PLAQUETTE L3 10-02-2012 - Université Paris Diderot-Paris 7

L3 BBM / BEE
30 UD TP 35 T R A V A U X P R A T I Q U E S à T H É M E 6 ECTS
Enseignant responsable : J. Wantyghem
ENZYMOLOGIE : 2 JOURS
1 Etude cinétique de l’activité de la chymotrypsine
Etude de l’état stationnaire : Substrats étudiés : Deux paranitro-anilides de spécificité différente.
Traitement des données cinétiques : Représentations graphiques permettant de déterminer KM et Vmax.
Calcul de kcat et kcat / K M.
Traitement statistique des données cinétiques - Ajustement des points expérimentaux à un modèle théorique.
Utilisation du logiciel Sigma-plot.
Confrontation des différentes déterminations.
Titrage de sites actifs.
Etude de l’état pré-stationnaire : Substrats étudiés : Para-nitrophénylesters.
Phénomène de jet.
Approfondissement du mécanisme réactionnel et détermination des constantes de vitesse des différentes
étapes.
2 Utilisation de la chymotrypsine pour sonder la structure tertiaire d'une protéine
Intérêt d’une protéolyse ménagée.
Visualisation des résultats sur un gel de poly-acrylamide de type SDS-PAGE-Tricine. Quantification des
résultats par un logiciel d'analyse d'image (ImageJ).
STRUCTURE et BIO-INFORMATIQUE : 2 JOURS
1 Etude structurale de l’Alcool-Déshydrogénase (ADH)
Etude de la cinétique de digestion de l’ADH par la trypsine.
Analyse des fragments obtenus par électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide
(SDS-PAGE).
Analyse des spectres de masse correspondant aux différents temps de digestion trypsique.
Comparaison des résultats expérimentaux aux prédictions établies à partir de la séquence de l’ADH.
Analyse du spectre de masse obtenu pour une digestion complète de l’ADH par la trypsine (mass peptide
finger-printing).
Spectre de fragmentation d’un des peptides issus de l’ADH par MS-MS et reconstitution de sa séquence.
2 Traitement informatique des données
Analyse des séquences primaire et secondaire et caractérisation de la structure tridimensionnelle des ADH.
Recherche dans les banques de données de la carte d’identité de l’ADH (code Swiss Prot, séquence
consensus….).
Recherche de protéines homologues.
Alignement de séquences des protéines homologues.
Prédiction de structures secondaires des protéines homologues.
Structure 3 D sous Rasmol, degré d’oligomérisation, visualisation du NADH et du zinc catalytique ou
structural, accessibilité des peptides obtenus lors de la digestion ménagée de l’ADH par la trypsine….
MÉTABOLISME : 2 JOURS
Etude du métabolisme oxydatif de la levure de boulangerie
Mesure de la vitesse de respiration des cellules entières.
Préparation des mitochondries de levure et de fractions sub-mitochondriales.
Vitesse de respiration des mitochondries et des fractions.
Action des inhibiteurs.
Localisation de la phosphorylation oxydative et de l’ordre des complexes de la chaîne respiratoire.
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