COURS APOPTOSE X. Caubit

Mécanismes de mort cellulaire
Mort par apoptose: processus physiologique qui inclue des signaux
spécifiques induisant le suicide et la mort cellulaire.
Les études effectuées chez le nématode, la drosophile et les mammifères montrent
que l’apoptose est un programme génétiquement contrôlé impliquant de multiples
effecteurs en réponse à de nombreux stimuli.
L’apoptose est une des modalités de mort cellulaire programmée

DEFINITIONS
La mort cellulaire programmée désigne une mort cellulaire physiologique impliquant un
processus actif et sous le contrôle d’un programme codé génétiquement par la cellule
elle-même.
L’apoptose est un cas de mort cellulaire programmée suivant une séquence d’évènements
cellulaires, cytologiques, bien précis, décrits en 1972 par Kerr, Wyllie et Currie (tissus humains et
de rongeurs).
Elle concerne les animaux et constitue le cas le mieux connu de mort cellulaire programmée.
Apoptose vient d’un terme grec qui désigne la chute des feuilles d’un arbre ou des pétales d’une fleur.
De nombreuses évidences montrent qu’il existe des cas de mort cellulaire programmée chez les végétaux (au
cours du développement ou en réponse à des pathogènes) mais les évènements cellulaires et cytologiques
associés ne sont pas comparables à ceux mis en jeu dans l’apoptose. D’autre part, il ne semble pas que les
programmes génétiques impliqués soient conservés.
La mort cellulaire programmée s’oppose à la nécrose, qui constitue un cas de mort «
accidentelle. La nécrose est un processus dégénératif qui intervient dans des cellules ayant
subi
des dommages physiques, chimiques ou osmotiques. Initialement considéré comme un
processus accidentel et non contrôlé, cependant il y a de plus en plus d’évidence montrant que
les morts par nécrose et apoptose présentent des similarités, la nécrose serait donc également
un mode de mort cellulaire régulée
La sénescence correspond à un arrêt de la prolifération irréversible. Des cellules normales en
culture ne peuvent se multiplier qu’un nombre limité de fois puis entre en sénescence. Elle peut
être induite prématurément par des signaux oncogéniques, des dommages dans l’ADN ou des
conditions de culture inappropriées.

Classification of cell death
Kroemer et al., 2008
L’apoptose : une modalité de mort cellulaire programmée

Mort cellulaire par apoptose classique– caractérisée par une marginalisation de
la chromatine et la fragmentation de la cellule et du noyau avant que des
modifications morphologiques soient observées dans les organites
intracellulaires
Nature Immunology 4, 416 - 423 (2003)

Autophagic cell death : mort cellulaire par
autophagie
(Sandu et al., 2005)
L’autophagie est le processus par lequel les organites et les autres constituants
cellulaires sont séquestrés et dégradés par les lysosomes. Le cytoplasme est
activement détruit bien avant que des changements soient observables dans le
noyau. Morphologiquement elle se caractérise par une vacuolisation du
cytoplasme et la formation de vésicules autophagiques.
C’est un mode de résistance au stress, permettant à la fois la survie au cours de
carences nutritionnelles et la mort des cellules endommagées au carencées
en facteurs de survie.

Différents types de morts
cellulaires
(Lockshin & Zakeri (2004). Int. J. Biochem. Cell Biol. 36: 2405)

La nécrose est une forme rapide et violente de populations
cellulaires étendues, caractérisée par un gonflement du
cytoplasme, la destruction de tout les organites et la rupture de la
membrane plasmique
A la différence de la nécrose, l'apoptose affecte en général des cellules
isolées, aboutissant à un processus de condensation et de fragmentation.
Induction intrinsèque de l’apoptose
Induit en réponse à des stimulation de mort
(activation d’oncogène, ADN dégradée)
Caractérisée par l’engagement des
mitochondries (et caspase-dépendante)
Apoptose/nécrose
Induction extrinsèque de l’Apoptose
Initiaté par la fixation d’un ligand de mort
”death ligand” (e.g. FasL) à un récepteur de
mort ”death receptor” (e.g. Fas).
Apoptose médiée par récepteur, apoptose
Caspase-Dependante.

Induction de l’apoptose
• Mort cellulaire programmée impliquée
dans l’élimination de cellules qui sont
produites en excès (lymphocytes,
neurones, ..)
• stimulus toxique (virus, produit chimique,
radiation ionisante)
• Signaux extracellulaires (Fas, p75 NGF-R,
TNF)
• ADN endommagée (p53)

Description cytologique de l’apoptose
APOPTOSE et NECROSE
L’apoptose a été décrite grâce à des observations en microscopie électronique
à transmission.
Elle se déroule en deux phases:
1. formation des corps apoptotiques
2. phagocytose de ces corps
La formation des corps apoptotiques est précédée de plusieurs évènements:
-La cellule se détache de ses voisines
-La chromatine se condense et s’accole à l’enveloppe nucléaire
-Le noyau et le cytoplasme se condense
-Les organites s’agglomèrent
-Le noyau se fragmente
-Enfin la cellule se condense
Ceci aboutit à la formation de protubérances à la surface des cellules qui
lorsqu’elles se détachent donnent les corps apoptotiques.
Ceux ci sont phagocytés.
Les modifications de la chromatine sont le résultat d’une fragmentation internucléosomique
réalisé par une DNAse.

L’apoptose se caractérise par une
fragmentation de l’ADN
Clivage de l’ADN au niveau des liens
internucléosomiques
DNA Laddering: fragmentation en
multiple de 180 bp

Nucléofilament
ADN de haut
poids moléculaire
ADN « fragmentée»
Faible poids moléculaire
ADN ladder
Après electrophorèse

Les premières manifestations morphologiques se caractérisent
par une compaction et une marginalisation de la chromatine
nucléaire, une convolution des membranes nucléaires et
cytoplasmique, une condensation du cytoplasme.
Le noyau se fragmente ensuite, chaque fragment est entouré
d'une double enveloppe.
Des corps apoptotiques
(éléments cytoplasmiques
et nucléaires) sont ensuite
relargués, et vont être phagocytés
par les cellules voisines,
sans aucune réaction inflammatoire.
On distingue très nettement l'apoptose
de la nécrose, qui détruit
immédiatement tous les organites
cellulaires, avec une conservation de
la forme générale (fantômes de cellules).

