13.genere corynebacterium - Facoltà di Medicina e Chirurgia

UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA
Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
AA 2011-2012
Genere Corynebacterium

Corynebacterium
• Famiglia : Corynebacteriaceae
• Genere : Corynebacterium
• Turicella
• Studi di filogenesi molecolare basati sulle sequenze 16S
rRNA hanno permesso di appurare che i generi
Corynebacterium e Turicella sono strettamente correlati
al genere Mycobacterium ,Nocardia, Streptomyces,
Rhodococcus e ai batteri acido-alcol resistenti.

Genere Corynebacterium: microrganismi ubiquitari,
colonizzano normalmente vari distretti del corpo umano
tra cui nasofaringe e cute.
Tutte le specie possono essere considerate come
patogeni
opportunistici, ma poche specie sono associate a malattia
nell’uomo

Specie
C. diphtheriae
C. ulcerans
C. jeikeium
C. urealyticum
C. minutissimum
Genere Corynebacterium
Malattia
difterite respiratoria, difterite cutanea
faringiti
setticemie, infezioni opportunistiche
infezioni tratto urinario, infezioni
opportunistiche
eritrasma, infezioni opportunistiche

Caratteristiche del genere
• Significato clinico da attribuire all’isolamento di specie diverse dal
diphtheriae da un campione biologico sia per le forme saprofite
presenti nel nostro organismo sia per quelle a localizzazione
ambientale.
• E’ possibile supporre una possibile infezione da C.diphtheriae spp,:
• a) se l’isolamento proviene da un sito sterile
• b) se il corineforme è il microrganismo predominante in un
campione raccolto in maniera corretta,
• c) se si presenta come unico microrganismo in un campione di
urina con una carica sup. a 10.4 ufc (unità formanti colonia),
• d) se è isolato ripetutamente in campioni consecutivi
• e) se all’esame microscopico oltre al coryneforme se sono presenti
anche leucociti in n° elevato e se si trova in concomitanza con altri
microrganismi si scarsissimo significato clinico

Corynebacterium diphtheriae
dimensioni: 0.3-0.8 x 1.0-8.0 μm
bacillo a forma di clava
Gram-positivo
tipica disposizione a “ideogrammi cinesi”,
immobile, acapsulato, catalasi +.
Aerobio.anaerobio facoltativo,asporigeno
Fermenta i carboidrati con produzione di acido lattico.
La parete batterica contiene: arabinosio, galattosio,
mannosio, acido meso-diaminopimelico
e acidi micolici a corta catena
(corynemicolico e corynemicolenico)
Inoltre può essere presente un 6,6'-diestere del trealosio
(simile al fattore cordale dei Micobatteri)

Corynebacterium diphtheriae
Presenta Granuli metacromatici
o granuli di Babes-Ernst
accumulo di sostanze nutritizie
evidenziabili con colorazione di Gins-Albert
al blu di metilene
I ceppi tossigenici producono una potente esotossina

Fattori di virulenza
Esotossina
blocco della sintesi proteica
Enzimi
• fosfolipasi D
• ureasi
• neuraminidasi
Sviluppo di resistenza agli antibiotici

La patogenesi della difterite è basata su
due eventi primari:
1) la capacità di un dato ceppo di C. diphteriae di
colonizzare la cavità nasofaringea e/o la cute
(importanti una neuraminidasi e il “fattore cordale” =
6,6'-di-O-mycoloyl-a,a'-D-trealosio)
2) la capacità di produrre la tossina difterica.
La tossina difterica è estremamente tossica: nell’uomo e
nelle altre specie suscettibili come scimmia e coniglio,
una dose di 100-150 ng/kg può essere letale.

Il gene che codifica per la tossina difterica
(gene“tox”) è portato da una famiglia di fagi lisogenici
tra cui il “corynebatteriofago beta” è quello più studiato.
un ceppo avirulento di C. diphtheriae può
essere convertito al fenotipo virulento in seguito ad
infezione e lisogenizzazione da parte di un fago.
Ciò può verificarsi sia in situ che in vitro
Corynebatteriofagobeta

La tossina difterica ha un peso molecolare di 58.3
KDa ed è formata inizialmente da una singola
catena polipeptdica di 535 aminoacidi.
sono necessari 2 stadi perché il prodotto del gene
venga secreto:
1) rottura proteolitica della sequenza principale
della proteina tox durante la secrezione dalla
cellula batterica
2) rottura della molecola della tossina in 2
polipeptidi (A e B) che rimangono attaccati
tramite un ponte disolfuro.

