Riggio Marilisa, Scudiero Rosaria, Borrelli Lucia, De Stasio Roberta ...

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Cromatografia per gel filtrazione di un estratto da fegato di Podarcis sicula
Campioni di fegato prelevati dal lacertiliano Podarcis sicula sono stati omogenizzati
in acetone preraffreddato e centrifugati. I residui sono stati essiccati sotto vuoto a
temperatura ambiente. Le polveri acetoniche ottenute sono state estratte in tampone
Tris-HCl 50 mM pH 8,6 e successivamente sottoposte ad un doppio trattamento
con solventi organici, che determina la precipitazione selettiva delle
metalloproteine (Comeau et al., 1992). Il campione ottenuto è stato incubato
con CdCl 2
e cromatografato su una colonna di Sephadex G-75 equilibrata con
tampone Tris-HCl 20 mM pH 8,6. L’eluato è stato analizzato per contenuto di
Cu e Cd ed assorbanza a 280 nm (Scudiero et al., 1997).
Retrotrascrizione dell’RNA epatico, amplificazione del cDNA codificante le proteine
MT e CTR e 5' RACE
L’RNA totale è stato estratto dal fegato di P. sicula e A. fragilis utilizzando il reagente
TRI-REAGENT (Sigma Chemical), secondo il metodo messo a punto da
Chomcyznski & Sacchi (1987). Il cDNA a singola elica è stato prodotto dall’
RNA totale da tessuto epatico di P. sicula e A. fragilis mediante polimerizzazione
con l’enzima Trascrittasi inversa.
La PCR è stata condotta utilizzando come DNA stampo il cDNA a singola elica
ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa. Per ciascuna reazione sono stati
utilizzati un primer non specifico e un primer specifico disegnato sulla base di
sequenze consenso delle proteine MT e CTR. I prodotti da PCR sono stati clonati
in vettori plasmidici (Riggio et al., 2000).
La 5'-RACE è stata effettuata utilizzando il kit di amplificazione Marathon (fornito
dalla Clontech). Per la reazione di PCR sono stati utilizzati come primer
specifici oligonucleotidi disegnati sulla base delle sequenze parziali delle proteine
MT e CTR precedentemente ottenute. Le sequenze nucleotidiche e
amminoacidiche sono state analizzate utilizzando programmi al computer, quali
Blast, Fasta e Clastal X, presenti al sito www.ebi.ac.uk.
Risultati e discussione
Accumulo di metalli pesanti nei tessuti di P. muralis e di Rana synklepton esculenta
Allo scopo di determinare il contenuto di “metalli traccia” nei tessuti delle specie
esaminate, frammenti di tessuto sono stati sottoposti a combustione totale
come descritto nei metodi, e il contenuto di zinco, rame e cadmio è stato determinato
mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico. I risultati ottenuti,
riportati nelle tabelle I e II, dimostrano che lo zinco e il rame sono presenti in tutti
i tessuti esaminati e il contenuto di zinco è generalmente maggiore rispetto a
quello del rame. Ciò non è sorprendente perché, di norma, in situazioni fisiologiche,
il contenuto tissutale di rame è di uno o più ordini di grandezza inferiore a