Nécrose Apoptose
L’apoptose

APOPTOSE et NECROSE
Différences apoptose/nécrose
Nécrose Apoptose
Déclenchée par des traumatismes,
des infections, des poisons, une
ischémie (embolie).
-concerne des groupes de cellules voisines
-pas d’activité endonucléasique observée
-dilatation de certains organites et compartiments
-dilatation cytoplasmique
-rupture des membranes
-réaction inflammatoire
Déclenchée par des infections,
des maladies, le vieillissement,
au cours du développement,…
-intervient dans des cellules isolées
-activité endonucléasique
-les organelles restent en général intacts
-condensation nucléaire et cytoplasmique
-formation de corps apoptotiques
-pas de réaction inflammatoire
La nécrose est considérée comme une mort cellulaire « passive » par opposition à l’apoptose,
Processus dans lequel la cellule joue un rôle actif.

Lors de l’apoptose l’élimination des cellules se fait par phagocytose
Phagocytosis tags and receptors

L’apoptose : un phénomène contrôlé et ordonné qui comprend de multiples étapes
1) Libération du cytochrome c, perte du potentiel de membrane de la mitochondrie
2) Activation des caspases
3) Inversion du positionnement de la phosphatidyl sérine
4) Condensation, marginalisation de la chromatine et dégradation de l’ADN par
des DNAses
5) Formation de corps apoptotiques phagocytés pas les macrophages

Généralités sur les rôles de l’apoptose
Longtemps, la mort cellulaire a été considérée comme le résultat d’une situation pathologique
même si dès le 19ième siècle certains scientifiques avaient déjà observé que la mort cellulaire
était une constante au cours du développement.
Il faut attendre la seconde moitié du 20ième siècle pour que l’idée selon laquelle la mort
cellulaire, notamment la mort cellulaire programmée comme l’apoptose, peut être, dans
certains cas, la réponse d’une situation non pathologique s’impose et devienne un sujet
d’intérêt.
Ainsi l’apoptose est impliquée dans:
-Le développement embryonnaire et post-natal (exemples: formation des doigts par destruction
des tissus interdigitaux, différentiation des organes sexuels, métamorphose chez les
amphibiens, les insectes….)
- Trois modalités de mort cellulaire
- phylogénétique: régression d’organes vestigiaux
- morphogénétique: fusion, repliement, mise en forme d’organes
- Histogénétique: ajustement d’un nombre de cellules à la fonction

Rôle de l'apoptose (suite)
• Au cours du développement
Le développement normal d'un organe s'effectue non
par modelage, mais par sculpture : les cellules sont
produites en grand excès puis certaines meurent, en
fonction des critères particuliers requis.
• A l'âge adulte
Dans le tissu normal, il existe un équilibre entre mitose
et apoptose. Les cellules nécessitent en permanence
certains 'facteurs de croissance' pour survivre.
Homéostasie: Renouvellement de la peau,
des cellules intestinales,…..

Métamorphose
Rôles de la mort cellulaire programmée dans le
développement embryonnaire et la morphogenèse
Les tubes de Muller important pour les
femelles sont éliminés chez les males
Formation de structures : Espaces interdigitaux
Elimination de structures : différenciation sexuelle, métamorphose,
Organogenèse : tube digestif, reins, tube neural, remodelage des os…
Contrôle du nombre de cellules: neurones dans le système nerveux central

Apoptose et développement
• Développement du système nerveux au cours duquel on
estime que 50% des neurones meurent par apoptose). Dans le
système nerveux les neurones sont produits en excès, ceux qui
survivent reçoivent des signaux de leurs cellules cibles
. Régulation/ajustement du nombre des neurones
• Le développement du système immunitaire (exemple:
constitution du répertoire T par sélection clonale dans le
thymus)
l'apoptose est responsable de la délétion des cellules T autoréactives
(permettant la tolérance du soi), et la sélection des
lymphocytes B responsables de la réponse immunitaire

Quelques exemples pour le système nerveux
Mort phylogénétique dans le système nerveux:
Suppression de cellules qui ont une fonction transitoire:
chez la sauterelle, deux neurones pionniers envoient leurs axones du SNC au
bourgeon de membre, puis meurent une fois que ces axones ont permis le
guidage des axones des autres neurones et ont formé le nerf principal de la
patte
Suppression de cellules qui ne sont plus nécessaires:
Chez les vertébrés: mort des neurones dans la partie caudale de la moelle
épinière permettant de ne laisser que des cellules gliales
Mort histogénétique dans le système nerveux:
- Très fréquent : correction des erreurs de connexion.
- Plasticité dans le cerveau adulte
- Mort des neurones impliqués dans la production du chant saisonnier du
canari

Apoptose et système immunitaire)
• Dans le système immunitaire, l'apoptose est responsable de
la délétion des cellules T auto-réactives (constitution du
répertoire T par sélection clonale dans le thymus, permettant la
tolérance du soi), et la sélection des lymphocytes B
responsables de la réponse immunitaire.
• Apoptose chez les organismes adultes
La réponse immunitaire: élimination de cellules infectées, élimination
en fin de réponse d’un certain nombre de cellules de l’immunité
ayant participé à cette réponse (à l’exception des lymphocytes T
ou B mémoire), élimination de cellules tumorales ou de cellules
infectées (virus, élimination des cellules anormales (Lésions de l’
ADN).
« Privilège immun » dans certains tissus (chambre antérieure de
l’oeil, le cerveau, les testicules, des antigènes ne déclenchent pas
de réponse immunitaire. Les cellules de ces tissus produisent un
fort niveau de FasL, les cellules T qui expriment Fas seraient
tuées si elles entraient dans ces tissus.
• Les lymphocytes cytotoxiques sont tueurs par induction de
l'apoptose de la cellule cible

• Elimination de cellules « dangereuses »
Cellules ayant de l’ADN endommagée
Cellules présentant un « signaling mitogénique » inapproprié qui est en conflit
avec l’environnement cellulaire
Élimination des cellules autoréactive du système immunitaire
Élimination des cellules infectées (virus, …) par le lymphocytes Tcytotoxiques.
Cellule cible
Lymphocyte T cytotoxique
Défense contre le cancer,
les agents infectieux :
Élimination des cellules tumorales
et des cellules infectées

Maladies associées à un dérèglement du processus apoptotique
Apoptose et pathologie
→ maladies neurodégénératives, maladies auto-immunes, Cancers

Mécanismes biochimiques
• De nombreux facteurs interviennent pour susciter l’apoptose, mais
tous aboutissent à une voie commune passant par la
mitochondrie, la protéine Bcl-2 et les caspases (voir plus loin).
• Les principaux mécanismes mettant en route le mécanisme de
mort cellulaire programmée sont :
– Le traitement des cellules par des substances cytotoxiques
– L’atteinte de l’ADN par des radiations ionisantes (protéine P53)
– L’hypoxie
– Une infection par des virus
– La transmission d’un signal de mort provenant de l’extérieur de
la cellule (récepteur Fas des lymphocytes cytotoxiques, des
natural killer, du facteur de nécrose TNFa )
– La privation de facteurs de croissance

C elegans un modèle pour étudier
les mécanismes d’apoptose
• L’identification des gènes impliqués dans l’apoptose
au cours du développement chez C. elegans
• La nature hautement reproductible du programme de
mort cellulaire et en particulier la reproduction des
patrons spécifiques de division/mort dans des mutants
suggère fortement une détermination génétiques.
• La mort cellulaire n’est pas une détérioration
passive comme on l’avait souvent cru
jusqu’alors, mais une fonction active, une voie
de différenciation terminale de la cellule,
nécessitant l’intervention de molécules
spécialisées.

Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans
(nématode)
Identification des gènes contrôlant l’apoptose

Le développement de C elegans
Sur 1090 cellules
générées, 131 meurent
Un animal adulte contient 959 cellules qui proviennent de 1090 cellules produites au
cours du développement embryonnaire.
Exactement 131 cellules somatiques subissent le programme de mort cellulaire (dans un
vers « sauvage »)
Parmi les 1090 cellules, 302 sont des neurones et de nombreuses morts cellulaire
programmée se produisent dans le lignage neuronal.

Le contrôle du développement à lieu lors de divisions asymétriques qui
produisent deux cellules filles qui adopteront des comportements différents.
Des mutations (mutants lin: pour «lineage » (lignage) altèrent le programme
de développement de différentes façons.
Exemple: mutants à lignage heterochronique, lin14, altération du « timing »
du changement d’états, une cellule adopte un programme de division
normalement destiné à une cellule plus jeune.
X indique une mort par mort cellulaire programmée

La mort peut être étudier à la résolution d’une
cellule
X
X
P11
P11aap
Adapter de Sulston and Horvitz,
Dev. Biology 56, 110-150, 1977

En 1983, E. Hedgecock a isolé deux mutants (ced-1 and ced-2)
impliqué dans la mort cellulaire, la découverte des ces mutants a été
très importante.
Dans le mutant ced-1, des cellules meurent mais ne sont pas
éliminées par phagocytose. Il y a persistance de corpuscules
cellulaire
(ced = Cænorhabditis elegans death genes)
sauvage
Mutant ced-1

Ellis et Horvitz ont recherché des mutations suppresseurs de ced-1
Ils ont isolé deux mutations ced-3 et ced-4
Dans ces mutants aucune cellules ne meurt d’apoptose, il s’agit de l’identification
des deux premiers gènes « tueurs de cellules »
Découverte du mutant ced-9, dans lequel toutes les cellules meurent

Les gènes impliqués dans la C.
elegans:
• egl-1, egg laying defective.
premier gène découvert impliqué dans le
processus de mort cellulaire programmé.
Une mutation gain de fonction provoque la mort
de deux neurones innervant la vulve, ce qui
conduit défaut de ponte des œufs.
• ced-4, cell death determining
caractérisé comme un suppresseur d’un gain de
fonction egl-1.

Gènes impliqués dans le processus de mort cellulaire
programmée (suite)
• ced-3
supprime la persistance de corpuscules cellulaire dans
des animaux défectifs pour la phagocytose. Dans le
double mutant ced-3/ced-1, il n’y a pas de mort par
apoptose.
• ced-9
Favorise la survie ou agit comme un régulateur négatif de
la mort cellulaire.
. Ced-1,-2,-5,-6,-7,-10
gènes impliqués dans la phagocytose (ou gène de
nettoyage). Ils n’agissent pas directement dans le
« système » de décision.

Identification des gènes contrôlant l’apoptose (suite)
Ced-9::Bcl-2
Ced-4::Apaf-1
Ced-3::protéase à cystéine active

Gènes impliqués dans la mort cellulaire chez C. elegans
(suite):
• L’analyse des phénotypes des doubles mutants
et des mutants gains de fonction
(surexpression/ou expression ectopique) indique
les relations entre les différents gènes.

Régulation moléculaire de l’apoptose:
C. Elegans:
Se fixe et inhibe Ced-9
Se fixe et inhibe
Ced-4
Se fixe sur et active Ced-3
Par oligomérisation
Caspase
Coupures de substrats
et mort

L’équivalent de Ced-3 chez les mammifères est l’enzyme de conversion
initialement connue comme ICE et rebaptisée Caspase 1 (Cys catalytic Asp
targeting protease).
Ced-4 agit comme adaptateur pour l’activation de caspases (Yang et al,
1998); l’équivalent chez les mammifères est Apaf-1.
Ced-9 a pour équivalent Bcl-2, considéré initialement comme un oncogène
découvert dans un lymphome humain, mais aujourd’hui considéré comme associé avec
un contrôle négative (protecteur) de l’apoptose. Les protéines Bcl-2 et ced-9 présentent
23% identité, et bcl-2 peut remplacer ced-9 chez C. elegans. Chez les animaux
supérieurs, Bcl-2 est un membre d’une grande famille de protéines dont certaines
favorisent la survie, d’autre la mort (voir plus loin).
Le gène egl1 code pour une protéine de cette famille qui contient un
domaine BH3 qui favorise la mort.
Les gènes ced représentent tous des composants communs à
toutes les morts cellulaires programmées.

Conservation des différentes familles de protéines impliquées dans l’apoptose

Inactivation de caspase 9
+/+
+/+
Diminution de la mort cellulaire programmée dans le cerveau des embryons Casp9-/-
-/-
-/-
-/-
Hakem et al, 98

L’apoptose un évènement bénéfique !
Apoptose dans les neurons au cours du développement du cerveau
Embryon sauvage E18.5. Embryon mutant Caspase 9-knockout E18,5
(From Kuida et al. (1998).
94: 325-37).

Inactivation de apaf chez la souris
-/-
Yoshida et al, 1998

L’équivalent de ced-9 chez les
mammifères est Bcl-2
• 1986: le gène Bcl-2 est cloné à
partir d’un évènement de
translocation (14/18)
responsable d’un lymphome.
• Bcl2 = B cell lymphoma
• Dans cette translocation, le
gène Bcl-2 est juxtaposé à
coté du locus qui code pour les
chaînes lourdes
d’immunoglobulines. Dans ce
locus Bcl-2 est surexprimé et
empêche la mort

Les travaux menés chez C elegans, la drosophile et les mammifères ont permis
de définir trois phases dans le déroulement du processus :
une phase de décision, une phase d’exécution et une phase d’élimination des
débris cellulaires.
La phase de décision peut dépendre de facteurs externes, sous la forme de signaux
de survie ou de mort émis par certaines cellules de l’organisme.
Elle peut aussi dépendre de facteurs internes, qui activent souvent, mais pas
toujours, la protéine P53.

