3. Arsenico - Giornale Italiano di Medicina del Lavoro ed Ergonomia ...

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16 G Ital Med Lav Erg 2009; 31:1 http://gimle.fsm.it INTERFERENTI ENDOCRINI SCHEDE MONOGRAFICHE 3. ARSENICO 2008) hanno dimostrato che alle dosi più elevate di As (10 ppm) si verificava una significativa alterazione dei pathways relativi alla regolazione dell’actina nel citoscheletro, MAPK, Jak-Stat, Tight junction, Toll-like, fosfatidilinositolo e i pathways di signalling dell’insulina. Indicativamente 20 geni mostrano una dose risposta, includendo quelli associati alla cancerogenesi o alla crescita tumorale tra cui ciclina D1, CLIC4, efrina A1, STAT3 e DNA metiltransferasi 3a. Dosi uguali o inferiori a 1 ppm solo raramente erano in grado di indurre alterazioni significative dei suddetti pathways. In tal caso, le specie arsenicali potevano contribuire alla cancerogenesi come co-cancerogeni/mutageni (ad es. esposizione a raggi UV, fumo, deficit nella dieta) (Rossman, 2002 e 2004) (Figura 6). Sebbene alle dosi più elevate di As non siano stati correlati in passato cambiamenti trascrizionali nei geni identificati con la cancerogenesi, l’ultimo studio citato suggerisce che essi potrebbero svolgere un ruolo negli stadi precoci della cancerogenesi epiteliale ed essere quindi considerati potenziali biomarcatori. Più recentemente un altro studio ha evidenziato come la distribuzione sub-cellulare della proteina PCBP2 (poly- C binding protein 2) possa essere alterata dopo esposizione ad arsenito di sodio. (Fujimura K, 2008). La proteina PCBP2 è un componente dell’α-complex dell’mRNA dell’α-globina umana che aumenta la stabilità dell’RNA messaggero, facilita la traduzione di trascritti cellulari e virali ed è anche implicata in altri importanti processi biologici quali la regolazione trascrizionale e il silenziamento traduzionale. Appare quindi chiaro come l’effetto dell’esposizione ad As debba essere meglio compresa al fine di chiarire il complesso meccanismo di regolazione genica in tali sistemi. 13. MicroRNA I microRNA (miRNA), costituiti da brevi sequenze di RNA non codificante, sono stati ampiamente studiati in questi ultimi anni per la loro attività regolatoria post-trascrizionale, in grado di alterare in modo significativo l’espressione genica. Un recente studio ha valutato se l’esposizione cellulare a fattori che sono in grado di indurre anomalie dello sviluppo o cancro possa variare anche il profilo dei miRNA (Marsit, 2006). È stato rilevato che la mancanza di acido folico o l’esposizione ad arsenito di sodio inducevano un’aumentata espressione Figura 6. Mappa delle interazioni tra i possibili meccanismi d’azione della carcinogenesi indotta dall’As (i geni espressi in modo differenziato nella cute di topi K6/ODC, in seguito a esposizione a 10 ppm di arsenito di sodio per 30 giorni, sono identificati dai riquadri, con i relativi andamenti di up- o down-regolazione indicati dalle frecce) (modificato da Ahlborn, 2008)
G Ital Med Lav Erg 2009; 31:1 17 http://gimle.fsm.it 3. ARSENICO INTERFERENTI ENDOCRINI SCHEDE MONOGRAFICHE di miRNA, mentre un irraggiamento con raggi γ non provocava alcuna alterazione. È stato dimostrato che l’esposizione cronica ad arsenico inorganico e ai suoi metaboliti mediante somministrazione di acqua elevava l’insorgenza di tumore cutaneo in topi transgenici K6/ODC. Al fine di identificare potenziali biomarcatori e i possibili meccanismi di cancerogenesi, sono stati condotti studi sui profili di espressione genica nei citati animali previa somministrazione di 0- 0,05- 0,25 e 10 ppm di sodio arsenito. È emerso che la carenza di acido folico amplificava negli animali la risposta al trattamento con As, con conseguente interferenza con la normale proliferazione e differenziazione cellulare. Tale esperimento conferma che la carenza di acido folico rappresenta un fattore di suscettibilità nutrizionale nella genesi del tumore cutaneo indotta da As (Nelson, 2007). Un altro studio ha evidenziato come l’interazione tra miRNA e target, che porta alla repressione traduzionale del gene, possa essere facilmente soppressa in particolari condizioni di stress ossidativo tra cui anche l’esposizione ad arsenito di sodio 0,1 mM (Bhattacharyya, 2006). Tale osservazione, se confermata anche in vivo, complicherebbe ulteriormente la comprensione dei meccanismi di azione di questo interferente. 