Proteiinipuhdistus Johdanto - Edu.fi
Proteiinipuhdistus Johdanto - Edu.fi
Proteiinipuhdistus Johdanto - Edu.fi
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
www.edu.<strong>fi</strong>/biogeeni<br />
<strong>Proteiinipuhdistus</strong><br />
<strong>Johdanto</strong><br />
Proteiinien jälkikäsittely on monimuotoinen, usein myös vaikeahko ja kalliskin<br />
laji. Haastetta hommassa riittääkin jos esimerkiksi E.Colin tuottamista<br />
tuhansista proteiineista pitäisi yksi ainoa saada eristettyä talteen tehokkaasti<br />
hyvällä saantoprosentilla. Lopullisten proteiinituotteiden laatuvaatimukset<br />
vaihtelevat, esimerkiksi diagnostiikkateollisuudessa puhdistustavoite on usein<br />
90 - 95 %, rokotteissa 99 % ja lääkkeissä 99,99 %. Tekniikoita ja<br />
vaihtoehtoja on monia ja materiaalia löytyy runsaasti esim.<br />
kromatogra<strong>fi</strong>amateriaalien valmistajilta (esim. Sigma-Aldrich, GE,<br />
Bio-Rad, Giagen). Kromatogra<strong>fi</strong>alaitteistossa on yleensä pumppu,<br />
pylväs, detektori, piirturi ja fraktionkerääjä.<br />
Laboratoriossa aika ja raha rajoittavat usein toimintaa.<br />
Simulaatiolla voi testata näppärästi erilaisten vaihtoehtojen<br />
toimivuutta puhdistuksissa vaikka kotisohvalla. Eräs hyväksi<br />
todettu ja palkittu englanninkielinen proteiinipuhdistussimulaatio<br />
löytyy hakusanalla ”protlab”. Tekniikat ja proteiinipuhdistus<br />
tulevat varmasti tutuiksi kun ratkaiset ohjelman tehtävät.<br />
Kuva 1 Proteiininpuhdistuksen päävaiheet ja tavoitteet.<br />
1
www.edu.<strong>fi</strong>/biogeeni<br />
Laboratoriotyö: <strong>Proteiinipuhdistus</strong>. Lämpökäsittely ja ioninvaihtokromatogra<strong>fi</strong>a<br />
Tässä työssä perehdytään lämpökäsittelyyn ja ioninvaihtokromatogra<strong>fi</strong>aan ja lähtömateriaalina käytetään<br />
fermentointityössä tuotettuja E.coli-soluja. Jos käytettävissä ei ole ko. soluja niin muokkaa ohjeita<br />
käsiteltävälle materiaalille sopivaksi. Muista geneettisesti muokattujen organismien oikeat hävitystavat!<br />
Muista:<br />
1. Ei etanolia ja suolaa samaan aikaan matriisiin. Suolakiteet pilaavat kalliin matriisin. Matriisia voi<br />
käyttää erittäin monta kertaa kun sitä kohdellaan oikein.<br />
2. Tee letkuliitokset huolella ja vältä kaikin keinoin ilman pääseminen pylvääseen ja letkuihin. Ilma<br />
muuttaa kromatogra<strong>fi</strong>apylväsmatriisin rakennetta ja työn onnistumisprosentti on tämän jälkeen<br />
vaatimaton.<br />
Solujen<br />
hajottaminen<br />
Lämpökäsittely<br />
Näytteen lataus<br />
pylvääseen +<br />
pesu<br />
Eluointi<br />
Tulosten<br />
mittaus ja<br />
laskenta<br />
1. Punnitse 10 g E.colissa tuotettua solumassaa 50 ml Falcon-putkeen. Tuote on nyt solunsisäinen<br />
eGFP-proteiini. eGFP:n ja samankaltaisen punaisen dsRed –proteiinin tietoja on taulukossa 1.<br />
2. Lisää Falcon-putkeen puskuria A (20 mM Tris, pH 8) niin, että lopputilavuus on 40 ml. Homogenoi<br />