Identification des gènes contrôlant l’apoptose
Prix Nobel de Physiologie ou de Médecine 2002
pour leur travaux sur l’organogenèse et la mort cellulaire programmée
Sydney Brenner
(britannique)
H. Robert Horvitz
(américain)
John E. Sulston
(britannique)

Qu’est ce qu’une caspase?
• Ced-3 et les caspases de mammifères : « les
exécuteurs » .
• Ced-3 code pour une cystéine protéase de 503 résidus
(55 kDa), qui est fortement apparenté à la caspase 1 de
mammifères.
• Cys catalytic Asp targeting protease, Caspase : Cystéine
protéase qui clive après un acide aspartique.
• Initialement identifié comme l’enzyme qui convertit (active)
l’interleukine 1β (ICE).
• Elles sont activées par protéolyse (après Asp).
• Elles peuvent s’auto activées et elles peuvent aussi
activées d’autres caspases. Elles peuvent donc réalisées
des cascades d’amplifications dans les cellules.
• • Les substrats « apoptotiques » des Caspases sont
nombreux (~40/nombre en augmentation).

CASPASES
Les caspases sont nécessaires et suffisantes pour induire l’apoptose
Mise en évidence du rôle des caspases en 1993 par la découverte de l’homologie
entre ced-3 et l’enzyme ICE (interleukin-1b processing enzyme) renommée depuis
caspase-1 et par la démonstration que la surexpression de la caspase-1 dans des
cellules de mammifères est suffisante pour induire l’apoptose.
surexpression de caspases
apoptose
Signaux inducteurs de l’apoptose
caspases
apoptose
Inhibiteur de caspases

Les caspases
Caspase-1, enzyme initialement identifiée comme ICE (Interleukin 1ß Converting Enzyme).
Elle se forme à partir d’une proenzyme de 45 kD, qui est activé par clivage protéolytique
en une forme « large » (p20) et « petite » (p10). La forme fonctionnelle (caspase active)
correspond à une forme homodimérique (p20:p10)2.

Mécanisme d’activation des caspases

Structure et régulation des Caspases
• Leur activité nécessite le clivage en deux sites.
• Elles contiennent un site actif conservé (Cystéine) dans le « Large
domaine »
• Elles possèdent un prodomaine qui contient des domaines
d’interactions avec d’autres protéines. Ces domaines permettent
l’activation des caspases
– CARD domain (domaine de recrutement des caspases)
– DED (Death Effector Domain)

CASPASES
Activation post-traductionnelle des caspases-8, 9
La pro-caspase 9 se trouve en majorité sous forme monomérique dans le cytoplasme et
le clivage n’est ni nécessaire ni suffisant pour l’activation.
Le changement de conformation permettant l’activation se produit lors de la dimérisation.
La dimérisation est stimulée par la liaison de la pro-caspase aux facteurs Apaf-1 et au
cytochrome c.
Grande ss-u Petite ss-u
Apaf-1
Cytochrome c
Activation par
régulation allostérique
Apoptosome
[caspase-9/Apaf-1/cyto c]
L’activation de la caspase-8 procèderait d’un mécanisme impliquant clivage et
régulation allostérique. La liaison à des protéines adaptatrices (voir plus loin) entraîne
la multimérisation et un changement de conformation qui constituerait une première
étape d’activation. Puis, le clivage permettrait alors d’obtenir une forme pleinement
active.

L’apoptosome
Complexe protéique de 1,7 Mda composé les
Protéines Apaf1, procaspase9 et cytochrome c
Ce complexe se forme (en présence d’ATP ) en deux
étapes, il favorise l’activation de la procaspase 9.

Autres niveaux de régulation des caspases
LES CASPASES
Bien que les caspases soient exprimées de façon constitutive par de multiples types
cellulaires et que les processus d’activation post-traductionnels sont de loin les plus
importants, d’autres mécanismes de régulation ont été identifiés.
1. Régulations transcriptionnelles
2. Phosphorylation
3. Dégradation (régulation de la demi-vie des caspases)

Les substrats cellulaires des caspases
CASPASES
Les caspases ne dégradent pas massivement les protéines cellulaires car leur
spécificité de coupure est trop étroite. Elles clivent en un ou quelques sites seulement
certaines protéines clés impliquées dans la structuration ou le fonctionnement de la
cellule. Une centaine de substrats ont été identifiés à ce jour, substrats qui peuvent être
classés en 6 catégories:
1. Protéines impliquées dans l’apoptose
2. Protéines kinases
3. Protéines de structure et protéines essentielles
4. Protéines impliquées dans des mécanismes de réparation cellulaire
5. Protéines de régulation du cycle cellulaire
6. Protéines impliquées dans des pathologies
Il est à noter que les modifications introduites par les caspases (clivage) et leurs
conséquences ont un caractère IRREVERSIBLE: notion de POINT DE NON RETOUR
(correspond au moment ou l’arrêt du stimulus apoptotique ne peut plus arrêter le
processus, coïncide avec l’activation des caspase effectrices) .

Les substrats cellulaires des caspases
CASPASES
1/ Caspases
Bid, Bcl-2, Bcl-xL (voir plus loin)
IAPs (inhibitor of apoptosis; voir plus loin)
DFF45/ICAD (DNA fragmentation factor 45 kDa; son inactivation permet le clivage
internucléosomique de la chromatine)
2/ Akt, FAK (kinases impliquées dans des signaux de survie)
PAK2 (kinase pro-apoptotique impliquée dans la formation des corps apoptotiques)
ROCK1 (membrane blebbing)
3/ gelsoline (entraîne la coupure des microfilaments d’actine et contribuerait ainsi à
l’arrondissement des cellules et à leur détachement de la matrice extracellulaire)
kératines, vimentine
lamines A, B, C
b-caténine, g-caténine (destruction des interactions cellule-cellule)
topoisomérase I et II, RNA pol I

Fragmentation de l’ADN par CAD lors de
l’apoptose
Lorsque ICAD est présente, elle inhibe CAD (caspase activated DNAse),
Lorsque ICAD est coupé par la caspase 3, elle n’exerce plus d’activité inhibitrice
sur CAD, celle-ci rentre dans le noyau et coupe l’ADN au niveau des liens
internucléosomiques.

Les substrats cellulaires des caspases
CASPASES
4/ DNA-dependent protein kinase (DNA-PK; active les mécanismes de réparation de
l’ADN en cas de cassures double-brin)
ATM (Ataxia Telangectasia Mutated; active les mécanismes de réparation de l’ADN
suite à certains dommages)
PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase; mécanisme de réparation de l’ADN)
5/ Wee1 (inhibition de Cdks; augmente la quantité de certains facteurs proapoptotiques)
p27 KIP1 (idem)
p21 CIP1 (idem)
Rb (inhition de E2Fs; augmente le niveau de synthèse des pro-caspases)
6/ certaines caspases clivent, par exemple, l’huntingtine et la protéine APP (amyloid
precursor protein), protéines impliquées respectivement dans la maladie de
Huntington et la maladie d’Alzheimer. Ce clivage favorise l’apparition des formes
pathogènes de ces protéines qui entraînent la mort de certains neurones.

L’initiation de l’apoptose implique une cascade
auto activée de protéase
il est essential d’avoir des régulateurs négatifs
très fort pour empêcher la mort par inadvertance,
ainsi qu’un mécanisme pro apoptotique bien
contrôlé pour initier le processus quand cela
est nécessaire.

Deux voies peuvent initier
Voie intrinsèque ou voie de la
mitochondrie
- Régulée par la mitochondrie
- Relargage du cytochrome c
Induction intrinseque de l’apoptose
Induit en reponse à des stimulation de mort
(activation d’oncogène, ADN dégradée)
Médiée via les mitochondries (et caspase
dépendante)
l’apoptose
Voie extrinsèque, via un récepteur de mort
-Activée par un ligand
- Fas, TNF alpha
Ces deux voies sont interconnectées, notemment au niveau des effecteurs (caspases)
Induction extrinsèque de l’apoptose
Initiaté par la fixation d’un ”ligand de mort”
(e.g. FasL) à un ”récepteur de mort”
(e.g. Fas).
Apoptose Caspase-Dependante liée à
l’activation de récepteur

L’apoptose dans les cellules matures
dépends de signaux soient internes
soient externes.
• Les cellules répondent à des conditions internes
non favorables ou des signaux provenant en
général des points de contrôle du cycle cellulaire
• Les cellules peuvent recevoir des signaux de mort
venant de l’extérieur
- Privation de facteur de croissance
- Élimination de l’auto-immunité par apoptose des
lymphocytes reconnaissant les auto déterminants
- Effets tueurs des lymphocytes T sur d’autres
cellules

La mort cellulaire et sa regulation
SURVIVAL
”Composants” de la survie et de l’apoptose
Extracellaires: Neurotrophic Factors and ”Death Receptor Ligands”
Membrane plasmique: Neurotrophic Receptors and ”Death Receptors”
Reguleurs cytoplasmiques: Bcl-2 family proteins, adaptor proteins
Effectors cytoplasmiques: Caspases
Regulation/Signalisation
"Survival Signal" "Death Signal"
YES
NO
YES
APOPTOSIS

Voie de survie : PKB/Akt

Voies d’activation des caspases et régulations
La voie intrinsèque: engagement de la mitochondrie
Cette voie est encore appelé voie du stress. Elle est activée en réponse à des signaux intracellulaires
(dommages à l’ADN), des signaux de stress (hypoxie, privation en facteurs sériques et
cytokines) ou par la dérégulation de la transduction de signaux contrôlant la prolifération
cellulaire (stimuli oncogéniques).
L’activation de cette voie converge vers la mitochondrie pour entraîner le relargage d’un certain
nombre de facteurs pro-apoptotiques contenus dans cet organite suite à la perméabilisation de la
membrane mitochondriale externe (nous nous limiterons à cet aspect).
Dommages ADN Stress Oncogènes
mitochondrie
Cytochrome-c Smac/Diablo
APOPTOSE

La mitochondrie : le forum de la mort
Mitochondrie et apoptose
- La mitochondrie est l’usine énergétique de la cellule
- Contient les moyens de sa destruction, elle séquestre un certain
nombre de protéines pro-apoptotiques, comme le cytochrome c
(transporteur d’électron).
Le cytochrome c à un rôle central avec la protéine Apaf-1, dans l’activation de la
caspase-9, dans le cytoplasme. Il doit traverser la membrane mitochondriale
externe
La régulation de ce processus est sous la dépendance des protéines de la famille
Bcl2.

Le Cytochrome c est une protéine abondante de la membrane interne de la mitochondrie,
elle agit comme un intermédiaire dans le transport des électrons. cytochrome c est
monomérique, et peut diffusé librement dans la membrane interne (contraire aux autres
cytochrome).
Les évènement de l’activation apoptotique conduisent à l’altération de la perméabilité des
protéines « pores » de la membrane mitochondriale. Il a été montré que le relargage initiale du
cytochrome c à lieu suite à un processus hautement spécifique impliquant les protéines de la
famille Bcl-2. (Adrain and Martin, 2001).

Voies d’activation des caspases et régulations
La voie intrinsèque: rôle des facteurs pro-apoptotiques libérés par la mitochondrie
Cas du cytochrome-c:
Cyt-c Apaf-1 Caspase-9 (initiatrice) Casp-3, 6, 7
Interaction et
Changement
de conformation
pour Apaf-1
Recrutement via
domaines CARD
Interactions
homophiliques
Apaf-1: Apoptosis Protease Activating Factor-1
Cas de Smac/Diablo et Htra2/omi:
Smac/Diablo
IAPs (Inhibitors of Apoptosis) Caspases activées
Htra2/Omi
Interactions
protéine-protéine

Voies d’activation des caspases et régulations
Les protéines de la famille bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale
externe
Il existe au moins une vingtaine de protéines dans cette famille. Elles peuvent être classées
en trois groupes en tenant compte de leurs caractéristiques structurelles et fonctionnelles.
BH: Bcl-2 Homology domain
Le domaine trans-membranaire (TM) est important dans le ciblage des protéines Bcl-2 vers les membranes
internes. Dans des cellules saines, Bcl-2 est localisé au niveau de l’enveloppe nucléaire, du réticulum
endoplasmique (RE) et de la membrane externe mitochondriale (Bcl-x L et Bcl-w se localisent dans la
membrane externe mitochondriale de façon prépondérante).

Voies d’activation des caspases et régulations
Les protéines de la famille bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale
externe
Bax et Bak sont nécessaires
pour l’apoptose. Ils pourraient
jouer un rôle dans le processus
de perméabilisation.
Bak est membranaire
(mitochondrie et RE).
Bax est cytoplasmique.
Les protéines BH3-only
fonctionnent en amont comme
capteurs des signaux proapoptotiques.
BH3
Bcl-2

Les protéines de la famille bcl-2 contrôlent la perméabilisation de la
membrane mitochondriale externe
membrane
externe
mitochondriale
Signal pro-apoptotique
BH3
?
Bcl-2 Bak
Bax
?
Bax
Bak Bax
oligomérisation
?
Cytochrome-c
Changements de conformation de Bax et Bak en réponse aux signaux proapoptotiques
permettent homo-oligomérisation

