Methodes d'évaluation de la biomasse

Méthodes de mesure de la Croissance

Constitution des Microorganismes
Protéines 52.4%
Polysaccharides 16.6%
Lipides 9.4%
ARN 15.4%
ADN 3.2%

Composition Elémentaire
95% du poids sec d’une cellule sont composés d’ éléments
majeurs : C, O, H, N, S, P, K + , Ca 2+ , Mg 2+ et Fe 2+ …
C (50%)
O (20%)
N (14%)
H (8%)
P (3%)
S, (9%)
Na et K (1% chacun)
Ca , Mg (0,5% chacun)
Fe (0,2%)
les oligoéléments (0,2% cumulé)
(éléments traces : Co, Zn, Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se..)

Élémént
C
O
N
H
P
S
Teneur pour 100g de cellules
m(g)
50%
20%
14%
8%
3%
9%
MA
0,28
Formulation pour un microorganisme
CH 1,92 O 0,3 N 0,24
12
16
14
1
31
32
Nbre m/MA
4,16
1,25
1
8
0,1
Pour 1C
1
0,3
0,24
1,92
0,02
0,067

CO 2 + H 2 O +
CH 3 COOH + C 2 H 5 OH
C 6 H 12 O 6 + NH 4 CL + O 2 +
CH 1,92 O 0,3 N 0,24
ADP + Pi
ATP
CH 1,92 O 0,3 N 0,24
CH 1,92 O 0,3 N 0,24 : 50% de protéines
CHALEUR

Mesure du nombre : comptage total
des particules
-Chambre de comptage de Petroff-Hausser, hémocytomètres, hématimètre
- rapide, peu sensible, pas de distinction vivante/morte (sauf si coloration)
-plus facile si coloration
- besoin de concentration importante (>10 7 cellules /ml)

Cellule de Malassez

Cellule de Petroff-Hausser
25 carrés couvrent une surface de
1mm2.
On compte les bactéries (x) dans
quelques carrés pris au hasard (n).
Nbre total de bactéries dans 1mm2
X = (x/n) 25
La chambre a une profondeur de
0,02mm ( Volume: 0,02mm3)
Bactérie/mm3 = (x/n) 25 . 1/0,02
1mm3 = 1µl

-marquage fluorescence (épifluorescence – ex : acridine orange
ou DAPI – ADN – avec orangé d’acridine, on peut en théorie
distinguer les bactéries vivantes qui sont vertes, et les bactéries
mortes qui sont rouges en fonction du degré d’ouverture de la
chaîne d’ADN)

-Obtention d'une sonde marquée par NickTranslation.
-Hybridation in situ avec l'ADN dénaturé.
-Traitement avec des anticorps fluorescents pour localiser
le gène d'intérêt au microscope à épifluorescence

Evaluation of the physiological state of
Lactobacillus helveticus CNRZ32
in different conditions using in situ
hybridization.
(a) Cells at the beginning of the exponential
growth phase, incubated in MRS broth for 1 h
at 42 °C.
(b) Cells in exponential growth phase,
incubated in MRS broth for 3 h at 42 °C
(control).
(c) Cells submitted to a stress treatment in
acid MRS broth (pH 3.5–3.6) for 2 h at 42 °C
after growth in optimal conditions for 1 h at
42 °C.
(d) Cells incubated for 24 h in MRS broth at
42 °C.

Coulter Counter
Cytomètre de flux
COMPTAGE AUTOMATIQUE

Compteurs électriques de particules de type Coulter
pour grands microorganismes (levures non filamenteuses, protozoaires, algues)

La Plage de mesure varie entre 1 et
360µm
Principe du Coulter Counter
Basé sur la variation de résistance
provoquée par les particules placées dans un
champ électrique.
Résistance mesurée entre 2
électrodes de part et d’autre d’un orifice
calibré à travers lequel les particules sont
aspirées.
Chaque fois qu’une particule
traverse l’orifice, elle déplace son propre
volume d’électrolyte et génère un signal
proportionnel au volume de liquide déplacé.
Un dispositif manométrique permet
de mesure le volume de liquide aspiré et
connaître la concentration de particule

La Cytométrie de Flux

Un système complexe de filtres et de détecteurs permet de
faire plusieurs mesures simultanées
(2 mesures de diffraction et des mesures de fluorescence).