näyte voimakkaasti ravistelemalla.<br />
3. Tee ultraäänilaitteeseen ohjelma, jossa on 10 sekunnin hajotus + 10 sekunnin<br />
lepoaika ja kokonaishajotusaika on 3 min. Kiristä ultraäänilaitteen kärki kiinni<br />
työkalulla ja viritä laite ko. kärjelle sopivaksi. Löysästi kiinnitetty kärki voi hajottaa<br />
laitteen ja virheellisillä asetuksilla ajo voi myös vaurioittaa laitetta.<br />
4. Hajota solut ultraäänikäsittelyllä (sonikoimalla). Muista jäähdyttää näytettä<br />
hajotuksen aikana esim. jäähauteella, koska sonikoinnissa muodostuu paljon<br />
lämpöä.<br />
5. Sentrifugoi 10000 g, 10 min. Muista tasapainottaa ajo. Siirrä supernatantti (= yläliuos = tuote)<br />
uuteen 50 ml Falcon-putkeen ja kirjaa tuotetilavuus muistiin (kuva 2). Pipetoi putkesta 0,5 ml näyte<br />
(näyte 1) ja varastoi se pakkaseen riittävillä merkinnöillä varustettuna.<br />
6. Lämpökäsittele tuoteliuos (+70 °C, 30 min, sekoita useaan kertaan lämmityksen aikana).<br />
7. Sentrifugointi 10000 g, 10 min. Muista tasapainottaa ajo. Siirrä supernatantti uuteen 50 ml Falconputkeen<br />
ja kirjaa tuotetilavuus muistiin (kuva 2). Pipetoi putkesta 0,5 ml näyte (näyte 2) ja varastoi<br />
se pakkaseen riittävillä merkinnöillä varustettuna.<br />
8. Tutustu kromatogra<strong>fi</strong>alaitteistoon ja sen mahdolliseen ohjelmistoon huolella. Laitteiston toimivuus<br />
kannattaa kokeilla ennen varsinaista ajoa, koska monissa ajoissa käytetään suolaa ja kuivuneena<br />
tämä tukki tehokkaasti suodattimet, letkut ja detektorit, jos loppuhuuhtelut ovat olleet<br />
riittämättömät. Testauksen voi tehdä vaikka asentamalla kaikki ajossa tarvittavat osat, letkut,<br />
liittimet ja liuokset laitteistoon ilman kromatogra<strong>fi</strong>amatriksia. Aja työn aloituspuskuria ja varmista,<br />
että neste pääsee virtaamaan laitteessa eikä ilmaa tule mistään liuokseen. Tarvittaessa vaihda<br />
suodattimia, letkuja tai tiivistä liitoksia.<br />
9. Tee tarvittava ohjelma laitteeseen tai aja käsiajolla. Usein ensimmäisissä ajoissa on helpompaa ajaa<br />
käsisäädöillä ainakin eluutiovaiheeseen asti (=kohdeproteiinin kerääminen). Kun tuote ajetaan<br />
2
www.edu.<strong>fi</strong>/biogeeni<br />
pylväästä ulos lineaarisella gradientilla, niin tuohon tarvitaan useimmiten ohjelma. Toki tuotteen<br />
voi eluoida myös ”steppinä”.<br />
10. Valmista erotuspylväs (halkaisija noin 1 cm), anionimatriisista noin 10 cm (lisätietoja hakusanoilla:<br />
Q Sepharose fast flow, GE Healthcare) ja kiinnitä se laitteistoon.<br />
11. Poista matriisin ja letkujen säilytyksessä käytetty 20-prosenttinen etanoliliuos ajamalla laitteiston<br />
läpi puskuria A (virtausnopeusmaksimi 3 ml/min) niin kauan että absorbanssi- ja<br />
sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat.<br />
12. Aja näyte pylvääseen (max. 2 ml/min). Vihreän kohdeproteiinin tulisi jäädä pylvääseen kiinni.<br />
Ongelmatapauksissa pysäytä ajo ja yritä selvittää ongelman aiheuttaja (puskurit, matriisi).<br />