Bcl2 interagit avec les domaines BH3 des protéines tueuses BH3 (Bad, Bid, et NoxA)
Une manière d’empêcher l’inhibition par Bcl-2 est d’activer la transcription des
genes Bad, Bid, et NoxA, ces protéines empêcheraient l’action de Bcl2 et activeraient Bax
et/ou Bak
• Bax et Bak formeraient alors des multimères, s’insereraient dans la membrane externe de la
Mitochondrie. Cela conduirait à la perte du potentiel de membrane, l’ouverture de pore et la
libération du cytochrome c, et la multimerization de Apaf-1, ……etc

Voies d’activation des caspases et régulations
La voie extrinsèque: engagement des récepteurs de mort (vertébrés)
Induction extrinséque de l’apoptoses
Apoptose caspase dependante induite par des récepteurs
Composants:
• Recepteurs aux ligands de mort
• Ligands de ”mort”
• Proteines adaptatrices
• Caspases

Voie de mort par récepteur/ voie
extrinsèque

Voies d’activation des caspases et régulations
La voie extrinsèque: engagement des récepteurs de mort (vertébrés)
Les récepteurs de mort sont des protéines transmembranaires. Ils induisent l’apoptose suite à
leur activation par des ligands spécifiques. L’apoptose est donc ici déclenchée par des signaux
provenant de l’environnement de la cellule. Cette voie est importante, par exemple, dans le cadre
de l’immunité (développement du système immunitaire mais aussi réponse immunitaire).
Ligands et récepteurs de mort
(Shakibaei et al. (2005). Antioxid. Redox. Signal. 7: 482).

Ligands et recepteurs de morts
(Curtin & Cotter (2003). Cell. Signalling. 15: 983).

Famille des récepteurs TNF
Cysteine-Rich Domains
(CRD)
Death Domains (DD)
Se fixent sur DDs d’autres
protéines (e.g. FADD)…
…ce qui provoque leur
recrutement à la membrane
plasmique

Structure des récepteurs de mort
extracellulaire
intracellulaire
Voies d’activation des caspases et régulations
CD95
DD
CRD
CRD
CRD
CRD: Cystein-Rich Domain
(le nombre de domaines CRD est variable selon les récepteurs)
DD: Death Domain (80 acides aminés)
domaine d’interaction protéine-protéine

Voies d’activation des caspases et régulations
Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de CD95
DISC
(3, 6, 7)
FADD: Fas Associated Death Domain
Protéine adaptatrice
DED: Death Effector Domain
domaine d’interaction protéine-protéine
DISC: Death Inducing Signalling Complex
la caspase-8 contient un DED dans son
prodomaine

Activation de l’apoptose par le
ligand Fas (FasL)

Voies d’activation des caspases et régulations
Interactions entre les voies intrinsèque et extrinsèque
Type cellulaire I
Voie extrinsèque seule
Type cellulaire II
Amplification par voie intrinsèque
Notion démontrée pour des lignées
et certains types cellulaires in vivo
mais la réalité physiologique de cette
dichotomie n’est pas clairement
établie

Lymphocyte T cytotoxique
Cellule tumorale
La voie perforine/ granzyne
Young et al., Sci. Am., 1988.

Voie perforine/granzyme

1. Augmentation de Ca2+ intracellulaire
2. Induction d’une exocytose
3. Libération de perforine dans l’espace inter-cellulaire
4. Insertion dans la membrane de la cellule cible
5. Polymérisation des monomères de perforine
6. Formation de pores cylindriques

Mécanismes de survie en aval du cytochrome c
Sequestration by heat shock proteins
La protéine Apaf1 interagit avec les protéines heat shock hsp70 et hsp90, qui sont
des "holdase" de type chaperones. Hsp70 séquestre directement le domaine
CARD
et bloque le recrutement de la caspase-9 (Beere et al, 2000). Hsp90 s’ associe aussi
avec le monomère Apaf1, et contribue probablement à l’inhibition de la caspase.
Hsp90 pourrait entrer en compétition avec le cytochrome c (Pandey et al., 2000).
Inhibition directe de la catalyse des caspases:
les inhibiteurs des protéines apoptotique (IAPs)
Les IAPs représentent la dernière ligne de défense contre l’apoptose et agissent
en se fixant directement sur le site substrat des caspases.

Voies d’activation des caspases et régulations
Les IAPs: protéines inhibitrices de l’apoptose
Les premiers IAPs ont été identifiés chez les baculovirus et depuis ont été trouvés chez la drosophile et les
vertébrés.
Le domaine BIR est un caractère essentiel des IAPs mais n’est pas suffisant pour assigner un rôle antiapoptotique
à une protéine.
NAIP: Neuronal apoptosis inhibitory protein
c-IAP: Cellular IAP
XIAP: X-chromosome-linked IAP
Ts-IAP: testis-specific IAP
BIR: Baculoviral IAP repeat

Mécanismes de l’inhibition des caspases par les IAP
A. Situation non-apoptotique : Les domaines BIR des protéines IAP se lient aux formes clivées
dimériques des caspases-9, -3 et -7. Cette inhibition compétitive empêche l’association des
hétérodimères de caspases et leur activation.
B. Situation apoptotique : La protéine Smac/Diablo est libérée de l’espace inter-membranaire
mitochondrial et se lie avec les protéines IAPs. La formation de complexes entre IAP et
Smac/Diablo autorise l’association des hétérodimères de caspases. Celles-ci peuvent dès lors
induire la mort cellulaire (d’après Goyal, 2001).

Interactions entre les voies intrinsèque et extrinsèque
Schéma (simplifié) intégré des « voies de mort » par apoptose

Schéma général représentant
les deux voies principales
de déclenchement de la mort
cellulaire

Rôle primordial de la protéine p53 dans la régulation du cycle cellulaire.
En cas de prolifération cellulaire, en présence de c-myc, la protéine p53 va
contrôler la division cellulaire en vérifiant l’intégrité du DNA.
Si le DNA n’est pas correct ou si Bcl-2 est absent ou inhibé, on observe
une stimulation de la voie de l’apoptose. Si, au contraire, le DNA a pu être
réparé, le cycle cellulaire se poursuit.

Voies d’activation des caspases et régulations
Rôle de p53 dans l’apoptose
p53 découvert en 1979. Depuis 1985, identification d’isoformes
p53 est une protéine suppresseur de tumeurs; p53 est un facteur de transcription.
Dommages ADN
(UV, rayons X, Agents chimiques)
Hypoxie Oncogènes
Points de contrôle du cycle
Arrêt de la prolifération
Réparation de l’ADN
p53
?
Apoptose
Sénescence
?: régulations transcriptionnelles et non transcriptionnelles de gènes impliqués dans l’apoptose

Vérification de l’état de l’ADN par la protéine p53
certaines mutations entrainent une réelle instabilité génétique (par exemple perte de
fonction de la protéine nucléaire p53). Cette instabilité augment la fréquence de
mutations. D’autres mutations préviennent l’arrêt du cycle cellulaire nécessaire
Indispensable à l’examen et à la réparation d’ADN (par exemple la perte-de-fonction de
la protéine Rb).