MESURES INDIRECTES DU NOMBRE DE
CELLULES

Dénombrement des bactéries cultivables
Dénombrement des CFU (unités formant colonies) sur un milieu solide le plus souvent
méthode précise mais longue et problème si les amas de cellules ne sont pas dissociés
Dilutions en série suivies du dépôt d’un volume connu sur boîte :

Filtration sur Membrane

Mesures visuelles d’un trouble
il faut que la concentration en bactéries atteigne au moins 10 7 /ml afin
que le milieu commence à apparaître trouble.

-turbidimétrie :estimation d'une concentration particulaire par l'évaluation
(macroscopique, à l'oeil) d'un trouble et par comparaison avec une gamme étalon
ex: étalon de Mac Farland
-peu précise
- donne un ordre de grandeur :
détermination visuelle de la turbidité :
Pas de trouble = moins de 10 7 bactéries/ml
Trouble léger = 10 7 –10 8 /ml
Trouble important = 10 8 –10 9 /ml
Trouble très important = plus de 10 9 /ml (les cultures
atteignent rarement plus de 10 10 /ml)
Utilisation éventuelle d’une gamme standard de McFarland :
0,5Mc farland = 10 7 –10 8 CFU/ml -

Technique du Nombre le plus probable

Mesure de la masse
-directe : détermination du poids sec des organismes -
culture/centrifugation/lavage/séchage à 100-110°C dans un four
-/pesées –
- méthode longue et peu sensible/précise, pas de distinction entre les vivantes
et les mortes.

Mesure de l’absorbance
Dédié à la mesure de particules d’une taille typiquement comprise entre 0.05
µm et 5 µm.
l’importance de la diffraction de la lumière est mesurée par un
spectrophotomètre à des longueurs d’ondes autour de 600 nm (pour minimiser
absorbance du milieu).
-Méthode précise, simple, rapide mais ne distingue pas cellules vivantes et
mortes, peu sensible (il faut plus de 10 6 bactéries/ml)
-problème des milieux très colorés ou très troubles
– Nécessité d’être dans la gamme de linéarité ou diluer la solution.

Io I lumière diffractée (mesurée
par néphélomètre)
lumière transmise (mesurée
par spectrophomtomètre)

DO à
600nm
DO = f (C)
Mg/ml
Courbe poids sec
-Dans la partie linéaire, l’intensité transmise peut être déterminée par la loi
de Beer-Lambert
.
Loi de Beer-Lambert : A = D.O = log (I 0 / I) = ε l C
où A:: l'absorbance, D.O: la densité optique
Ιο l'intensité lumineuse incidente, Ι: l'intensité lumineuse
transmise,
ε: le coefficient d'extinction molaire caractéristique de la substance
étudiée à une longueur d'onde donnée en L mol -1 cm -1 ,
L: l'épaisseur traversée en cm et C: la concentration en mol.L -1 .

Centrifugation
Surnageant
Culot repris dans l’eau/lavage
Centrifugation
Surnageant
Solution de Travail: DO=1
2/10 4/10 6/10 8/10 1
DO(600nm)
Confection de la courbe Poids sec
Culot repris dans un volume 20 ml
Solution mère DO = 50 : x mg/ml
Db: mg/ml
10ml mis à sécher
Les cellules sont pesées
Densité bactérienne: mg/ml

Mesure du Volume Cellulaire global
Fast, reproducible and reliable determination of biomass in suspension cell cultures
with VoluPAC tubes
Joachim Luecke Nature Methods - 3, (2006)
For PCV measurements, aliquots of a
well-mixed suspension culture (CHO
cells) (100–1,000µl in multiples of
100µl) were transferred into VoluPAC
tubes.
The tubes were centrifuged in a
microcentrifuge equipped with a
swinging bucket rotor for 1 min at
2,500g (5,000 r.p.m.).
The height of the cell pellet was
visually determined by taking a reading
from the capillary graduation;
alternatively, an image analysis device
was used.

Mesure de l’activité
- consommation de substrat
- mesure de constituants cellulaires
-dosage des protéines
- dosage de l’azote cellulaire (Kjeldal)
- nucléotides tels ATP, FAD, FMN (ex : ATP par luciférase de
luciole dépendante de l’ATP. On peut détecter 10 4 bactéries/ml)
- mesure des produits d’excrétions
(ex : 14 CO 2 )
- mesure des variations physico-chimiques du milieu
(ex :pH, potentiel redox, conductivité/impédance, chaleur)

Très sensible: détecte 10 -10 mg d’ATP soit 10 -16 moles (1O -10 µmoles)
Pool d’ATP chez E. coli: 4,5-7,5µmoles/g
Turn over: 4-8/s
luciferase