Tossina pantropa
Tossina difterica
La tossina difterica ha un peso molecolare di 58.3
KDa ed è formata inizialmente da una singola
catena polipeptidica di 535 aminoacidi.
Per azione di proteasi si divide in 2 frammenti:
“A” (21.500 daltons) e
“B” (40.500 daltons)
+ una “regione di traslocazione”
che rimangono uniti tramite un ponte disolfuro.

La tossina difterica presenta
tre regioni distinte:
1) regione che lega il recettore
2) regione di traslocazione
3) regione catalitica
regione di
traslocazione
regione catalitica
regione che lega
il recettore
Il RECETTORE per la tossina è il fattore di crescita epidermica
che lega l’eparina, presente in molte cellule cardiache e nervose.

Tossina difterica
Il frammento B si lega sulla membrana cellulare e tale legame
determina l’ingresso nella cellula del frammento A.
La frazione A una volta liberata nel citoplasma, esplica il suo
meccanismo d’azione di blocco della sintesi proteica
attraverso il distacco del NAD di una molecola d’adenosina
difosfato ribosile (ADPR) e catalizzando il trasferimento di
questa al fattore di allungamento EF-2 (mediante ADP
ribosilazione), con conseguente blocco sul ribosoma di
aggiunta di aminoacidi per la formazione della catena
polipetidica.
BLOCCO DELLA SINTESI PROTEICA CELLULARE
MORTE CELLULARE

Meccanismo d’azione della tossina difterica
1 Legame della tossina al recettore 2
Dopo acidificazione dell’endosoma
la regione di traslocazione si
inserisce nella membrana
della vescicola
3 4
4
Internalizzazione per endocitosi
La regione catalitica (A) passa nel citosol
provocando inibizione della sintesi proteica
ATTIVO INATTIVO
1
3
2

La produzione della tossina difterica è inversamente proporzionale
alla concentrazione di ferro nel mezzo di coltura. Ciò è dovuto al
fatto che la regolazione dell’espressione del gene tox è mediata da un
repressore attivato dal ferro, DtxR, che è codificato nel genoma di
C diphtheriae. L’espressione di tox dipende dallo stato fisiologico
di C. diphtheriae. In condizioni in cui il ferro rappresenta il substrato
limitante, esso si dissocia da DtxR, il gene tox viene derepresso, e
la tossina è sintetizzata e rilasciata nel terreno di cultura.

Epidemiologia
La difterite è considerata una
malattia pediatrica = colpisce gli
adulti che da bambini non hanno
eseguito una completa vaccinazione.
L’uomo è il solo serbatoio.
L’infezione è diffusa da portatori asintomatici
di C. diphtheriae a livello della cute e/o
dell’orofaringe.
Esistono due forme: respiratoria e cutanea

Difterite respiratoria
La trasmissione avviene attraverso le goccioline di
Flügge
è caratterizzata da febbre, gola infiammata, senso di
malessere, faringite essudativa.
L’essudato evolve in uno spesso strato di fibrina di
colore grigio-verdastro detto pseudomembrana,
che si forma sul sito di infezione

Il periodo d’incubazione della difterite è di 2-6 giorni
L’essudato che forma la pseudomembrana
(costituito da batteri, linfociti, plasmacellule, fibrina,
cellule morte) ricopre le tonsille, l’ugola, il palato, il
nasofaringe, la laringe.
Il distacco della pseudomembrana provoca
emorragie.
Le porzioni che si distaccano
vengono espettorate.
Complicazioni sono
rappresentate da Croup e miocarditi.
“bull neck”

Stadi clinici
Trasmissione della malattia, P.i. 2-6gg
• Sintomi iniziali: irritabilità, mancanza di attività, placche ed
essudato presenti nel faringe
• Dopo 2-3 gg : sintomi acuti, membrana ispessita grigia, che copre il
faringe, linfonodi ingrossati, infiammazione, edema dei tessuti molli
che circondano il faringe, classico collo taurino.
• Dopo 7gg, guarigione della membrana - convalescenza
Complicazioni
Morte nel 3.5-
12% dei casi

Complicazioni
• Asfissia: dovuta ad ostruzione delle vie aeree superiori da parte
della pseudomembrana
• È la più comune causa di morte nella difterite
• Miocardite: dovuta al danno tossico dei muscoli cardiaci avviene
nel 10-25% dei casi.
• E’ la manifestazione più frequente e grave in quanto può essere
letale in seguito ad arresto cardiaco;
• Neuropatie periferiche: possono interessare i nervi cranici e quelli
spinali, e il segno precoce è rappresentato dalla paralisi del
velopendulo.