Les porteurs de mutations de la protéine p53 transmises par les cellules
germinales, développent des cancers précoces

Rôle de p53 dans l’apoptose
Voies d’activation des caspases et régulations
Régulations transcriptionnelles de gènes de la famille Bcl-2
p53
Bax
Noxa (BH3)
Puma (BH3)
Régulations transcriptionnelles de gènes de la machinerie apoptotique
p53
Apaf-1
Caspase-6
Ces régulations peuvent initier l’apoptose
Ces régulations ne permettent pas,
probablement, l’initiation de l’apoptose mais
contribuent à potentialiser la réponse
apoptotique dans le contexte d’une libération
de cytochrome-c

Rôle de p53 dans l’apoptose
Voies d’activation des caspases et régulations
Régulations transcriptionnelles de gènes qui inhibent les voies anti-apoptotiques
p53
PTEN
Régulations transcriptionnelles de gènes codant des IAPs
p53
Répression
transcriptionnelle
RTK
PI3K
Akt/PKB
Survie
Survivine (IAP)
Bcl-2
L’importance de cette régulation
Dépend des types cellulaires

Exécution de l’apoptose dans les cellules
des mammifères.
La protéine P53 et plusieurs autres facteurs pro-apoptotiques
ont comme cible la protéine Bax. Ils stimulent l’activité de celleci,
soit par l’intermédiaire des protéines antagonistes Puma et
BCL2, soit par l’intermédiaire du facteur Bid. La protéine P53
stimule également la synthèse de la protéine Bax. Celle-ci fait
apparaître des pores dans la membrane mitochondriale externe,
par où s’échappent divers promoteurs d’apoptose (Diablo,
cytochrome c, AIF), qui contrôlent l’assemblage et le
fonctionnement de l’apoptosome, ainsi que la dégradation de
l’ADN nucléaire. Ce dernier phénomène peut être déclenché
plus directement par la protéine Parp1, qui contraint les
mitochondries à libérer le facteur AIF. Cette voie apoptotique ne
fait donc pas intervenir la chaîne des caspases.

Rôle de p53 dans l’apoptose
Contrôle non transcriptionnel de l’apoptose
Voies d’activation des caspases et régulations
Des données récentes tendent à montrer qu’en réponses à certaines signaux pro-apoptotiques, p53
s’accumule dans la mitochondrie. Cette accumulation provoquerait, selon un mécanisme non élucidé, la
libération du cytochrome-c et l’activation des caspases.

Voies d’activation des caspases et régulations
Régulation de l’apoptose dépendante de p53
Points de contrôle du cycle
Arrêt de la prolifération
Réparation de l’ADN
p53
Apoptose
Sénescence
Comment s’effectue le choix d’une réponse versus une autre réponse?
-pourrait dépendre du type cellulaire considéré
-pourrait dépendre du signal pro-apoptotique ou de son intensité
-pourrait dépendre de l’état d’activation d’autres voies ayant un impact sur les
voies apoptotiques par exemple (importance du microenvironnement)

Voies d’activation des caspases et régulations
Régulation de l’apoptose dépendante de p53
Un modèle postule que c’est l’amplitude et/ou la durée de la « réponse p53 » qui
sera déterminante dans la destinée de la cellule, c’est-à-dire la quantité de forme
active de p53 et la durée de vie de cette forme.
Quantité de
p53 active
q2
q1
arrêt
prolifération
apoptose
dt1 dt2
q1 < q2
(dt1; q1) = f (Intensité signal; durée signal)
(dt2; q2) = f (Intensité signal; durée signal)
p53
p53
Sites de haute affinité
p53
p53
Sites de faible affinité
p21
arrêt prolifération
Noxa
Apaf-1
apoptose
…………..
…………..

Voies d’activation des caspases et régulations
Régulation de l’apoptose dépendante de p53
Zhao et al. ont utilisé une lignée cellulaire p53-/- dans laquelle ils peuvent
contrôler le niveau d’expression de p53 produit à partir d’un transgène inductible
introduit dans ces cellules (appelées EB-1). L’induction est réalisée en utilisant
des traitements au ZnCl2 à différentes concentrations.
50mM: pas de mort cellulaire les premières 24H
Induction de l’expression de p53
après 8h de traitement au ZnCl2
100mM: Idem
200mM: mort cellulaire massive les premières 24H
Cinétique d’expression de groupes de gènes après un traitement au ZnCl2 (100mM)
Cluster 2: on retrouve des gènes de réponse à p53 qui contrôlent l’arrêt du cycle cellu
Cluster 3 et 4: on retrouve des gènes de réponse à p53 qui contrôlent l’apoptose

Voies d’activation des caspases et régulations
Régulation de l’apoptose dépendante de p53
Un second modèle intègre le fait que des modifications post-traductionnelles de
p53 peuvent modifier l’activité transcriptionnelle du facteur.
Les modifications les mieux étudiées de p53 sont les phosphorylations.
p53 P
p53 P
Signal 1 Signal 2
p53 P
P
p53
P
p21
p53
Noxa
…………..
P
P
P
P
p53
arrêt prolifération apoptose
Apaf-1
…………..

Voies d’activation des caspases et régulations
Régulation de l’apoptose dépendante de p53
Zhao et al. ont traité plusieurs lignées
cellulaires avec différents types de
rayonnements entraînant des
dommages dans l’ADN de différents
types et pouvant induire un arrêt du
cycle ou l’apoptose en fonction des
types cellulaires considérés.
UV Rayons g ZnCl2
Lignées 1, 2, 3 et 4 EB-1
Profil 1 Profil 2 Profil 3
Profil: ensemble des gènes induits ou réprimés par p53

La voie PKB/Akt
(Molecular Biology of the Cell (4. Ed;
2002 by Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, and Walter).
(Cancer Medicine 6 (Holland, Frei) 2003 BC Decker Inc.)

Des facteurs trophiques inhibent l’apoptose
Les récepteurs à dépendance

La voie PI3K/Akt
Voies d’activation des caspases et régulations
P
Akt P
P
p53 Bad (BH3) GSK3
expression de NF-kB
APOPTOSE
certains gènes proapoptotiques
expression de
gènes de survie
Bcl-X L
IAPs

Signalisation dans les cellules non
Signalisation via les récepteurs de survie,
tyrosine Kinase (en général les récepteurs
aux neurotrophines)
Stimulation de la PI-3 kinase
Stimulation de Akt
Phosphorylation de Bad
14-3-3 se fixe sur et inactivate Bad.
Famille Bcl-2 :
apoptotiques
Bax est de façon prédominante dans le
cytoplasme et une partie des protéines Bax est
fixée à la membrane de la mitochondrie et
intéragit avec Bcl-XL
Bax ne forme pas des canaux ioniques.
Pas de sortie du cytochrome c.
Apaf-1 se fixe sur Bcl- XL et n’interagit avec
la caspase-9
(Pettmann & Henderson (1998). Neuron 20: 633).

