bioquímicasMotilidad:• La motilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos.• El movimiento se puede observar en cultivos frescos utilizando un microscopiode luz compuesto.• La motilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a lascorrientes en la preparación.• Se puede hacer en medios de cultivo conteniendo agar al

Pruebas bioquímicasReducción de nitrato y nitrito:• Se detecta una respiración anaerobia en la que usa nitrato como aceptor final deelectrones.• Los nitratos se reducen a nitritos mediante una reductasa de nitrato y en algunasbacterias, los nitritos se reducen a productos gaseosos (N 2 y N 2 O) mediantereductasa de nitrito.• Se inoculan medios conteniendo nitrato potásico y el nitrito se detectaañadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo.• Para saber si el nitrato se redujo a gas:• Tubo Durham.• Añadir zinc en polvo, color rojo indica presencia de nitrato.21

Pruebas bioquímicasOxidasa:• La prueba de oxidasa determina la presencia del sistema de citocromo oxidasa.• Es una prueba útil en la identificación de No-fermentadores (Pseudomonas spp.) yNeisseria spp., los cuales son positivos.• Permite diferenciar entre las Enterobacterias (negativos) y los Nofermentadores(positivos).• Hay varios métodos disponibles, incluyendo la prueba de Kovac (0.5-1% dediclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina).• Se añade una gota a un papel de filtro y se toca la colonia conun palito de madera o algodón y se frota contra el reactivo.22

Pruebas bioquímicasOxidasa:• El desarrollo de un color lavanda en10-15 segundos se considerapositivo.• Oxidasa positivo - Pseudomonasaeruginosa• Oxidasa negativo - Escherichia coli• El reactivo también puede añadirsedirectamente sobre la colonia, pero…23

Pruebas bioquímicasUreasa:• Se usa para determinar la capacidad de un organismo de usar la urea formandodos moléculas de amoniaco por la acción del enzima ureasa.• Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona, urea al 2% y rojofenol como indicador de pH.• La enzima hidroliza la urea (H 2 N-CO-NH 2 ) y origina amonio, el cual genera unaumento en el pH, el cual puede detectarse con el indicador.• Es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo paradiferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivotardío.24

Pruebas bioquímicasLysine Iron Agar (LIA) – asignación25

Pruebas bioquímicasSulfide-indole-motility (SIM):• Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.• Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indoly de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.• El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o deErlich, para originar un compuesto de color rojo.• Las cepas móviles pueden apreciarse por la turbidez que producen alrededor dela punción.26• Las cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de unprecipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato, siempre que elmedio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Pruebas bioquímicasMotility-Indole-Ornithine Agar (MIO):• Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae.• Por su composición, es posible detectar tres reacciones en un mismo tubo:movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.• La movilidad se demuestra por un turbidez en el medio o por crecimiento quese difunde más allá de la línea de inoculación.• La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.• La fermentación de glucosa baja el pH y cambia el indicador a amarillo.• La acidez provee condiciones óptimas para la actividad de la enzima.• La ornitina decarboxilasa decarboxila la ornitina presente.• Se alcaliniza el medio y cambia el púrpura de bromocresol a color púrpura.27

Sistemas de identificación manualesLos sistemas de identificación comerciales e basan en:• Reacciones basadas en pH• Reacciones enzimáticas• Utilización de carbono• Detección de crecimiento bacteriano• Detección de ácidos grasos volátiles y no-volátiles por cromatografía28

Sistemas de identificación manuales• Normalmente se incluye unacomputadora o libros con códigosnuméricos basados en el perfilmetabólico de los microorganismo.• API (Analytical Profile Index) paraidentificar Enterobacterias en elmercado desde 1970.• API 20E• Se genera un código de 7 dígitos.• Requiere oxidasa, no incluida.• Pruebas extras: nitrato y motilidad.• 20 cápsulas liofilizadas en una tirillacon sustratos basados en pH.29• Se prepara una suspensión debacterias, se inocula, se incuba 18-24 horas y se lee.

Sistemas de identificación manualesID Tri-Panel• Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivosusando pruebas bioquímicas.• Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.• El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentesantimicrobianos para determinar susceptibilidad.• Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.• Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.30

Sistemas de identificación manualesID Tri-Panel• Paneles para la identificación de organismos Gram-negativos y Gram-positivosusando pruebas bioquímicas.• Se pueden probar hasta tres organismos en un panel.• El panel contiene 104 microtubos con sustratos congelados y agentesantimicrobianos para determinar susceptibilidad.• Se utiliza un sistema computarizado para leer y analizar el panel.• Se utilizan reacciones adicionales: catalasa y oxidasa.31

Sistemas de identificación manualesOtros:• Crystal E/NF (Becton Dickinson)• RapID NS Plus (Remel)• Microbact (Oxoid)• Enterotube II (Becton Dickinson)• Uni-N/F Tek (Remel)• GN2 MicroPlate (Biolog)Biolog tiene una de las bases de datos más grandes.32

Sistemas de identificación automatizados• MicroScan• Sensititre• Vitek• BD Phoenix 100• Sherlock33

34Resumen: