Première observation de la maladie de la galle du collet causée par Agrobacterium tumefaciens

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Downloaded by [Mehdi El Arbi] at 03:23 12 February 2012 M. El Arbi et al. 460 Matériels et méthodes Localisation de la parcelle La parcelle cultivée en oliviers à huile, Olea europaea, variété ‘Chemlali’ se trouve dans la zone d’Elkarma de la région d’Elhouareb, délégation de Haffouz du Gouvernorat de Kairouan (Fig. 1). Isolement de la bactérie Les échantillons végétaux ont été lavés à l’eau courante afin d’enlever les particules de sol adhérentes aux galles, puis les galles ont été désinfectées en surface à l’eau de javel (0.5%) et lavées à l’eau distillée stérile. Des fragments de tumeurs coupés aseptiquement ont été broyés au mortier dans de l’eau distillée stérile. La suspension obtenue a été laissée à la température ambiante pendant 30 min avant de procéder à l’isolement par étalement sur du milieu Mannitol-Glutamate additionné de tellurite de potassium comme préconisé par Mougel et al. (2001). Après incubation à 28 ◦ C pendant 48 h, les colonies individualisées et caractéristiques, circulaires, convexes et de couleur noire ont été repiquées sur le même milieu pour purification par épuisement. Fig. 1. Localisation de la parcelle où a été détectée l’infection. Identification des biovars Les isolats ayant la forme et la consistance des agrobactéries ont subit les tests biochimiques décrits par Moore et al. (1988). Ces tests regroupent la coloration Gram, la production d’uréase, l’hydrolyse de l’esculine et la production de 3-cétolactose. L’observation microscopique d’Agrobacterium tumefaciens révèle des bactéries en bâtonnet à Gram négatif. Le virage de l’indicateur coloré au rose suite à l’alcalinisation du milieu de Christensen traduit un test d’uréase positif, un test positif d’hydrolyse de l’esculine se manifeste par une coloration noire du milieu de culture due à la libération du glucose et de l’esculétine, responsable de cette teinte en présence de sels de fer et la production du 3-cétolactose se traduit par l’apparition d’un halo jaunâtre autour des colonies d’Agrobacterium. Si les trois précédents tests biochimiques sont positifs, la souche isolée fait alors partie du biovar 1 (i.e. complexe A. tumefaciens). Test du pouvoir pathogène des isolats sur Kalankoë et olivier Les tests du pouvoir pathogène ont été effectués avec des jeunes plants de Kalankoë (Kalankoë daigremontiana)
Downloaded by [Mehdi El Arbi] at 03:23 12 February 2012 Agrobacterium tumefaciens on olive 461 blessés au niveau du collet à l’aide d’un scalpel stérile. L’inoculation a été réalisée avec une anse préalablement trempée dans une colonie âgée de 48 h au niveau des blessures (Moore et al., 1988). La sensibilité d’Olea europaea à l’isolat O7 d’Agrobacterium tumefaciens a été testée sur des plants d’olivier ‘Chemlali’, produits par micropropagation de bourgeons axillaires, âgées de quatre mois, dans les mêmes conditions que pour les plants de Kalankoë. Confirmation du pouvoir pathogène par PCR L’ADN génomique a été extrait à l’aide de Kit Dneasy TM Tissue Kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France). L’ADN a été quantifié en comparaison avec une gamme étalon d’ADN de thymus de veau grâce au logiciel Molecular Analyst (Bio-Rad, Ivry sur Seine, France). Les amorces F749 (5 ′ -GCTAGCTTGGAAGATCG- CAC-3 ′ )etF14(5 ′ -GAACGTGTTTCAACGGTTCA-3 ′ ) dessinés dans la région localisée entre le gène virB11 et virG15 de la plupart des plasmides Ti (Nesme et al., 1989) ont été utilisées pour détecter par PCR la présence de plasmide Ti dans les isolats. La PCR a été effectuée dans un volume réactionnel de 25 µL contenant: 5 µL del’ADN extrait, 2.5 µL de Tampon Taq (10 mM Tris-HCl [pH 8.3], et 0.01% de gélatine), 2.5µL de dNTP’S (20 mM), 0.75 µL deMgCl2 (50 mM), 11 µL deH2O ultra pure, 0.75 µL de W%, 2.5 µL de chaque amorce et 0.25 µL de Taq polymérase (2 U, Gibco-BRL) (Rhouma et al., 2005). L’amplification a été effectuée dans un thermocycleur Perkin-Elmer selon le programme suivant : une dénaturation initiale à 95 ◦ C pendant 7 min, suivie de 35 cycles (1 min à 95 ◦ C, 1 min à 55 ◦ Cet1minà 72 ◦ C). Les produits de la PCR (5 µL de chaque échantillon) ont été mélangés avec 5 µL d’un tampon de dépôt (Saccharose, bleu de bromophénol et TBE 5×) et déposés sur un gel d’agarose horizontal de 1% contenant 1 µg ml −1 de bromure d’éthidium. La migration a été réalisée Arbre malade Arbre sain dans un tampon TBE 1x par une électrophorèse horizontale à 80 V pendant 90 min. Les gels d’électrophorèse colorés au BET ont ensuite été exposés aux UV (302 nm) et photographiés. Les produits PCR purifiés à l’aide du kit QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France) ont été séquencés à l’aide d’un séquenceur automatique à capillaires Megabace 1000 (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Orsay, France). Les séquences vérifiées par examen visuel des électrophorégrammes ont été alignées par le programme CLUSTALW (Thompson et al., 1994). La qualité de l’alignement a été contrôlée en utilisant le programme SEAVIEW (Galtier et al., 1996). Pour la comparaison des séquences avec d’autres de référence, nous avons utilisé le programme SeqApp (Gilbert; http://iubio.bio.indiana.edu/ soft/molbio/seqapp/; A Macintosh Biosequence editor, analyser and network handyman). A partir des séquences alignées, un arbre phylogénétique a été réalisé selon la méthode de construction implémentée dans le logiciel TREECON1.3b (http://www.psb. rug.ac.be/bioinformatics/psb/Userman/treeconw.html). Résultats et discussion Symptômes observés Des symptômes d’affaiblissement général associé à une coloration des feuilles tendant vers le vert pâle ont été observés au champ chez des oliviers de la variété ‘Chemlali’ (Fig. 2a). A l’examen, les arbres présentant ces symptômes portaient des galles plus ou moins volumineuses (2 à 3 cm 3 ) selon leur emplacement au collet ou sur les racines (Fig. 2b). Ces galles sont plus ou moins sphériques, blanchâtres, spongieuses à ferme et dont la surface est irrégulière rappelant l’inflorescence d’un choufleur. En vieillissant, les galles augmentent rapidement de taille, leur surface se mamelonne, puis elles durcissent et se fendillent à la périphérie, tandis que leur couleur s’assombrit de plus en plus. (a) (b) (c) (d) Fig. 2. Symptômes, agent causal et pathogénie sur Kalankoë. a, Symptômes observés sur l’arbre. b, Galles observées sur racines. c, Aspect des isolats sur le milieu Mannitol-Glutamate additionné de tellurite de potassium. d, Développement de Galles sur Kalankoë après 1 mois d’inoculation.
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