Signalisation dans les cellules en
apoptose
Pas de signalisation par les récepyeurs de survie
Pas de phosphorylation de Bad
Bad interagit avec Bcl- XL
Bad empèche l’action anti-apoptotique de Bcl- XL.
Famille Bcl-2 :
Bax est localisé de façon prédominante
fixé à la membrane et forment des
cannaux ioniques
Passage d’ion (entrée) à travers la
membrane la mitochondriale.
Sortie du cytochrome c dans le
cytoplasme.
Le cytochrome c se fixe sur Apaf-1.
L’ATP se fixe sur Apaf-1.
Caspase-9 se fixe sur Apaf-1.
Activation de la caspase-9.
Activation de la caspase-3.
On peut ajouter dans certain cas une
voie de mort extrinséque via les récepteurs
de mort ”death recepteur” (Pettmann & Henderson (1998). Neuron 20: 633).

Apport de la drosophile
Le potentiel des antagonistes des IAP antagonists semble plus important
chez la drosophile que chez les vertébrés, ce qui indique que les IAPs
peuvent avoir une importance relative chez différents organismes

Chez la drosophile on trouve 7 caspases (DCP-1, drICE, Dredd, DECAY, STRICA, et
DAMM, don’t un équivalent fonctionel de la caspase 9, DRONC),
- Une protéine homologue de Apaf-1 (Dark/Dapaf-1/HAC-1),
- Deux protéines de la famille Bcl-2 (Drob-1/Debcl/dBorg-1/dBok and Buffy/dBorg-2)
- quatre IAPs, DIAP1, DIAP2, Deterin, and dBruce
Diap1contient deux motifs BIR motifs et en position C-terminal un domaine
RING, qui possède une activité E3-ubiquitin ligase.

cytological region 75C
RHG genes: reaper, hid, grim, sickle
Les petites protéines HID, GRIM, REAPER, et SICKLE contiennent chacune un petit
motif hydrophobe qui se fixe au domaine BIR des IAPs

Les Caspases, Rpr, Grim, Hid and Jafrac2 ont une affinité différentielle et sélective de
fixation sur les domaines BIR des DIAP1. les antagonistes des IAP entrent en compétition
avec les caspases pour la fixation des IAPs. L’affinité relative de chaque “IAP-antagonists”
pour les domaines BIR est indiquée par des +.

Mécanisme d’action des protéines Grim, Reaper, Sickle et Hid
Model du mécanisme d’action de Grim, Reaper, Sickle, et Hid.
Le domaine N-terminal de Grim, Reaper, Sickle, et Hid se fixe aux IAPs, bloque leur capacité à
inhiber les caspases, et favorise l’autoubiquitination et la dégradation des IAPs par le proteasome.
Le domain GH3 de Grim (et peut de Reaper and Sickle), induit l’apoptose par la voie mitochondrial.
Les deux voies cooperent pour induire l’apoptose dans les cellules induites à mourir de façon Grimdependante.

La protéine Reaper a comme cible le facteur Diap1+. Elle agit de deux
manières:
1) elle ralentit la production de Diap1 en inhibant la synthèse protéique.
2) elle entraîne la dégradation de Diap1, en la contraignant à fonctionner
comme ubiquitine ligase et à fixer sur elle-même un signal de destruction
par le protéasome

Diap1 inhibe les caspases Dronc et Drice, en déclenchant la dégradation de
Dronc par le protéasome, et en empêchant Drice de fonctionner :
La protéine Diap1 a donc une double fonction en tant qu’ubiquitine ligase, car
elle peut déclencher sa propre destruction mais aussi celle de la caspase Dronc.
Dans les cellules où Reaper est actif, la protéine DRP1 provoque la
fragmentation des mitochondries
La protéine Reaper active donc les procaspases Dronc et Drice de deux
manières : soit en réduisant la concentration intracellulaire de la protéine
Diap1 soit en activant le facteur DRP1.

Dégradation des caspases
DIAP auto ubiquitination
et dégradation

Méthodes de détection de l’apoptose dans les cellules
Essai TUNEL colorimétrique (TdT-mediated dUTP nick end-labeling)
TdT: Terminal-deoxynucleotidyl-Transferase
Principe: la TdT permet l’ajout de dUTP biotinylé aux extrémités 3’OH de l’ADN fragmenté des cellules
en apoptose. On utilise ensuite de la streptavidine couplée à la peroxydase et on révèle en utilisant un
substrat de cette enzyme (DAB [diaminobenzidine], donne un précipité de couleur brune). Ainsi, les
noyaux des cellules apoptotiques apparaissent bruns ou noirs après le marquage qui peut être réalisé
sur des cultures de cellules ou des sections de tissus.

Essai TUNEL fluorescent
Techniques d’analyse
Principe: le dUTP est couplé cette fois-ci à la fluorescéine. Le marquage peut être réalisé sur des
cellules en culture même si ce sont des cellules non adhérentes et sur des sections de tissus. Ici, on
pourra analyser les résultats par la cytométrie de flux également ce qui permet dans certains cas des
quantifications plus fines du nombre de cellules apoptotiques.

Anticorps dirigés contre les caspases activées
Techniques d’analyse
anti-caspase 3 activée: anticorps polyclonal développé chez le lapin. Le peptide utilisé pour immuniser le
lapin est identique chez l’Homme, la souris, le rat et le hamster ce qui lui confère une réactivité croisée
importante. Il est particulièrement indiqué pour l’immunohistochimie (immuno sur sections de tissus et sur
cultures cellulaires adhérentes)

Coloration de l’ADN

Marquage annexin V

Méthodes de détection de
l’apoptose dans les cellules
Activité des Caspases : mesure de l’activité des caspases
Anticorps contre les formes actives des caspases
Cytochrome c Détection et relarguage du cytochrome c de la mitochondrie vers le cytoplasme
Mitochondrie Détecter des changements du potentiel transmembranaire de la Mitochondrie
Fragmentation d’ADN TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase-dUTP Nick End Labeling).
Caspase Activity TUNEL-staining
Red = active caspases Bright Green = DNA fragmentation
(http://www.b-bridge.com/eng/products/apop/cdk.htm)
Mitochondrial Transmembrane Potential
Apoptotic cell Normal cell
(J. Biol. Chem. 276: 35891-9, 2001).

Fin