13. Aja tämän jälkeen puskuria A niin kauan, että absorbanssi- ja sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat<br />
eli kunnes kaikki sitoutumaton materiaali on tullut ulos pylväästä.<br />
14. Eluoi tuote pylväästä nousevalla suolagradientilla B puskurin (20 mM Tris, pH 8 + 1 M NaCl) avulla<br />
esim. 20 minuutissa. Muista käynnistää fraktionkerääjä eluoinnin alussa. Aja lopuksi eluutioohjelman<br />
loppuasetuksilla pylväs tyhjäksi (absorbanssi palaa lähes perusviivalle).<br />
15. Poista suolat järjestelmästä puskurin A avulla. Aja puskuria niin kauan, että absorbanssi- ja<br />
sähkönjohtokykylukemat tasaantuvat.<br />
16. Aja järjestelmään 20 % etanoli säilytysliuokseksi. Irrota pylväs, siirrä matriisi säilytysastiaan ja siirrä<br />
matriisi kylmäsäilytykseen.<br />
17. Analysoi valituista fraktioista proteiini- ja fluoresenssisignaalit. Yhdistä fraktiot lopuksi tulosten<br />
perusteella. Tee tuloksista puhdistustaulukko.<br />
Kuva 2 Ensimmäisessä kuvassa on denaturoituja proteiineja lämpökäsittelyn ja sentrifugoinnin jälkeen.<br />
Viereisessä kuvassa on saman vaiheen supernatantti. Kolmannessa kuvassa supernatantti on ajettu<br />
ioninvaihtopylvääseen ja viimeinen kuva on eluointivaiheesta.<br />
Taulukko 1 eGFP ja dsRed –proteiinien ominaisuuksia.<br />
Proteiini Viritysaallonpituus (nm) Mittausalue (nm) Koko (kDa)<br />
eGFP 485 535 noin 27<br />
DsRed 560 590 noin 27<br />
3
www.edu.<strong>fi</strong>/biogeeni<br />
Tulosten käsittely<br />
Täytä seuraavalla sivulla oleva puhdistustaulukko mittaustulosten perusteella ja tee lopullisista tuloksista<br />
kuvaaja. Spesi<strong>fi</strong>nen fluoresenssiaktiivisuus lasketaan kokonaisaktiivisuus jaettuna<br />
kokonaisproteiinimäärällä. Saantoprosentti lasketaan kyseessä olevan kohdan kokonaisaktiivisuus jaettuna<br />
alkuperäisellä kokonaisaktiivisuudella. Rikastuskerroin lasketaan samalla tavalla kuin saantoprosentti,<br />
mutta spesi<strong>fi</strong>sellä fluoresenssiaktiivisuudella. Alla olevassa kuvassa 3 on erään puhdistustyön tuloskuvaaja.<br />
Kuva 3 Entsyymipuhdistuskuvaaja.<br />
4
www.edu.<strong>fi</strong>/biogeeni<br />
Täytä oheista puhdistustaulukko töiden edetessä soveltuvin osin. Tee lopuksi tiedoista kuvaaja.<br />
Päivämäärä _____________________ Proteiini ________________________ Lähtömateriaali _________________________________ Solumassa (g) ____________<br />
Entsyymiaktiivisuusmääritysmenetelmä ________________________________<br />
Proteiinimääritys _______________________________<br />
Solujen hajotus, sonikointiaika, aktiivinen hajotusaika (min) ____ , syklit ____s + lepo ____s<br />
Vaihe<br />
V<br />
(ml)<br />
Proteiinipitoisuus<br />
(mg/ml)<br />
Proteiinia yht.<br />
(mg)<br />
Fluoresenssi<br />
(RFU/100 µl)<br />
Kokonaisfluoresenssi<br />
(RFU)<br />
Spesi<strong>fi</strong>nen<br />
fluoresenssiaktiivisuus<br />
(RFU/mg)<br />
Saantoprosentti<br />
(%)<br />
Rikastuskerroin<br />
5
Change language