14. Metodi di analisi 14.1. Determinazione di arsenico totale e speciazione di forme organiche Nella determinazione di As totale in matrici biologiche sono state utilizzate diverse tecniche strumentali (B’Hymer, 2004; Francescani, 2004; Gong, 2002; Mandal, 2004; WHO, 2001) e tra queste, se ci si limita alle tecniche routinarie, risultano la spettrometria a fluorescenza atomica (AFS), la spettrometria di assorbimento atomico con tecnica di generazione dell’idruro (HGAAS) abbinata a trappola criogenica e tubo di quarzo, la spettrometria di assorbimento atomico con atomizzazione elettrotermica (ETAAS), la spettrometria di massa con sorgente a plasma induttivo (ICP-MS) sia in versione singolo quadrupolo, sia in versione ad alta risoluzione. Relativamente a quest’ultima strumentazione la determinazione di As presenta due ordini di difficoltà: a) il primo riconducibile alla formazione dello ione molecolare 40 Ar 35 Cl in grado di provocare un’interferenza spettrale sull’isotopo 75 As; b) un’ulteriore problematica deriva dall’effetto matrice del campione biologico (urina, sangue, siero) con conseguente interferenza non spettrale (Amarasiriwardena, 1998). In questi ultimi la versione ICP-MS in singolo quadrupolo è stata interfacciata a una cella di reazione dinamica (DRC) e più raramente a una cella di collisione per eliminare le interferenze poliatomiche e questa soluzione, economicamente più vantaggiosa della configurazione ad alta risoluzione ha rappresentato una soluzione valida per campioni di urina, siero e sangue intero. Va rilevato che è comunque necessaria una mineralizzazione preventiva della matrice biologica con trattamento in forno a microonde in contenitori pressurizzati in Teflon e utilizzo di adeguata miscela acida. Questa soluzione offre diversi vantaggi per quanto riguarda la fase preparativa, in quanto permette il trattamento contemporaneo di un discreto numero di campioni con tempi più brevi rispetto ai sistemi convenzionali. Allo stesso tempo garantisce un adeguato controllo dei fenomeni di inquinamento accidentale da As. In merito alla preparazione del campione verranno evidenziate in un successivo paragrafo le relative problematiche, in particolare quando è richiesta la speciazione delle forme arsenicali inorganiche ed organiche. In quest’ultimo decennio, la determinazione di As totale è risultata un indicatore biologico utilizzato prevalentemente come test di screening, anche per studi sulla popolazione generale. Viceversa si sono intensificate le metodiche analitiche per la speciazione dell’As in diverse matrici biologiche, in grado quindi di consentire una differenziazione tra le diverse forme chimiche di As organico e inorganico. Un requisito fondamentale di questa speciazione è che la preparazione del campione all’analisi non determini alterazioni delle diverse forme chimiche originarie dell’elemento. Recentemente Heitland e Koster (2008) hanno utilizzato un metodo routinario per la determinazione in urina che utilizza la cromatografia liquida a elevate prestazioni interfacciandola alla ICP-MS. Va evidenziato che questi autori hanno impiegato un metodo validato e controlli di qualità sia interni, sia esterni. Il LOD del metodo, riferito ad As III e As V , al monometilarsonato V e all’arsenobetaina è risultato pari a 1 µg/l. I citati autori hanno considerato tale valore adeguato per un’applicabilità del metodo anche a studi sulla popolazione generale e residente nella Germania del nord. Un ulteriore aspetto è che la strumentazione ICP-MS era di tipo convenzionale e quindi sicuramente più accessibile della DRC-ICP-MS o del Sector Field ad alta risoluzione. La stessa tecnica strumentale HPLC-ICP-MS è stata impiegata da Morton e Mason (2006) per la determinazione di arsenito III , arsenato V , arsenobetaina, acido monometilarsonoso III e acido dimetilarsinico V in urina umana, verificando l’applicabilità del metodo in una ricerca condotta su un gruppo di popolazione generale inglese. In uno studio recente condotto su 210 soggetti maschi giapponesi non professionalmente esposti ad As Hata, (2007) ha fatto ricorso all’HPLC-ICP-MS per la determinazione di arsenito III , arsenato V , acido monometilarsonoso III , acido dimetilarsinico V , arsenobetaina, arsenocolina, ossido di trimetilarsina oltre a forme metaboliche non identificabili. Gli stessi autori hanno determinato la concentrazione totale
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