Première observation de la maladie de la galle du collet causée par Agrobacterium tumefaciens

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Downloaded by [Mehdi El Arbi] at 03:23 12 February 2012 M. El Arbi et al. 462 Isolement sur milieu semi-sélectif Des colonies noires sont apparues sur milieu MG-Te ensemencé avec des broyats de tumeurs après 4 jours d’incubation à 28 ◦ C (Fig. 2c). Ces colonies présentaient une morphologie typique et étaient vraisemblablement des agrobactéries car celles-ci résistent au tellurite de potassium qui leur donne leur couleur noire alors que ce produit inhibe les espèces du genre Pseudomonas fréquemment associées aux agrobactéries dans les tumeurs. Tests biochimiques Les résultats des tests biochimiques consignés dans le tableau 1, nous ont permis de confirmer l’appartenance des trois isolats O7, O9 et O11 au biovar 1 (i.e. au complexe A. tumefaciens) sans pouvoir se prononcer, pour les autres isolats, qui peuvent être soit du biovar 2 ou du biovar 3 (i.e. R. rhizogenes ou A. vitis) car ces isolats ne produisaient pas de 3-céto-lactose. Ces tests biochimiques permettent de déterminer le taxon bactérien sur des critères chromosomiques mais ne donnent cependant aucune indication sur leur pathogénie qui est codée par des gènes plasmidiques. Test du pouvoir pathogène Le pouvoir pathogène des isolats O7, O9 et O11 a été testé en infectant des plants de Kalankoë daigremontiana. Tableau 1. Caractérisation biochimique des isolats. Uréase Esculine 3–Cétolactose Biovar1 + + + Biovar2 D D − Biovar3 ND ND − Isolats O1 + − − O2 − + − O3 − + − O4 − + − O5 − − − O6 − + − O7 + + + O8 − − − O9 + + + O10 − + − O11 + + + O12 − + − O13 − + − O14 − + − O15 − + − (+) : réaction positive ; (−) : réaction négative ; (d) : réaction diverse ; (ND) : réaction non définie. Des tumeurs typiques de galle du collet se sont développées après 1 mois d’inoculation au collet de Kalankoë (Fig. 2d), révélant que les isolats testés qui appartenaient au complexe A. tumefaciens / biovar 1 étaient également des agrobactéries pathogènes. Confirmation du pouvoir pathogène par PCR L’électrophorèse des amplifiats PCR de la région vir obtenus avec O7, O8, O9, O10 et O11 (Fig. 3) a montré la présence d’une bande chez O7, O9 et O11 uniquement. Les bandes d’environ 432 pb avaient migré vers le même niveau que la bande obtenue avec la souche C58 qui héberge un plasmide Ti à nopaline responsable de la pathogénie chez cette souche. Ce résultat confirme le pouvoir pathogène testée par inoculation de Kalankoë et nous a conduit, pour une identification plus poussée à chercher la natures de leurs plasmides. Séquençage des produits PCR de la région virB11-virG15 Les séquences des deux isolats O7 et O9 obtenues sont identiques (Fig. 4). La recherche d’analogues des séquences obtenues dans la base de données ‘Nucleotide collection (nr/nt)’ sur NCBI a fait ressortir, entre autres, la séquence ‘A. tumefaciens nopaline plasmid pTiC58 virB, virG and virC genes’ dont le numéro d’accession est ‘Y00535.1’ (Fig. 5), ayant un alignement significatif avec un pourcentage d’identité de 99% (393/397) et des brèches (Gaps) de 1% (4/397). Les plasmides des isolats issus de 432 pb 1Kb+ Eau C58 O8 O10 O7 O9 O11 Fig. 3. Électrophorèse sur gel d’agarose des amplifiats PCR de la région vir (0.8%, 80v).
Downloaded by [Mehdi El Arbi] at 03:23 12 February 2012 Agrobacterium tumefaciens on olive 463 1 GTATNATGCT CGCACGCAGT TCGATGTCAT CGTACCCTTC CGTGCCCACG 51 GTGACATTTA CGAGGTGGGC GAAATCTGGC TCGCTGCCGA TGCGCGTCGG 101 CGCGGTGAGA CAATAGGCGA TCTTCTTAAC CAGCAGTAGT TGTGATCCAT 151 GTTTCTAAAT GCCGCATGGC GCGTTGTAGA ATTACGTTTG TAGCAATGCT 201 CAGCAATCTT TGTCATCAAA CGGAGACATC TAGTTTGCAT TTCTGTCGTG 251 CGCGGTTTGG TCGAAATCTT GCCGAAATGC CCGTGTAGTG AGAGAAAATT 301 AAAGAGTGGA GTCTAGCAAA TACAACCTTT ACGTGTATAA ATTCTGTTGA 351 GCTGCAAATG GCTGGCCAGG ATCCTAGATT GAGAGGTGAA CCGTTAAAC Fig. 4. Séquence de la région virB11-virG15 des isolats O7 et O9. Fig. 5. Dendrogramme montrant la position phylogénétique des souches O7 et O9. l’olivier sont donc de type nopaline comme la majorité des souches locales tunisiennes (Rhouma et al., 2006). Confirmation de la sensibilité de l’olivier à la galle du collet Les plantules de la variété ‘Chemlali’ âgées de 4 mois inoculées par O7 ont toutes développé des galles typiques après un mois d’incubation (Fig. 6). Ce test qui vérifie le postulat de Koch, confirme le pouvoir pathogène de Fig. 6. Développement de Galles sur olivier (Variété Chemlali) par l’isolat O7. l’isolat testé et la sensibilité à la galle du collet de l’olivier en général et de la variété ‘Chemlali’, qui représente la majorité du patrimoine oléicole tunisien, en particulier. Conclusion La maladie causée par Agrobacterium tumefaciens connue pour affecter les arbres fruitiers peut également s’attaquer à l’olivier. Notre étude confirme donc celles effectuées en Algérie, en Australie, en Argentine, en Jordanie et maintenant en Tunisie qui montrent que l’olivier est aussi un hôte de cette bactérie. Les résultats de la caractérisation biochimique ont montré que parmi les isolats obtenus, uniquement les isolats (O7, O9 et O11) appartiennent au biovar1 c’est-à-dire au complexe d’espèces A. tumefaciens selon la nomenclature actuelle. Ces isolats se sont également avérés être pathogènes et la cause des symptômes observés au champ puisqu’ils ont induits la formation de galles après inoculation non seulement sur une plante indicatrice, le Kalankoë, mais également sur la plante d’origine, O. europea complétant ainsi le postulat de Koch. La prédiction du pouvoir pathogène par PCR des isolats O7, O9 et O11, va de paire avec les résultats trouvés sur Kalankoë. L’amplification d’une région du plasmide obtenue par le couple d’amorces (F14-virG15 et F749virB11), la taille des amplifiats obtenus ainsi que l’analyse des séquences obtenues avec O7 et O9 ont montré que leurs plasmides sont de type nopaline comme la majorité des souches isolées en Tunisie à ce jour. En accord avec les travaux de Costechareyre et al. (2010), l’étude de gènes chromosomiques tel que recA des isolats isolés de tumeurs d’oliviers permettra de voir à quelle(s) espèce(s) génomique(s) ils appartiennent au
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