Difterite cutanea
Si trasmette per contatto cutaneo con persone
infette.
C. diphtheriae colonizza la superficie cutanea
quindi penetra nel tessuto sottocutaneo attraverso
lesioni della pelle.
Si sviluppa una papula che evolve in ulcera che si
ricopre di una membrana grigia.
Possono verificarsi
segni sistemici dovuti
all’esotossina

Persone a rischio di contrarre infezioni da
Corynebacterium:
• Persone non vaccinate
• Persone che vivono in aree urbane affollate
• Bambini e adulti con scarsa immunità

Diagnosi di laboratorio
Campioni biologici: tamponi nasofaringei, gola (tamponi
sterili di cotone o calcio alginato)
Poiché le lesioni sono spesso ricoperte dalla
pseudomembrana è necessario esporre accuratamente
la superficie prima di effettuare il tampone.
Per l’esame microscopico viene impiegata la colorazione
di Gram e quella, specifica, di Gins e Albert

Per l’isolamento primario vengono impiegati terreni di coltura
come il terreno di Loeffler, il terreno di Pergola, l’agar tellurito
di Mueller-Miller , l’agar Tinsdale e il CNA (Agar sangue,
Colistina è acido nalidixico)
Le colonie sono grigio-nere.
Uresasi +
Molti ceppi richiedono acido nicotinico e pantotenico.
Per la produzione della esotossina in vitro il terreno deve essere
privo di ferro.
neg / pos

C. diphtheriae può essere identificato come biotipo mitis,
intermedius o gravis sulla base della fermentazione dei
carboidrati, della morfologia della colonia e del tipo di
emolisi in agar sangue

C. diphtheriae
biotipo mitis
biotipo intermedius
Nuovo biotipo: C. diphtheriae b. belfanti
biotipo gravis

Test di ELEK
(test di immunodiffusione per la
dimostrazione della produzione di
esotossina in vitro)
Carta con anti-tossina
Carta con anti-tossina
Bande di
precipitato
Semina di Corynebacterium:
- Tossinogenico (pos)
- Campione in esame (test)
- Non tossinogenico (neg)
Ora: si può dimostrare la presenza del gene tox con la PCR

Indagini sierologiche
• A scopo diagnostico le indagini sierologiche non sono
usate, perché la positività degli anticorpi è un dato
acquisibile troppo tardi rispetto all’urgenza di un
intervento terapeutico, ma possono assumere un valore
dal punto di vista epidemiologico per valutare la
diffusione dell’immunità in determinati paesi o per
definire i soggetti a rischio.

Controllo della difterite
L’immunizzazione con il tossoide difterico è molto
efficace (circa il 97% di protezione).
Il tossoide difterico si ottiene inattivando la tossina con
formaldeide a 37° C in ambiente leggermente alcalino.
La corretta vaccinazione prevede 3 dosi, a partire dal II
mese di vita, distanziate di 4-8 settimane, seguite dalla
quarta dose dopo 1 anno dalla terza.
Il tossoide difterico è uno dei
componenti del vaccino
DPT
(difterite, pertosse, tetano).

Il test di Schick (inoculazione intradermica di piccolissime
quantità di tossina) è stato usato per molti anni per
saggiare l’immunità verso la tossina difterica.
Attualmente sono preferibili test sierologici per dimostrare
la presenza di anticorpi specifici verso la tossina.

Terapia
La terapia antibiotica prevede la somministrazione di
Penicillina, Eritromicina, Tetraciline, Cefalosporine.
I pazienti con difterite devono essere trattati rapidamente
con antitossina neutralizzante.

C. Urealyticum
Presenta una notevole affinità per il tratto urinario,
Dove può produrre infezioni delle vie urinarie, dalla pielonefrite alla
batteriuria asintomatica. La sua capacità di produrre ureasi sembra
giocare un ruolo importante nella patogenesi delle UTI e può portare alla
formazione di calcoli renali.